KR20160080165A - 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법 - Google Patents

퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160080165A
KR20160080165A KR1020140191645A KR20140191645A KR20160080165A KR 20160080165 A KR20160080165 A KR 20160080165A KR 1020140191645 A KR1020140191645 A KR 1020140191645A KR 20140191645 A KR20140191645 A KR 20140191645A KR 20160080165 A KR20160080165 A KR 20160080165A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
sequence
unmethylated
methylated
promoter
Prior art date
Application number
KR1020140191645A
Other languages
English (en)
Inventor
황성주
박명규
박민구
이지원
Original Assignee
주식회사 휴젠바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 휴젠바이오 filed Critical 주식회사 휴젠바이오
Priority to KR1020140191645A priority Critical patent/KR20160080165A/ko
Publication of KR20160080165A publication Critical patent/KR20160080165A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/164—Methylation detection other then bisulfite or methylation sensitive restriction endonucleases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로 퇴행성 뇌질환과 관련된 유전자의 메틸화 수준을 측정하기 위한 조성물과 이를 통해 측정된 메틸화 수준으로부터 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 및 크로이츠펠트-야콥병 등과 같은 퇴행성 뇌질환을 조기에 진단하고자 하는 방법이다.

Description

퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법{Neurodegenerative disease diagnostic composition and method using the same}
본 발명은 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로 퇴행성 뇌질환과 관련된 유전자의 메틸화 수준을 측정하기 위한 조성물과 이를 통해 측정된 메틸화 수준으로부터 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 및 크로이츠펠트-야콥병 등과 같은 퇴행성 뇌질환을 조기에 진단하고자 하는 방법이다.
보건복지부의 통계에 따르면 65세 이상 노인의 치매 유병률은 9.18%이었다. 이전 4년간 65세 이상 치매환자 증가율은 26.8%로 같은 기간 노인 인구 증가율 17.4%를 9% 이상 상회하였다. 급속한 고령화로 치매 유병률은 계속 상승하여 매 20년마다 약 2배씩 증가하여 2020년에는 65세 이상의 약 10%가 치매환자로 예상되고 있다(보건복지부, 2012년 치매유병률 조사).
알츠하이머성 치매는 전체 치매의 약 70%에 해당하며 가장 대표적인 퇴행성 뇌질환이다. 알츠하이머성 치매의 신경병리학적 특징은 베타 아밀로이드(beta amyloid, Aβ) 단백질이 응집되어 언어기능을 관장하는 측두엽과 공간, 감각 기능을 관장하는 두정엽에서 플라그 형태로 침착된다는 것이다. 또한 뉴런 신경세포의 미세소관을 지지하는 타우(tau) 단백질이 풀리면서 엉키게 되고 신경섬유다발이 손상되어 진행될수록 병변은 뇌 전체로 퍼져 나가게 된다.
임상적으로 유용한 뇌질환 진단용 바이오 마커의 숫자는 매우 적다. 주된 원인은 뇌-혈류 장벽에 기인한다. 혈류로부터 위해 물질의 뇌 유입을 방지하는 반면 뇌로부터 생체분자들의 출입도 제어하기 때문이다[J. Alzheimers. Dis. (2011) 25:505-515]. 뇌척수액이 매일 혈류로 유입이 되지만 저분자량의 단백질, 펩티드, 리피드 단백질들만이 혈류로 유입된다. 알츠하이머성 치매 환자의 혈액에서 타우 단백질과 아밀로이드 베타 단백질의 바이오마커로서의 변별력을 검토한 다수의 연구가 수행되었으나, 타우 단백질은 민감도가 떨어지며 아밀로이드 베타 단백질은 혈류에서 다양한 단백질들과 결합되어 있어 진단적 유용성이 추가적으로 검증되어야 한다[J. Neural Trasm. (2009) 116:913-920].
혈액으로부터 퇴행성 뇌질환 진단용 바이오 마커를 탐색하기 위한 임상연구들이 진행되고 있으며 대부분 혈액내 단백질 농도를 환자군과 동일-연령 대조군과 비교분석한 연구이다. 호주 AIBL (Australian Imaging Biomarker and Lifestyle) 연구그룹은 754명의 정상인과 207명의 알츠하이머 환자군의 혈장 단백질 151종을 정량분석한 결과, 코티솔(cortisol), 베타2 마이크로글로불린(β2 microglobulin), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) 등의 혈장 단백질이 환자군에서 유의적으로 증가하였으며 ApoE (apolipoprotein E), IL-17 (interleukin-17) 등은 감소함을 보고하였다[Arch Neurol. (2012) 69(10):1318-1325].
퇴행성 뇌질환을 조기에 진단하기 위한 상용기술과 제품도 지속적으로 개발되고 있는데, PET영상진단에 사용되는 시약 프로브, 환자로부터 채취한 뇌척수액을 이용한 단백질 농도 정량, 혈액으로부터 베타-아밀로이드 항체 정량 등 다양한 기술이 임상적으로 시도되고 있다.
제약사 Eli Lilly는 양전자 단층촬영(PET)에 사용되는 프로브(Amyvid)를 FDA로부터 허가 받았다. PET을 이용해서 환자의 뇌를 스캔할 때 보조적으로 사용되는 imaging 시약인 Amyvid는 아밀로이드 단백질 침전물에 결합하여 이의 확인을 돕는다. 그러나 가격이 미화 1,600달러로 보편적으로 활용하기에는 비용에 제약이 따른다. 또한 정상 노인층에서 약 20%는 이러한 아밀로이드 침전물이 확인이 되며 인지능력에 문제가 없다는 결과도 있어 아밀로이드 침전물만으로 알츠하이머 치매를 확진할 경우 양성 환자들이 증가하는 등 임상적 유용성을 기대할 수 없다.
스웨덴의 BioArctic Neuroscience AB사는 뇌척수액으로부터 아밀로이드 단백질과 tau단백질 농도를 정량하는 진단시약을 개발하고 있다. 그러나 치매증상의 확정 진단이 아닌 조기진단의 임상적 유용성를 가지려면 혈액에서 이들 단백질 또는 특이적 마커들을 분석할 수 있어야 한다.
그리고 미국 LabCorp. 검사기관과 한국 메디프론은 혈액에서 아밀로이드 항체를 알츠하이머 1차 진단용 시약으로 개발하고 있다. 아밀로이드 항체 단일물질에 기반한 진단은 다양한 기전으로 발생하는 퇴행성 뇌질환을 진단하기에는 충분한 변별력을 가지고 있다고 할 수 없으며 환자를 정상군으로 판정할 위음성의 가능성도 상존한다.
이에 본 발명은 퇴행성 뇌질환의 증상이 발현되기 이전이라도 높은 수준의 정확성으로 퇴행성 뇌질환을 조기에 진단할 수 있는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물과 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제; 및 (b) 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물이 제공될 수 있다.
여기서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 수준을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬(CpG island)의 메틸화 수준을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 상기 CpG 섬의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 상기 CpG 섬의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 132로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍일 수 있다.
여기서, 상기 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위(UTR) 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화 수준을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위(UTR) 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 서열번호 133 내지 서열번호 138로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a) 및 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물을 더 포함할 수 있다.
여기서, 상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 또는 이의 염일 수 있다.
여기서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 크로이츠펠트-야콥병일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면,
(a) 환자의 생물학적 시료로부터 비세포(cell-free) DNA 및 단핵구 세포의 유전체 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 비세포(cell-free) DNA와 유전체 DNA의 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)로부터 비메틸화된 사이토신 염기가 변형된 비세포(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 132로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭시키는 단계;
(d) 상기 단계 (b)로부터 비메틸화된 사이토신 염기가 변형된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 133 내지 서열번호 138로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
(e) 상기 단계 (c)의 PCR 증폭 산물 및 상기 단계 (d)의 PCR 증폭 산물의 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단 방법이 제공될 수 있다.
여기서, 상기 환자의 생물학적 시료는 혈액일 수 있다.
여기서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 크로이츠펠트-야콥병일 수 있다.
본 발명은 퇴행성 뇌질환을 혈액 기반으로 분석하여 질환 발병 가능성을 조기에 진단하는 일차 진단법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 퇴행성 뇌질한 진단용 조성물은 퇴행성 뇌질환의 발병이나 진행을 차단할 수 있는 치료제의 효능을 평가하기 위한 바이오 마커로도 활용될 수 있다.
게다가, 본 발명은 후생 유전학적 진단을 기반으로 하여 식이, 생활습관 및 환경 등과 퇴행성 뇌질환 사이의 상관 관계의 입증이 일반적으로 사용되는 SNP 기반 바이오 마커보다 용이하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 퇴행성 뇌질환 진단의 대상이 되는 유전자의 선별 과정과 선별된 유전자의 메틸화 수준의 측정을 위한 프라이머 쌍의 검증 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 뇌졸중 환자군으로부터 분리한 DNA를 주형으로 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 이용한 진단 방법에 따라 얻어진 PCR 산물의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 알츠하이머성 치매 환자군으로부터 분리한 DNA를 주형으로 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 이용한 진단 방법에 따라 얻어진 PCR 산물의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 알츠하이머성 치매 환자군으로부터 분리한 DNA를 주형으로 글로벌 DNA 마커를 분석한 고해상도 융해곡선 분석결과를 나타낸다. (1)은 LINE-1 100% 메틸화, (2)는 LINE-1 75% 메틸화, (3)은 알츠하이머 환자의 분석 시료, (4)는 LINE-1 50% 메틸화, (5)는 LINE-1 25% 메틸화 곡선을 나타낸다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함한다.
이하, 본 발명에 따른 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 일 측면에 따른 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물은 퇴행성 뇌질환 관련 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제와 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 일 실시예에 따른 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물은 (a) p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제와 (b) 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
여기서, 상기 유전자들은 퇴행성 뇌질환과 관련된 후생유전학적 진단을 위해 바이오 마커의 대상이 되는 유전자들로서, 뇌세포 사멸, 뇌세포 염증, 신경세포 분화, 허혈 기전, 지질 대사, 혈액 응고 및 내피 세포 기능 등과 관련된 기능을 가진다.
상기 유전자들은 퇴행성 뇌질환의 발병 가능성에 따라 정상 대조군에 비해 메틸화 수준이 높거나 낮을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "메틸화(methylation)"는 DNA의 사이토신(cytosine) 잔기의 5번째 탄소에 메틸기가 첨가되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "CpG 섬(CpG island)"은 CpG가 예외적으로 높은 빈도로 모여 있는 게놈 영역을 의미하며, C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 의미한다.
CpG에서, C는 사이토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 사이토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포다이에스테르 결합을 의미한다.
인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다.
실제로, CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다.
정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.
포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링 (5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신 (5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다.
5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드 (5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸 그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다.
CpG의 메틸화는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다.
또한, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. 이는 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 타이민(T)이 되기 쉽기 때문이다.
본 발명의 목적상 p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 프로모터 영역 내의 CpG의 메틸화 수준이 정상 대조군과 비교하여 상대적으로 과메틸화 및/또는 저메틸화되어 있을 경우, 퇴행성 뇌질환이 발병되었거나 발병 가능성이 높은 환자라고 진단할 수 있다.
또한, 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준이 정상 대조군과 비교하여 상대적으로 과메틸화 및/또는 저메틸화되어 있을 경우, 퇴행성 뇌질환이 발병되었거나 발병 가능성이 높은 환자라고 진단할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 유전자의 전사, 발현을 위해, RNA 중합효소 및 여러 가지 전사관련 조절인자들이 결합하는 부위로서, 유전자 발현의 양적 조절이 일어나는 유전자의 부위를 말한다.
상기에 언급된 모든 유전자의 프로모터 영역 내의 CpG의 메틸화 수준이 정상 대조군과 비교하여 상대적으로 과메틸화 및/또는 저메틸화되어 있을 경우, 퇴행성 뇌질환이 발병되었거나 발병 가능성이 높은 환자라고 보다 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 진단 대상이 되는 퇴행성 뇌질환은 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 발생하는 뇌질환을 총칭하는 개념으로 해석된다.
퇴행성 뇌질환은 대부분 발병 원인이 알려져 있지 않지만, 연관 신경계를 선택적으로 침범하며, 질병의 발병이 천천히 시작해서 지속적인 진행을 보이는 것이 특징이다.
예를 들어, 본 발명의 진단 대상이 되는 퇴행성 뇌질환은 바람직하게는 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 크로이츠펠트-야콥병일 수 있다.
다만, 상기 예에 한정되지 않으며, 추가적으로 경도인지장애, 전두측두엽치매, 루이소체 치매, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측색 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의결결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증 또는 외상후스트레스장애 등과 같은 질환을 대상으로 할 수도 있다.
여기서, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 수준을 측정하기 위한 것이다.
보다 구체적으로, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬(CpG island)의 메틸화 수준을 측정하기 위한 것이다.
여기서, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 상기 CpG 섬의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다.
상기 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 상기 CpG 섬의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 132로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍일 수 있다.
또한, 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위(UTR) 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화 수준을 측정하기 위한 것이다.
보다 구체적으로, 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위(UTR) 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적 프라이머 쌍을 포함한다.
상기 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 133 내지 서열번호 138로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍일 수 있다.
추가적으로, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)와 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물를 더 포함할 수 있다.
일반적으로 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물로는 예를 들어 소듐 바이설파이트와 같은 바이설파이트가 사용된다.
비메틸화된 사이토신 잔기를 바이설파이트를 사용하여 변형시켜 대상 유전자의 프로모터 영역 내 메틸화 여부를 검출하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면,
(a) 환자의 생물학적 시료로부터 비세포(cell-free) DNA 및 단핵구 세포의 유전체 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 비세포(cell-free) DNA와 유전체 DNA의 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)로부터 비메틸화된 사이토신 염기가 변형된 비세포(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 132로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭시키는 단계;
(d) 상기 단계 (b)로부터 비메틸화된 사이토신 염기가 변형된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 133 내지 서열번호 138로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
(e) 상기 단계 (c)의 PCR 증폭 산물 및 상기 단계 (d)의 PCR 증폭 산물의 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단 방법이 제공될 수 있다.
여기서, 단계 (a)의 생물학적 시료란 p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자와 LINE1 유전자, 보다 구체적으로 상기 유전자들의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬(CpG island)의 메틸화 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 다양한 시료를 의미한다.
상기 생물학적 시료는 바람직하게는 혈액(말초혈액) 또는 혈액 내 포함된 세포, 예를 들어, 말초혈액의 단핵구일 수 있다.
단계 (a) 내 비세포(cell-free) DNA 및 단핵구 세포의 유전체 DNA의 수득은 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, 마그네틱 비드(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, USA) 방식, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
단계 (b)에서 비세포(cell-free) DNA와 유전체 DNA의 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 것은 상기에 언급된 바에 따른, 바이설파이트, 바람직하게는 소듐바이설파이트와 같은 화합물 처리로 수행될 수 있다.
단계 (c)의 PCR 증폭은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 생명공학적 기술로서, 이 때 프라이머 쌍은 메틸화 수준의 측정 대상인 p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 보다 구체적으로 상기 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬(CpG island)의 서열에 따라 특이적으로 디자인된다.
또한, 단계 (d)의 PCR 증폭은 단계 (c)와 마찬가지로 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 생명공학적 기술로서, 이 때 프라이머 쌍은 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위 내 적어도 하나의 CpG 섬(CpG island)의 서열에 따라 특이적으로 디자인된다.
보다 상세하게는, 상기 프라이머 쌍들은 이미 메틸화된 상태로 존재하여 단계 (b)에서 바이설파이트에 의해 변형되지 않은 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍(정방향 + 역방향)과 메틸화되지 않은 상태로 존재하여 단계 (b)에서 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍(정방향 + 역방향)이다.
다른 변형예에 있어서, 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머 쌍일 수 있다.
이어서, 단계 (e)에서는 단계 (c)와 단계 (d)의 증폭 산물의 메틸화 수준을 정상 대조군 시료(예를 들어, 퇴행성 뇌질환이 발병되지 않았거나 퇴행성 뇌질환의 발병 가능성이 없는 환자로부터 취득된 시료)의 메틸화 수준과 비교하여 퇴행성 뇌질환의 발병 가능성을 진단한다.
또한, 다른 변형예에 있어서, 단계 (e)는 예를 들어 전기 영동 결과 원하는 위치에서 밴드가 검출되었는지 여부를 통해 메틸화 수준을 판단하며, 이로부터 퇴행성 뇌질환의 발병 가능성을 진단할 수도 있다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다.
퇴행성 뇌질환 환자 및 동일-연령 대조군으로부터 DNA 순수 분리
퇴행성 뇌질환 진단을 위한 바이오마커 선별을 위해 환자 및 동일-연령 대조군으로부터 검사 동의서를 구득하고 혈액 시료를 채취하였다(한양대학교 의과대학 신경외과교실). 퇴행성 뇌질환 중 알츠하이머성 치매 환자의 기본 임상정보는 하기의 표 1, 혈관성 치매 환자의 기본 임상정보는 하기의 표 2, 뇌졸중 환자의 기본 임상정보는 하기의 표 3에 기재되어 있다.
질환 구분 분류번호 성별/나이 병력 교육기간(년) 진행단계
알츠하이머성 치매 Alz-01 F/70 고혈압,당뇨 12 mild
Alz-02 M/81 고혈압,당뇨 6 mild
Alz-03 F/80 없음 6 moderate
Alz-04 F/82 고혈압,당뇨 3 moderate
Alz-05 F/79 고혈압 0,비문맹 mild
Alz-06 M/60 없음 6 moderate
Alz-07 F/61 없음 6 mild
Alz-08 F/81 없음 5 moderate
Alz-09 F/79 고혈압,당뇨 3 mild
Alz-10 M/71 고혈압 12 moderate
질환 구분 분류번호 성별/나이 병력 교육기간(년) 진행단계
혈관성 치매 VaD-01 F/74 고혈압,당뇨 0,비문맹 mild
VaD-02 F/60 없음 6 mild
VaD-03 F/79 고혈압,당뇨 0,문맹 mild
VaD-04 M/77 파킨슨,고지혈증 6 mild
VaD-05 F/78 고혈압,당뇨 0,비문맹 mild
VaD-06 M/72 고혈압 17 mild
VaD-07 M/76 고혈압 16 mild
VaD-08 M/73 고혈압 9 moderate
VaD-09 M/66 고혈압 6 mild
VaD-10 F/79 고혈압 12 mild
질환
구분		 분류번호 성별/
나이		 혈압 당뇨 HDL/LDL Triglyce-ride 흡연 유무
(개비/일)		 평소운동량 BMI 우울증
(1-5)
뇌졸중 Stroke-01 M/81 X 58/44 80 20 없음 N/A 1
Stroke-02 F/59 X 55/71 78 비흡연자 없음 25.1 1
Stroke-03 M/72 X 40/131 116 10 없음 22.2 3
Stroke-04 F/79 X X 45/84 52 비흡연자 없음 22.7 약물복용
Stroke-05 M50 33/115 138 3 없음 30.07 0
Stroke-06 F/68 X N/A N/A 비흡연자 등산,주1회 21.42 0
Stroke-07 M/66 48/66 70 비흡연자 걷기,매일 23.31 1
Stroke-08 M/70 X 70/155 67 비흡연자 걷기,매일 20.76 0
Stroke-09 F/65 X 43/70 91 비흡연자 걷기,매일 23.11 0
Stroke-10 M/66 X 44/114 46 비흡연자 헬스,매일 22.72 0
알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중 환자군 및 동일-연령 대조군으로부터 연구 동의서를 구득하고 말초 정맥혈 5cc를 K3EDTA 튜브에 채혈하였다. 각 혈액시료는 채혈 당일 실험실로 냉장 조건으로 운반하였다.
비세포(cell-free) DNA 및 유전체 DNA를 분리하기 위해 마그네틱 비드(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, USA) 방식을 사용하였다. 혈액 시료는 4,000X rpm, 10분 원심분리를 통해 혈장 및 버피 코트(buffy coat) 층을 분리하였다.
유전체 DNA 분리를 위해서는 분리한 버피 코트 약 50 μL 부피를 96-웰(well) 플레이트에 검체 수만큼 분주하였다. 이후 8-채널 피펫을 이용하여 단백질분해 시약 믹스(mix) 200 μL를 흡인하여 상기 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 피펫으로 반응액을 오르내리는 과정을 5회 반복하면서 혼합하여 반응을 촉진하였다.
이 후 마그네틱 비드가 포함된 반응액 10 μL를 첨가하고 피펫으로 혼합한 뒤 5분간 실온에서 정치한 후 마그네틱 분리기(separator)에 96-웰 플레이트를 고정하였다. 2분간 반응한 후, 비드를 제외한 상층액을 제거하였다.
그리고 단백질분해효소 K가 포함되지 않은 라이시스(lysis) 완충용액 500 μL를 첨가하고 마그네틱 비드가 균일하게 퍼지도록 피펫으로 혼합하였다. 그리고 세척 완충용액(80% 에탄올) 1 mL을 첨가하고 피펫으로 혼합한 뒤 1분간 실온에서 정치한 후 마그네틱 분리기(separator)에 고정시키고 추가로 2분간 반응하였다. 상층액을 제거하고 세척 완충용액(80% 에탄올) 1 mL을 첨가하였다.
피펫으로 반응액을 혼합한 후 2분간 실온에서 정치한 후 상층액을 제거하였다. 비드 펠렛을 5분간 건조한 후, 유전체 DNA를 용출하기 위해 용출 완충용액(10mM Tris, pH 8.0) 50 μL를 로딩하고 피펫으로 오르내리는 과정을 10회 반복하면서 실온에서 5분 반응하였다.
순수 DNA를 포함하는 상층액은 회수하여 다음 분석단계 전까지 냉동보관(-20℃)하였다.
비세포(cell-free) DNA는 혈장 200μL를 사용하고, 단백질분해 시약 믹스(mix) 500 μL 및 마그네틱 비드가 포함된 반응액 30 μL를 사용하며 나머지는 유전체 DNA 분리 절차와 동일하게 수행하였다.
후생유전학 바이오마커로서의 유전자 선별 및 프라이머 디자인
뇌세포 사멸, 뇌세포 염증, 신경세포 분화, 허혈 기전, 지질 대사, 혈액 응고, 내피세포 기능 등 퇴행성 뇌질환 발현의 병리기전에 작용하는 유전자들을 대상으로 스크리닝 대상 후보 유전자들을 선정하였다.
Gene Network Central과 같은 질병연구 데이터베이스의 simulation을 통해 correlation index 5+ 이상이면서, PubMed 연구논문을 대상으로 메타분석 시, 3개 이상의 연구기관에서 독립적인 연구결과로 퇴행성 뇌질환과 관련성이 보고된 유전자 약 150종으로 구성된 후보 유전자 풀(pool)을 구성하였다. 후보 유전자를 대상으로 1차 스크리닝 검사를 시행하였다.
알츠하이머성 치매의 연구 대상 세포주로 흔히 활용되는 SH-SY5Y 세포주(ATCC® CRL-2266™)로부터 유전체 DNA를 분리하여 알츠하이머성 치매의 양성 대조군 DNA로 사용하였다. SH-SY5Y는 인간 골수 유래 신경아세포종 세포주로서 이글? 최소 필수 배지(EMEM) 20mL을 포함하는 T-75 플라스크에서 7일 배양후 1:25 비율로 subculture하고 추가로 4일 배양하였다(37℃, 5% CO2). 이후 배양액을 원심분리(1,000 X g, 3분)하여 부유중인 세포들을 회수하였고, 플라스크에 접착되어 자란 세포들은 0.25% 트립신 용액을 첨가하여 탈착시킨 후 동일한 조건으로 원심분리하여 세포들을 회수하였다.
3 X 106 세포들의 SH-SY5Y 세포로부터 유전체 DNA를 순수 분리하였다. 또한 MMSE 인지능력 검사와 MRI 검사에서 정상으로 확인된 63세 남성의 말초 정맥혈 50cc를 채혈하였다. 이 혈액으로부터 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)를 분리하여 subculture를 수행하였고, 이 중 3 X 106 세포들로부터 유전체 DNA를 분리하여 알츠하이머성 치매 음성 대조군 DNA로 사용하였다. 상기 양성 및 음성 대조군 DNA 각 500ng을 바이설파이트 변형시킨 후, 메틸화-특이 PCR을 수행하였다.
각 유전자별 음성 대조군의 시그널 강도와 양성 대조군의 시그널 강도를 대조하였고 양성 대조군에서 메틸화 시그널 비율이 1.5배 이상 상승하거나 또는 반대로 1.5배 이상 감소된 유전자를 선정하였다.
그 결과, 뇌세포 사멸과 관련된 유전자로는 p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9 및 CASP3, 뇌세포 염증과 관련된 유전자로는 IL6, COX2, NFkB, iNOS 및 IRAK1, 신경세포 분화와 관련된 유전자로는 SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B 및 NOTCH3, 허혈 기전과 관련된 유전자로는 AP-1, PLA2 및 ERK, 지질 대사와 관련된 유전자로는 ALOX5, LPL, PDE4D 및 FABP2, 혈액 응고와 관련된 유전자로는 FBN-1, 내피세포 기능과 관련된 유전자로는 COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1 및 EDN1과 마지막으로 기타 유전자로서 LIMK1이 선정되었다.
또한, 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준 측정과 관련하여 LINE1 유전자를 Global DNA 메틸화를 측정하기 위한 대상 유전자로 선정하였다.
미국 NCBI, GenBank의 염기서열 db로부터 해당 유전자들의 프로모터 영역의 염기서열을 다운로드 받은 후 상용프로그램 Methyl Primer Express v.1(Applied BioSystems, Inc. USA) 또는 공개 프로그램/웹사이트(BiSearch, MethBLAST)를 통해 CpG 섬을 탐색하고 이로부터 특정 영역을 선별하고 메틸화-특이 PCR을 위한 올리고뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 프라이머를 디자인하였다.
비메틸화 대립유전자와 변별력을 높이기 위해 올리고뉴클레오타이드 염기 서열의 3' 쪽에 한 개 이상의 CpG 섬이 위치하도록 디자인하였으며, 메틸화 대립유전자와 비메틸화 대립유전자의 올리고뉴클레오타이드는 동일한 CpG 섬을 포함하고 융해온도(Tm) 차이를 1℃ 이내로 제한하여 특이도를 높이고자 하였다.
선정된 유전자들의 후생유전학적 분석을 위해 디자인된 프라이머 쌍의 올리고뉴클레오타이드 염기 서열(서열번호 1 내지 서열번호 132)과 유전체 DNA의 반복서열의 후생유전학적 분석을 위해 디자인된 프라이머 쌍의 올리고뉴클레오타이드 염기 서열(서열번호 133 내지 서열번호 138)은 하기의 표 4 내지 표 10에 기재되어 있다.
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
1 COL3A1(메틸화,정방향) TTT GAT TAA TAC GGT GAA ATT TCG T
2 COL3A1(메틸화,역방향) CCG AAT AAC TAA AAC TAC AAA CGC C
3 COL3A1(비메틸화,정방향) TTT GAT TAA TAT GGT GAA ATT TTG T
4 COL3A1(비메틸화,역방향) CTC CCA AAT AAC TAA AAC TAC AAA CAC C
5 COL4A1(메틸화,정방향) CGC GGC GGA TAG TTA GTT TTC
6 COL4A1(메틸화,역방향) CCT CCC CTT TAA AAC GCC G
7 COL4A1(비메틸화,정방향) TGT GGT GGA TAG TTA GTT TTT GG
8 COL4A1(비메틸화,역방향) CAA AA TCC TCC CCT TTA AAA CAC C
9 MTHFR(메틸화,정방향) TGA GAT TAG GAG TGG TTG TAG ACG A
10 MTHFR(메틸화,역방향) TAA AAA AAC GAA CCT ACA AAA CGA A
11 MTHFR(비메틸화,정방향) TGA GAT TAG GAG TGG TTG TAG ATG A
12 MTHFR(비메틸화,역방향) TAA AAA AAC AAA CCT ACA AAA CAA A
13 CDKN2A(메틸화,정방향) GAG TAG TTG GGA TTA TAG GTA TGC GT
14 CDKN2A(메틸화,역방향) ATT CTA AAA AAC CGA AAC AAA CGA A
15 CDKN2A(비메틸화,정방향) GAG TAG TTG GGA TTA TAG GTA TGT GT
16 CDKN2A(비메틸화,역방향) ATT CTA AAA AAC CAA AAC AAA CAA A
17 CDKN2B(메틸화,정방향) TTG GTT TAG TTT TTG GCG TAT GC
18 CDKN2B(메틸화,역방향) CCA ACC GAC AAA AAA TTC CGT
19 CDKN2B(비메틸화,정방향) TTT GGT TTA GTT TTT GGT GTA TGT GT
20 CDKN2B(비메틸화,역방향) AAA CCA ACC AAC AAA AAA TTC CAT T
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
21 PDE4D(메틸화,정방향) TAA TTT GGA GGG TAG TGG TTC GG
22 PDE4D(메틸화,역방향) CGA AAA ACC CGA CGT AAA ACG
23 COX2(메틸화,정방향) TTT CGG TAT TTT ATT TAA GGC GA
24 COX2(메틸화,역방향) CCA AAC GCA CAA ATT TCC G
25 ALOX5(메틸화,정방향) AGG TTT TAG TCG CGG GAA GC
26 ALOX5(메틸화,역방향) A AAA CCA AAA ATC ACG AAT CGA C
27 ALOX5(비메틸화,정방향) GG GTT AGG TTT TAG TTG TGG GAA GT
28 ALOX5(비메틸화,역방향) AAA AAA CCA AAA ATC ACA AAT CAA C
29 CRP(메틸화,정방향) TTT TTG TGT TTT TTA AAG AGT CGG
30 CRP(메틸화,역방향) ACG AAT CGA AAA CAA TTC CGT A
31 CRP(비메틸화,정방향) GG TTT TTG TGT TTT TTA AAG AGT TGG
32 CRP(비메틸화,역방향) CC ACA AAT CAA AAA CAA TTC CAT A
33 FBN-1(메틸화,정방향) TT TCG GTA GGG TTT TAT TTA TCG C
34 FBN-1(메틸화,역방향) A CGA TTT TAA CCC GCT CTA CGA C
35 FBN-1(비메틸화,정방향) TT TTG GTA GGG TTT TAT TTA TTG TGG
36 FBN-1(비메틸화,역방향) AA TAA CAA TTT TAA CCC ACT CTA CAA C
37 ABCA1(메틸화,정방향) AAA ATT TCG TAA TTG CGA GCG A
38 ABCA1(메틸화,역방향) C AAA ACG CCC TAA AAA CCG AC
39 ABCA1(비메틸화,정방향) GGTAAAAATTTTGTAATTGTGAGTGA
40 ABCA1(비틸화,역방향) AAAACAAAACACCCTAAAAACCAAC
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
41 IRAK1(메틸화,정방향) GAG TTT TCG GAA GGT TCG GTT TC
42 IRAK1(메틸화,역방향) GA AAC TCT AAA AAA CGA ACG ACG A
43 IRAK1(비메틸화,정방향) TTTTTGGAAGGTTTGGTTTTGG
44 IRAK1(비메틸화,역방향) CAAAACTCTAAAAAACAAACAACAAC
45 SOX6(메틸화,정방향) GCG TTT TTC GTT TTT GTT TTT TC
46 SOX6(메틸화,역방향) CCT ACC CCA ACC CCT CGA
47 SOX6(비메틸화,정방향) TGTTTTTTGTTTTTGTTTTTTTGG
48 SOX6(비메틸화,역방향) CTATCCTACCCCAACCCCTCAAT
49 LPL(메틸화,정방향) TTA GTC GGT TTA TTA GTC GGT TCG C
50 LPL(메틸화,역방향) GA ACA AAA CTT TAC TCT CCA TCT CG
51 LPL(비메틸화,정방향) AGTTGGTTTATTAGTTGGTTTGTGT
52 LPL(비메틸화,역방향) CAAACAAAACTTTACTCTCCATCTCAAA
53 FABP2(메틸화,정방향) CGA GTA GTT GGG ATT ATA GGC GT
54 FABP2(메틸화,역방향) AAT CAC GAA ATC AAA AAA TCG AA
55 FABP2(비메틸화,정방향) TTGAGTAGTTGGGATTATAGGTGT
56 FABP2(비메틸화,역방향) AATCACAAAATCAAAAAATCAAA
57 PRKCH(메틸화,정방향) TTT TTG GTT TGA AGT TCG TCG A
58 PRKCH(메틸화,역방향) TAA AAA ACC GAA CCT ACC CGT C
59 PRKCH(비메틸화,정방향) TTTTTTGGTTTGAAGTTTGTTGA
60 PRKCH(비메틸화,역방향) CTAAAAAACCAAACCTACCCATC
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
61 IL-6(메틸화,정방향) AGA CGG ATT ATA GTG TAC GGT TGC
62 IL-6(메틸화,역방향) ATA AAA TCA TCC ATT CTT CAC CGA T
63 IL-6(비메틸화,정방향) TGGATTATAGTGTATGGTTGTGG
64 IL-6(비메틸화,역방향) AATAAAATCATCCATTCTTCACCAAT
65 EDN1(메틸화,정방향) TTG GTA GTT TGT AAA GGG GAA GC
66 EDN1(메틸화,역방향) CGA AAA TAA AAC CAA ACC CGA
67 EDN1(비메틸화,정방향) TTGGTAGTTTGTAAAGGGGAAGTG
68 EDN1(비메틸화,역방향) CCAAAAATAAAACCAAACCCAAA
69 LIMK1(메틸화,정방향) TTA TCG TTT GGT AGG GGT TCG T
70 LIMK1(메틸화,역방향) AAA ACC TCC GCT TCC CTA CG
71 LIMK1(비메틸화,정방향) GTTATTGTTTGGTAGGGGTTTGT
72 LIMK1(비메틸화,역방향) AAAAAAACCTCCACTTCCCTACAC
73 NR2A(메틸화,정방향) TAG GGT GTT TAG GCG TTT ATC G
74 NR2A(메틸화,역방향) AAA AAA AAC AAC TCC CTC CGA A
75 NR2A(비메틸화,정방향) AGGGTGTTTAGGTGTTTATTGG
76 NR2A(비메틸화,역방향) AAAAAAAACAACTCCCTCCAAA
77 NR2B(메틸화,정방향) TTT TTT AGT CGT TTT TCG TCG G
78 NR2B(메틸화,역방향) AAC TTA ACC CGA ATC CGT AAC G
79 NR2B(비메틸화,정방향) GTTTTTTAGTTGTTTTTTGTTGG
80 NR2B(비메틸화,역방향) CTTAACCCAAATCCATAACACC
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
81 MAPK1(메틸화,정방향) TTT CGG TTA GAG TGT CGT GGC
82 MAPK1(메틸화,역방향) AAA AAT TAC TTA AAT CCA AAA AAC GAA
83 MAPK1(비메틸화,정방향) GTTTTGGTTAGAGTGTTGTGGTGT
84 MAPK1(비메틸화,역방향) AAAAAATTACTTAAATCCAAAAAACAA
85 MAPK8(메틸화,정방향) A TTT TGT GTC GAC GAG GTT CG
86 MAPK8(메틸화,역방향) CGC GAA AAA AAC CTC CGA
87 MAPK8(비메틸화,정방향) ATTTTGTGTTGATGAGGTTTGA
88 MAPK8(비메틸화,역방향) AACCACAAAAAAAACCTCCAAA
89 p38(메틸화,정방향) ATT TCG TTT TTC GGG TTT AAG C
90 p38(메틸화,역방향) ACC AAC ATA AAA AAA CCC CGT C
91 p38(비메틸화,정방향) TTTGTTTTTTGGGTTTAAGTGA
92 p38(비메틸화,역방향) AACCAACATAAAAAAACCCCATC
93 NFkB1(메틸화,정방향) TTT GGT ATG TTT GGA TTT ATG TCG A
94 NFkB1(메틸화,역방향) GAT AAA AAA ACC CCC AAA AAA CG
95 NFkB1(비메틸화,정방향) TGGTATGTTTGGATTTATGTTGA
96 NFkB1(비메틸화,역방향) CAATAAAAAAACCCCCAAAAAACAC
97 JUN(메틸화,정방향) GGT GTA ACG GAG ATT TAG TTG AGC
98 JUN(메틸화,역방향) CGA TCA AAT TCA AAA ACG ACG A
99 JUN(비메틸화,정방향) GGGGTGTAATGGAGATTTAGTTGAGT
100 JUN(비메틸화,역방향) CAATCAAATTCAAAAACAACAAT
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
101 PLA2(메틸화,정방향) TTT TAA GTA GTT GGG ATT ATA GGC GT
102 PLA2(메틸화,역방향) TTT AAA AAA CCA AAA CGA ACG AA
103 PLA2(비메틸화,정방향) TTTTAAGTAGTTGGGATTATAGGTGT
104 PLA2(비메틸화,역방향) CTTTAAAAAACCAAAACAAACAAA
105 iNOS(메틸화,정방향) GTC GAA AAT TGA GGT TTC GGT C
106 iNOS(메틸화,역방향) CAA CTA ACT ACA CTA CCT CCC CGA
107 iNOS(비메틸화,정방향) TTGAAAATTGAGGTTTTGGTTGT
108 iNOS(비메틸화,역방향) AACTAACTACACTACCTCCCCAAA
109 p53(메틸화,정방향) ATT TAC GGA ATT CGC GGA GTC
110 p53(메틸화,역방향) AAA AAA AAC GTA AAC GCT TCT CG
111 p53(비메틸화,정방향) ATTTATGGAATTTGTGGAGTTGG
112 p53(비메틸화,역방향) AAAAAAAACATAAACACTTCTCACC
113 BCL2(메틸화,정방향) TTA TAC GGT TAG AAA GGG TTT AGG C
114 BCL2(메틸화,역방향) GAA CGA ACG ACG AAA TAC GAA A
115 BCL2(비메틸화,정방향) ATGGTTAGAAAGGGTTTAGGTGG
116 BCL2(비메틸화,역방향) CCAAACAAACAACAAAATACAAA
117 APAF1(메틸화,정방향) GTG TTT CGG AAT GGG GTA TAG C
118 APAF1(메틸화,역방향) AAA ACT ACA AAT TCG ACC ACG CT
119 APAF1(비메틸화,정방향) TGTTTTGGAATGGGGTATAGTGG
120 APAF1(비메틸화,역방향) AAAAACTACAAATTCAACCACACT
서열
번호		 유전자명
(메틸화/비메틸화, 정방향/역방향)		 서열(5‘-3’ 순서)
121 CASP9(메틸화,정방향) GGG ATA AGT TCG AGG GGA GTT AC
122 CASP9(메틸화,역방향) AAT CCA CGC CTA AAC GAC GA
123 CASP9(비메틸화,정방향) GGGGATAAGTTTGAGGGGAGTTAT
124 CASP9(비메틸화,역방향) CCAAATCCACACCTAAACAACAAA
125 CASP3(메틸화,정방향) A GTA GTG TAG ACG CGG TTT TTA GC
126 CASP3(메틸화,역방향) ACC GAA CAA ATA CCC GAA CG
127 CASP3(비메틸화,정방향) AGTGTAGATGTGGTTTTTAGTGG
128 CASP3(비메틸화,역방향) AAACCAAACAAATACCCAAACAAA
129 NOTCH3(메틸화,정방향) GTT TGG GTT TTC GAG GGT TC
130 NOTCH3(메틸화,역방향) AAC TTC GCC GAA ATA AAA CGA C
131 NOTCH3(비메틸화,정방향) GGTTTGGGTTTTTGAGGGTTT
132 NOTCH3(비메틸화,역방향) CCAACTTCACCAAAATAAAACAAC
133 LINE1(HRM,정방향) TCGGAGGGTTTTACGTTTAC
134 LINE1(HRM,역방향) TCGAACTTCCCGACTACTTT
135 LINE1(HRM,정방향) GGTTTGGAGGGTTTTATGTTTAT
136 LINE1(HRM,역방향) TCAAACTTCCCAACTACTTTATT
137 LINE1(HRM,정방향) ACGGTCGTATTTGGAAAATC
138 LINE1(HRM,역방향) GTAAACGTAAAACCCTCCGA
바이설파이트 변형
알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중 환자군과 동일-연령 정상군을 대상으로 퇴행성 뇌질환 관련하여 발현되는 병리 기전별 주요 후생유전학적 변화들을 메틸화-특이 PCR 방법으로 계층화 분석을 수행함으로써 메틸화 변화 및 이후 유전자 발현 이상에 따른 조기 진단용 바이오마커를 탐색하고자 하였다.
알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중 환자군 및 동일-연령 대조군으로부터 순수 분리한 비세포(cell-free) DNA와 유전체 DNA를 메틸램프 DNA 변형 키트(Methylamp DNA modification kit, Cat.No P-1001-2, Epigentek Inc., USA)를 사용하여 CpG 섬의 비메틸화된 C 염기를 T 염기로 변환시켰다.
각 시료 DNA를 0.5 μg씩 24μL의 부피에 분주하고 R1 용액 1μL를 첨가하여 DNA 이중나선을 단일가닥으로 분리하였다. 125μL 부피의 R1/R2/R3 혼합용액을 각 시료에 분주하고 65℃, 90분간 바이설파이트 염 처리를 하였다. 300μL의 R4 용액을 각 시료에 분주하고 스핀 칼럼으로 로딩하였다.
12,000X rpm, 15초 원심분리하고 200μL의 R5 용액을 로딩하여 세척과정을 수행하였다. 50μL 부피의 R1/에탄올 혼합용액을 각 시료 칼럼에 로딩하여 설폰기를 해리시켰다. 이후 200μL 90% 에탄올 세척과정을 2회 반복하고 최종적으로 40μL R6 용액을 로딩하고 12,000X rpm, 20초 원심분리하여 CT 변형 DNA를 분리하였다.
메틸화-특이 중합효소연쇄반응( methylation - specific PCR )
바이설파이트 염 처리과정을 통해 CT 변환된 비세포(cell-free) DNA를 주형으로 사용하여 퇴행성 뇌질환 관련 33개의 유전자들의 후생유전학적 특성을 분석하였다.
20 ~ 50ng의 바이설파이트 염 처리 DNA, AmpliTaq Gold 중합효소(Applied BioSystems Inc., USA) 1U, 300μM dNTPs, 3.5mM MgCl2, 분석 대상 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 포함한 PCR 반응액의 부피는 20μL이었다.
중합효소연쇄반응 조건은 95℃ 10분 초기 열 변성 시행 후 95℃ 20초, 58℃ 30초, 72℃ 30분 과정을 40 사이클 증폭하였다.
증폭 주기 시행 후, 72℃에서 5분간 최종 사슬 연장반응을 수행하였다. PCR 증폭산물은 4% 아가로스 젤 전기영동을 통해 분리하였다. 전기영동 이미지를 촬영, 저장하고 이미지 분석 소프트웨어(AlphaEaseFC, Alpha Innotech Inc., USA)를 활용하여 각 바이오마커 증폭산물의 시그널 강도(intensity)를 정성적으로 평가함과 동시에 해당 산물의 IDV(integrated density value)값을 저장하여 정량적으로 비교하였다.
양성 대조군은 남성 유전체 DNA 100μg을 CpG methyltransferase(Cat.No M0226S, New England Biolabs Inc., USA) 100 U으로 37℃, 3시간 반응시키고 65℃, 20분 반응으로 효소 불활성화 시킨 후 사용하였다.
고해상도 융해곡선 분석
유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하기 위해 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중 환자군과 동일-연령 정상군으로부터 분리한 유전체 DNA를 사용하여 고해상도 융해곡선 분석을 수행하였다.
우선, 각 시료로부터 바이설파이트 염 처리를 통해 CT 변환된 DNA 각 10ng, 2X MeltDoctor HRM Master mix(Cat.No 4415440, Applied BioSystems Inc., USA), LINE-1 정방향 및 역방향 올리고 각 5pmole을 포함하는 반응용액 부피는 20μL로 맞추었다.
ABI 7500FAST 실시간 정량분석 장비를 활용하여 PCR 증폭은 2 단계로 진행하고 융해곡선 분석은 60℃부터 95℃까지 1%(0.35℃/초 증가)씩 융해온도(Tm)를 증가시키면서 SYTO 9 형광을 측정하였다.
세부 조건은 하기와 같다. 95℃, 10분으로 중합효소를 활성화시키고, 95℃ 15초, 60℃ 60초 과정을 40 사이클 증폭하였다.
증폭 주기 시행 후, 95℃에서 10초간 열 변성시킨 후 60℃ 60초간 증폭산물을 결합(annealing)시킨후 초당 0.35℃씩 융해온도를 증가시키면서 증폭산물의 형광값을 25회씩 측정하도록 분석 조건을 프로그램하였다.
분석 종료 후, 융해곡선은 분석 소프트웨어(HRM software v3.0.1, Applied BioSystems Inc., USA)를 사용하였다. raw 융해곡선과 derivative 융해곡선 plot의 분석 영역을 조정하여 분석을 수행하며 기지의 메틸화 빈도(%)를 갖는 양성 대조군 표준곡선에 대비하여 분석 시료의 메틸화 빈도를 정량분석 하였다.
고해상도 융해곡선 분석에 사용되는 메틸화 및 비메틸화 표준물질은 Cells-to-CpG 메틸화 및 비메틸화 유전체 DNA 컨트롤 키트(P/N 4445552, Applied BioSystems Inc., USA)를 사용하여 제조하였다.
키트에 포함된 메틸화 및 비메틸화 컨트롤 DNA 각 500ng씩 바이설파이트 염 변형을 수행하였다.
CT 변형 DNA를 순수분리한 후 OD260 측정으로 단일가닥 DNA의 농도를 정량하였다. 정량 DNA는 2ng/μL로 희석하여 메틸화 100%, 75%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 0%의 메틸화 표준물질을 제조하고 각 분석시 표준곡선 수립을 위해 2회 반복 사용하였다.
통계분석
고해상도 융해곡선 분석은 3반복으로 수행하며 고해상도 융해 소프트웨어 v3.0.1 상에서 derivative 융해 곡선으로 분석 시료간 편차를 확인하였다.
3회 반복 시료간 5% 이상의 피크-멜트 온도 편차가 있는 경우 아웃라이어를 제외하고 나머지 시료의 데이터로 평균 메틸화 빈도를 설정하였다.
분석 시료간 재현성은 일원배치 분산분석(ANOVA)으로 평가하였고 분석간 재현성은 분석 시료 플레이트의 표준편차를 총 평균값으로 나눈 변동계수(CV)%로 평가하였다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> hugenebio <120> Neurodegenerative disease diagnostic composition and method using the same <130> KNP140056 <160> 138 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of COL3A1 <400> 1 tttgattaat acggtgaaat ttcgt 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of COL3A1 <400> 2 ccgaataact aaaactacaa acgcc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of COL3A1 <400> 3 tttgattaat atggtgaaat tttgt 25 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of COL3A1 <400> 4 ctcccaaata actaaaacta caaacacc 28 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of COL4A1 <400> 5 cgcggcggat agttagtttt c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of COL4A1 <400> 6 cctccccttt aaaacgccg 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of COL4A1 <400> 7 tgtggtggat agttagtttt tgg 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of COL4A1 <400> 8 caaaatcctc ccctttaaaa cacc 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of MTHFR <400> 9 tgagattagg agtggttgta gacga 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of MTHFR <400> 10 taaaaaaacg aacctacaaa acgaa 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of MTHFR <400> 11 tgagattagg agtggttgta gatga 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of MTHFR <400> 12 taaaaaaaca aacctacaaa acaaa 25 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of CDKN2A <400> 13 gagtagttgg gattataggt atgcgt 26 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of CDKN2A <400> 14 attctaaaaa accgaaacaa acgaa 25 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of CDKN2A <400> 15 gagtagttgg gattataggt atgtgt 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of CDKN2A <400> 16 attctaaaaa accaaaacaa acaaa 25 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of CDKN2B <400> 17 ttggtttagt ttttggcgta tgc 23 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of CDKN2B <400> 18 ccaaccgaca aaaaattccg t 21 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of CDKN2B <400> 19 tttggtttag tttttggtgt atgtgt 26 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of CDKN2B <400> 20 aaaccaacca acaaaaaatt ccatt 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of PDE4D <400> 21 taatttggag ggtagtggtt cgg 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of PDE4D <400> 22 cgaaaaaccc gacgtaaaac g 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of COX2 <400> 23 tttcggtatt ttatttaagg cga 23 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of COX2 <400> 24 ccaaacgcac aaatttccg 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of ALOX5 <400> 25 aggttttagt cgcgggaagc 20 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of ALOX5 <400> 26 aaaaccaaaa atcacgaatc gac 23 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of ALOX5 <400> 27 gggttaggtt ttagttgtgg gaagt 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of ALOX5 <400> 28 aaaaaaccaa aaatcacaaa tcaac 25 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of CRP <400> 29 tttttgtgtt ttttaaagag tcgg 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of CRP <400> 30 acgaatcgaa aacaattccg ta 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of CRP <400> 31 ggtttttgtg ttttttaaag agttgg 26 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of CRP <400> 32 ccacaaatca aaaacaattc cata 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of FBN-1 <400> 33 tttcggtagg gttttattta tcgc 24 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of FBN-1 <400> 34 acgattttaa cccgctctac gac 23 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of FBN-1 <400> 35 ttttggtagg gttttattta ttgtgg 26 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of FBN-1 <400> 36 aataacaatt ttaacccact ctacaac 27 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of ABCA1 <400> 37 aaaatttcgt aattgcgagc ga 22 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of ABCA1 <400> 38 caaaacgccc taaaaaccga c 21 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of ABCA1 <400> 39 ggtaaaaatt ttgtaattgt gagtga 26 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of ABCA1 <400> 40 aaaacaaaac accctaaaaa ccaac 25 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of IRAK1 <400> 41 gagttttcgg aaggttcggt ttc 23 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of IRAK1 <400> 42 gaaactctaa aaaacgaacg acga 24 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of IRAK1 <400> 43 tttttggaag gtttggtttt gg 22 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of IRAK1 <400> 44 caaaactcta aaaaacaaac aacaac 26 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of SOX6 <400> 45 gcgtttttcg tttttgtttt ttc 23 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of SOX6 <400> 46 cctaccccaa cccctcga 18 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of SOX6 <400> 47 tgttttttgt ttttgttttt ttgg 24 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of SOX6 <400> 48 ctatcctacc ccaacccctc aat 23 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of LPL <400> 49 ttagtcggtt tattagtcgg ttcgc 25 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of LPL <400> 50 gaacaaaact ttactctcca tctcg 25 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of LPL <400> 51 agttggttta ttagttggtt tgtgt 25 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of LPL <400> 52 caaacaaaac tttactctcc atctcaaa 28 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of FABP2 <400> 53 cgagtagttg ggattatagg cgt 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of FABP2 <400> 54 aatcacgaaa tcaaaaaatc gaa 23 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of FABP2 <400> 55 ttgagtagtt gggattatag gtgt 24 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of FABP2 <400> 56 aatcacaaaa tcaaaaaatc aaa 23 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of PRKCH <400> 57 tttttggttt gaagttcgtc ga 22 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of PRKCH <400> 58 taaaaaaccg aacctacccg tc 22 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of PRKCH <400> 59 ttttttggtt tgaagtttgt tga 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of PRKCH <400> 60 ctaaaaaacc aaacctaccc atc 23 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of IL-6 <400> 61 agacggatta tagtgtacgg ttgc 24 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of IL-6 <400> 62 ataaaatcat ccattcttca ccgat 25 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of IL-6 <400> 63 tggattatag tgtatggttg tgg 23 <210> 64 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of IL-6 <400> 64 aataaaatca tccattcttc accaat 26 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of EDN1 <400> 65 ttggtagttt gtaaagggga agc 23 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of EDN1 <400> 66 cgaaaataaa accaaacccg a 21 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of EDN1 <400> 67 ttggtagttt gtaaagggga agtg 24 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of EDN1 <400> 68 ccaaaaataa aaccaaaccc aaa 23 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of LIMK1 <400> 69 ttatcgtttg gtaggggttc gt 22 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of LIMK1 <400> 70 aaaacctccg cttccctacg 20 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of LIMK1 <400> 71 gttattgttt ggtaggggtt tgt 23 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of LIMK1 <400> 72 aaaaaaacct ccacttccct acac 24 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of NR2A <400> 73 tagggtgttt aggcgtttat cg 22 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of NR2A <400> 74 aaaaaaaaca actccctccg aa 22 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of NR2A <400> 75 agggtgttta ggtgtttatt gg 22 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of NR2A <400> 76 aaaaaaaaca actccctcca aa 22 <210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of NR2B <400> 77 ttttttagtc gtttttcgtc gg 22 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of NR2B <400> 78 aacttaaccc gaatccgtaa cg 22 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of NR2B <400> 79 gttttttagt tgttttttgt tgg 23 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of NR2B <400> 80 cttaacccaa atccataaca cc 22 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of MAPK1 <400> 81 tttcggttag agtgtcgtgg c 21 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of MAPK1 <400> 82 aaaaattact taaatccaaa aaacgaa 27 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of MAPK1 <400> 83 gttttggtta gagtgttgtg gtgt 24 <210> 84 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of MAPK1 <400> 84 aaaaaattac ttaaatccaa aaaacaa 27 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of MAPK8 <400> 85 attttgtgtc gacgaggttc g 21 <210> 86 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of MAPK8 <400> 86 cgcgaaaaaa acctccga 18 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of MAPK8 <400> 87 attttgtgtt gatgaggttt ga 22 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of MAPK8 <400> 88 aaccacaaaa aaaacctcca aa 22 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of p53 <400> 89 atttcgtttt tcgggtttaa gc 22 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of p38 <400> 90 accaacataa aaaaaccccg tc 22 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of p38 <400> 91 tttgtttttt gggtttaagt ga 22 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of p38 <400> 92 aaccaacata aaaaaacccc atc 23 <210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of NFkB1 <400> 93 tttggtatgt ttggatttat gtcga 25 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of NFkB1 <400> 94 gataaaaaaa cccccaaaaa acg 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of NFkB1 <400> 95 tggtatgttt ggatttatgt tga 23 <210> 96 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of NFkB1 <400> 96 caataaaaaa acccccaaaa aacac 25 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of JUN <400> 97 ggtgtaacgg agatttagtt gagc 24 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of JUN <400> 98 cgatcaaatt caaaaacgac ga 22 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of JUN <400> 99 ggggtgtaat ggagatttag ttgagt 26 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of JUN <400> 100 caatcaaatt caaaaacaac aat 23 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of PLA2 <400> 101 ttttaagtag ttgggattat aggcgt 26 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of PLA2 <400> 102 tttaaaaaac caaaacgaac gaa 23 <210> 103 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of PLA2 <400> 103 ttttaagtag ttgggattat aggtgt 26 <210> 104 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of PLA2 <400> 104 ctttaaaaaa ccaaaacaaa caaa 24 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of iNOS <400> 105 gtcgaaaatt gaggtttcgg tc 22 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of iNOS <400> 106 caactaacta cactacctcc ccga 24 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of iNOS <400> 107 ttgaaaattg aggttttggt tgt 23 <210> 108 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of iNOS <400> 108 aactaactac actacctccc caaa 24 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of p53 <400> 109 atttacggaa ttcgcggagt c 21 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of p53 <400> 110 aaaaaaaacg taaacgcttc tcg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of p53 <400> 111 atttatggaa tttgtggagt tgg 23 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of p53 <400> 112 aaaaaaaaca taaacacttc tcacc 25 <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of BCL2 <400> 113 ttatacggtt agaaagggtt taggc 25 <210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of BCL2 <400> 114 gaacgaacga cgaaatacga aa 22 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of BCL2 <400> 115 atggttagaa agggtttagg tgg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of BCL2 <400> 116 ccaaacaaac aacaaaatac aaa 23 <210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of APAF1 <400> 117 gtgtttcgga atggggtata gc 22 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of APAF1 <400> 118 aaaactacaa attcgaccac gct 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of APAF1 <400> 119 tgttttggaa tggggtatag tgg 23 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of APAF1 <400> 120 aaaaactaca aattcaacca cact 24 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of CASP9 <400> 121 gggataagtt cgaggggagt tac 23 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of CASP9 <400> 122 aatccacgcc taaacgacga 20 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of CASP9 <400> 123 ggggataagt ttgaggggag ttat 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of CASP9 <400> 124 ccaaatccac acctaaacaa caaa 24 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of CASP3 <400> 125 agtagtgtag acgcggtttt tagc 24 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of CASP3 <400> 126 accgaacaaa tacccgaacg 20 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of CASP3 <400> 127 agtgtagatg tggtttttag tgg 23 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of CASP3 <400> 128 aaaccaaaca aatacccaaa caaa 24 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in promoter of NOTCH3 <400> 129 gtttgggttt tcgagggttc 20 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in promoter of NOTCH3 <400> 130 aacttcgccg aaataaaacg ac 22 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for unmethylated sequence in promoter of NOTCH3 <400> 131 ggtttgggtt tttgagggtt t 21 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for unmethylated sequence in promoter of NOTCH3 <400> 132 ccaacttcac caaaataaaa caac 24 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in 5' UTR of LINE1 <400> 133 tcggagggtt ttacgtttac 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in 5' UTR of LINE1 <400> 134 tcgaacttcc cgactacttt 20 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in 5' UTR of LINE1 <400> 135 ggtttggagg gttttatgtt tat 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in 5' UTR of LINE1 <400> 136 tcaaacttcc caactacttt att 23 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for methylated sequence in 5' UTR of LINE1 <400> 137 acggtcgtat ttggaaaatc 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for methylated sequence in 5' UTR of LINE1 <400> 138 gtaaacgtaa aaccctccga 20

Claims (14)

  1. (a) p53, JNK, p38, p16, p15, BCL2, APAF1, CASP9, CASP3, IL6, COX2, NFkB, iNOS, IRAK1, SOX6, PRKCH, NR2A, NR2B, NOTCH3, AP-1, PLA2, ERK, ALOX5, LPL, PDE4D, FABP2, FBN-1, COL4A1, COL3A1, MTHFR, ABCA1, EDN1 및 LIMK1로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제; 및
    (b) 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬(CpG island)의 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a)는 상기 유전자의 프로모터 영역 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 상기 CpG 섬의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 상기 CpG 섬의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 132로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위(UTR) 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 LINE1 유전자의 5' 비번역 부위(UTR) 내 적어도 하나의 CpG 섬의 메틸화된 서열에 특이적 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 서열번호 133 내지 서열번호 138로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제(a) 및 유전체 DNA의 반복 서열의 메틸화 수준을 측정하는 제제(b)는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 또는 이의 염인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 크로이츠펠트-야콥병인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
  12. (a) 환자의 생물학적 시료로부터 비세포(cell-free) DNA 및 단핵구 세포의 유전체 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 비세포(cell-free) DNA와 유전체 DNA의 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)로부터 비메틸화된 사이토신 염기가 변형된 비세포(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 132로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (b)로부터 비메틸화된 사이토신 염기가 변형된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 133 내지 서열번호 138로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (c)의 PCR 증폭 산물 및 상기 단계 (d)의 PCR 증폭 산물의 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 진단 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 크로이츠펠트-야콥병인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 진단 방법.
KR1020140191645A 2014-12-29 2014-12-29 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법 KR20160080165A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140191645A KR20160080165A (ko) 2014-12-29 2014-12-29 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140191645A KR20160080165A (ko) 2014-12-29 2014-12-29 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160080165A true KR20160080165A (ko) 2016-07-07

Family

ID=56499898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140191645A KR20160080165A (ko) 2014-12-29 2014-12-29 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20160080165A (ko)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101965380B1 (ko) * 2018-07-31 2019-04-03 이화여자대학교 산학협력단 피부 세포에서 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머 질환 진단용 조성물 및 이의 이용
CN111334570A (zh) * 2020-04-03 2020-06-26 首都医科大学宣武医院 一种检测dna甲基化水平的引物探针组合物及其应用
KR20210065875A (ko) * 2019-11-26 2021-06-04 서울대학교산학협력단 Pbmc의 자가포식 연관 유전자를 이용한 개의 근육노화 평가 방법
WO2021172863A1 (ko) * 2020-02-27 2021-09-02 이화여자대학교 산학협력단 알츠하이머병에 대한 분자 진단 테스트
KR20210109210A (ko) * 2020-02-27 2021-09-06 이화여자대학교 산학협력단 유전자 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머병 치매 진단용 조성물 및 이의 이용
WO2023052640A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Tivenix Sa A method for diagnosing and predicting progression of neurodegenerative diseases or disorders
WO2023112946A1 (ja) * 2021-12-17 2023-06-22 伸行 小林 アルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法及びキット
CN116926196A (zh) * 2023-08-14 2023-10-24 青岛瑞思德医学检验实验室有限公司 一种宫颈细胞基因甲基化检测试剂盒及其检测方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101965380B1 (ko) * 2018-07-31 2019-04-03 이화여자대학교 산학협력단 피부 세포에서 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머 질환 진단용 조성물 및 이의 이용
WO2020027569A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 이화여자대학교 산학협력단 피부 세포에서 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머 질환 진단용 조성물 및 이의 이용
KR20210065875A (ko) * 2019-11-26 2021-06-04 서울대학교산학협력단 Pbmc의 자가포식 연관 유전자를 이용한 개의 근육노화 평가 방법
WO2021172863A1 (ko) * 2020-02-27 2021-09-02 이화여자대학교 산학협력단 알츠하이머병에 대한 분자 진단 테스트
KR20210109210A (ko) * 2020-02-27 2021-09-06 이화여자대학교 산학협력단 유전자 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머병 치매 진단용 조성물 및 이의 이용
CN111334570A (zh) * 2020-04-03 2020-06-26 首都医科大学宣武医院 一种检测dna甲基化水平的引物探针组合物及其应用
WO2023052640A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Tivenix Sa A method for diagnosing and predicting progression of neurodegenerative diseases or disorders
WO2023112946A1 (ja) * 2021-12-17 2023-06-22 伸行 小林 アルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法及びキット
CN116926196A (zh) * 2023-08-14 2023-10-24 青岛瑞思德医学检验实验室有限公司 一种宫颈细胞基因甲基化检测试剂盒及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Piwecka et al. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease
KR20160080165A (ko) 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법
Lim et al. Brain somatic mutations in MTOR cause focal cortical dysplasia type II leading to intractable epilepsy
Rovelet-Lecrux et al. De novo deleterious genetic variations target a biological network centered on Aβ peptide in early-onset Alzheimer disease
Tang et al. Characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy using a parallel sequencing system
CN105143467B (zh) 用于预测间质性肺炎的风险的方法
Guelfi et al. Transcriptomic and genetic analyses reveal potential causal drivers for intractable partial epilepsy
US9410204B2 (en) Biomarkers for diagnosing ischemia
CN103930568A (zh) 用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法
KR20110081836A (ko) 연령-관련 황반 변성에서 유전자 다형성
JP2013511732A (ja) 神経障害の診断、診断補助および／またはその進行のモニタリングのための方法、キットおよび試薬
JP2007093341A (ja) 生物における低線量放射線被ばくを検出する方法
CN108715893B (zh) 一组与放疗引起的放射性脑损伤相关的snp标志物及其应用
KR101604178B1 (ko) 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커
Pizzolo et al. Glucocorticoid remediable aldosteronism (GRA) screening in hypertensive patients from a primary care setting
KR102294939B1 (ko) Lats1 유전자 변이 마커 기반의 근위축성 측삭경화증의 진단방법
WO2021039777A1 (ja) 関節リウマチを検査する方法
KR20180044220A (ko) miRNA 기반의 인지장애 질환 진단용 조성물 및 방법
JP7394441B2 (ja) 脳腫瘍を検査する方法
US10168340B2 (en) Methods for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis
EP4106872A1 (en) Compositions and methods for assessing the efficacy of inhibitors of neurotransmitter transporters
KR20200028320A (ko) 알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단
WO2000020575A1 (fr) Gene associe a la pollinose
Giorgio et al. Design of a multiplex ligation-dependent probe amplification assay for SLC20A2: Identification of two novel deletions in primary familial brain calcification
WO2023090436A1 (ja) 短鎖ｒｎａを用いた神経変性疾患の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination