KR101965380B1

KR101965380B1 - 피부 세포에서 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머 질환 진단용 조성물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101965380B1
Application number: KR1020180089567A
Authority: KR
Inventors: 안정혁; 성혜윤; 정지향
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2019-04-03
Also published as: WO2020027569A1

Abstract

본 발명은 IDE (Insulin Degrading Enzyme) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease)을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

피부 세포에서 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머 질환 진단용 조성물 및 이의 이용 {Composition for diagnosing Alzheimer's disease using alteration of CpG methylation in promoter region of IDE gene in skin cell and uses thereof}

최근 급격한 산업화와 선진화 및 의학의 발전으로 국민 평균수명은 연장되었으나 젊은 층의 출산기피 현상으로 세계적으로 유례를 찾기 어려울 정도로 급속히 인구 노령화가 진행되고 있으며 이에 따른 노인성 질환이 크게 증가하고 있다.

대표적 노인성 질환인 알츠하이머 질환 (또는 알츠하이머성 치매)은 치매의 가장 흔한 형태로, 기억력 감퇴로 시작하여 시간과 공간의 인지 능력 상실, 망상 및 성격변화, 언어 기능 마비, 및 운동 기능 마비 등의 증상으로 장기간에 걸쳐 점진적으로 진행하여 결국 사망에 이르는 대표적인 퇴행성 뇌질환이다.

알츠하이머 질환을 치료하기 위한 연구가 지난 수십년간 지속적으로 진행되어 왔음에도 불구하고 현재까지 근본적인 치료제는 없으며 단지 증상을 완화하거나 병변의 진행을 늦추는 수준의 치료만이 행해지고 있는 실정이다. 따라서, 알츠하이머 질환은 조기 진단 및 선제적 치료를 통해 치매의 발병시기를 지연시키는 것이 가장 효과적인 관리 방법으로 제시되고 있다.

그러나, 현재 알츠하이머 질환 진단에 사용되고 있는 간이 정신 상태 검사 (mini-mental state examination: MMSE)의 경우 환자의 연령, 교육수준, 또는 의도적 대답 거부 등이 검사 결과의 정확도에 크게 영향을 미치는 단점이 있고, MRI나 PET을 이용한 뇌영상검사의 경우, 고가의 장비를 시용하기 때문에 특별한 증상을 나타내지 않는 초기단계에 검사를 시행하기가 어려운 단점이 있다.

이에, 알츠하이머 질환의 진단을 위한 다른 방법으로, 뇌척수액 또는 혈청에서 베타 아밀로이드 단백질을 검출하는 방법, tau 단백질의 농도를 측정하는 방법, 신경아교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)-항체를 검출하는 방법 등의 생화학적 방법들이 제안되었으나, 진단의 간편성과 정확도 등의 문제가 제기되고 있다 (국제공개특허 제92/17152호; 미국특허 제4,666,829호; 국제공개특허 제89/06242호; 미국특허 제5,231,000호 등).

따라서, 알츠하이머 질환의 조기진단을 위해 임상증상을 대변하거나, 증상이 나타나기 이전의 전임상 상태를 측정할 수 있는 새로운 진단 마커가 절실히 요구된다.

국제공개특허 WO 1992-017152 (1992.10.15 공개) 미국특허등록 US 4,666,829호 (1987.05.19 등록) 국제공개특허 WO1989-006242 (1989.07.13 공개) 미국특허등록 US 5,231,000호 (1993.07.27 등록)

본 발명자들은 피부 세포에서 IDE (Insulin Degrading Enzyme) 유전자의 프로모터가 알츠하이머 질환에 특이적으로 고메틸화(hypermethylation)되는 것을 확인하고, 이를 바이오마커로 이용하여 IDE 유전자의 프로모터의 메틸화 정도를 측정함으로써 알츠하이머 질환을 진단할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 일예는 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 키트를 제공한다.

다른 예는 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

다른 예는 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

다른 예는 알츠하이머 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 피부 세포에서 IDE (Insulin Degrading Enzyme) 유전자의 프로모터가 알츠하이머 질환에 특이적으로 고메틸화된다는 발견에 기초한 것으로, IDE 유전자의 프로모터의 특정 CpG 위치에서 일어나는 특이적인 DNA 고메틸화 정도를 측정하여 알츠하이머 질환을 진단하는 분자생물학적 진단 기술을 제공한다.

DNA 메틸화 변화는 DNA에 존재하기 때문에 검출이 용이하고, 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며, 한 유전자의 특정 위치에서 일어나므로 분석이 손쉬운 장점을 가진다.

또한, 본 발명에서는, 놀랍게도, 피부 섬유아세포에서의 IDE 유전자의 비정상적인 메틸화의 변화가 알츠하이머 질환 모델의 뇌병변 시료에서 얻은 게놈 DNA의 메틸화 변화와 상당한 유사성을 보이는 것으로 확인되었으므로, 피부 세포나 피부 조직 시료를 통한 손쉬운 진단이 가능하다는 장점이 있다.

따라서, 일 구체예는 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 조성물을 제공한다.

다른 구체예는 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 키트를 제공한다.

다른 구체예는 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

다른 구체예는 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

다른 구체예는 알츠하이머 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "메틸화" 또는 "메틸레이션"은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.

포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.

본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정하거나, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알츠하이머 질환이 아닌 사람의 시료에 비하여, 알츠하이머 질환 환자의 시료에서는 IDE 유전자의 프로모터에서의 고메틸화가 특이적으로 나타나는 것을 통해서, 프로모터의 메틸화 여부에 따라 알츠하이머 질환 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서, 유전자의 CpG 부위란, 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 유전자의 DNA 는, 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다.

일예로, 본 발명에서 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, IDE 유전자의 프로모터 CpG 부위, 보다 상세하게는 10 번 염색체의 94334776 내지 94334897 번째 염기서열(서열번호 1) 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 10 번 염색체의 94334836 번째 염기(서열번호 1의 61번째 염기)에 위치한 사이토신의 메틸화를 측정하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 최신 버전인 GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) 에 따라 표현하였지만 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) 에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.

본 발명에서 용어, "IDE 유전자" 는 인슐린 분해 효소(Insulin Degrading Enzyme)를 코딩하는 유전자로, 상기 효소는 혈액에서 인슐린을 분해하여 인슐린 활성을 소실시키며, 글루카곤, 아밀린, 브래디키닌 및 칼리딘과 같은 다앙한 펩타이드들을 분해함으로써 세포간 펩타이드 시그널링에 관여하는, 아연-함유 단백질 분해 효소이다. IDE 유전자를 결실시킨 마우스들은 인슐린 수치가 상승하고 당 내성이 향상되는 것으로 알려져 있다. 인간 IDE 유전자는 10번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database 에 Gene ID: 3416 로 등록되어 있다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 알츠하이머 질환 발병 여부를 확인하거나, 증상이 나타나기 이전의 전임상 상태를 측정하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸화 DNA에 특이적으로 결합하는 메틸화 DNA 항체 (예를 들어, 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체) 등을 포함할 수 있다.

상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트 변형된 DNA 는 서열분석 또는 메틸화 특이적 PCR 등 다양한 방법을 통하여 메틸화를 검출할 수 있으며, 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, WO01/26536; US2003/0148326A1).

또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.

알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 유전자의 특정 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 일예로서, 환자의 피부 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제제는 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.

한편, 메틸화 DNA 항체란, DNA 중의 메틸화된 염기에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 구체적으로는, 메틸사이토신에 대한 항체와 같이, DNA 사슬 중 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 가진 항체를 들 수 있다. 또한, 시판되고 있는 메틸화 DNA 항체 중에서, 본원에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다.

메틸화 DNA 항체는 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 메틸사이토신 항체를 제조하기 위해서는, 5-메틸사이티딘, 5-메틸사이토신, 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 항체를 제조한 후 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로서 선별할 수 있다.

또한, 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸화 DNA 항체를 이용하여 메틸화 수준을 측정하는 경우, 이들을 이용하여 메틸화된 DNA 를 면역침강시킨 후, 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing) 등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다. 또한, 항체의 면역학적 검출 또는 정량을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질 표지, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 사용할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있고, 그 외 방사성 동위원소 표지, 라텍스 비드 표지, 콜로이드 표지, 비오틴 표지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 DNA 메틸화 마이크로어레이 형태로 구현될 수 있다.

다른 구체예로, 본 발명은 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 알츠하이머 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

이를 위한 일 구현예로, 본 발명은 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 알츠하이머 질환이 아닌 대조군 시료의 해당 유전자 프로모터의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "피부 시료"란 알츠하이머 질환에 의해 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 피부 조직 또는 피부 세포를 포함하고, 구체적으로는 피부 섬유아세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

먼저, 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 검출하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, 메틸화된 염기와 메틸화되지 않은 염기의 차이를 이용한, 제한효소 또는 바이설파이트를 이용하는 방법, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강방법(예, MIRA, MeDIP), DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 이용한 방법 등을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용하여 메틸화 수준을 측정 내지 검출할 수 있다.

일예로, 본원의 방법은 (a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 해당 유전자의 특정 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다.

또한, 상기 (a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 (b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 (a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.

또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 CpG가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 CpG가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.

유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 다른 예로, 메틸화 DNA 항체, 예를 들어 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸사이토신에 대한 항체를 이용한 면역침강방법을 예시할 수 있다. 예를 들어, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 5-메틸사이토신을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 면역침강한 후 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing)등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다.

이와 같은 방법에 따라, 대상 시료 내 IDE 유전자의 CpG 부위가 고메틸화 상태로 검출되는 경우, 알츠하이머 질환이라고 진단 또는 예측할 수 있는 것이다.

따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, IDE 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 변화는 알츠하이머 질환 환자의 피부 시료에서 특이적으로 나타나며 알츠하이머 질환 환자의 유전자의 발현에 영향을 미치므로, 유전자의 메틸화 변화를 바이오마커로 사용하여 알츠하이머 질환 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, IDE 유전자 프로모터의 특정 CpG 부위의 고메틸화를 바이오마커로 사용하여 알츠하이머 질환 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 환자의 피부 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하여 알츠하이머 질환을 진단하는 분자생물학적 진단법을 제공하며, 이는 간편하고 비침습적이며 경제적인 장점이 있다. 또한, DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다. 또한, 피부 세포나 피부 조직 시료를 통한 손쉬운 진단이 가능한 장점이 있다.

도 1은 독성 베타 아밀로이드(Aβ) 또는 DMSO를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자 프로모터 CpG 부위의 DNA 메틸화 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 독성 베타아밀로이드(Aβ) 또는 DMSO를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 5-aza-2'-deoxycytidin 또는 DMSO를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자의 DNA 메틸화 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 5-aza-2'-deoxycytidin을 또는 DMSO를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 알츠하이머성 치매 생쥐 모델의 뇌 조직(해마, 피질) 및 피부 조직(피부 섬유아세포)에서 IDE 유전자의 발현 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 피부 섬유아세포 배양 및 처리

사람의 일차(primary) 피부 섬유아세포인 NHDF (normal human dermal fibroblast) 는 American type culture collection (ATCC no. PCS-201-012)에서 구입하여 2% (v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum), 1 μg/ml 하이드로코르티손(hydrocortisone), 10 ng/ml 인간 표피성장인자(human epidermal growth factor), 3 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), 10 μg/ml 헤파린(heparin), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 30 μg/ml 겐타마이신(gentamicine) 및 15 ng/ml 암포테리신 B(amphotericin B)를 포함하고 있는 Medium 106 에서 배양하였다.

배양된 NHDF를 1.5 μM 독성 베타 아밀로이드(Aβ₁ _- ₄₂)로 5일간 처리하여 알츠하이머성 치매 세포 모델을 확립하였다. 대조군으로서, 독성 베타 아밀로이드 대신 1.5 μM 디메틸 설폭시드(Dimethyl sulfoxide: DMSO)로 NHDF를 5일간 처리하였다.

또한, 배양된 NHDF를 20 μM DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-deoxycytidine (Sigma-Aldrich)로 3일간 처리한 후 IDE 유전자 발현 변화를 역전사-정량적 PCR (Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction: RT-qPCR)을 이용하여 측정하였다. 대조군으로서, 5-aza-2'-deoxycytidine 대신 20 μM DMSO로 NHDF를 3일간 처리하였다.

실시예 2. 생쥐 피부 섬유아세포 (skin fibroblast) 분리 및 배양

알츠하이머성 치매 모델로서, APP Swedish 돌연변이와 9번째 엑손 결손 돌연변이를 동시에 발현하는 12개월령의 APP swe/PS1 형질전환 쥐 (B6C3-Tg(APP695)85Dbo Tg(PSEN1)85Dbo)를 사용하였으며, 형질전환 쥐와 대조군으로서 littermate 정상 쥐의 뇌조직 (전두엽 피질(frontal cortex)과 해마(hippocampus)) 과 피부 조직으로부터 피부 섬유아세포를 각각 분리하여 유전자 발현의 변화를 조사하였다.

구체적으로, 형질전환 쥐와 littermate 정상 쥐의 피부 조직에서 섬유아세포를 무균 환경 하에 분리하기 위하여, 쥐에서 적출된 피부를 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) 에 넣어 4 ℃ 에서 이동 및 보관하였고, 포셉으로 피부에 있는 DPBS 를 최대한 제거한 후 페트리 디쉬에 옮겨 잘게 잘라주었다. 잘게 자른 조각을 0.14 units/ml의 Liberase DH collagenase (Sigma-Aldrich)를 포함한 배지 (100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 30 μg/ml 겐타마이신을 포함한 DMEM/F12) 로 옮겨 37 ℃ 에서 90분 간 300 rpm으로 처리하여 섬유아세포를 분리하였다. Collagenase를 불활성시키기 위해 15% 우태아혈청 (FBS)에 노출시킨 뒤 524 xg에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 섬유아세포 침전물을 15% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지에 넣고 37 ℃ 의 5% CO₂ 및 3% O₂ 배양기에서 배양하였다. 배지의 색이 노란색으로 변하면 절반의 배지를 빼내고 새 배지를 추가하였다. 14일 후 15% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 포함한 EMEM 배지로 바꾸어서 배양하였다.

실시예 3. Total RNA 와 genomic DNA추출

생쥐 뇌조직, 생쥐 피부 섬유아세포, 및 인간 피부 섬유아세포 NHDF에서 각각 RNeasy mini kit (Qiagen)와 QIAmp mini kit (Qiagen)을 이용하여 total RNA와 genomic DNA를 추출하였다. 추출방법은 제조사의 매뉴얼을 따라 실시하였다. 추출된 total RNA와 genomic DNA는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량하였으며, RNA 와 DNA 상태는 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 degradation 여부를 확인하였다.

실시예 4. DNA 메틸레이션 마이크로어레이

Aβ₁ _-42또는5-aza-2'-deoxycytidine으로 처리한 NHDF와, 대조군으로 DMSO로 처리한 NHDF 세포를, Infinium(®) Human Methylation EPIC BeadChip (Illumina)을 사용하여 genome-wide DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 수행하였다. DNA 메틸화 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화 된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다.

두 군에서 차별적으로 메틸화되어 있는 유전자 (Differentially methylated genes, DMGs)를 확인하기 위하여 Bayesian t-test 방법을 사용하였다. 최종적으로 p value<0.05이면서 절대값 β 차이=0.3 인 CpG 부위를 차별적으로 메틸화되어 있는 CpG 부위(differentially methylated CpG site)로 선정하고, 이 중에서 프로모터 부분에 존재하는 CpG 부위의 메틸화 정도가 변한 유전자를 DMG로 선정하였다.

실시예 5. 역전사 정량 PCT (RT- qPCR )

cDNA 합성을 위해 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)을 사용하였다. 1 μg의 total RNA 와 50 ng oligo dT를 70 ℃에서 10분간 denature한 후 여기에 5X RT buffer 4 μl, 0.1 mM DTT 2 μl, 2.5 mM dNTP mixture 4 μl, Superscript II 역전사효소 200 units 및 RNase inhibitor 10 units을 포함한 반응액에 혼합한 20 μl 반응액을 25 ℃ 에서 10분, 42 ℃에서 50분, 95 ℃에서 5분 동안 반응하여 cDNA를 합성한 후 이것을 1:4로 희석하여 이 중 2 μl를 취하여 주형으로 사용하였다. qPCR은 cDNA 2 μl, SYBR Premix EX Taq (Takara Bio) 10 μl, Rox reference dye (50Х, Takara Bio) 0.4 μl 및 각 유전자의 프라이머 200 nM를 포함한 20 μl 반응액을 ABI 7500fast sequence detection system (Applied Biosystems)을 이용하여 95 ℃에서 30초 반응한 후, 40 cycles (95 ℃ 에서 3초, 60 ℃ 에서 30초) 반복하여 증폭하였다. PCR 산물의 specificity는 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 1분, 95 ℃에서 15초 동안 반응하여 확인하였다. GAPDH mRNA 발현을 internal control로 사용하였으며, IDE 유전자의 발현은 GAPDH 발현 수준으로 ΔΔC_T 방법으로 보정되었다. 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 다음과 같다.

	서열	서열번호
human IDE (forward)	5'- AGCAGGCTTGAGCTATGATCT -3'	2
human IDE (reverse)	5'- GTTCAGCCCGGAAATTGTTAAGA -3'	3
human GAPDH (forward)	5'- AATCCCATCACCATCTTCCA -3'	4
human GAPDH (reverse)	5'- TGGACTCCACGACGTACTCA -3'	5
mouse IDE (forward)	5'- CAGAAGGACCTCAAGAATGGGT -3'	6
mouse IDE (reverse)	5'- GCCTCGTGGTCTCTCTTTATCT -3'	7
mouse GAPDH (forward)	5'- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG -3'	8
mouse GAPDH (reverse)	5'- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3'	9

실험결과

1. 독성 베타 아밀로이드를 처리한 인간 피부 섬유아세포의 DNA 메틸화 변화 분석

인간 피부 섬유아세포 NHDF를 배양하여 알츠하이머성 치매의 병인 물질의 하나로 알려진 독성 베타 아밀로이드 (Aβ₁ _- ₄₂)로 장기간 (1.5 μM로 5일) 처리하여 알츠하이머성 치매 특이적 표현형을 나타내는 세포 모델을 확립하였다. 확립된 알츠하이머성 치매 세포 모델의 DNA 메틸화 변화를 분석하기 위해 Aβ₁ _- ₄₂로 처리한 NHDF와 대조군으로 DMSO로 처리한 NHDF 세포를 Infinium(®) Human Methylation EPIC BeadChip (Illumina)을 사용하여 genome-wide DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 시행하였다. 두 군에서 차별적으로 메틸화 되어 있는 유전자 (Differentially methylated genes, DMGs)를 선별하기 위하여 Bayesian t-test 방법을 사용하였다. 최종적으로 p value<0.05이면서 절대값 β 차이=0.3 인 CpG 부위를 차별적으로 메틸화되어 있는 CpG 부위(differentially methylated CpG site)로 선정하고, 이 중에서 프로모터 부분에 존재하는 CpG 부위의 메틸화 정도가 변한 IDE 유전자를 DMG로 최종 선정하였다 (표 2).

유전자	Methylation Chip ID	Location of CpG site	Differentially methylated value ¹ ⁾	메틸레이션 상태
IDE	cg18197594	TSS1500	0.33013	고메틸화
1) 베타 아밀로이드(Aβ₁ _- ₄₂)로 처리한 세포에서의 β 값과 DMSO 로 처리한 세포에서의 β값의 차이를 말함

2. 독성 베타 아밀로이드를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자의 프로모터 CpG 메틸화 변화

DNA 메틸레이션 마이크로어레이 분석 결과, 독성 베타 아밀로이드를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자의 프로모터에 존재하는 특정 CpG 부위의 DNA 메틸화가, 대조군 DMSO를 처리한 인간 피부 섬유아세포에 비해 30% 정도 높아져 있는 것을 확인하였다 (도 1). IDE 유전자의 프로모터에 존재하는 특정 CpG 부위는 10번 염색체의 94334836 번째에 위치하는 사이토신이며 주변 염기서열은 다음과 같다:

CAAGTATTGCTTTAAATGGGAATTCAGTAGGAGGGTTCCTTAATCAAGTTGATGCTTTAT C GAAGACGTACCCACGATCTTTTTAACAGTGCGGTTTCACCTAAAGGCAAACCTTTGGATGA (서열번호 1: 10 번 염색체의 94334776 내지 94334897 번째 염기서열)

또한, 독성 베타아밀로이드를 처리한 인간 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자의 발현이 대조군에 비해 현저히 감소한 것을 RT-qPCR로 확인하였다 (도 2).

3. DNA 메틸화에 의한 IDE 유전자의 발현 조절

인간 피부 섬유아세포에 탈 DNA 메틸레이션 제제인 5-aza-2'-deoxycytidin을 3일간 처리한 후 IDE 유전자의 발현 변화를 조사한 결과, DNA 메틸화가 줄어들면서 IDE 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 DNA 메틸화에 의해 IDE 유전자의 발현이 억제되는 것을 보여주며 IDE 유전자의 발현이 DNA 메틸화에 의해 조절되는 것을 의미한다 (도 3 및 도 4).

4. 알츠하이머성 치매 모델의 피부 섬유아세포에서 IDE 유전자의 발현 감소

12개월령 알츠하이머성 치매 모델 APP swe/PS1 형질전환쥐 (Borchelt; B6C3-Tg(APP695)85Dbo/Tg(PSEN1)85Dbo)의 해마(hippocampus) 및 피질(cortex) 부위에서 IDE 유전자의 발현이 정상 쥐와 비교하여 감소되어 있었다 (도 5). 또한, 동일 쥐의 피부에서 추출 배양한 피부 섬유아세포에서도 뇌조직과 유사하게 IDE 유전자의 발현이 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 따라서, 알츠하이머성 치매 동물 모델을 통하여 IDE 유전자의 발현 감소는 알츠하이머성 치매에서 특징적으로 나타나는 현상임을 확인하였다. 본 실험 결과를 통하여 IDE 유전자의 발현 감소는 뇌조직 뿐만 아니라 피부에서도 발견되는 알츠하이머성 치매의 특성임을 확인할 수 있었다.

결론

결론적으로, 독성 베타 아밀로이드를 처리한 피부 섬유아세포에서 알츠하이머성 치매 환자의 뇌세포와 유사하게 IDE의 발현이 저하되어 있는 것을 확인하였고, IDE 유전자의 발현이 독성 베타 아밀로이드에 의해서 유도된 DNA 메틸화 변화에 의해 조절됨을 확인하였다. 본 실시예의 결과는 알츠하이머성 치매 환자의 뇌세포에서 일어나는 생화학적 변화를 피부 섬유아세포에서 확인할 수 있음을 시사하며, 피부 섬유아세포를 이용하여 IDE 유전자의 특정 CpG 부위에서 나타나는 특이적인 DNA 메틸레이션의 고메틸화를 측정함으로써 비침습적인 방법으로 알츠하이머성 치매를 진단하는 바이오마커로 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Composition for diagnosing Alzheimer's disease using alteration of CpG methylation in promoter region of IDE gene in skin cell and uses thereof <130> DPP20173004KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(122) <223> Ch10: 94334776-94334897 <400> 1 caagtattgc tttaaatggg aattcagtag gagggttcct taatcaagtt gatgctttat 60 cgaagacgta cccacgatct ttttaacagt gcggtttcac ctaaaggcaa acctttggat 120 ga 122 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IDE (forward primer) <400> 2 agcaggcttg agctatgatc t 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IDE (reverse primer) <400> 3 gttcagcccg gaaattgtta aga 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH (forward primer) <400> 4 aatcccatca ccatcttcca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH (reverse primer) <400> 5 tggactccac gacgtactca 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IDE (forward primer) <400> 6 cagaaggacc tcaagaatgg gt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IDE (reverse primer) <400> 7 gcctcgtggt ctctctttat ct 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse GAPDH (forward primer) <400> 8 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse GAPDH (reverse primer) <400> 9 tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims

피부 시료로부터 IDE (Insulin Degrading Enzyme) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 조성물로서,
상기 IDE 유전자 프로모터의 CpG 는 서열번호 1(10 번 염색체의 94334776 내지 94334897 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는, 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 키트.
알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 피부 시료로부터 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 IDE 유전자 프로모터의 CpG 는 서열번호 1(10 번 염색체의 94334776 내지 94334897 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 알츠하이머 질환이 아닌 대조군 시료의 해당 유전자 프로모터에서의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준의 측정 단계는
(a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
(b) 상기 처리된 DNA를 IDE 유전자 프로모터의 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 방법.
제6항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 검출하는 방법은 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 및 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
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