JP2011500012A - プロテオミクスにおけるアプタマーの使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
a)前記試料又はその誘導体を1個以上のアプタマーと組み合わせ、そして前記試料中の1個以上の分子を前記アプタマーと結合させること;
b)結合分子を非結合分子から分離すること;及び
c)当該アプタマー又は各アプタマーに結合した分子を定量化すること、
を含み、
前記結合分子の定量化は当該アプタマー又は各アプタマーの少なくとも一部の配列決定により行われることを特徴とする方法、に関する。
本実施例は、アプタマータグのライブラリーを使用した血清試料中のタンパク質の定量化を示す図1に説明されている。既知のアプタマーの種々のライブラリーを血清から取り出されたタンパク質混合物に対して選別する。タンパク質混合物を固体の支持体上に固定しそして厳密な洗浄を行なって、非結合アプタマーおよび結合の弱いアプタマーを除去する。
バイオマーカーの発見での使用のためそして図2に示される通り、アプタマーライブラリーを様々な個人から取り出された試料に対して選別する。適当数の既知の対照又は健康な試料もまた、基準値又は健康条件を確立するために必要とする。病気の状態を示すと知られた多数の試料もまた選別する。健康対病気の2つの集団の比較により、この2つの集団間の著しい変化を示すアプタマーの同定が可能になる。当該アプタマー又は各アプタマーの配列が一旦解明されると、該アプタマーが結合するタンパク質が次に同定され得る。タンパク質の同定は、次世代配列決定技術によるか又はクロマトグラフィやMSなどのプロテオームに基づく方法によってよい。
本実施例は本発明の別の方法を説明し、そして図3に図示されている。
本実施例においては、アプタマーライブラリーは1個のタンパク質に特異的アプタマーの少なくとも1つのプールを含む。同様に、パネルは、各プールが異なるタンパク質に特異的である、アプタマーの多数のプールを含み得る。
本実施例においては、アプタマーのライブラリーは1個以上のタンパク質に特異的であると知られた1つ以上の配列を含む。興味深い当該タンパク質又各タンパク質の正体もまた既知である。該ライブラリーは単一のタンパク質に特異的な単一のプールを含みうるか、又はそれはタンパク質のアレイに特異的な多数のプールを含みうる。
新規のオリゴヌクレオチドアプタマーを該アプタマーが使用された次世代DNA配列決定技術プラットフォームに適合するようにデザインした。
i)そのようなアプタマーより取り出された一本鎖のオリゴヌクレオチド配列は次世代DNA配列用途に用いられる試料調製手順に適合する、
ii)前記配列はイルミナGAI配列決定技術を用いて配列決定できる、即ち、ProNuc1の正体が引き出される(「読まれる」);そして
iii)ProNuc1配列全体の計数は、標準イルミナGAI配列決定実験に従い、試料に入れた調製されたProNuc1配列の数と直接的に相関し、それにより次世代配列決定が本発明によるプロテオミクスに適用し得ることを確認する。
オリゴヌクレオチド配列が特徴的なタンパク質親和性を示すことを確認するためにキャピラリー電気泳動法(CE)を使用した。
DNAの材料をTGK緩衝液(トリス(ヒドロキシアミノ)メタン−グリシン−カリユウム緩衝液)、pH8.4、に希釈することにより、乾燥アプタマー供給源からProNucF1(ママ)の原料100nMの原液を調製した。希釈に続き、このアプタマー原液を75℃で10分間培養し、続いて氷中で冷却及び貯蔵して、マルチマーの不在を確実にした。加熱手順もアプタマーの二次的構造の形成を確実にする。
分離はベックマン(Beckman)P/ACE2200 CE−LIFシステム(ベックマン−コールター(Beckman−Coulter)、アメリカ合衆国カリフォルニア州フラートン)を使用して達成した。分離は、検出器を30cm距離で、全長40.2cmの溶融シリカ毛細管(50μm ID、360μm OD)を使用して行った。毛細管は、1M NaOH、脱イオン化されたH2O及び緩衝液を各々10分間ずつ該毛細管にポンプで送り込むことにより前処理した。各々の電気泳動分離の間に、毛細管を塩基、水及び緩衝液で再びすすいで毛細管壁からいずれの残存試料をも除去した。試料は1psiで4秒間圧力を用いて注入した。LIF検出器は、励起のために3mWのアルゴン−イオンレーザー(Beckman−Coulter)の488nmラインを用い、そして発光を520±10nmのフィルターで集めた。データを記録し、そしてP/ACEソフト(Beckman−Coulter)を用いて分析した。
タンパク質−アプタマー複合物が各試料の培養後に実際に形成されたことをまず確実にするために、各タンパク質濃度レベルでの試料を(表2)に記載された条件を用いてノーマルモードでカラム上を流した。
一例として、150nMのIgE及び100nMのProNuc1Fを含有する試料についてのノーマルモード注入のためのクロマトグラムを図4に示す。
前記実施例に説明された結合特性は定量化との関連で適用可能であること、即ち、タンパク質濃度における差が結合アプタマーの画分(アプタマー−タンパク質複合体)と相互関係を有すること、を実証するために実験を行った。これらアプタマー−タンパク質複合体の選択は、クリロフ(Krylov)他(米国化学協会ジャーナル(Journal of the American Chemical Society)(2002)124 13674−13675;分析化学(Analytical Chemistry)(2003)75 1382−1386)によって開発された平衡混合物の非平衡(NECEEM)のキャピラリー電気泳動を用いて達成した。
加えられた配列決定配列(ProNuc1)を含む官能性IgEアプタマーの配列決定を可能にするために、適合した試料調製プロトコルを開発した。
配列決定データを製造業者の指示に従って処理した。データ分析のために、異なるレーンで得られた配列の読み出しを評価するため異なる戦略を適用した:a)アプタマー配列への完全な一致の探索(正確)、b)3つまでの増幅/配列決定誤差が許容される探索(アグレップ(Agrep))。他の処理方法も適用しうることが明らかである。図8は、異なるレーンで引き出された正確な一致/3つまでの誤差のある一致、即ち正確なアプタマー配列計数と誤差許容のアプタマー配列計数(アグレップ)、を探すことにより、異なるレーンで計数されたIgEアプタマーの絶対数をプロットする。X軸での値はレーン8から1にいたるまでのレーンの読み出しに相当する(対照レーン4は除外されている;表3参照)。
Claims (43)
- 生物試料中の少なくとも1個の分子の量を測定する方法であって、
a)前記試料又はその誘導体を1個以上のアプタマーと組み合わせ、そして前記試料中の1個以上の分子を前記アプタマーと結合させること;
b)結合分子を非結合分子から分離すること;及び
c)当該アプタマー又は各アプタマーに結合した分子を定量化すること、
を含み、
前記結合分子の定量化は当該アプタマー又は各アプタマーの少なくとも一部の配列決定により行われることを特徴とする方法。
- 前記少なくとも1個の分子がタンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記分子の正体が既知であることを特徴とする、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記分子の正体が未知であることを特徴とする、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記方法は更に前記分子の正体を決定することを含むことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 当該アプタマー又は各アプタマーの配列が既知であることを特徴とする、請求項1ないし請求項4のいずれか1項に記載の方法。
- 各アプタマー配列が固有のタグを有することを特徴とする、請求項1ないし請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タグが前記アプタマーの配列であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記タグが前記アプタマーの配列の一部であることを特徴とする、請求項7又は請求項8に記載の方法。
- 配列決定が単一分子アレイ又は単一クローン分子アレイ上で行われることを特徴とする、請求項1ないし請求項9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は当該分子又は各分子に結合した前記アプタマーを除去しそして該アプタマーを表面に配置することを更に含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は配置したアプタマーを増幅することを更に含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記1個以上のアプタマーは同一分子に結合する異なる配列を含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1個以上のアプタマーはアプタマー配列のパネルを含み、各パネルは異なる分子に結合することを特徴とする、請求項1ないし請求項12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーはポリヌクレオチド又はポリペプチドに由来することを特徴とする、請求項1ないし請求項14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーはポリヌクレオチドでありそして約30個ないし約60個の塩基を有することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 前記アプタマーは約40個の塩基を有することを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記アプタマーはポリペプチドでありそして約30個ないし約60個のアミノ酸を有することを特徴とする、請求項15に記載の方法
- 前記生物試料は体液であることを特徴とする、請求項1ないし請求項18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記体液は血液であるか又は血液に由来することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 体液は血清又は血漿であることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
- 前記方法は:
d)第2の生物試料をc)で得た定量化されたアプタマーと組み合わせること;
e)結合分子を非結合分子から分離すること;
f)アプタマーに結合した分子を定量化すること;及び
g)c)で得た量をf)で得た量と比較すること、
を更に含み、
前記第2の試料中の1個以上の分子に結合したアプタマーの定量化は、各アプタマーのすくなくとも一部の配列決定により行うことを特徴とする、請求項1ないし請求項21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記方法は当該アプタマー又は各アプタマーの量を対照又は基準量と比較することを更に含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の試料は病気の状態にあると知られた個人から得られたことを特徴とする、請求22又は請求項23に記載の方法。
- 前記第2試料は健康な状態にあると知られた個人から得られたことを特徴とする、請求項22又は請求項23に記載の方法
- 前記第2の試料は薬物療法後の個人から得られたことを特徴とする、請求項22又は請求項23に記載の方法。
- 請求項1ないし請求項26のいずれか1項に記載の方法の、1つ以上のバイオマーカーを同定するための使用。
- 請求項1ないし請求項26のいずれか1項に記載の方法の、1つ以上のバイオマーカーの妥当性を確認するための使用。
- 請求項1ないし請求項21のいずれか1項に記載の方法の診断法としての使用。
- 請求項1ないし請求項26のいずれか1項に記載の方法により同定されたアプタマーの、診断キットにおける使用。
- 請求項1ないし請求項26のいずれか1項に記載の方法と共に使用するための診断キットであって、1個以上のアプタマーを含むことを特徴とするキット。
- 前記1個以上のアプタマーは請求項1ないし請求項26のいずれか1項に記載の方法により同定されたこと特徴とする、請求項31に記載の診断キット。
- 試料中の分子を定量化するためのタグとしてのアプタマーの使用であって、前記アプタマーの配列の少なくとも一部が前記タグであることを特徴とする使用。
- 前記分子はタンパク質であることを特徴とする、請求項33に記載の使用。
- 定量化は前記タグの少なくとも一部の配列決定により行われることを特徴とする、請求項33又は請求項34に記載の使用。
- 配列決定は単一分子アレイ又は単一クローン分子アレイ上で行われることを特徴とする、請求項35に記載の使用。
- 配列決定に使用可能なアプタマーであって、
アプタマー配列;及び
少なくとも1つのアダプター配列、を含み、
前記アダプター配列は配列決定用の表面への該アプタマーの付着のための付着配列を含むことを特徴とするアプタマー。 - 前記アダプター配列は更に配列決定プライマーを含むことを特徴とする、請求項37に記載のアプタマー。
- 前記アプタマー配列はDNA,RNA,PNA又はそれらの混合物であることを特徴とする、請求項37又は請求項38に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーは更にラベルを含むことを特徴とする、請求項37ないし請求項39のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記ラベルは放射性標識であるか又は蛍光性であることを特徴とする、請求項40に記載アプタマー。
- 前記ラベルは6−カルボキシフルオレセインであることを特徴とする、請求項41に記載のアプタマー。
- 請求項1ないし請求項26のいずれか1項に記載の方法あるいは請求項31又は請求項32に記載の診断キットにおける、請求項37ないし請求項42のいずれか1項に記載のアプタマーの使用。
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