KR102252036B1

KR102252036B1 - Cmip 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물

Info

Publication number: KR102252036B1
Application number: KR1020190121848A
Authority: KR
Inventors: 박재호; 황진택; 최효경; 정상원; 성미정
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2019-10-01
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2021-05-14
Also published as: KR20210039241A

Abstract

본 발명의 비만 특이적 마커 유전자의 메틸화를 검출함으로써 비만의 발병을 조기에 예측 및 진단할 수 있다. 본 발명의 CMIP 메틸화 바이오마커는 비만의 위험성 평가, 진단 및 치료 타겟의 선정에도 활용될 수 있다.

Description

CMIP 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물{Method for providing information of prediction and diagnosis of obesity using methylation level of CMIP gene and composition therefor}

본 발명은 CMIP 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 CMIP(C-Maf Inducing Protein) 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법, 비만의 예측 또는 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

비만은 그 자체의 위험성보다 비만으로 인해 유발될 수 있는 여러 합병증 때문에 그 심각성이 더욱 크게 인식되고 있다. 비만은 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 대사증후군, 지방간, 관절 이상, 및 암 발병 위험을 증가시킨다고 알려져 있다. 2010년 세계보건기구에서 발표한 바에 따르면, 정상 체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상(고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배) 높게 나타났다. 상기 질환들 이외에도 여성의 경우 체지방이 과다하면 성호르몬의 균형이 깨져 심한 경우 불임증을 초래할 수 있고, 자궁내막암과 유방암의 위험성이 높아진다고 알려져 있다. 더불어 비만은 신체적인 질환 뿐 만 아니라 사회적 고립감이나 소외, 자신감 결여, 및 우울감과 같은 정신적 질환을 유발할 수 있으므로 비만의 예방 및 치료에 대한 필요성은 매우 중요하게 인식되고 있다.

비만의 발병은 유전적 요인, 환경적 요인, 그리고 식이요인이 복합적으로 작용하여 일어나는데, 식이요인 중에서는 고지방식이(high-fat diet, HFD)로 대표되는 고열량식이가 비만의 주요 원인으로 손꼽힌다. 잘못된 식습관으로 인해 비만해지면 내당불내성, 고혈압, 고지혈증과 같은 증상으로 대표되는 대사증후군이 생길 가능성이 높아지며, 비알코올성 지방간의 발병 위험도 함께 증가한다.

대사증후군과 비알코올성 간질환은 일반적으로 인슐린 저항성(insulin resistance)과 연관이 있는 것으로 알려져 있지만 아직 명확한 원인 기전은 밝혀지지 않았다. 특히 간은 탄수화물·지질·단백질의 합성, 분해, 저장 등 대사의 중심이 되는 기관으로, 비만한 경우 간 조직에서 인슐린 저항성이 나타나고 간의 탄수화물 및 지질대사가 변화하며, 결과적으로 비알코올성 지방간의 위험이 높아진다고 알려져 있다. 뿐만 아니라 간에 지방이 축적되면 간조직에서 염증성 지표들이 높아진다고 보고되고 있다.

최근에는 후성유전학적 연구 방법 및 기술이 발전함에 따라, 비만으로 인해 간 조직에서 대사 교란이 일어나고 염증반응이 증가하는 원인을 후성유전학 차원에서 규명하고자 하는 연구들이 증가하고 있다. 후성유전적 변화는 DNA 염기 서열의 변화 없이 유전자 발현을 조절할 수 있으며, 가역적이고 대를 이어 유전되는 특징을 가진다. 특히, DNA 메틸화는 후성유전학적 변화의 주요 기전으로서, 식이요인이 건강에 미치는 영향을 밝히기 위해 많은 연구자들이 이에 관심을 가지고 연구하고 있다. 고지방식이가 DNA 메틸화 패턴 변화에 미치는 영향에 대한 연구는 간 조직을 비롯하여 지방조직과 근육 조직을 대상으로 이루어지고 있다. 고지방식이가 DNA 메틸화 변화에 미치는 영향을 개별 유전자 수준에서 분석한 연구가 대다수이며 high-throughput 방법을 통한 전장 유전체 수준(genome-wide)의 연구는 매우 부족한 실정이다.

임신 기간부터 시작하여 성인기까지 지속적으로 고지방식이를 섭취한 경우의 DNA 메틸화 패턴 변화를 전장 유전체 수준에서 분석한 연구가 있지만, DNA 메틸화 패턴은 임신/수유 기간 뿐만 아니라 성인기에도 영향을 받을 수 있기 때문에 성인기에 고지방식이를 섭취하는 것이 전장 유전체 차원의 DNA 메틸화 패턴 변화에 미치는 영향 역시 연구가 필요하다.

본 발명자들은 비만의 예측 또는 진단을 위한 특이적 메틸화 바이오마커를 발굴하기 위해 노력하였다. 그 결과, 정상군과 비만군의 시료에 대한 유전체 메틸화 분석을 수행하여, 두 그룹간에 메틸화 수준에 현저한 차이가 있는 CMIP(c-Maf inducing protein) 유전자의 인트론 부위를 확인하고, 해당 부위에 대한 DNA 메틸화 시퀀싱을 수행하여 비만군에서 상기 부위의 메틸화 수준 감소가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 비만의 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비만의 예측 또는 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면 CMIP(C-Maf Inducing Protein) 유전자의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 비만의 예측 또는 진단을 위한 특이적 메틸화 바이오마커를 발굴하기 위해 노력하였고 그 결과, 정상군과 비만군의 시료에 대한 유전체 메틸화 분석을 수행하여, 두 그룹간에 메틸화 수준에 현저한 차이가 있는 CMIP 유전자의 인트론 부위를 확인하고, 해당 부위에 대한 DNA 메틸화 시퀀싱을 수행하여 비만군에서 상기 부위의 메틸화 수준 감소가 있음을 규명하였다.

본 발명의 비만 특이적 메틸화 마커 유전자는 비만 위험성 평가, 예측, 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이 있다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화는 CMIP 유전자의 프로모터 부위, 5' 비전사 영역(5' untranslated region), 인트론 또는 엑손 부위에서 검출하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 영역에서 검출하는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 상기 메틸화된 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 메틸화된 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 상기 메틸화된 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 메틸화는 바이설파이트 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis), 시퀀싱 바이 라이게이션(sequencing by ligation), 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR 또는 핵산 칩 등의 방법에 의하여 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바이설파이트 시퀀싱 방법은 메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 방법으로, 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 메틸화-비의존적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 상기 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제는 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트(bisulfite)가 처리된 DNA 상의 비메틸화된(unmethylated) 시토신(C) 염기는 탈아민화(deamination)되어 우라실(U) 염기로 바뀌는 반면, 메틸화된 시토신 염기는 그대로 시토신으로 남아있게 된다. 즉, 바이설파이트 처리에 의해 DNA 상에서 시토신 염기의 메틸화 유무에 따라 서로 구별할 수 있도록 다른 염기로 표지된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하지 않고 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭된 산물을 시퀀싱 프라이머를 이용하여 Sanger 방법으로 시퀀싱하거나 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS) 방법으로 분석하여 메틸화 핵산을 검출할 수 있다.

상기 차세대 시퀀싱 방법은 시퀀싱 바이 신세시스(Sequencing by synthesis)와 시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation) 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법의 특징은 bacterial clone을 만드는 대신 단일 DNA 단편을 공간적으로 분리하여 in situ로 증폭하고(clonal amplification), 시퀀싱을 해낸다는 것이다. 이때, 수십 만개의 단편을 동시에 읽어내기 때문에 매시브 페러럴 시퀀싱(massive parallel sequencing) 방법으로 불리기도 한다. 기본적으로는 시퀀싱 바이 신세시스 방법이며, 모노 혹은 디뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가면서 시그널을 얻는 방법을 사용하는데 파이로시퀀싱, ion torrent, Solexa 방법들이 여기에 해당한다.

시퀀싱 바이 신세시스에 기반하는 NGS 장비로는 로슈(Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나(Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지(Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 마지막으로 퍼시픽바이오사이언스(Pacific BioSciences)사의 PacBio 플랫폼이 있다. 454와 Ion PGM은 클로날증폭(clonal amplification)방법으로 emulsion PCR을 사용하며, HiSeq은 브릿지 증폭(Bridge amplification)을 사용한다. 시퀀싱 바이 신세시스 방법은 한 개의 뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가며 DNA를 합성시켜 나갈 때 발생되는 인산(phosphate), 수소이온, 혹은 미리 붙여 놓은 형광을 검출하여 서열을 읽어 나간다. 서열을 검출하는 방법에 있어, 454는 인산을 이용하는 파이로시퀀싱(pyroseqeuncing) 방법을 사용하며, Ion PGM은 수소이온 검출을 이용한다. HiSeq과 PacBio는 형광을 검출하여 서열을 해독한다.

시퀀싱 바이 라이게이션은 DNA ligase를 이용하는 시퀀싱 기술로 DNA 염기서열에 존재하는 특정 위치의 뉴클레오티드를 확인하는 기술이다. 대부분의 시퀀싱 기술이 중합효소를 사용하는 것과 달리 중합효소를 사용하지 않으며 DNA ligase가 미스매치 서열을 ligation하지 않는 특징을 이용한다. SOLiD 시스템이 여기에 해당한다. 이 기법에서는 간격을 두면서 두 개씩 염기를 읽는데, 프라이머 리셋(primer reset)을 통해 독립적으로 다섯 번을 반복하기 때문에, 최종적으로는 각 염기를 두 번씩 중복하여 읽어서 정확도를 높인다.

메틸화 특이 PCR, 실시간 메틸화 특이 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR은 PCR을 기반으로 메틸화를 검출하는 방법이다.

메틸화 특이 PCR 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변형된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하고 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작한다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변형시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석한다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 혼합할 경우, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있는 특징을 이용한 것이다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정한다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 비만의 예측 또는 진단용 키트는, CMIP 유전자의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 유효성분으로 포함하고 있어, 생물학적 시료로부터 분리된 게놈 DNA 시료를 대상으로 CMIP 유전자의 메틸화를 검출하여 비만을 예측 또는 진단할 수 있다.

상기 게놈 DNA 시료는 CpG를 함유하는 것이 바람직하다. 통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이나, 이에 한정되지 않으며, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 포함할 수 있다. 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유할 수 있다.

본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 프라이머는 게놈상에서 메틸화가 일어났는지 여부를 검출하기 위한 PCR, 메틸화 특이 PCR, 실시간 메틸화 특이 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 정량 PCR, 핵산 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 또는 시퀀싱 바이 라이게이션에 사용하기 위한 프라이머일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 분리된 생물학적 시료로부터 CMIP(C-Maf Inducing Protein) 유전자의 메틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하는 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화 여부 측정은 CMIP 유전자의 프로모터, 5'UTR(Untranslated region), 인트론 및 엑손 중 어느 한 부위에 위치하는 CpG의 메틸화를 측정하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 영역의 CpG 의 메틸화를 측정하는 것일 수 있다.

상기 메틸화 여부를 측정하는 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 비만 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 상기 방법은 정상 대조군의 CMIP 유전자의 메틸화와 비교하여 CMIP 유전자의 메틸화 수준이 감소하면 비만으로 결정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

도 1은 고지방고당 식이에 따른 마우스의 체중 증가를 측정한 결과이다.
도 2a는 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 후 마우스의 간 무게를 측정한 결과이다.
도 2b는 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 후 마우스의 부고환 지방 무게를 측정한 결과이다.
도 2c는 고지방고당 식이를 24주 동안 공급한 후 마우스의 간 무게를 측정한 결과이다.
도 2d는 고지방고당 식이를 24주 동안 공급한 후 마우스의 부고환 지방 무게를 측정한 결과이다.
도 3은 고지방고당 식이를 12주, 24주 동안 공급한 마우스에서 Cmip 유전자의 DNA 메틸화 수준을 측정한 결과이다.
도 4는 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 마우스의 간에 대하여 메틸화 시퀀싱을 실시한 결과이다.
도 5a는 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 후 마우스의 간에서 Cmip 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 5b는 고지방고당 식이를 24주 동안 공급한 후 마우스의 간에서 Cmip 유전자의 발현을 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 비만 동물 모델 구축

8주 연령의 C57BL/6N 수컷 마우스를 중앙실험동물(서울, 대한민국)에서 구입하여, 1주 동안 일반사료 98052602(Research Diets, Inc., NJ, USA)를 제공하여 안정화 시켰다. 고지방고당 식이(high-fat and high-sucrose diet, D12079B, Research Diets, Inc.)와 일반사료 98052602(Research Diets, Inc.)를 제공하면서 몸무게 기록 후 12주, 24주째에 간 및 지방 조직을 분리하였다.

대조군과 비교하여 고지방고당 식이를 공급한 마우스에서 몸무게와 간 및 부고환 지방 무게가 현저히 증가하였으며, 이를 통해 비만이 유도되었음을 확인하였다(도 1, 도 2a 내지 2d).

실시예 2. 메틸화 분석

2-1. RRBS 라이브러리 구축

MspI 및 ApeKI을 포함하는 RRBS 라이브러리를 구축하기 위해 지노믹 DNA 500 ng을 MspI(NEB, Ipswich, MA, USA)과 37℃에서 7시간 동안 반응시켰다. 그 다음, ApeKI(NEB)을 첨가하여 75℃에서 16 내지 20시간 동안 반응시켰다. 제한효소로 절단된 산물은 MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen, Venlo, Netherlands)로 정제하였다. 정제 후 dA를 첨가하고, 메틸화된 어댑터를 연결시켰다. 전기영동을 실시하고 아가로스 겔에서 160-420 bp 크기의 슬라이스를 분리하였다. 제조사의 지시에 따라 ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO Research, Irvine, CA, USA)를 이용하여 바이설파이트 전환을 수행하였다.

PfuTurbo Cx Hotstart DNA polymerase(Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하여 최종 라이브러리를 얻었다. RRBS 라이브러리는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 분석하였다.　샘플을 시퀀싱하기 전에 시퀀싱 가능한 라이브러리 단편의 양을 qPCR을 통해 결정하였다. 이어서, 샘플은 용출 버퍼(QIAGEN)를 이용하여 10 nM로 희석하였다. RRBS 라이브러리는 NextSeq500 (Illumina, San Diego, CA, USA)로 시퀀싱하였다.

2-2. RRBS 데이터 분석

Raw reads의 퀄리티를 조절하기 위해 FastQC v0.11.2 (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 실시하고, trim galore v0.4.1(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 이용하여 어댑터 시퀀싱을 절단하였다. 절단된 서열은 BS-seeker2 v2.0.10 (Guo et al., 2013)를 이용하여 쥣과의 레퍼런스 게놈(mm10)에 얼라인하였다. RRBS 라이브러리의 MspI 및 ApeKI 단편을 커버하기 위해 in silico에서 30 내지 500 bp 길이 범위의 이중 효소 MspI(CCGG) 및 ApeKI(GCWGC) 단편을 구축하였다. 리드(read) 당 4개의 불일치를 허용하도록 하여 로컬 얼라인먼트 모드에서 Bowtie2로 리드를 얼라인하였다. 맵핑 비율을 향상시키기 위해 맵핑되지 않은 리드를 페어드-엔드(paried-end) 모드에서 재맵핑하였다. 두 개의 페어드-엔드 메이트가 겹치는 경우, 하나의 메이트를 제거한 후 각 CpG 사이트의 메틸화 수준을 측정하였다.

12주, 24주째에 고지방고당식이, 대조식이 군에서 각 3마리씩 선별(몸무게 기준)하여 간 및 지방조직에서 DNA 추출 후 RRBS 방법으로 전장 유전체의 DNA 메틸화 변화를 분석하여, 12주, 24주째의 간 조직에서 Cmip 유전자 인트론에 위치한 CpGs 에서 고지방고당 식이에 의한 메틸화 감소를 확인하였다(q < 0.05, 20% 이상 감소)(도 3).

2-3. 통계처리를 통한 Cmip 메틸화 부위 선발

그룹간 DMR(100 bp)를 식별하기 위해 커스텀 Perl 스크립트를 사용하였다. 간단히 설명하면, 게놈상의 DNA 메틸화 수준은 레퍼런스 게놈(mm10)을 통해 고정된 크기 윈도우(100 bp)를 50 bp 단위로 슬라이딩시킴으로써 프로파일링하였다. 주어진 윈도우에서 모든 CpG 부위의 DNA 메틸화 비율(0 내지 1)을 Mann-Whitney U 테스트(q < 0.05)를 사용하여 두 그룹(12주 및 24주에 HFHS 대 대조군) 사이에서 비교하였다. 신뢰할 수 없는 DMR 후보를 걸러내기 위해 10개 미만의 판독 값으로 커버되거나 그룹간 평균 차이가 < 0.2를 나타내는 영역은 제거하였다. 확인된 DMR은 UCSC 레퍼런스 유전자 주석(mm10)과 함께 HOMER(v5.7)를 사용하여 주석을 달았다.

선별 부위의 개별 CpG 메틸화 변화를 BSAS(bisulfite amplicon sequencing) 방법을 활용하여 분석하여 10개의 CpGs에서 고지방고당 식이에 의해 DNA 메틸화 감소가 유도됨을 BSAS 방법을 활용하여 확인하였다(도 4).

	Position		Gene	Tissue	Genomic region	Strand
#CpG	Chr	Loci	Gene	Tissue	Genomic region	Strand
CpG1	8	117,325,154	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG2	8	117,325,176	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG3	8	117,325,179	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG4	8	117,325,186	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG5	8	117,325,224	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG6	8	117,325,243	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG7	8	117,325,249	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG8	8	117,325,271	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG9	8	117,325,289	Cmip	Liver	Intron	(+)
CpG10	8	117,325,314	Cmip	Liver	Intron	(+)

2-4. Real-time RT-PCR 활용 유전자 발현 분석

제조사의 지시에 따라 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 세포로부터 RNA를 분리하였다. 500 ng의 총 RNA와 역전사 효소(TOYOBO, Osaka, Japan)를 30℃에서 10분, 42℃에서 20분 및 99℃에서 5분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. SYBR green super mix(TOYOBO) 및 thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 95℃에서 10초, 58℃에서 10초, 72℃에서 20초의 반응을 40회 반복하고 최종 멜팅 커브 스텝을 실시하여 유전자를 증폭시켰다.

비만 동물모델의 간 조직에서 Cmip 유전자 발현분석을 실시하여 DNA 메틸화 감소에 의해 Cmip 발현이 증가함을 확인하였다(도 5a 및 5b).

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Method for providing information of prediction and diagnosis of obesity using methylation level of CMIP gene and composition therefor <130> PN190266 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMIP Human <400> 1 tacgctggct ttgcggcagg ggtgcagcag cagtgggtgg tgatgcggct gctcttgagt 60 ggcctggtgg ggtcatttca gtttcaaggc cttggagagt gtgcttagca ggtggggcct 120 aagatttgca tttcagctgc ccaggtagtc aagaagcggt atagcaaagc ggctgtgagc 180 ccattctctg gagtcctgct 200 <210> 2 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMIP Mouse <400> 2 gatgcggctg ctctgaggag ccctgtcgtc gaactccgcc ctcaggtggc ctcatctggc 60 ctgaggttct ccaacggtca gatgtccaca gcccggagac ggctgtttga actgttgctg 120 gcgtgcacag ccccttggac gtcttatcct tgttgggcct tattcgtatt 170

Claims

서열번호 2로 표시되는 마우스 CMIP(C-Maf Inducing Protein) 유전자의 8번 염색체 117,325,154 내지 117,325,314번째 염기 사이에 존재하는 CpG의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 메틸화된 CpG의 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 메틸화된 CpG의 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 메틸화된 CpG의 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 비만의 예측 또는 진단용 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항의 조성물을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 키트.
분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 2로 표시되는 마우스 CMIP(C-Maf Inducing Protein) 유전자의 8번 염색체 117,325,154 내지 117,325,314번째 염기 사이에 존재하는 CpG의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 방법은 정상 대조군의 CpG의 메틸화와 비교하여 CpG의 메틸화 수준이 감소하면 비만으로 결정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 비만 의심 또는 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 메틸화를 측정하는 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.