CN103134938A - 适体在蛋白质组学中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适体在蛋白质组学中的用途，是用于测量生物学样品中至少一种分子的量的方法，该方法包括：a)将所述样品或其衍生物与一种或多种适体组合并容许所述样品中的一种或多种分子结合至所述适体；b)将结合的分子与未结合的分子分开；并c)对结合至所述或每种适体的所述分子定量，其中对结合的分子的定量是通过对所述或每种适体的至少一部分测序来进行的。还涵盖所述方法的用途和自所述方法衍生的产品。

Description

适体在蛋白质组学中的用途
本发明是申请日为2008年10月10日，申请号为200880120684.1（国际申请号为PCT/GB2008/003447），名称为“适体在蛋白质组学中的用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及复杂混合物中蛋白质的鉴定和定量。具体而言，本发明涉及适体(aptamer)作为复杂混合物中蛋白质和蛋白质数量的标签(tag)或代替物(proxy)的用途。在另一个方面，本发明涉及下一代多核苷酸测序方法在蛋白质组学中的用途。
背景技术
蛋白质组通常被描述为在生物学系统(例如细胞、组织、体液、器官或生物体)中找到的蛋白质的全集。对天然存在蛋白质的研究通常称作“蛋白质组学”且涵盖对在特定时间时和/或在感兴趣的内部或外部条件下表达的蛋白质组的研究。蛋白质组学方法常常针对蛋白质组的整体分析且要求能自一份或多份样品解析、鉴定和定量多种(例如数百种或数千种)蛋白质。
蛋白质组学的承诺中有其识别新的生物标志物(即作为生物学指示剂发出生理学状态改变(例如由于疾病或治疗性干预)的信号的蛋白质)的能力。生物标志物发现通常涉及比较在不同生理学状态中表达的蛋白质组并鉴定其存在或表达水平在生理学状态间一致不同(consistently differ)的蛋白质(Schrattenholz A,Groebe K.Electrophoresis.(2007)Jun 28(12)1970-9)。
血液中的蛋白质是鉴定疾病状态和药物治疗标志物的特殊靶物。广泛假设，血液中的蛋白质的量和/或构象应当在统计上与此类状况有关，其方式在权重上超过内在的天然变异性。血液和其它体液是特殊的靶物，因为它们浸泡(bathe)受影响组织，转运生死攸关的蛋白质且能在医学会诊过程中使用相对便宜和直接的规程获得供测试用。
然而，血液中的蛋白质具有很大范围的浓度，其中少数蛋白质占比超过所有蛋白质的99.9%而且其它蛋白质占据的分布为皮克至毫克每毫升(QianW.J.等,Mol.Cell.Prot.(2006)5(10)1727-1744)。由于现有蛋白质组学技术的限制，此丰度范围仍然是假设的。蛋白质组学科学家采用多种方法来达到此范围，目的也是使对蛋白质相对丰度的破坏最小化。这常常要求通过选择性纯化来排除高丰度的蛋白质。还尝试通过选择性聚焦样品中所有肽的子集来降低所获得的肽的复杂性。这些规程是漫长的，而且样品、复制品、仪器和实验室间的再现性仍有待以生物标志物蛋白质的统计发现(statisticaldiscovery)的必要方式来证明。
生物标志物发现中常常使用的基于常规质谱术(MS)的蛋白质组学通过将生物学样品分开以自所研究的混合物分离单一蛋白质来进行。最近，这从二维凝胶前进至多维基于柱的高效液相层析(HPLC)。蛋白质能被分解成较短的亚基或肽。然后将分离的肽进料入质谱仪中，质谱仪将肽离子化并使它们进一步分解，产生质量/电荷测量的梯状物。这些测量及其丰度也能在多种方案下量化，通常是相对于一些对照。然后将所得图谱梯状物针对已知肽序列或盲目地自原始数据进行解读，并使用获得的质量和序列信息来搜索序列数据库以鉴定作为各肽起源的蛋白质。
然而，复杂生物学样品的蛋白质水解通常产生数以十万计的肽，它们会压倒已知层析和MS系统的分辨能力，引起不完全的分辨和组分肽鉴定受损。通常，在基于MS的蛋白质组学中，自样品得到的图谱中多达80%不能正确或一致地重解读成差别肽或(因此)蛋白质。它们在MS过程中的片段化行为和丰度也能是依赖背景的，进一步使再现性变复杂(Liu H,Sadygov RG， Yates JR3rd.,Anal.Chem.(2004)Jul 15 76(14)4193-201)。
使生物学样品的蛋白质组分析能够进行的一种方法是在对所生成的肽混合物进行下游解析和鉴定步骤(如层析分离和/或质谱术(MS))之前，降低由分开此类样品来产生的所述肽混合物的复杂性。理想的是，降低蛋白质肽混合物的复杂性会降低样品的每种个别蛋白质所存在的不同肽的平均数目，仍会使肽混合物中实际呈现的样品中蛋白质的级分最大化。
蛋白质的生物学加工以使基于MS的确认混淆的多种方式使血液(血清或血浆)的使用进一步不明(Qian W.J.等,Mol.Cell.Prot.(2006)5(10)1727-1744)。最近的研究显示了极其矛盾的自临床样品鉴定和计数蛋白质的尝试。就是以常规的基于MS的蛋白质组学分离、断裂和测量蛋白质的动作改变了它们的相对丰度和化学组成。
基于蛋白质组学的分析的输出是所研究的样品中显著关联的蛋白质的“命中列表”。通常，此列表是具有可变统计意义的蛋白质的选集。通常对该列表进行生物学导向研究，并对每个成员的潜在生物学意义做出理性选择。搜索具有推定统计意义的蛋白质或假定生物标志物列表的过程一般称作“发现”。
然后将努力聚焦于检验和验证少数选定的“命中”。这涉及在更宽的临床样品群体中证实测量得到的蛋白质丰度，目的是显示所发现的和所选择的蛋白质是真实的而非假阳性，而且它们是对疾病或药物状态特异性的。这种证实蛋白质组学测量和推定生物标志物在更一般化的群体中的数量意义的过程通常称作“验证”(Zolg,Mol.Cell.Prot.(2006)5(10),1720-1726)。这常常要求对发现阶段使用备选技术。
这通常是使用针对纯化的推定蛋白质生成的抗体实现的。然后能在基于ELISA的测定法中针对数以百计的样品使用这些抗体，再次应用相关统计学，并确立该蛋白质作为生物标志物的有效性。此过程的最终意图还有使抗体成为临床测定法的一部分。然而，抗体的生成是费时且昂贵的，而且并非总是可能生成对给定蛋白质特异性的抗体。另一项复杂因素是蛋白质备选变体或同型(isoform)的存在，它们可以在其表面上具有所附着糖分子的壳和其它修饰。同型在发现阶段基于MS的鉴定中可能是不明显的，并因此使测量的统计显著性及特异性抗体的生成变复杂(Zolg,Mol.Cell.Prot.(2006)5(10),1720-1726;Rifai等,Nature Biotech(2006)24(8)971-83)。
发现和验证都具有高失败率，而且是费时且昂贵的练习。成功和失败通常只能在付出很长时间和很多金钱后的验证阶段后判断。因此，最近的努力聚焦于用于发现的基于MS的方法的精化和抗体的大量生成，以努力加速发现、验证及衍生临床产品(Anderson和Hunter,Mol.Cell Prot.(2006)5(4)573-588;Zangar等,Expert Review of Proteomics(2006)3(1)37-44)。
因而，显然需要新方法来审查蛋白质，特别是自体液得到的复杂的蛋白质混合物。具体而言，需要鉴定和测量蛋白质丰度，尤其是复杂混合物中多种蛋白质的丰度的技术，它要克服技术缺点及妨碍当前技术的科学和成本约束。具体而言，需要工具来取代昂贵且有时不可靠的抗体生成和使用以鉴定和验证靶蛋白质。此类工具还能用于代替现有的基于发现的技术，如MS，前提是能足够快速且便宜地生成有足够多样性的抗体备选物来探查生物学样品中的全范围的天然蛋白质。
对此类工具的明显要求是对混合物的最小限度操作，从而可获得样品中蛋白质以其天然构造以及任何天然修饰和变异的真实呈现。此类工具还应是高度且准确可再现的。
适体是形成限定明确的三维形状，从而容许它们以与抗体在概念上相似的方式结合靶分子的短聚合物，通常是核酸(DNA、RNA、PNA)。适体组合了小分子和抗体的最佳特征，包括高特异性和亲和力、化学稳定性、低免疫原性、和靶蛋白质-蛋白质相互作用的能力。在高特异性之外，适体对它们的靶物具有非常高的亲和力。通常，针对蛋白质生成的适体具有皮摩尔至低纳摩尔范围内的亲和力。与单克隆抗体不同，适体是化学合成的，而非生物表达的，从而提供重大成本优势。
虽然适体提供了抗体的有用且有效的备选，仍然有如何经由适体对蛋白质定量的问题。复杂的蛋白质混合物及生物学样品中存在的大动态范围的蛋白质提供了特别的问题。通常，使用放射性标记物对适体定量。虽然放射性标记物的定量是可接受的，而且已经使用多年，但是仍然需要改进和加速定量，以及改进准确度和再现性。
发明内容
如此，最广义地，本发明涉及一种用于测量生物学样品中至少一种分子的量的方法，该方法包括：
a)将所述样品或其衍生物与一种或多种适体组合并容许所述样品中的一种或多种分子结合至所述适体；
b)将结合的分子与未结合的分子分开；并
c)对结合至所述或每种适体的分子定量，
其中对结合的分子的定量是通过对所述或每种适体的至少一部分测序来进行的。
换言之，本发明涉及适体作为标签用于对蛋白质定量的用途，其中所述适体的序列就是所述标签。可理解的是，适体具有可阅读的独特序列，例如像条形码一样。依照本发明，此独特条形码成为该条形码(适体)所结合的每种蛋白质的标签。通过阅读条形码(对适体测序)，消除了对另外的标签和/或标记物的需要。
与现有方法不同，适体序列作为标签的用途容许只使用单一分子实体进行蛋白质鉴定和定量。事实上，对适体测序容许对每种独特序列的情况或出现计数，因此容许直接对每种适体所结合的蛋白质定量。换言之，当各适体结合各蛋白质时，每种适体成为样品或蛋白质混合物内蛋白质的直接呈现。可理解的是，经由本发明的方法，对初始蛋白质或样品的操作降至最少，由此容许尽可能接近天然状态地审查蛋白质或蛋白质混合物。这样，可获得蛋白质或蛋白质群体的真实图像。
本发明还涉及如下方面：
1.一种用于测量生物学样品中至少一种分子的量的方法，该方法包括：
a)将所述样品或其衍生物与一种或多种适体组合并容许所述样品中的一种或多种分子结合至所述适体；
b)将结合的分子与未结合的分子分开；并
c)对结合至所述或每种适体的分子定量，
其中对结合的分子的定量是通过对所述或每种适体的至少一部分测序来进行的。
2.根据项1的方法，其中所述至少一种分子是蛋白质。
3.根据项1或2的方法，其中所述分子的身份是已知的。
4.根据项1或2的方法，其中所述分子的身份是未知的。
5.根据项4的方法，其中该方法进一步包括确定所述分子的身份。
6.根据项1-4任一项的方法，其中所述或每种适体的序列是已知的。
7.根据项1-6任一项的方法，其中每种适体序列携带独特的标签。
8.根据项7的方法，其中所述标签是所述适体的序列。
9.根据项7或8的方法，其中所述标签是所述适体的序列的一部分。
10.根据项1-9任一项的方法，其中测序是在单分子阵列或克隆单分子阵列上进行的。
11.根据项1-10任一项的方法，其中该方法进一步包括清除结合至所述或每种分子的所述适体并将所述适体排列在表面上。
12.根据项11的方法，其中该方法进一步包括扩增所排列的适体。
13.根据项1-12任一项的方法，其中所述一种或多种适体包含结合相同分子的不同序列。
14.根据项1-12任一项的方法，其中所述一种或多种适体包含多组适体序列，每组结合不同分子。
15.根据项1-14任一项的方法，其中所述适体是自多核苷酸或多肽衍生的。
16.根据项15的方法，其中所述适体是多核苷酸且具有约30个至约60个碱基。
17.根据项16的方法，其中所述适体具有约40个碱基。
18.根据项15的方法，其中所述适体是多肽且具有约30个至约60个氨基酸。
19.根据项1-18任一项的方法，其中所述生物学样品是体液。
20.根据项19的方法，其中所述体液是血液或者是自血液衍生的。
21.根据项20的方法，其中所述体液是血清或血浆。
22.根据项1-21任一项的方法，其中该方法进一步包括：
d)将第二生物学样品与c)中获得的定量的适体组合；
e)将结合的分子与未结合的分子分开；
f)对结合至适体的分子定量；并
g)将c)中获得的数量与f)中获得的数量比较，
其中对结合至第二样品中一种或多种分子的适体的定量是通过对每种适体的至少一部分测序来进行的。
23.根据项1-22任一项的方法，其中该方法进一步包括将所述或每种适体的数量与对照或基线数量比较。
24.根据项22或23的方法，其中所述第二样品是自已知处于疾病状态的个体获得的。
25.根据项22或23的方法，其中所述第二样品是自已知处于健康状态的个体获得的。
26.根据项22或23的方法，其中所述第二样品是自药物治疗后的个体获得的。
27.项1-26任一项的方法用于鉴定一种或多种生物标志物的用途。
28.项1-26任一项的方法用于验证一种或多种生物标志物的用途。
29.项1-21任一项的方法作为诊断方法的用途。
30.通过项1-26任一项的方法鉴定的适体在诊断试剂盒中的用途。
31.以项1-26任一项的方法使用的诊断试剂盒，其中该试剂盒包含一种或多种适体。
32.根据项31的诊断试剂盒，其中所述一种或多种适体是通过项1-26任一项的方法鉴定的。
33.适体作为标签用于对样品中的分子定量的用途，其中所述适体的序列的至少一部分是所述标签。
34.根据项33的用途，其中所述分子是蛋白质。
35.根据项33或34的用途，其中定量是通过对所述标签的至少一部分测序来进行的。
36.根据项35的方法，其中测序是在单分子阵列或克隆单分子阵列上进行的。
37.一种能够测序的适体，其包括：
适体序列；和
至少一种衔接头序列，
其中所述衔接头序列包含供所述适体附接于表面用来测序的附着序列。
38.根据项37的适体，其中所述衔接头序列进一步包含测序引物。
39.根据项37或38的适体，其中所述适体序列是DNA、RNA、PNA或其混合物。
40.根据项37-39任一项的适体，其中该适体进一步包括标记物。
41.根据项40的适体，其中所述标记物是放射性标记物或者是发荧光的。
42.根据项41的适体，其中所述标记物是6-羧基荧光素。
43.项37-42任一项的适体在项1-26任一项的方法或项31或32的诊断试剂盒中的用途。
发明详述
在一个优选的实施方案中，对适体测序是在没有扩增的情况中实现的，所以通过对如下的测序装置上每个种类的出现计数来获得适体的绝对或数字计数，该测序装置在测序之前将各分子分开，例如“下一代”DNA测序仪。获得每种序列的出现的直接计数，它又等于适体所结合的蛋白质的绝对计数。可以将序列子集呈现在计数装置上，这应当是所研究的分子群体中给定序列的出现的代表性样品。再一次，这与当前的适体定量方法不同，后者通常要求扩增结合的标签或扩增适体分子，从而产生其相对丰度的模拟估值(如专利公开号US2007-0166741中所记载的)。这是由于为了鉴定结合蛋白质的适体而使用标记物和别的标签的限制。结果，定量与实际丰度(即模拟信号)成比例，而不能分辨绝对或个别出现。
使用适体序列作为标签的另一项优势是序列提供极大范围的可能标签。例如，四个碱基的序列提供256种不同组合及如此256种可能的独特标识符或标签。如此，虽然可以获得整个适体序列，但是测序的核苷酸数目只需要足以鉴定特定适体就够了。换言之，或者整个适体序列作为标签，或者标签是适体序列的一部分。
虽然本发明的方法可用于用一种适体序列对样品中的一种蛋白质定量，但是本发明的另一项优势是由独特序列提供的可能的标签的范围容许同时对同一样品中的多种蛋白质定量。如此，可以使用一组已知适体序列或已知适体序列文库来对复杂混合物中的多种蛋白质定量，而且这样，本发明容许审查复杂生物学样品。另外，一组适体或适体文库可以靶向特定蛋白质，特别是已知在样品中少量存在的蛋白质。因为使用已知方法不太可能鉴定和定量样品中的低丰度蛋白质，所以本发明提供了用于审查这些小且至今难以捉摸的群体的解决方案。文库或组应当理想地含有过度的适体种类来探查样品。
本发明可分析一种蛋白质(例如凝胶切下的蛋白质)，而且特别适合于分析蛋白质混合物，包括复杂蛋白质混合物。术语“蛋白质的混合物”或“蛋白质混合物”一般指两种或更多种蛋白质的混合物，例如包含两种或更多种不同蛋白质的组合物。
在优选的实施方案中，要分析的蛋白质混合物可包括超过约10、优选超过约50、甚至更优选超过约100、仍更优选超过约500种不同蛋白质，如例如超过约1000或超过约5000种不同蛋白质。一种例示性复杂蛋白质混合物可涉及而非限于生物学样品或其部分中存在的所有或部分蛋白质。
如本文中所使用的，术语“生物学样品”或“样品”一般指自生物学来源获得的未纯化或纯化形式的材料。举例而言，而非限制，样品可以获得自：病毒，例如原核或真核宿主的病毒；原核细胞，例如细菌或古细菌，例如自由活动的(free-living)或浮游的原核生物或者包含原核生物的集落或生物膜；真核细胞或其细胞器，包括自体内或原位获得的或体外培养的真核细胞；真核组织或生物体，例如来自真核组织或生物体的，含有细胞的或不含细胞的样品；真核生物可包含原生生物(例如原生动物或藻类)、真菌(例如酵母菌或霉菌)、植物和动物(例如哺乳动物，人类或非人哺乳动物)。“生物学样品”可如此涵盖例如细胞、组织、生物体、或其提取物。可以优选通过合适方法自其生物学来源(例如自动物，如哺乳动物，人类或非人哺乳动物)移出生物学样品，如但不限于收集或采集尿液、唾液、痰、精液、乳、粘液、汗液、粪便等，采集血液、脑脊髓液、间质液、眼液(玻璃体)或滑液，或组织活检、切除术、等。可以进一步细分生物学样品以分离或富集其一部分，该部分要用于获得本发明中所分析的蛋白质。举例而言，而非限制，可以将多种组织类型彼此分开；可以自样品分离特定细胞类型或细胞表型，例如使用FACS分选、抗体淘选、激光捕捉解剖(laser-capture dissection)等；可以将细胞与间质液分开，例如可以将血细胞与血浆或血清分开；等等。可以直接将样品应用于本发明的方法，或者可以在使用前将样品加工、提取或纯化至不同程度。
可以自健康受试者或患有状况、病症、疾病或感染的受试者得到样品。例如，而非限制，受试者可以是健康的动物(例如人类或非人哺乳动物)，或者具有癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、代谢病、CNS疾病、眼科疾病、心脏病、肺病、肝病、胃肠病、神经变性性疾病、遗传病、传染病、或病毒感染、或其它病的动物(例如人类或非人哺乳动物)。
优选的是，可以处理自生物学样品得到的蛋白质混合物以从中消减高丰度蛋白质，从而提高蛋白质组分析的灵敏度和性能。举例而言，哺乳动物样品(如人类血清或血浆样品)可以包括含量丰富的蛋白质，例如清蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、运铁蛋白、触珠蛋白(haptoglobin)和纤维蛋白原(fibrinogen)，可以优选自样品如此消减它们。用于清除含量丰富的蛋白质的方法和系统是已知的，如例如免疫亲和消减，而且通常是商业上可得到的，例如Agilent Technologies(Santa Clara,California)的多重亲和清除系统(MARS-7，MARS-14)。
虽然本发明具有蛋白质定量的具体应用，但是可理解的是，本发明还具有其它分子(如代谢物)定量及潜在小分子和生物学治疗剂鉴定的应用。
在一个实施方案中，本发明使用下一代多核苷酸测序技术来鉴定和定量适体标签。这样，本发明提供了与当前可用方法相比更灵敏且有效的定量方法，并在蛋白质组学领域中利用由这种基因组方法提供的大动态范围、特异性和灵敏度。
下一代多核苷酸测序技术要求将DNA或RNA或其它多核苷酸序列的各分子分离到表面(如珠或芯片)上，由此创建序列的单分子阵列。该阵列的表面密度容许每个分子得到个别分辨，例如通过光学显微术。在阵列上对多核苷酸分子的测序容许对序列进行“数字”(即绝对)计数，如此对阵列上存在的序列直接定量。在一些技术中，一旦排列就可以克隆扩增序列以加强和/或阐明来自每种序列的信号。但是，通过对阵列上序列的出现而非自每种扩增子生成的信号计数来获得定量。合适的测序和定量技术的例子可见于出版物中，如WO 00/006770和Branton等(Nature Biotechnology(2008)26 1146-1153)。
因而，在一个优选的实施方案中，对结合的适体序列的定量是使用结合的序列的单分子阵列进行的。或者，可以在克隆阵列上对适体序列定量，其中在表面上排列后扩增每种序列。
由于适体对其靶蛋白质的高特异性，可以使用适体作为混合物内蛋白质的代替物。结合于其蛋白质和后续洗脱后，经由对其序列在平行测序装置上的频率计数来对适体定量，从而能够对样品内的特定蛋白质定量。通过暗示或代替，这与使用抗体作为蛋白质的代替物的方式相似。事实上，适体序列或标签的分布代表获得蛋白质的生物学群体或样品中相应蛋白质的分布。
此外，在阵列上对克隆分子计数为每种适体标签的数量或比例提供绝对数。这称作“数字计数”，而且与现有的DNA/RNA定量方法不同，后者依赖如附着染料的荧光等参数的间接模拟测量。这样，不需要操作蛋白质或蛋白质混合物，除了在合适条件下暴露适体。另外，认为数字计数是卓越的，因为它避免了模拟定量的许多含混(ambiguity)和信号噪声问题(Smyth GK,Bioinformatics(2007)Sep 19)。
在一个具体的实施方案中及如图1所示，针对自生物学材料(例如血清)得到的体外折叠蛋白质集筛选并选择适体文库。可理解的是，可以通过任何方法来生成适体标签文库，包括SELEX和共同待审的(co-pending)申请号EP07020629.7中记载的方法。
清除或洗脱不结合蛋白质的适体。为了实现这一点，有多种已知选项可用。例如，可用在固体支持物上固定化一种蛋白质或复杂蛋白质样品。可以实施严格清洗来清除不结合的和弱结合的适体。另一个选项是使用蛋白质靶物上适体的可逆交联(光适体)。也可以采用基于平衡混合物的平衡毛细管电泳(ECEEM)或非平衡变体(NECEEM)的非SELEX办法来快速选择具有规定结合特性的“聪明”适体(Drabovich等,Anal.Chem.(2006)78,3171-3178)。
自它们的蛋白质宿主移除剩余的、结合的适体，并运行穿过(run through)下一代测序仪，由此对它们测序和计数。
作为下一代测序的一个具体例子，将结合的适体随机排列在表面(如珠或芯片)上。任选地循环扩增适体，在表面上的离散x和y坐标处或在各珠上产生多组克隆单链分子。序列结合至阵列后，将引物添加至每个序列。然后DNA测序仪执行逐步化学，该逐步化学由容许每个循环测定每个互补序列上一个碱基的试剂组成。这样，确立反映每个结合的适体序列的互补序列。照明和成像系统容许此过程被拍照，而且通过多次重复规程，能获得初始适体的序列。此类技术通常能够对超过0.4-1亿种长达50个碱基对的DNA片段测序，而且这些数目正在快速增长。从样品准备到测序输出，此过程目前需要少于1-3天，而且这些时间表(time scale)正在缩短。
可理解的是，可以使用落在“下一代多核苷酸测序”范畴中的其它方法，而且本发明不限于所提供的具体例子。“下一代多核苷酸测序”是一般用来描述自2004年出现的DNA/RNA测序平台的新创术语。它们的共同特征是它们使用与基于“Sanger”测序的旧技术不同的测序化学。新平台使用新化学且一般具有很高的通量和低得多的成本。这是通过平行运行测序反应的能力来实现的。新平台通常通过合成或链延伸(建造)来行进，与通过剪断碱基(降解)来运转的Sanger法不同。另外，新平台操作微量的克隆分子，与具有很大的DNA测序仪分子对碱基测量比的Sanger法不同。
也可理解的是，虽然提到了DNA测序，但是DNA测序技术也可用于RNA或PNA(肽核酸)序列。如此，提到下一代测序仪或测序涵盖DNA、RNA和PNA，以及基于核酸的聚合物的所有其它化学变体及其类似物，它们适合于在本发明的方法中使用。
虽然本发明的一个优选实施方案使用适体序列的二维阵列，但是本发明涵盖溶液中的和三维的下一代测序。对于后者，可以连锁标签以提高阵列的动态范围。
本发明的一项重大优势是可以在一项测定法或实验中使用针对不同蛋白质的多种适体来审查复杂蛋白质混合物，由此能够平行地对一份样品中的多种蛋白质定量。此多重性显然适应高通量测定法，如下一代测序。认为在联合使用时，多种蛋白质充当特异和灵敏生物标志物的力量在权重上远远胜过一种蛋白质的使用，因为多种生物标志物在患病状态中通常共同地而非个别地起作用。
理想的是，文库适体序列包含对一种蛋白质特异性的适体序列池(pool)。或者，该池包含对超过一种蛋白质特异性的适体序列。例如，该文库可以含有已知对蛋白质A特异性的适体序列a1、a2和a3。或者，该文库可以含有适体序列a1、a2和a3，以及对蛋白质B特异性的b1和b2，c1等。虽然适体序列a1、a2和a3可以是对蛋白质A特异性的，但是本发明涵盖如下的情况，例如适体序列a2对蛋白质B也是特异性的。换言之，适体文库可以含有离散地对蛋白质特异性的序列，以及结合超过一种蛋白质的序列。后一种情况当在混合物中搜索相关蛋白质家族和组时可能是有用的。
虽然优选所述或每种适体所结合的蛋白质或分子的身份是已知的，但是此类特征不是至关重要的。例如，适体所结合的蛋白质的类别可以是已知的，但是该类别的具体成员在患病状态中可发生改变。一旦完成定量，就可以阐明蛋白质的身份。例如，可以针对蛋白质混合物测定一种或多种特异性适体。适体特异性结合感兴趣蛋白质，然后可以自混合物分离和纯化感兴趣蛋白质。本发明的一项重大优势是直到审查过程结束时才需要确定蛋白质生物标志物的实际鉴定。如此，审查期间不需要操作蛋白质样品。
可理解的是，可以通过任何已知方法来进行多肽测序。例如，可以在柱上固定化感兴趣适体，使蛋白质混合物流过柱，并使用常规的基于MS的蛋白质组学分析与柱上结合于适体的蛋白质。
在另一个实施方案中，适体携带独特的序列标签。这样，一旦适体被鉴定为结合一种或多种感兴趣蛋白质，就可以自适体移除标签，然后对标签测序和计数。这样，使用标签作为适体的地址并提供备选方法来提供定量。
可理解的是，该方法可用于提供多种解决方案和答案。具体而言，该方法可用于审查生物学样品以确定与健康状态相比某些蛋白质或分子在疾病状态是否上调或下调。因为可以同时使用多组适体，所以本发明容许同时审查多种潜在和/或已知生物标志物。适体序列作为标签的使用(而非间接标签和标志物，如放射性标记物和抗体)容许鉴定上调和下调的分子，以及翻译后修饰的改变、构象变化、变体出现等等。这样，能被鉴定的可能生物标志物的细查(canvass)比使用当前可用技术时可能的情况宽得多。
事实上，可以使用聚焦适体集选择性地审查蛋白质组的特定区域。另外，因为适体序列提供这样大范围的可能标签，所以可以同时审查蛋白质组的多个离散区域。
在又一个实施方案中，可以用复杂样品考验适体组或池。然后可以洗脱结合级分，并针对第二份不同样品再探查。然后游离的、未结合的适体反映蛋白质丰度的差异。这样，能测量例如作为患病或处理后状态的结果而发生的蛋白质丰度的变化，以及样品中出现的任何蛋白质的出现。在这些实施方案中，复杂蛋白质混合物通常是自体液(如血液、血浆或血清)得到的。
可理解的是，本发明还可用于验证生物标志物。具体而言，可以针对来自一名或多名健康个体的蛋白质样品筛选一组或一套不同适体，并与自患有感兴趣疾病的一名或多名个体采集的蛋白质样品比较。
因为可以同时对多种蛋白质定量，所以本发明高度适应高通量分析，由此显著降低生物标志物验证通常所需要的成本和时间。
本发明关于验证蛋白质生物标志物的一项优势是可使用适体来代替抗体。特异性抗体的生成是昂贵的，而且并非总是成功的。另一方面，通常可能对给定过程生成选择性适体，而且该过程快速且便宜得多。在使用时，针对复杂蛋白质混合物测定对特定感兴趣蛋白质特异性的一种或多种适体。与患病样品中的结合相比健康样品中适体结合的缺失(或反之亦可)可以通过适体计数来阐明。再次，无需对蛋白质样品进行操作，而且蛋白质本身不需要鉴定。另外，可以在一项实验中针对多种感兴趣蛋白质测定多种适体。
通过能够审查蛋白质的全集(full complement)，本发明的方法还可用于建立个体中蛋白质的构象和丰度的图像。也就是，提供患者的蛋白质组成的序型或图谱。例如，可以使用前列腺特异性抗原(PSA)的图像来建立前列腺癌的预后和诊断，以及提供疾病进展的指示。
又例如，如果发现患者具有某种蛋白质变体，那么关于患者的蛋白质序型的信息可用于评估疾病预后或易感性，而且可用于帮助为患者开发个性化治疗方案。例如，在他们的CCR5基因中携带特定突变的人可生成CCR5受体变体。这些受体变体不结合HIV，因此携带受体变体的人变成HIV+及因此进展至AIDS的机会较低。
通过确定相同样品的复制品之间的变异，以及自不同个体获得的样品之间的变异，本发明还可用于测定适体对单一分子(如蛋白质)的特异性。
本发明的用途还在于诊断法。具体而言，已知鉴定经过验证的生物标志物的一种或多种适体可简单地用于审查自个体采集的体液，如血液或血清。因为适体的结合指示了蛋白质的存在，所以可以使用一组适体来鉴定已知在异常状态中发生改变的一种或一组生物标志物蛋白质。例如，可以使用序型分析来针对已知基线评估特定蛋白质的数量。此类用途的例子有作为妊娠测试或PSA水平测试的用途。又例如，败血症是一种异常状态，其中已知许多因子根据败血症的类型和感染的阶段而上调或下调。
此类诊断法可以是试剂盒的形式，其包括一组适体，该适体的结合指示自个体衍生的生物学样品中已知对特定异常状态特异性的生物标志物的存在。
在另一个实施方案中，本发明可用于测定疾病进展。例如，败血症中的生物标志物样式在感染过程里有变化。鉴定生物标志物作为败血症进展指示剂会大大有助于制定适宜的治疗方案。
本发明还容许进行患者序型分析，其又可用于指导治疗方案和可能的预防处理。
如此，本发明提供了单一平台，在该平台上可实现多种输出。
在又一个方面，本发明涵盖克隆或单一分子阵列用于适体测序和计数的用途。
发明人认识到可以理想地对适体进行适应性修改，以增强它们与下一代DNA测序平台的相容性。因此，可以增强适体，从而能够使用此类技术平台来进行适体测序和鉴定。如此，从另一方面看，本发明涵盖包含适体序列和衔接头序列的能够测序的适体。衔接头序列包含如下的序列，该序列使适体能够附接于表面，从而能够对适体测序。
能够测序的适体可以另外包含用于对适体测序的测序引物。
此类构建物可以包括超过一个测序和附着衔接头。例如，适体序列可以夹在退火至适体序列每个末端的测序和附着衔接头对之间。
能够测序的适体还可以包含标记物，从而能够进行适体显现。可理解的是，可以使用任何合适的标记物，包括荧光标记物和放射性标记物。
本发明的能够测序的适体可以在上文所述方法、用途、和诊断试剂盒中使用。
附图说明
下面经由非限制性实施例来描述本发明，其中：
图1图示了本发明的方法，其中将适体序列文库与血清蛋白质组混合。洗脱结合的适体/蛋白质级分，之后在第二代测序仪上测序和计数。来自测序仪的输出是结合的级分中存在的每种序列的数目。
图2图示了该方法用于生物标志物发现的用途，其中将来自不同患者的蛋白质组与基线或对照比较。
图3图示了本发明的一个备选实施方案中，其中将适体文库与第一血清蛋白质组样品混合。对结合的级分定量后，扩增血清样品内与感兴趣蛋白质结合的适体群体并与第二血清蛋白质组样品混合。然后进行第一和第二相应定量输出的比较。
图4的层析图显示了将等体积的150nM IgE和100nM ProNuc1FR温育30分钟后获得的混合物的不同成分。
图5显示了与恒定的(100nM)ProNuc1F浓度一起温育的0/20/40…2000nM IgE(自底部至顶部)的CE层析图。
图6的图显示了对不同蛋白质浓度作图的结合的ProNuc1F的级分。
图7是适体的下一代测序的适应样品制备方案的示意图。
图8的图显示了使用两种不同分析方法找回的IgE适体序列的绝对计数。
图9的图显示了针对掺入无关(PhiX)序列混合物中的序列数目绘图的通过下一代测序计数得到的、序列混合物中存在的IgE适体序列的级分。
实施例
实施例1
此实施例图示于图1，其显示了使用适体标签文库对血清样品中的蛋白质定量。针对自血清得到的蛋白质混合物筛选已知适体的多样性文库。在固体支持物上固定化蛋白质混合物并实施严格清洗以清除未结合的和弱结合的适体。
然后自它们的蛋白质宿主清除剩余的结合的适体，并在下一代测序仪上测序和计数。排列后，可通过标准方法(如PCR)来扩增结合的适体序列以提高测序仪上信号相对于背景噪声的清晰度。
来自测序仪的输出会是如由适体文库呈现的、生物学样品中存在的蛋白质的绝对定量。
实施例2
对于在生物标志物发现中的用途和如图2所示，针对自不同个体得到的样品筛选适体文库。还会要求合适数目的已知对照或健康样品来建立基线或健康状况。还会筛选一定数目的、已知呈现疾病状态的样品。两个群体(健康的对患病的)的比较会容许鉴定在两个群体间显示显著变化的适体。一旦阐明每种适体的序列，就可鉴定适体所结合的蛋白质。蛋白质的鉴定可以通过下一代测序技术或基于蛋白质组的方法(如层析和MS)来进行。
实施例3
此实施例描述了本发明的一种备选方法且图示于图3。
针对第一生物学样品筛选适体文库。与实施例1或实施例2一样，清除未结合的适体，自它们的宿主蛋白质释放剩余的结合的适体，并在下一代测序仪上测序和计数。
然后针对第二生物学样品筛选结合至第一样品中蛋白质的序列群。如前所述，丢弃未结合的适体，并对剩余的适体测序和计数。如果这两份样品是自健康受试者得到的，那么这两份样品之间的任何变化可归于正常群体内的变异。类似的，自已知患有特定疾病的患者得到的两份样品的输出之间的任何变化也可归因于变异。然而，健康受试者与患病受试者之间的任何显著变异可归因于由感兴趣疾病引起的蛋白质群体的变化。然后可以翻译其中找到显著变化的适体序列以鉴定适体所结合的蛋白质。
实施例4
在此实施例中，适体文库包含至少一个对一种蛋白质特异性的适体集合。同样地，该组可含有多个适体集合，其中每个集合是对不同蛋白质特异性的。
蛋白质混合物可以仅仅是生物学样品，如血液或血清。或者，蛋白质混合物可以是通过对生物学样品富集蛋白质级分而获得的。在此实施例中，必须小心使对蛋白质群体的破坏和变性最小化。
针对蛋白质混合物筛选已知的、选定的适体序列的文库。在一个例子中，使蛋白质混合物结合至柱，并让该组适体流过柱。清除不结合的适体。自它们的蛋白质宿主移出结合的适体，并在下一代测序仪上测序和计数。
如果感兴趣的蛋白质确实是疾病状态的生物标志物，那么适体可见于来自患病样品的结合级分且不见于自健康个体得到的样品。或者，蛋白质作为生物标志物的作用可表现为与健康受试者相比时患病个体中蛋白质的上调或下调。
实施例5
在此实施例中，适体文库含有已知对一种或多种蛋白质特异性的一种或多种序列。每种感兴趣蛋白质的身份也是已知的。文库可包含对单一蛋白质特异性的单一集合，或者它可以包含对多种(an array of)蛋白质特异性的多个集合。
针对自个体得到的生物学样品(如血液)筛选适体文库。可以在支持物上保持适体文库，并且生物学样品通过适体。清除任何未结合的蛋白质，并且保留适体:蛋白质复合物。自它们的蛋白质宿主释放保留的适体，并在下一代测序仪上测序和计数。
可以使用下一代测序仪上适体的存在和数量、或者缺失来诊断特定疾病或困境(predicament)。
实施例6
设计了一种新的寡核苷酸适体，使得该适体与所使用的下一代DNA测序技术平台相容。
该适体具有如下的寡核苷酸序列，其具有三个独特区：a)功能性适体区，b)衔接头区，和c)标记物。
此研究中的适体区基于经过充分研究的、对人免疫球蛋白E具有高亲和力的适体(Wiegand等Journal of Immunology(1996)157 221-230)。
衔接头区使得该构建物与Illumina GA1下一代测序仪的样品制备规程相容，而且是依照制造商的方案设计的。
标记物是发荧光的6-羧基荧光素(FAM)，包括它是为了容许显现构建物。
构建物通过标准固相DNA合成获得，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化以确保低错误率。
带FAM标记物的构建物在下文中称作ProNuc1F，而不带标记物的称作ProNuc1。
构建物用来证明：
i)此类适体衍生的单链寡核苷酸序列与用于下一代DNA序列应用的样品制备规程相容；
ii)使用Illumina GA1测序技术能对序列测序，即能找回(“读取”)ProNuc1的身份；及
iii)遵循标准Illumina GA1测序实验，完整ProNuc1序列的计数直接与掺入样品中的制备的ProNuc1序列的数目关联，由此证实下一代测序能依照本发明应用于蛋白质组学。
实施例7
使用毛细管电泳(CE)来证实寡核苷酸序列展现独特的蛋白质亲和力。
试剂和溶液的制备
如下自干的适体来源制备储备100nM ProNucF1储液，即在TGK缓冲液(三(羟基氨基)甲烷-甘氨酸-钾)缓冲液,pH8.4)中稀释DNA材料。稀释后，将适体储液于75℃温育10分钟，随后冷却，并在冰中储存以确保没有多聚体。加热规程还确保适体二级结构的形成。
自浓缩的5500nM蛋白质储液开始，在TGK缓冲液中制备IgE的稀释系列(表1)：
表1：IgE稀释系列
Figure BDA00002818884800181
通过将5μl的ProNucF1储液与5μl蛋白质溶液一起温育来制备展现适体-蛋白质复合物形成的CE样品。以此方式为每个蛋白质浓度水平制备总共六份复制品。将所有样品于室温温育最少30分钟且不长于40分钟。
设备
分离是使用Beckman P/ACE 2200 CE-LIF系统(Beckman-Coulter,Fullerton,CA,USA)实现的。分离是使用熔融硅石毛细管(50μm ID，360μmOD)实施的，总长40.2cm，检测仪位于30cm。通过泵入1M NaOH、去离子H2O、和缓冲液穿过毛细管，每种10分钟，预处理毛细管。在每次电泳分离之间，用碱、水、和缓冲液再次冲洗毛细管以自毛细管壁清除任何残留样品。使用1psi压力注射样品4s。LIF检测器采用3mW Ar离子激光的488nm线(Beckman-Coulter)进行激发，并经由520±10nm滤光片收集发射。用P/ACE软件(Beckman-Coulter)记录并分析数据。
蛋白质-适体结合
以正常模式使用表2所述条件在柱上运行每个蛋白质浓度水平的样品，首先确保每份样品温育后确实形成了蛋白质-适体复合物。
表2：正常模式分离条件
Figure BDA00002818884800191
结果
作为例子，图4显示了含有150nM IgE和100nM ProNuc1F的样品的正常模式注射的层析图。
为了使适体-蛋白质复合物形成适用定量目的，结合的适体级分必须反映蛋白质稀释系列。为了证明这一点，将恒定量的ProNuc1F与不同蛋白质浓度一起温育(见上文)。
自图5可见，随着蛋白质浓度升高(底部记录线“0”；上部记录线5000nM)，适体-蛋白质复合物的峰面积增大。同时，游离ProNuc1F的信号降低至检测不到游离适体的点(上部记录线)。这显示了向针对IgE的已知适体序列添加对下一代测序规程特异性的衔接头序列没有削弱ProNuc1F的适体能力-ProNuc1F保持其对IgE的高和选择性亲和力。
图6显示了转换成图的图5信息，其中将“结合的ProNuc1F级分”对蛋白质浓度绘图。自此图可见，ProNuc1F适体能用于“读取出”定量蛋白质信息。自此(和其它)图还有可能推导平衡解离常数Kd，由其可得知ProNuc1F对IgE的亲和力，即76-92nM。
实施例8
进行了实验来证明在前实施例中所例示的结合特征在定量背景中是适用的，即蛋白质浓度的差异与结合的适体(适体-蛋白质复合物)级分相关。对这些适体-蛋白质复合物的选择是依靠平衡混合物的不平衡毛细管电泳(NECEEM)来实现的，NECEEM是由Krylov等开发的(Journal of the American ChemicalSociety(2002)124 13674-13675;Analytical Chemistry(2003)75 1382-1386)。
方法
开发了适应样品制备方案以容许对含有添加的测序序列的功能性IgE适体(ProNuc1)测序。
图7描绘了样品制备方案中的不同步骤。测序引物位点1上引物1退火后，通过用Taq聚合酶进行的延伸形成双链分子。将衔接头连接至双链分子，生成完整分子。
此研究中所使用的IgE适体序列是在其3’端具有测序引物位点1的单链寡核苷酸。为了制备互补链，使加尾(tailed)引物与引物1退火，并使用Taq聚合酶实施延伸。
此反应的配方为：
Figure BDA00002818884800201
将反应物混合并加热至94℃达2分钟，接着受控冷却至60℃并于72℃温育10分钟。使用Qiagen MinElute柱按照制造商的说明清洁反应产物，并在10μlEB缓冲液中洗脱。
通过加热至94℃达2分钟并受控冷却至室温，将100μM ProAd1和ProAd2衔接头溶液各20μl在总体积50μl 10mM Tris-HCl pH8.3中一起退火。ProAd1和ProAd2是自Illumina GA1试剂盒得到的合成寡核苷酸。
所使用的混合物为：
将反应物混合并于室温温育15分钟，之后在2%琼脂糖中进行凝胶电泳。自凝胶切出适宜大小的条带，提取DNA，并遵循标准Illumina富集PCR方案进行扩增。
使用Agilent Bioanalyzer 2100对PCR扩增子定量，并通过如下制备测序反应物：将这些扩增的适体添加至恒定量的PhiX，意图产生表3给出的IlluminaGA1簇数目/格(tile)，以产生2x稀释系列。第4道是没有添加适体的PhiX，充当对照道。
为了避免怀疑，PhiX指双链DNA PhiX174噬菌体的环状基因组，其由5386个核苷酸组成。在此研究中，依照Illumina GA1测序方案加工该基因组，充当不同道中序列载荷的标准化。
准备单末端流动室(single end flowcell)，并在Illumina GA1上按照制造商的说明测序。
表3：Illumina GA1流动室上八条不同道的每个格所使用的实际ProNuc1和PhiX序列数目。一条道由约300个格组成。
Figure BDA00002818884800212
结果：
按照制造商的说明加工测序数据。对于数据分析，应用不同策略来评估在不同道中获得的序列读取：a)对适体序列的精确匹配的搜索(Exact)；b)容许多至3处扩增/测序错误的搜索(Agrep)。显然也可以应用其它加工方法。图8描绘了在不同道中通过寻找在不同道中找回的精确匹配/至多三处错误的匹配，即精确适体序列计数和容错适体序列计数(Agrep)而计数得到的IgE适体绝对数。X轴的数值对应于第8道直至第1道的道读数(排除对照第4道；见表3)。
相反，图9相对于掺入PhiX序列混合物中的适体数目描绘了通过在获得的全部序列中寻找精确匹配而计数得到的IgE适体级分。在这两种情况中都显示了强线性相关性，证实了下一代测序用于对适体定量的用途。
上述数据显示了，当遵循标准Illumina GA1测序方案时，全部ProNuc1序列的计数直接与掺入样品中的制备的ProNuc1序列的数目相关，由此证实下一代测序能依照本发明用于定量。
此外，数据显示了所制备的ProNuc1序列能使用下一代测序技术来测序。换言之，能找回(“读取”)ProNuc1的身份。

Claims (43)

1.一种用于测量生物学样品中至少一种分子的量的方法，该方法包括：
a)将所述样品或其衍生物与一种或多种适体组合并容许所述样品中的一种或多种分子结合至所述适体；
b)将结合的分子与未结合的分子分开；并
c)对结合至所述或每种适体的分子定量，
其中对结合的分子的定量是通过对所述或每种适体的至少一部分测序来进行的。
2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种分子是蛋白质。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述分子的身份是已知的。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述分子的身份是未知的。
5.根据权利要求4的方法，其中该方法进一步包括确定所述分子的身份。
6.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述或每种适体的序列是已知的。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中每种适体序列携带独特的标签。
8.根据权利要求7的方法，其中所述标签是所述适体的序列。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述标签是所述适体的序列的一部分。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中测序是在单分子阵列或克隆单分子阵列上进行的。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中该方法进一步包括清除结合至所述或每种分子的所述适体并将所述适体排列在表面上。
12.根据权利要求11的方法，其中该方法进一步包括扩增所排列的适体。
13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中所述一种或多种适体包含结合相同分子的不同序列。
14.根据权利要求1-12任一项的方法，其中所述一种或多种适体包含多组适体序列，每组结合不同分子。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，其中所述适体是自多核苷酸或多肽衍生的。
16.根据权利要求15的方法，其中所述适体是多核苷酸且具有约30个至约60个碱基。
17.根据权利要求16的方法，其中所述适体具有约40个碱基。
18.根据权利要求15的方法，其中所述适体是多肽且具有约30个至约60个氨基酸。
19.根据权利要求1-18任一项的方法，其中所述生物学样品是体液。
20.根据权利要求19的方法，其中所述体液是血液或者是自血液衍生的。
21.根据权利要求20的方法，其中所述体液是血清或血浆。
22.根据权利要求1-21任一项的方法，其中该方法进一步包括：
d)将第二生物学样品与c)中获得的定量的适体组合；
e)将结合的分子与未结合的分子分开；
f)对结合至适体的分子定量；并
g)将c)中获得的数量与f)中获得的数量比较，
其中对结合至第二样品中一种或多种分子的适体的定量是通过对每种适体的至少一部分测序来进行的。
23.根据权利要求1-22任一项的方法，其中该方法进一步包括将所述或每种适体的数量与对照或基线数量比较。
24.根据权利要求22或23的方法，其中所述第二样品是自已知处于疾病状态的个体获得的。
25.根据权利要求22或23的方法，其中所述第二样品是自已知处于健康状态的个体获得的。
26.根据权利要求22或23的方法，其中所述第二样品是自药物治疗后的个体获得的。
27.权利要求1-26任一项的方法用于鉴定一种或多种生物标志物的用途。
28.权利要求1-26任一项的方法用于验证一种或多种生物标志物的用途。
29.权利要求1-21任一项的方法作为诊断方法的用途。
30.通过权利要求1-26任一项的方法鉴定的适体在诊断试剂盒中的用途。
31.以权利要求1-26任一项的方法使用的诊断试剂盒，其中该试剂盒包含一种或多种适体。
32.根据权利要求31的诊断试剂盒，其中所述一种或多种适体是通过权利要求1-26任一项的方法鉴定的。
33.适体作为标签用于对样品中的分子定量的用途，其中所述适体的序列的至少一部分是所述标签。
34.根据权利要求33的用途，其中所述分子是蛋白质。
35.根据权利要求33或34的用途，其中定量是通过对所述标签的至少一部分测序来进行的。
36.根据权利要求35的方法，其中测序是在单分子阵列或克隆单分子阵列上进行的。
37.一种能够测序的适体，其包括：
适体序列；和
至少一种衔接头序列，
其中所述衔接头序列包含供所述适体附接于表面用来测序的附着序列。
38.根据权利要求37的适体，其中所述衔接头序列进一步包含测序引物。
39.根据权利要求37或38的适体，其中所述适体序列是DNA、RNA、PNA或其混合物。
40.根据权利要求37-39任一项的适体，其中该适体进一步包括标记物。
41.根据权利要求40的适体，其中所述标记物是放射性标记物或者是发荧光的。
42.根据权利要求41的适体，其中所述标记物是6-羧基荧光素。
43.权利要求37-42任一项的适体在权利要求1-26任一项的方法或权利要求31或32的诊断试剂盒中的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107430130A (zh) * 2014-11-24 2017-12-01 吉尼维拉基公司 方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101896605A (zh) 2007-10-12 2010-11-24 普罗诺塔股份有限公司 适体在蛋白质组学中的用途
EP2589657A4 (en) * 2010-07-01 2014-04-23 Nat Inst Of Advanced Ind Scien METHOD FOR DETECTING TARGET MOLECULE
WO2013119260A1 (en) * 2011-03-30 2013-08-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Cross-reactive sensor arrays and methods of uses
US20120248666A1 (en) * 2011-03-30 2012-10-04 Firestone Industrial Products Company, Llc Gas spring and damper assembly and suspension system including same
IN2014DN06796A (zh) * 2012-02-15 2015-05-22 Oxford Nanopore Tech Ltd
EP4170031A1 (en) 2012-10-23 2023-04-26 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
EP2935628B1 (en) 2012-12-19 2018-03-21 Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH Compositions and methods for aptamer screening
GB201304810D0 (en) * 2013-03-15 2013-05-01 Isis Innovation Assay
US20140315727A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Base Pair Biotechnologies, Inc. Method for multiplexed molecular detection
US10546650B2 (en) 2015-10-23 2020-01-28 Google Llc Neural network for processing aptamer data
EP3427060A4 (en) 2016-03-07 2019-12-18 CFGenome, LLC NON-INVASIVE MOLECULAR WITNESSES
WO2018084594A1 (ko) * 2016-11-02 2018-05-11 김성천 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도
EP3554681B1 (en) 2016-12-16 2022-02-02 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Method for protein corona sensor array for early detection of diseases
US20210072255A1 (en) 2016-12-16 2021-03-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. System and method for protein corona sensor array for early detection of diseases
WO2018150030A1 (en) * 2017-02-20 2018-08-23 Neoneuro Aptamer as biomarkers
US11072816B2 (en) * 2017-05-03 2021-07-27 The Broad Institute, Inc. Single-cell proteomic assay using aptamers
CN112840024A (zh) * 2018-08-03 2021-05-25 贝克顿迪金森公司 单细胞中的核条形码化和捕获
AU2019374692A1 (en) 2018-11-07 2021-06-03 Seer, Inc. Compositions, methods and systems for protein corona analysis and uses thereof
KR20220078560A (ko) 2019-08-05 2022-06-10 시어 인코퍼레이티드 샘플 제조, 데이터 생성, 및 단백질 코로나 분석을 위한 시스템 및 방법

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309822B1 (en) * 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
CA2100860C (en) * 1991-01-18 2003-11-25 Joseph Schlessinger A receptor tyrosine kinase target protein cdna cloning method and hgrb proteins
US20070166741A1 (en) * 1998-12-14 2007-07-19 Somalogic, Incorporated Multiplexed analyses of test samples
DE69928265T3 (de) * 1998-07-30 2013-11-28 Illumina Cambridge Ltd. Matrizen von biomolekülen und ihre verwendung in sequenzierung
US7074586B1 (en) * 1999-06-17 2006-07-11 Source Precision Medicine, Inc. Quantitative assay for low abundance molecules
JP2004527220A (ja) * 2000-09-13 2004-09-09 アルケミックス コーポレイション 標的活性化核酸バイオセンサーおよびその使用方法
EP3252139A1 (en) * 2001-09-06 2017-12-06 Rapid Micro Biosystems, Inc. Rapid detection of replicating cells
US20030219801A1 (en) * 2002-03-06 2003-11-27 Affymetrix, Inc. Aptamer base technique for ligand identification
CA2749227A1 (en) 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
EP1599597B1 (en) * 2003-02-24 2010-08-04 Pritest, Inc. Translucent solid matrix assay device for microarray analysis
US7329742B2 (en) * 2003-09-04 2008-02-12 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
EP1700912B1 (en) * 2003-11-22 2014-10-29 Techno Medica Co., Ltd. Method of detecting target molecule by using aptamer
US20080261204A1 (en) 2004-01-23 2008-10-23 Lingvitae As Polynucleotide Ligation Reactions
WO2007044071A2 (en) 2005-04-21 2007-04-19 Exact Sciences Corporation Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
WO2006128010A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 The Trustees Of Boston University Quantification of nucleic acids and proteins using oligonucleotide mass tags
JP4706019B2 (ja) * 2005-07-08 2011-06-22 国立大学法人東京農工大学 アプタマーの同定方法
WO2007032359A1 (ja) * 2005-09-12 2007-03-22 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出方法
WO2007087312A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Molecular counting
US8492084B2 (en) * 2006-01-24 2013-07-23 Koji Sode Method and apparatus for assaying test substance in sample
EP2018622B1 (en) 2006-03-31 2018-04-25 Illumina, Inc. Systems for sequence by synthesis analysis
CN101896605A (zh) * 2007-10-12 2010-11-24 普罗诺塔股份有限公司 适体在蛋白质组学中的用途
CN102277353B (zh) 2007-10-22 2014-12-31 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 选择适配体的方法
US10361349B2 (en) * 2017-09-01 2019-07-23 Cree, Inc. Light emitting diodes, components and related methods

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107430130A (zh) * 2014-11-24 2017-12-01 吉尼维拉基公司 方法

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