KR102085669B1

KR102085669B1 - Cyp26c1 유전자의 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물

Info

Publication number: KR102085669B1
Application number: KR1020190000225A
Authority: KR
Inventors: 차민호; 김명선; 박재호
Original assignee: 한국 한의학 연구원; 한국식품연구원
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2020-03-06

Abstract

본 발명은 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 CYP26C1 메틸화 바이오마커는 소혈관폐색증의 예측뿐만 아니라, 소혈관폐색증 위험성 평가, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 활용될 수 있을 것이다.

Description

CYP26C1 유전자의 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물{Method for providing information of prediction and diagnosis of small vessel occlusion using methylation level of CYP26C1 gene and composition therefor}

본 발명은 CYP26C1 유전자의 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

소혈관폐색(small vessel occlusion)은 뇌의 소혈관이 막혀 이 혈관을 통해 혈액을 공급받지 못해서 발생하는 뇌경색(뇌졸중)으로, 서구인에 비해 아시아인에서 더 많이 발생하는 것으로 알려져 있다. 국내 뇌경색 임상 조사 기관(Clinical Research Center for Stroke, CRCS)을 통해 2011년부터 2013년까지 전 연령의 뇌경색 환자를 분석한 보고에서는 큰동맥죽경화증이 38.3%, 심장성색전증이 22.8%, 소혈관폐색이 14.6%, 다른 원인이 2.1%, 원인불명이 22.2%인 것으로 조사되었다. 소혈관은 대혈관보다 더 다양하고도 미세하게 우리 신체에 작용한다. 일반적으로 소혈관 질환은 대혈관 질환의 전조증상, 즉 대혈관 질환을 예고하는 선행신호가 될 수 있다는 점에서 주의를 요하는 질환이다.

최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암과 같은 질병을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 특히 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 특정 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 질병 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 질병의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(Alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈 내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 =6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G 염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75% 이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 한편, 정상인의 체세포(somatic cell)에서는 이들 중요 유전자 발현조절 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자와 비활성화(inactivation)된 X 염색체상의 유전자들은 메틸화되어 있다.

상당수의 질환은 유전자의 이상에 의해 발생하고, 유전자 이상 중 가장 많은 형태는 유전자의 코딩서열에 변화가 오는 것으로 이러한 유전자 자체의 변화(genetic change)를 돌연변이라고 한다. 어떤 유전자에 돌연변이가 있을 때, 그 유전자가 코딩하는 단백질은 구조와 기능이 바뀌고 장애와 결손을 가져오게 되며, 이러한 돌연변이 단백질은 질병을 유발한다. 그러나 특정 유전자에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 발현에 이상이 있으면 질병이 유발될 수 있다. 대표적인 예가 유전자 전사의 조절부위 CpG 섬의 시토신 염기부위에 메틸기가 붙는 메틸화로, 이 경우 그 유전자는 발현이 차단된다. 이와 같은 것을 후성유전적 변화(epigenetic change)라고 하며, 이것도 돌연변이와 마찬가지로 자손세포에 전달되며, 동일한 효과, 즉 해당 단백질의 발현 상실을 야기한다.

유전자의 메틸화 수준을 분석하여 특정 암에 대한 진단 또는 예측에 관한 기술은 일부 존재하였으나, 특정 유전자의 메틸화 수준 분석을 통해 소혈관폐색증을 예측 또는 진단하는 연구는 보고된 바가 없었다. 이에 본 발명자들은 조기 진단 또는 예측 등이 가능한 효과적인 소혈관폐색증 예측 또는 진단을 위한 특이적 메틸화 마커를 개발하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1069593호에는 '급성심근경색 진단용 마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1587635호에는 '갑상선암 진단을 위한 갑상선암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 CYP26C1 유전자의 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 정상군과 소혈관폐색증 환자군의 시료로부터 WGBS (whole genome bisulfite sequencing)을 수행하여, 두 그룹간에 메틸화 수준에 현저한 차이가 있는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위를 선택하고, 해당 부위에 대한 DNA 메틸화 시퀀싱을 수행한 결과, 소혈관폐색증 환자군에서 상기 부위의 메틸화 수준 감소를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 분리된 생물학적 시료로부터 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위 메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 메틸화를 정상 대조군 시료의 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화와 비교하는 단계를 포함하는, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CYP26C1 유전자 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 소혈관폐색증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 CYP26C1 메틸화 바이오마커를 통해 소혈관폐색증의 발병을 조기에 예측할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 CYP26C1 유전자는 소혈관폐색증의 위험성 평가, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 활용될 수 있으며, 소혈관폐색증의 후성유전학적(epigenetics) 연구에 도움이 될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 개요도이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분리된 생물학적 시료로부터 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위 메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 메틸화를 정상 대조군 시료의 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화와 비교하는 단계를 포함하는, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위는 CpG 섬(island)을 포함하는 서열로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 염기서열은 UCSC Genome Browser Human GRCh37/hg19 DNA 서열에서 10번 염색체의 94,820,155 ~ 94,820,614 위치의 염기이다.

본 발명에 따른 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보 제공 방법은 구체적으로는,

(a) 정상 대조군 및 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로 처리하는 단계;

(c) 상기 시약으로 처리된 게놈 DNA 또는 이의 단편에서 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화를 검출하는 단계; 및

(d) 정상 대조군의 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화 수준과 비교하여 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 검출된 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화 수준이 감소되면 소혈관폐색증으로 결정하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 개개인으로부터 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함하고, 바람직하게는 소혈관폐색증 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 소혈관폐색증 의심 대상 개체는, 소혈관폐색증 진단을 받지 않았으나 소혈관폐색증을 포함하는 뇌경색 질환 가족력이 있어 소혈관폐색증의 유전성 요인이 있는 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 (b) 단계의 시약은 바이설파이트, 다이설파이트, 하이드로젠 설파이트 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바이설파이트(bisulfite)가 처리된 DNA 상의 비메틸화된(unmethylated) 시토신(C) 염기는 탈아민화(deamination)되어 우라실(U) 염기로 바뀌는 반면, 메틸화된 시토신 염기는 그대로 시토신으로 남아있게 된다. 즉, 바이설파이트 처리에 의해 DNA 상에서 시토신 염기의 메틸화 유무에 따라 서로 구별할 수 있도록 다른 염기로 표지된다.

본 발명의 상기 (c) 단계의, 메틸화 검출을 위한 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 메틸화 검출을 위해 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합으로 처리되어 변형된 염기서열도 본 발명에 따른 메틸화 검출을 위한 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 서열의 범위에 포함될 수 있다. 상기 변형된 염기서열은 서열번호 1의 염기서열에서 시토신 염기를 우라실 또는 혼성화 과정에서 시토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변환되도록 처리된 것일 수 있다.

또한, 상기 (c) 단계의 메틸화 검출은 바이설파이트 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis), 시퀀싱 바이 라이게이션(sequencing by ligation), 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR 또는 핵산 칩 등의 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바이설파이트 시퀀싱 방법은 메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 방법으로, 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 메틸화-비의존적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하지 않고 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭된 산물을 시퀀싱 프라이머를 이용하여 Sanger 방법으로 시퀀싱하거나 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS) 방법으로 분석하여 메틸화 핵산을 검출할 수 있다.

여기서 차세대 시퀀싱 방법은 시퀀싱 바이 신세시스(Sequencing by synthesis)와 시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation) 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법의 특징은 bacterial clone을 만드는 대신 단일 DNA 단편을 공간적으로 분리하여 in situ로 증폭하고(clonal amplification), 시퀀싱을 해낸다는 것이다. 이때, 수십 만개의 단편을 동시에 읽어내기 때문에 매시브 페러럴 시퀀싱(massive parallel sequencing) 방법으로 불리기도 한다. 기본적으로는 시퀀싱 바이 신세시스 방법이며, 모노 혹은 디뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가면서 시그널을 얻는 방법을 사용하는데 파이로시퀀싱, ion torrent, Solexa 방법들이 여기에 해당한다.

시퀀싱 바이 신세시스에 기반하는 NGS 장비로는 로슈(Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나(Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지(Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 마지막으로 퍼시픽바이오사이언스(Pacific BioSciences)사의 PacBio 플랫폼이 있다. 454와 Ion PGM은 클로날증폭(clonal amplification) 방법으로 emulsion PCR을 사용하며, HiSeq은 브릿지 증폭(Bridge amplification)을 사용한다. 시퀀싱 바이 신세시스 방법은 한 개의 뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가며 DNA를 합성시켜 나갈 때 발생되는 인산(phosphate), 수소이온, 혹은 미리 붙여 놓은 형광을 검출하여 서열을 읽어 나간다. 서열을 검출하는 방법에 있어, 454는 인산을 이용하는 파이로시퀀싱(pyroseqeuncing) 방법을 사용하며, Ion PGM은 수소이온 검출을 이용한다. HiSeq과 PacBio는 형광을 검출하여 서열을 해독한다.

시퀀싱 바이 라이게이션은 DNA ligase를 이용하는 시퀀싱 기술로 DNA 염기서열에 존재하는 특정 위치의 뉴클레오티드를 확인하는 기술이다. 대부분의 시퀀싱 기술이 중합효소를 사용하는 것과 달리 중합효소를 사용하지 않으며 DNA ligase가 미스매치 서열을 라이게이션(ligation)하지 않는 특징을 이용한다. SOLiD 시스템이 여기에 해당한다. 이 기법에서는 간격을 두면서 두 개씩 염기를 읽는데, 프라이머 리셋(primer reset)을 통해 독립적으로 다섯 번을 반복하기 때문에, 최종적으로는 각 염기를 두 번씩 중복하여 읽어서 정확도를 높인다.

시퀀싱 바이 라이게이션의 경우, 16개 조합으로 만들어진 디뉴클레오티드 프라이머 세트 중, 해당 염기서열에 대응되는 디뉴클레오티드 프라이머가 순차적으로 라이게이션되며, 이 라이게이션들의 조합을 최종적으로 분석하여 해당 DNA의 염기서열이 완성된다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 메틸화는 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 염기서열 변화를 통해 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 (d) 단계의 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 수준 감소는 서열번호 1의 염기서열 중 35, 51, 55, 77, 82, 90, 103, 105, 114, 129, 135, 142, 156, 164, 173, 177, 183, 187, 194, 212, 217, 222, 225, 254, 265, 275, 295, 302, 323, 328, 340, 346, 351, 380, 410 및 434번째 시토신에서 정상 대조군에 비해 메틸화가 감소된 것일 수 있다(표 4 및 5 참고; 상기 위치는 서열번호 1의 염기서열의 첫 번째 위치(94,820,155)를 기준으로 표 4 및 5의 p 값이 0.05 이하인 위치를 순차적으로 기재한 것임).

본 발명은 또한, CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화를 검출할 수 있는 물질을 포함하는데, CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화가 정상 대조군에 비해 감소한 경우 소혈관폐색증으로 결정될 수 있다. 상기 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물에 있어서, 상기 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 메틸화된 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 메틸화된 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 메틸화된 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머 및 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부의 검출은 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로 처리된 게놈 DNA를 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질과 접촉시켜 확인되는 것일 수 있고, 상기 게놈 DNA는 소혈관폐색증 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 시료로부터 분리된 것일 수 있고, 바람직하게는 혈액 시료로부터 분리된 게놈 DNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물에 있어서, 상기 메틸화는 바이설파이트 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis), 시퀀싱 바이 라이게이션(sequencing by ligation), 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR 또는 핵산 칩 등의 방법에 의하여 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 소혈관폐색증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 소혈관폐색증 예측 또는 진단용 키트는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 유효성분으로 포함하고 있어, 생물학적 시료로부터 분리된 게놈 DNA 시료를 대상으로, CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화를 검출하여 소혈관폐색증을 예측 또는 진단할 수 있다.

상기 게놈 DNA 시료는 CpG-함유인 것이 바람직하다. 통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이나, 이에 한정되지 않으며, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 포함할 수 있다. 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유할 수 있다.

본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 샘플의 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 두 번째 용기 및 메틸화 CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 프라이머는 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하기 위한 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 정량 PCR, 핵산 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 또는 시퀀싱 바이 라이게이션에 사용하기 위한 프라이머일 수 있다. 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 시료 준비

본 발명의 소혈관폐색증(small vessel occlusion) 예측 또는 진단을 위한 DNA 메틸화 마커의 개발을 위해 하기 실험 대상을 모집하였고, 이들의 혈액 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하여 메틸화 분석에 사용하였다. 모집된 대상 중, 하기 표 1의 기준으로 실험 대상을 선별하였고, 정상군은 총 104명, 소혈관폐색증 환자군은 총 58명이 최종 선발되었다. 선발된 실험 대상 개체에 대해 신체적 특성 및 혈액 분석을 수행하였다(표 2 및 3).

실험 대상

정상군

고혈압, 당뇨, 고지혈, 심장질환, 중풍(인지,비인지) 없는 사람,
혈액응고제 미 복용자,
BMI 25(남성) 또는 23(여성) 이하, 및 BMI 20 이상인 사람.
대사성 질환 및 중풍 질환 제외.
* 비만의 기준은 한국인 비만 기준(한국비만학회 기준)에 따라 선정하였으며, 고혈압, 당뇨, 고지혈증은 과거력 자료에 기반하여 선정

소동맥폐색증 환자군

고혈압, 당뇨, 고지혈, 심장질환 없는 사람,
혈액응고제 미 복용자,
MRI에 의해 소동맥폐색증으로 진단된 환자,
BMI 25 이하.

또한, 본 발명은 한국한의학연구원 기관생명윤리심의위원회의 승인을 받아 진행되었으며, 임상 설문 자료 수집 및 인체유래물 수집은 피험자의 서면 동의를 획득한 후에 진행되었다.

2. 메틸화 분석

상기 정상군 및 소혈관폐색증 환자군 실험 대상 중 각 4개체의 게놈 DNA 시료를 선별하여 WGBS(whole genome bisulfite sequencing)를 수행하였다. WGBS의 분석은 마크로젠(한국)에 의뢰하여 수행하였으며, WGBS의 분석을 통해 정상군과 소혈관폐색증 환자군에서 메틸화 비율에 차이가 있는 지역을 선정하여, 정상군 97개 시료, 소혈관폐색증 환자군 56개 시료를 대상으로 해당 위치에 대해 바이설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)을 수행하였다. 바이설파이트 시퀀싱은 (주)엘에이에스(한국)에 의뢰하여 수행하였으며, 일루미나 MiSeq. 플랫폼을 사용하였다. 분석에 사용된 참조 서열은 UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에서 Human GRCh37/hg19을 이용하였다.

실시예 1. WGBS를 통한 분석 지역 선정

정상군 및 소혈관폐색증 환자군 유래 게놈 DNA 시료의 WGBS 분석을 통해 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위에서 양 그룹간 메틸화 수준에 유의성 있는 차이가 있는 지역이 확인되었다.

실시예 2. CYP26C1 유전자의 프로모터 부위(hg19:chr10: 94,820,155-94,820,614) 메틸화 분석을 통한 정상군과 소혈관폐색증 환자군간의 검정

CYP26C1 유전자의 프로모터 부위를 대상으로 모집된 실험 대상 전부의 게놈 DNA 시료를 이용하여 메틸화 여부를 확인하였다. 그 결과, 하기 표 4 및 5와 같이 소혈관폐색증 환자군 시료에서 36개의 시토신 위치에서 정상군 대비 메틸화 수준이 감소된 것이 확인되었다(p < 0.05).

상기 결과를 통해, CYP26C1 유전자의 프로모터 부위에 메틸화 수준이 감소된 경우 소혈관폐색증을 예측 또는 진단할 수 있을 것으로 사료되었으며, 본 발명의 CYP26C1 유전자가 소혈관폐색증 예측 또는 진단을 위한 특이적 메틸화 바이오마커로서 사용가능함을 확인할 수 있었다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Method for providing information of prediction and diagnosis of small vessel occlusion using methylation level of CYP26C1 gene and composition therefor <130> PN18457 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 460 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagagaaagg cacctagaag ctcgagggcg gggacggcag agggagccag cggccggggg 60 tgggccagga gcactgcggg gcgcaagccc gggtcagttc tgcgcgttgg gttcgcccac 120 tttctgagcg cctgcgaaga gcggggaagc tctggcgcga acccgcaggc cccgcccgag 180 gacgctcgcg gggcgagccc ccagcccagc tcgagccgcc ccggcgcctg ccactcccta 240 ctcagagccc ctccgtgagc gcgccgctgc ccaccgcctc caatcaccac tctgcgtgga 300 gcgctttaaa tatgcaaaga cacgtcacgt tgtgtgaacc gggatcggtc cgtagggggg 360 gagccaatat ctatataaac gtgtccagcg tgggccaaga agggttaaac gactggagga 420 gggacaggtg gggcgggggt ctgcagacca ggttggcaac 460

Claims

분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위 메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 메틸화를 정상 대조군 시료의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화와 비교하는 단계를 포함하는, 소혈관폐색증 (small vessel occlusion)의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
(a) 정상 대조군 및 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 상이하게 변형시키는 바이설파이트, 다이설파이트, 하이드로젠 설파이트 또는 이들의 조합으로 처리하는 단계;
(c) 상기 바이설파이트, 다이설파이트, 하이드로젠 설파이트 또는 이들의 조합으로 처리된 게놈 DNA 또는 이의 단편에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화를 검출하는 단계; 및
(d) 정상 대조군의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화 수준과 비교하여 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 검출된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위 메틸화 수준이 감소되면 소혈관폐색증으로 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 소혈관폐색증 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 메틸화의 검출은 바이설파이트 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis), 시퀀싱 바이 라이게이션(sequencing by ligation), 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR 또는 핵산 칩의 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 메틸화는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 염기서열 변화를 통해 검출하는 것을 특징으로 하는 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 (Cytochrome P450 Family 26 Subfamily C Member 1) 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 메틸화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 메틸화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 메틸화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP26C1 유전자의 프로모터 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소혈관폐색증의 예측 또는 진단용 조성물.
삭제
제8항 또는 제9항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 소혈관폐색증 예측 또는 진단용 키트.