KR102409747B1

KR102409747B1 - Snx20 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 조성물 및 이를 위한 정보 제공방법

Info

Publication number: KR102409747B1
Application number: KR1020200094589A
Authority: KR
Inventors: 박재호; 황진택; 정민유; 최효경; 정상원
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2022-06-16
Also published as: KR20220014672A

Abstract

본 발명은 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 키트 및 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비만 예측 또는 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.

Description

SNX20 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 조성물 및 이를 위한 정보 제공방법{Composition for predicting or diagnosing obesity using methylation level of SNX20 gene and method for providing information therefore}

비만은 그 자체의 위험성보다 비만으로 인해 유발될 수 있는 여러 합병증 때문에 그 심각성이 더욱 크게 인식되고 있다. 비만은 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 대사증후군, 지방간, 관절 이상, 및 암 발병 위험을 증가시킨다고 알려져 있다. 2010년 세계보건기구에서 발표한 바에 따르면, 정상 체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상 (고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배) 높게 나타났다. 상기 질환들 이외에도 여성의 경우 체지방이 과다하면 성호르몬의 균형이 깨져 심한 경우 불임증을 초래할 수 있고, 자궁내막암과 유방암의 위험성이 높아진다고 알려져 있다. 더불어 비만은 신체적인 질환뿐만 아니라 사회적 고립감이나 소외, 자신감 결여, 및 우울감과 같은 정신적 질환을 유발할 수 있으므로 비만의 예방 및 치료에 대한 필요성은 매우 중요하게 인식되고 있다.

비만의 발병은 유전적 요인, 환경적 요인, 그리고 식이요인이 복합적으로 작용하여 일어나는데, 식이요인 중에서는 고지방식이 (high-fat diet, HFD) 또는 고당식이 (high-sucrose diet, HFS)로 대표되는 고열량식이가 비만의 주요 원인으로 손꼽힌다. 잘못된 식습관으로 인해 비만해지면 내당불내성, 고혈압, 고지혈증과 같은 증상으로 대표되는 대사증후군이 생길 가능성이 높아지며, 비알코올성 지방간의 발병 위험도 함께 증가한다.

대사증후군과 비알코올성 간질환은 일반적으로 인슐린 저항성 (insulin resistance)과 연관이 있는 것으로 알려져 있지만 아직 명확한 원인 기전은 밝혀지지 않았다. 특히 간은 탄수화물·지질·단백질의 합성, 분해, 저장 등 대사의 중심이 되는 기관으로, 비만한 경우 간 조직에서 인슐린 저항성이 나타나고 간의 탄수화물 및 지질대사가 변화하며, 결과적으로 비알코올성 지방간의 위험이 높아진다고 알려져 있다. 뿐만 아니라 간에 지방이 축적되면 간 조직에서 염증성 지표들이 높아진다고 보고되고 있다.

최근에는 후성유전학적 연구 방법 및 기술이 발전함에 따라, 비만으로 인해 간 조직에서 대사 교란이 일어나고 염증반응이 증가하는 원인을 후성유전학 차원에서 규명하고자 하는 연구들이 증가하고 있다. 후성유전적 변화는 DNA 염기 서열의 변화 없이 유전자 발현을 조절할 수 있으며, 가역적이고 대를 이어 유전되는 특징을 가진다. 특히, DNA 메틸화는 후성유전학적 변화의 주요 기전으로서, 식이요인이 건강에 미치는 영향을 밝히기 위해 많은 연구자들이 이에 관심을 가지고 연구하고 있다. 고지방고당 식이가 DNA 메틸화 패턴 변화에 미치는 영향에 대한 연구는 간 조직을 비롯하여 지방조직과 근육 조직을 대상으로 이루어지고 있다. 고지방고당 식이가 DNA 메틸화 변화에 미치는 영향을 개별 유전자 수준에서 분석한 연구가 대다수이며 high-throughput 방법을 통한 전장 유전체 수준 (genome-wide)의 연구는 매우 부족한 실정이다.

임신 기간부터 시작하여 성인기까지 지속적으로 고지방고당 식이를 섭취한 경우의 DNA 메틸화 패턴 변화를 전장 유전체 수준에서 분석한 연구가 있지만, DNA 메틸화 패턴은 임신/수유 기간뿐만 아니라 성인기에도 영향을 받을 수 있기 때문에 성인기에 고지방고당 식이를 섭취하는 것이 전장 유전체 차원의 DNA 메틸화 패턴 변화에 미치는 영향 역시 연구가 필요하다.

본 발명자들은 비만의 예측 또는 진단을 위한 특이적 메틸화 바이오마커를 발굴하기 위해 노력하였다. 그 결과, 정상군과 비만군의 시료에 대한 유전체 메틸화 분석을 수행하여, 두 그룹 간에 메틸화 수준에 현저한 차이가 있는 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 엑손 부위를 확인하고, 해당 부위에 대한 DNA 메틸화 시퀀싱을 수행하여 비만군에서 상기 부위의 메틸화 수준 증가가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 비만의 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비만의 예측 또는 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 비만의 예측 또는 진단을 위한 특이적 메틸화 바이오 마커를 발굴하기 위해 노력하였고 그 결과, 정상군과 비만군의 시료에 대한 유전체 메틸화 분석을 수행하여, 두 그룹 간에 메틸화 수준에 현저한 차이가 있는 SNX20 유전자의 엑손 부위를 확인하고, 해당 부위에 대한 DNA 메틸화 시퀀싱을 수행하여 비만군에서 상기 부위의 메틸화 수준 증가가 있음을 규명하였다.

이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.

본 발명의 일 예는 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 메틸화는 SNX20 유전자의 프로모터, 5' 비전사 영역 (5'Untranslated region), 인트론 및 엑손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위에서 존재하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 SNX20 유전자의 메틸화된 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트, SNX20 유전자의 메틸화된 부위와 혼성화 할 수 있는 프로브, 이중 가닥 DNA의 정량화를 위한 염색시약, SNX20 유전자의 메틸화된 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 SNX20 유전자의 메틸화는 서열번호 1로 이루어진 염기서열의 7,342번째, 7,344번째, 7,360번째, 7,363번째, 7,373번째, 7,378번째, 7,381번째, 7,385번째, 7,399번째, 7,418번째, 7,426번째, 7,428번째, 7,447번째, 7,449번째, 7,451번째, 7,462번째, 7,468번째, 7,477번째, 7,486번째, 7,488번째, 7,496번째, 7,500번째, 7,502번째, 7,524번째, 7,530번째, 7,533번째, 7,537번째, 7,542번째, 7,549번째, 7,579번째, 7,581번째, 7,584번째 및 7,587번째로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기에서 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 예는 비만의 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 메틸화는 SNX20 유전자의 프로모터, 5' 비전사 영역 (5'Untranslated region), 인트론 및 엑손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위에 존재하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 비만의 예측 또는 진단용 키트는, SNX20 유전자의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 유효성분으로 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 SNX20 유전자의 메틸화 여부는 생물학적 시료로부터 분리된 시료를 대상으로 SNX20 유전자의 메틸화를 검출하여 비만을 예측 또는 진단할 수 있다.

본 발명에 있어서 생물학적 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 생물학적 시료로부터 분리된 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물로부터 제공되는 게놈 DNA 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 게놈 DNA는 CpG를 함유하는 것이 바람직하다. 통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이나, 이에 한정되지 않으며, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 포함할 수 있다. 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫 번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두 번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세 번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 프라이머는 게놈상에서 메틸화가 일어났는지 여부를 검출하기 위한 PCR, 메틸화 특이 PCR, 실시간 메틸화 특이 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 정량 PCR, 핵산 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 또는 시퀀싱 바이 라이게이션에 사용하기 위한 프라이머일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는 하기의 단계를 포함하는 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다:

대상으로부터 수득한 생물학적 시료로부터 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화를 측정하는 단계.

본 발명에 있어서 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 정상 대조군의 SNX20 유전자의 메틸화 수준과 시료시부터 측정된 SNX20 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화를 측정하는 단계는 비만 위험성 평가, 예측, 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 생물학적 시료는 비만 의심 또는 진단 대상 개체 유래인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 메틸화는 SNX20 유전자의 프로모터 부위, 5' 비전사 영역 (5' untranslated region), 인트론 및 엑손 중 어느 한 부위에 위치하는 CpG의 메틸화를 측정하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 영역의 CpG의 메틸화를 측정하는 것일 수 있다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신 (5-mC)이 있다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며 (5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루 (alu)나 전이인자 (transposon)와 같이 게놈 내에 반복되는 염기서열 (repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자 외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다.

본 발명에 있어서 바이설파이트 시퀀싱 방법은 메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 방법으로, 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 메틸화-비의존적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제는 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트 (bisulfite)가 처리된 DNA 상의 비메틸화된 (unmethylated) 시토신(C) 염기는 탈아민화 (deamination)되어 우라실(U) 염기로 바뀌는 반면, 메틸화된 시토신 염기는 그대로 시토신으로 남아있게 된다. 즉, 바이설파이트 처리에 의해 DNA 상에서 시토신 염기의 메틸화 유무에 따라 서로 구별할 수 있도록 다른 염기로 표지된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하지 않고 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭된 산물을 시퀀싱 프라이머를 이용하여 생거 (Sanger)방법으로 시퀀싱하거나 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing, NGS) 방법으로 분석하여 메틸화 핵산을 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서 차세대 시퀀싱 방법은 시퀀싱 바이 신세시스 (Sequencing by synthesis)와 시퀀싱 바이 라이게이션 (Sequencing by ligation) 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법의 특징은 박테리아 클론 (bacterial clone)을 만드는 대신 단일 DNA 단편을 공간적으로 분리하여 in situ로 증폭하고 (clonal amplification), 시퀀싱을 해낸다는 것이다. 이때, 수십 만개의 단편을 동시에 읽어내기 때문에 매시브 페러럴 시퀀싱 (massive parallel sequencing) 방법으로 불리기도 한다. 기본적으로는 시퀀싱 바이 신세시스 방법이며, 모노 혹은 디뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가면서 시그널을 얻는 방법을 사용하는데 파이로시퀀싱, ion torrent, Solexa 방법들이 여기에 해당한다.

본 발명에 있어서 시퀀싱 바이 신세시스에 기반하는 NGS 장비로는 로슈 (Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나 (Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지 (Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 마지막으로 퍼시픽바이오사이언스 (Pacific BioSciences)사의 PacBio 플랫폼이 있다. 454와 Ion PGM은 클로날증폭 (clonal amplification)방법으로 emulsion PCR을 사용하며, HiSeq은 브릿지 증폭 (Bridge amplification)을 사용한다. 시퀀싱 바이 신세시스 방법은 한 개의 뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가며 DNA를 합성시켜 나갈 때 발생되는 인산 (phosphate), 수소이온, 혹은 미리 붙여 놓은 형광을 검출하여 서열을 읽어 나간다. 서열을 검출하는 방법에 있어, 454는 인산을 이용하는 파이로시퀀싱 (pyroseqeuncing) 방법을 사용하며, Ion PGM은 수소이온 검출을 이용한다. HiSeq과 PacBio는 형광을 검출하여 서열을 해독한다.

본 발명에 있어서 시퀀싱 바이 라이게이션은 DNA ligase를 이용하는 시퀀싱 기술로 DNA 염기서열에 존재하는 특정 위치의 뉴클레오티드를 확인하는 기술이다. 대부분의 시퀀싱 기술이 중합효소를 사용하는 것과 달리 중합효소를 사용하지 않으며 DNA 리가제 (ligase)가 미스매치 서열을 결찰 (ligation)하지 않는 특징을 이용한다. SOLiD 시스템이 여기에 해당한다. 이 기법에서는 간격을 두면서 두 개씩 염기를 읽는데, 프라이머 리셋 (primer reset)을 통해 독립적으로 다섯 번을 반복하기 때문에, 최종적으로는 각 염기를 두 번씩 중복하여 읽어서 정확도를 높인다.

본 발명에 있어서 메틸화를 측정하는 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 메틸화 특이 PCR, 실시간 메틸화 특이 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR은 PCR을 기반으로 메틸화를 검출하는 방법이다.

메틸화 특이 PCR 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변형된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하고 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작한다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변형시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 택맨 프로브 (Taqman probe)를 이용하여 검출하는 방법과 사이버그린 (Sybr green)을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열 내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석한다.

택맨 프로브 (Taqman probe)를 이용한 real-time PCR (Specific detection : fluorescent reporter probe method)는 프로브 한 쪽 끝에는 발광을 하는 리포터 염료 (reporter dye)가 다른 쪽 끝에는 퀀처 염료 (quencher dye)가 붙어있다. 이 두개의 염료가 가까이 있으면 발광 염료가 빛을 내지 못한다. PCR 중합반응에 의해 태크 폴리머라제 (Taq polymerase) 가 중합반응을 진행하여 프로브까지 도달하게 되고, 이후 폴리머라제의 가닥 변이 활동 (strand displacement activity)에 의해 프로브를 절단하게 된다. 이렇게 되면 리포터 염료가 퀀처 염료염부터 거리가 멀어지게 되어 빛을 발광하게 된다. 써모사이클러 (Thermocycler)가 이 빛을 감지하게 되는데, 동시 다발적으로 발생하는 빛의 양이 많아지면 임계값 (thereshold)를 넘어가게 되면 증폭이 발생한 것으로 인정되며, 이때의 cycle의 수를 Ct 값 (Ct value)라고 한다. 즉, Ct value가 작으면 적은 PCR 반응이 반복되어도 증폭이 발생한 것으로 인정되므로 주형 (template)로 사용되는 DNA의 양이 많은 것이 되며, 또한, Ct 값이 크면 DNA의 양이 적은 것이다. 따라서, 정량 분석이 가능한 것이 장점이다.

사이버 그린 (SYBR green)을 이용한 real-time PCR (Non-specific detection: Real-time PCR with double-stranded DNA-binding dyes as reporter)은 PCR이 진행됨에 따라 목적하는 서열이 증폭이 되면 DNA 양이 증가하게 되는데, 이중 가닥의 DNA (double standed DNA)에 끼어 들어가는 성질이 있는 염료인 SYBR Green의 양도 증가하게 된다. 이 염료는 DNA에 끼어 들어가면 발광을 하게 되는데, 따라서 증폭된 DNA 양에 비례하여 발광이 되기 때문에 검출이 가능하다. 이 방법은 택맨 프로브를 이용하는 방법에 비해 사이버 그린을 이용한 검출법은 프라이머 세트만 필요하므로 단가가 낮으며, 서로 다른 종류의 염료를 이용하여 멀티플렉스 (multiplex)도 가능한 장점이 있다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 혼합할 경우, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있는 특징을 이용한 것이다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 이들 분리된 DNA를 엑손 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정한다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA를 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 방법은 정상 대조군의 SNX20 유전자의 메틸화와 비교하여 SNX20 유전자의 메틸화 수준이 증가하면 비만으로 결정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 키트 및 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비만 예측 또는 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것으로, 본 발명은 비만의 발병을 조기에 예측 및 진단할 수 있으므로, 비만의 위험성 평가, 진단 및 치료 타겟의 선정에도 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이에 따라 마우스의 체중 증가를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 후 마우스의 간 무게를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 후 마우스의 부고환 지방 무게를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 22주 동안 공급한 후 마우스의 간 무게를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 22주 동안 공급한 후 마우스의 부고환 지방 무게를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 12주 및 22주 동안 공급한 마우스의 지방 조직에 대하여 Snx20 유전자의 DNA 메틸화 수준을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 마우스의 지방 조직에 대하여 메틸화 시퀀싱을 실시한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 후 마우스의 지방 조직에 대하여 Snx20 유전자의 발현을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 고지방고당 식이를 22주 동안 공급한 후 마우스의 지방 조직에 대하여 Snx20 유전자의 발현을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예. 비만 동물 모델 구축

7주령의 C57BL/6N 수컷 마우스를 중앙실험동물(서울, 대한민국)에서 구입하여, 1주 동안 일반사료 98052602 (Research Diets, Inc., NJ, USA)를 제공하여 안정화시켰다. 고지방고당 식이 (high-fat and high-sucrose diet, D12079B, Research Diets, Inc.)와 일반사료 98052602 (Research Diets, Inc.)를 제공하면서 몸무게를 기록하였다. 대조군 및 고지방고당 식이를 공급한 마우스의 몸무게를 측정한 후, 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

주차	대조군		고지방고당 식이를 공급받은 마우스
주차	Mean	S.D.	Mean	S.D.
0	22.00	0.00	22.50	0.00
1	23.74	0.62	25.28	1.43
2	24.65	0.61	27.19	1.70
3	25.14	0.72	28.99	1.95
4	26.15	0.96	31.19	2.40
5	26.58	1.05	32.89	2.65
6	26.11	1.70	33.61	2.92
7	27.97	1.61	35.84	3.02
8	29.12	1.76	37.56	3.15
9	30.43	2.05	39.09	3.29
10	31.63	2.03	39.95	3.13
11	31.66	2.60	40.30	2.93
12	31.04	3.72	41.49	1.66
13	32.78	2.75	41.51	2.85
14	33.12	2.49	41.83	2.61
15	34.55	2.65	43.16	2.97
16	35.01	2.84	43.72	2.73
17	35.63	3.09	44.13	2.78
18	35.99	3.04	45.03	2.68
19	35.97	2.90	44.68	2.86
20	36.08	2.70	45.17	2.70
21	35.62	3.30	45.08	3.12
22	36.62	3.50	45.59	2.90

실험 진행 12주 및 22주째에 대조군 및 고지방고당 식이를 공급한 마우스의 간 조직 및 부고환의 지방 조직을 분리하여 무게를 측정하여 그 결과를 표 2, 도 2a, 2b, 2c 및 2d에 나타내었다.

12 주	간 조직		지방
12 주	Mean	S.D.	Mean	S.D.
대조군	1.16	0.10	0.85	0.18
고지방고당 식이를공급받은 마우스	1.86	0.29	2.14	0.18
22 주	간 조직		지방 조직
22 주	Mean	S.D.	Mean	S.D.
대조군	1.69	0.41	1.74	0.58
고지방고당 식이를공급받은 마우스	3.30	0.58	2.65	0.51

표 2 및 도 2a 내지 2d에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 고지방고당 식이를 공급한 마우스에서 몸무게와 간 조직 및 부고환 지방 조직의 무게가 현저히 증가하였으며, 이를 통해 비만이 유도되었음을 확인하였다.

실시예 1. 메틸화 분석

1-1. 제한 효소를 이용한 지노믹 DNA 단편 제작 및 A-테일링을 통한 DNA 라이브러리 구축

메틸화 분석을 위한 DNA 라이브러리를 구축하기 위하여 감소된 표현 바이설파이트 염기서열분석(Reduced representation bisulfite sequencing; 이하, RRBS)을 이용하여 지방 조직으로부터 DNA 라이브러리 단편을 제조하였다.

고지방고당 식이 12주 및 22주때 채취한 마우스의 지방 조직을 조직 지노믹 DND 키트 (Tissue Genomic DNA kit)를 이용하여 지노믹 DNA를 추출하였다. 추출한 지노믹 DNA 500 ng을 제한효소인 MspI(NEB, Ipswich, MA, USA)과 37 ℃에서 7시간 동안 반응시킨 후, 제한효소인 ApeKI(NEB)을 첨가하여 75 ℃에서 16 내지 20시간 동안 반응시켰다. 상기 효소는 CpG 디뉴클레오티드 상류의 포스포디에스테르 결합을　절단한다.　이러한 특정 효소를 사용할 때, 각 단편은 각 끝에 CpG를 갖는다.　반응이 완료된 제한효소로 절단된 지노믹 DNA 산물은 MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen, Venlo, Netherlands)로 정제하였다.

단편으로 제작된 지노믹 DNA는 말단 부위가 완전히 이중나선 구조로 되어 있지 않으므로, 5'-말단에 인산기를 추가로 붙여 주었다.

단편으로 제작된 지노믹 DNA와 연결될 어댑터에는 3'-T 돌출부가 포함되어 있으므로 어댑터를 연결하기 전에 돌출부에 A-테일을 첨가하는 것은 필수적이다. 특히, A-테일의 효율을 증가시키기 위하여 dATP를 과량으로 첨가하였다. 이후, A-테일이 첨가된 부분에 메틸화된 어댑터를 연결시켰다. 연결이 잘 되었는지 확인하기 위하여 전기영동을 실시하였으며, 아가로스 겔에서 160-420 bp 크기의 슬라이스를 분리하였다.

바이설파이트 전환을 위한 DNA 라이브러리가 제조되었다. 이와 같이 제조된 DNA 라이브러리는 대부분의 프로모터 서열과 CpG 섬을 나타낼 수 있다.

1-2. DNA 라이브러리의 바이설파이트 전환 및 PCR을 이용한 증폭 및 서열의 분석

DNA 라이브러리의 메틸화 부위를 선별하기 위하여 ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO Research, Irvine, CA, USA)를 이용하여 바이설파이트 전환을 수행하였다. 메틸화 되지 않은 시토신을 우라실로 제거하였고, 메틸화된 시토신만 선별하였다.

바이설파이트 전환을 거친 DNA 라이브러리를 PfuTurbo Cx Hotstart DNA polymerase (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭시켰다. 바이설파이트 전환을 거친 증폭된 DNA 라이브러리는 서열 분석 전에, dNTP 또는 염과 같은 미사용 반응 시약을 제거하기 위하여 정제 단계를 거쳤다.

최종적으로 바이설파이트 전환을 거친 완성된 DNA 라이브러리는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 분석하였다. 시퀀싱하기 전에 시퀀싱 가능한 DNA 라이브러리의 양을 qPCR을 통해 결정하였다. 이어서, DNA 라이브러리는 용출 버퍼(QIAGEN)를 이용하여 10 nM로 희석하였다. 시퀀싱을 하기 위한 메틸화된 DNA 라이브러리가 완성되었다.

1-3. RRBS 데이터 분석

메틸화된 DNA 라이브러리를 NextSeq500 (Illumina, San Diego, CA, USA)로 시퀀싱하였다. Raw reads의 퀄리티를 조절하기 위해 FastQC v0.11.2 (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 실시하고, trim galore v0.4.1(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 이용하여 어댑터 시퀀싱을 절단하였다. 절단된 서열은 BS-seeker2 v2.0.10 (Guo et al., 2013)를 이용하여 쥐과의 레퍼런스 게놈(mm10)에 얼라인 하였다.

메틸화된 DNA 라이브러리의 표 3에 나타낸 MspI 및 ApeKI 단편을 커버하기 위해 가상 실험에서의 컴퓨터 프로그래밍인 인실리코 (in silico)에서 30 내지 500 bp 길이 범위의 이중 효소 MspI 및 ApeKI 단편을 구축하였다.

서열번호	명명	서열(5'-3')
3	MspI	CCGG
4	ApeKI	GCWGC

리드(read) 당 4개의 불일치를 허용하도록 하여 로컬 얼라인먼트 모드에서 Bowtie2로 리드를 얼라인하였다. 맵핑 비율을 향상시키기 위해 맵핑되지 않은 리드를 페어드-엔드(paried-end) 모드에서 재맵핑하였다. 두 개의 페어드-엔드 메이트가 겹치는 경우, 하나의 메이트를 제거한 후 각 CpG 사이트의 메틸화 수준을 측정하였다.

12주 및 22주째에 고지방고당 식이, 대조식이 군에서 각 3마리씩 선별(몸무게 기준)하여 지방 조직에서 DNA 추출 후 RRBS 방법으로 전장 유전체의 DNA 메틸화 변화를 분석하여, 그 결과(q < 0.05, 20% 이상 증가)를 표 4 및 도 3에 나타내었다.

		Mean	S.E.
12 주	대조군	0.158	0.007
12 주	고지방고당 식이를 공급받은 마우스	0.400	0.023
22 주	대조군	0.211	0.011
22 주	고지방고당 식이를 공급받은 마우스	0.595	0.019

표 4 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조식이 군 대비 고지방고당 식이군은 12주 및 22주째의 지방 조직에서 Snx20 유전자 엑손에 위치한 CpGs에서 고지방고당 식이에 의한 메틸화가 증가된 것을 확인하였다.

실시예 2. 통계처리를 통한 Snx20 메틸화 부위 선발

그룹간 DMRs (DeModulation Reference)(100 bp)를 식별하기 위해 커스텀 Perl 스크립트를 사용하였다. 간단히 설명하면, 게놈상의 DNA 메틸화 수준은 레퍼런스 게놈(mm10)을 통해 고정된 크기 윈도우(100 bp)를 50 bp 단위로 슬라이딩시킴으로써 프로파일링하였다. 주어진 윈도우에서 모든 CpG 부위의 DNA 메틸화 비율 (0 내지 1)을 Mann-Whitney U 테스트(q < 0.05)를 사용하여 두 그룹(12주 및 24주에 고지방고당 식이를 공급받은 마우스 대 대조군) 사이에서 비교하였다. 신뢰할 수 없는 DMR 후보를 걸러내기 위해 10개 미만의 판독 값으로 커버되거나 그룹간 평균 차이가 < 0.2를 나타내는 영역은 제거하였다. 확인된 DMR은 UCSC 레퍼런스 유전자 주석 (mm10)과 함께 HOMER (v5.7)를 사용하여 주석을 달았다.

선별 부위의 개별 CpG 메틸화 변화를 BSAS(bisulfite amplicon sequencing) 방법으로 분석하였다.

분석 결과, 고지방고당 식이를 공급한 마우스 지방 조직에서 48개 CpGs의 DNA 메틸화 증가가 유도됨을 확인하여 표 5 및 도 4에 나타내었다.

#CpG	Chr	Loci	Gene	Tissue	Genomic region	Strand
CpG_1	8	88,627,471	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_2	8	88,627,478	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_3	8	88,627,479	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_4	8	88,627,481	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_5	8	88,627,494	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_6	8	88,627,498	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_7	8	88,627,500	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_8	8	88,627,502	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_9	8	88,627,504	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_10	8	88,627,506	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_11	8	88,627,515	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_12	8	88,627,518	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_13	8	88,627,520	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_14	8	88,627,530	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_15	8	88,627,539	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_16	8	88,627,541	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_17	8	88,627,548	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_18	8	88,627,553	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_19	8	88,627,555	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_20	8	88,627,566	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_21	8	88,627,575	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_22	8	88,627,577	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_23	8	88,627,579	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_24	8	88,627,583	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_25	8	88,627,586	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_26	8	88,627,590	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_27	8	88,627,593	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_28	8	88,627,595	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_29	8	88,627,599	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_30	8	88,627,602	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_31	8	88,627,613	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_32	8	88,627,623	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_33	8	88,627,625	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_34	8	88,627,634	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_35	8	88,627,637	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_36	8	88,627,640	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_37	8	88,627,644	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_38	8	88,627,656	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_39	8	88,627,660	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_40	8	88,627,671	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_41	8	88,627,679	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_42	8	88,627,685	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_43	8	88,627,687	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_44	8	88,627,693	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_45	8	88,627,698	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_46	8	88,627,711	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_47	8	88,627,716	Snx20	Adipose	Exon	(-)
CpG_48	8	88,627,721	Snx20	Adipose	Exon	(-)

또한, 마우스의 CpG 서열과 유사성이 높은 사람의 CpG 서열을 찾아 하기 표 6과 같이 나타내었다. 사람의 SNX20의 염기서열 시작점은 50,700,211이고 종결점은 50,715,223이다.

Human	Chr	Loci	Gene	Tissue	Genomic region	Strand
CpG_1	16	50,707,553	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_2	16	50,707,555	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_3	16	50,707,571	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_4	16	50,707,574	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_5	16	50,707,584	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_6	16	50,707,589	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_7	16	50,707,592	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_8	16	50,707,596	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_9	16	50,707,610	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_10	16	50,707,629	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_11	16	50,707,637	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_12	16	50,707,639	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_13	16	50,707,658	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_14	16	50,707,660	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_15	16	50,707,662	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_16	16	50,707,673	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_17	16	50,707,679	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_18	16	50,707,688	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_19	16	50,707,697	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_20	16	50,707,699	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_21	16	50,707,707	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_22	16	50,707,711	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_23	16	50,707,713	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_24	16	50,707,735	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_25	16	50,707,741	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_26	16	50,707,744	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_27	16	50,707,748	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_28	16	50,707,753	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_29	16	50,707,760	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_30	16	50,707,790	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_31	16	50,707,792	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_32	16	50,707,795	SNX20	Adipose	Exon	(-)
CpG_33	16	50,707,798	SNX20	Adipose	Exon	(-)

염기서열 비교분석으로 NCBI 홈페이지에서 제공되는 BLAST tool을 활용하여 인간의 CpG 와 마우스의 CpG서열의 상동성을 확인한 결과, 마우스 CpG 서열은 인간 CpG서열과 약 85 %이상의 상동성을 나타내었다.

실시예 3. Real-time RT-PCR 활용한 유전자 발현 분석

제조사의 지시에 따라 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 마우스의 지방 조직으로부터 RNA를 분리하였다. 500 ng의 총 RNA와 역전사 효소 (TOYOBO, Osaka, Japan)를 30 ℃에서 10분, 42 ℃에서 20분 및 99 ℃에서 5분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. SYBR green super mix (TOYOBO) 및 thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 95 ℃에서 10초, 58 ℃에서 10초, 72 ℃에서 20초의 반응을 40회 반복하고 최종 멜팅 커브 스텝을 실시하여 유전자를 증폭시켰다.

유전자 증폭에 사용된 프라이머 서열은 표 7과 같다.

서열번호	명명	서열(5'-3')
5	Snx20 Forward	GGACCCATAAACCAATGCAG
6	Snx20 Reverse	GTGTTCCTGGAGTTCCCTTG

도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 비만 동물모델의 지방 조직에서 Snx20 유전자 발현분석 결과를 비교하였을 때 고지방고당 식이를 12주 동안 공급한 마우스 (도 5a)보다 고지방고당 식이를 22주 동안 공급한 마우스 (도 5b)의 지방세포에서의 Snx20 발현도가 감소한 것을 확인하였다. 즉, 비만의 정도가 높을수록 Snx20 발현도가 감소됨을 의미한다.

Snx20 발현을 개시하는 프로모터 부위의 CpG의 메틸화로 Snx20의 발현이 억제됨을 의미하며, Snx20 유전자의 메틸화 수준이 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보 제공방법의 툴로 사용될 수 있음을 확인하였다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Method for providing information of prediction and diagnosis of obesity using methylation level of SNX20 gene and composition therefore <130> PN200138 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3263 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaacggggaa cttagaaagt ggcagcccct cggcttgtcg ccggagctga gaaccaagag 60 ctcgaagggg ccatatgaca ctcctcccgg acccctggac acacacagcc ctggagactg 120 gagccttgga gcatggcaag tccagagcac cctgggagcc ctggctgcat gggacccata 180 acccagtgca cggcaaggac ccagcaggaa gcaccagcca ctggccccga cctcccgcac 240 ccaggacctg acgggcactt agacacacac agtggcctga gctccaactc cagcatgacc 300 acgcgggagc ttcagcagta ctggcagaac cagaaatgcc gctggaagca cgtcaaactg 360 ctctttgaga tcgcttcagc tcgcatcgag gagagaaaag tctctaagtt tgtgatgggg 420 aaatcaaggc ctggagagat gacttatcca gggtcacgtg gcgagacagg gacagcacca 480 gaaccagacc cgagatgtcc acgtcaaagt gacatgctct gagaggcagc acacacagaa 540 taaccctgca tccaaattcc aggaagctct taggggtcat ccagctgggc ctaggggtgc 600 agggtcagtg ctgaggcctg ggcagggccg ctagcctccc tgagctttct ggcttcaggc 660 tgggaggcac agttcagggt ggactgtgac cccttggcct agaatgccct tagctctgct 720 ctctagtggc tgtccccata gctggaactc tgttttggag tggcaaaacc agttccacct 780 gctggtaggg gtaggttggc tcccaacaca tccccagcag gcctctcttg ggctcaaaag 840 ccaagctgtg cccagccacg tctccaaatg cttcctggcc cccatgcagc aactgcattt 900 agctgccttc ccagaatttc ctgcatgctc acacagccct tccctctggg gcccaacaat 960 gccacagcct gttctatcaa tcaccagctg ttttcctttg agcagtctcc ttttacttat 1020 gcacatttac ttgaaaaaga aacttcctat tactatccta aatggaaact cagaatcact 1080 tgctataatt agaaagtagc tacaaaaata aacacaatga aaccgatcac tgttattaca 1140 ccctaacccg cttttacctg agacaggccc tgagcctgag gccgctggta gacttttgtt 1200 aaaagagaga gagacagaga cagagaaata agcattagag acctgcaatc accaagctga 1260 gacttctctt tgatttactc agaaggactg gaaaatgttg tcctgcaaaa ggaggtaagt 1320 ttctcaccac gtagcgctga tcatcccgtg ttgcccgtgc gttgctgcag accatctggg 1380 gtcttgccca agcaccctgg agactttgct ccctggtttc ctggtcacca actcgagtgt 1440 tcagccctgt gtgctctcca gctcctaagt cgtgggcctg gtttcagctt tgattgccca 1500 ctcttggctt tcaacccgta ggctccggct cctgacgcca caccctgata tcaagaccct 1560 cagatggagc gagcgttctg ggctggtcga agcctgaagc cgcagtatgt ccttgagtgg 1620 gtccccccct acccatctag ctgttgcccc catggtaaga tcaagaaaat gccctcccct 1680 ccaaaagtcc ccacgccgag ccctcatctg tcagctccca ggctcggccc cctcactagc 1740 tccaggctgg gaggcacagt tcagggcaga ctgtggcccc tcagcatagc atggacttag 1800 ctctgctctc tagtggctgt ccccatagct agaactctgt tttggagcag caaaactagt 1860 tccacctgct ggtagggcta agttgactcc caacatgtcc ccagcgtgtt ggtgttggga 1920 accttgatct agctgctcgt tttctcagta accaaagatc cctggcactc ctacgatgtc 1980 tcaggcctta tctagagctg gggatacagc agtgaccagg acagaactgg tccctgcctc 2040 acggaagtga agtgtcagga ggccactccc aaagcaaatg gaagctggga cagaatgatg 2100 tcctcagcca ggtggtcagg gaaggcttct cagagggggc gctgttcaaa gaatcacaga 2160 gcatacaaag gagctggccc tgggagcaca gagaggggag aattttaggc aaagaggtag 2220 caggagcaca gccctgaggc aggaaactac ccccccacca ccctcggcat cctcagttct 2280 ggtttgcacc cagaaagggg gtaggtccag gacacacccg gactgatgtg tcacactggc 2340 tgtgccagct gagagagtgg gctccaggca ccactaacag agaagccttg caaggcaggt 2400 ccatgcaccg cccgcctcca gttaccactc attgcaaagg aaatgagctg ggagcctgtg 2460 tgtgggccgt gcagaccctt ttggttacaa gccacaaaaa cccaggttaa tctgatgagg 2520 aaggaattta ttatctgtaa agtccaggag caggctagct ttacaccaag caggatccaa 2580 ggacccacac ttgtcacctc atatctctct ctctctccca ctttcgcttt ctctgtctct 2640 tcttagttct gctttcctcc actgtgcctt cgctctcaga gagagctctc ccctggcagt 2700 gacaagatgg ctgcagcagc tccagcaacc tcagaggact cccccatcca gggtccttgt 2760 gagctcctca tctgtaggat gtgcagtaaa cactcacgtg tcctttcctg aggagcccag 2820 tggctggggt gggggctgag gggcagcccc tatgccctca cagtgcagca accttggtta 2880 gctcacccat cagggcagac ttgggcagaa atcatgtctt ggcatattgt tttgtaatct 2940 gctttttaaa ttgtcactat atattatgag catttcccta taatatacaa tattcttcca 3000 cattatgttt aatggtttca ttgtattcta atgcatattc tatagttatt ttaaccaccc 3060 cacaatgttg caaaatgtcc ttatttggga caacactgct gcaaacactt tgacccatat 3120 gtcctttttg tgtgcactct tatggcaact tctaacggtg gcatttctga atcatagaca 3180 cttttttgac ttctacatat tttatttttt tagttgacaa aaactgtatt tatgaatcat 3240 aaacacttaa tgattttgct att 3263 <210> 2 <211> 1434 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 cactcagccc atttcctgtt ttcaaaagga gaactcagga ttgcggcaga cattcagcca 60 tctagttgga ccttgcaaaa agagatcgga ctggggcatg tgactctcct ggaccccgaa 120 cccacaaagc ctgaagatcc cagctcaggt agccttggag catggcaagt ccagagcatc 180 ctgggagccc tggctggaga ggacccataa accaatgcag aacaaggacc agacaggaag 240 tattgccccc aggcccagac ctcccatgtc caggaccaga agaagcccaa gatggcccca 300 gctctaactc cagcatgacc acaagggaac tccaggaaca ctggcagaag gagaagagcc 360 gctggaaaca tgtcaggctg ctctttgaga tcgcctcagc ccgcatagag gagaggaaag 420 tctccaagtt tgtgatgtac caagtcgtgg tcatccagac cgggagcttc gacagcgaca 480 aggcggtggt ggaacggcgc tactcggact tcgagaggct gcagaaggcc ctcctcaagc 540 gcttcgggcc ggagctggag gacgtggcgt tcccgcggaa gcgcctgacc gggaacctgt 600 cggccgagac catctgcgag cggcgccggg agctgcgcga gtacctgcgg ctgctttacg 660 ccgtgcgcgc cgtgcgccgc tcgcgcgagt tcctcgactt cctcacgcgg cccgagctgc 720 gcgaggcctt cggctgcctg cgcgccggcc agtacgcgcg cgcgctcgag ctgctgggcc 780 gcgcgctgcc gctgcaggag aagctgacgg cgcactgccc gagcgccgcc gtgcccgcgc 840 tttgcgccgc gctcgtctgc ttgcgcgacc tcgagcggcc ggccgaggcc ttcgcagtcg 900 gcgagcgcgc gctgcgatgc ctgcggacgc gcgagaacca ccgctactac gcgccactgc 960 tggacgccat ggtgcgcctg gcctacgcgc tgggcaagga cttcgcggcg ctgcagagcc 1020 gcctggacga gaaccagctc cggaggccca cgcacaggga cgccaccctg aaggagctca 1080 cggtgcggga gtatctgtcc tgaggcggcc cgacaggtgc cctggcatcc aggctgcgca 1140 gacagtgtcg tgggtcgcca tcgcctgggg gctttgctgg acggctttgg acaagcctgg 1200 cttgaggggc tcctgggacc tctggaagag ccatcttgtg acccttgagt gccaggttct 1260 ctaaatccta agccgacaag ctcagctatc aaaactttgc aagtactatg gaccttacgt 1320 gccatctcgg aatgggaagg acttgcctac cgcacagaat gtgttcaagg ccagcctaaa 1380 aagtttgctg agactggctc caaataaaga ggtctgagga tgtgacttaa tggc 1434 <210> 3 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MspI <400> 3 ccgg 4 <210> 4 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApeKI <400> 4 gcwgc 5 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snx20 Foward <400> 5 ggacccataa accaatgcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snx20 Reverse <400> 6 gtgttcctgg agttcccttg 20

Claims

서열번호 1로 표시되는 인간 SNX20 유전자의 16번 염색체 50,707,553, 50,707,555, 50,707,571, 50,707,574, 50,707,584, 50,707,589, 50,707,592, 50,707,596, 50,707,610, 50,707,629, 50,707,637, 50,707,639, 50,707,658, 50,707,660, 50,707,662, 50,707,673, 50,707,679, 50,707,688, 50,707,697, 50,707,699, 50,707,707, 50,707,711, 50,707,713, 50,707,735, 50,707,741, 50,707,744, 50,707,748, 50,707,753, 50,707,760, 50,707,790, 50,707,792, 50,707,795 및 50,707,798으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 표시되는 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자 엑손의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정할 수 있는 물질은 SNX20 유전자의 메틸화된 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트, SNX20 유전자의 메틸화된 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 이중 가닥 DNA의 정량화를 위한 염색시약, SNX20 유전자의 메틸화된 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 비만의 예측 또는 진단용 조성물.
삭제
제1항 및 3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 비만의 예측 또는 진단용 키트.
하기의 단계를 포함하는 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
대상으로부터 수득한 생물학적 시료로부터 서열번호 1로 표시되는 인간 SNX20 유전자의 16번 염색체 50,707,553, 50,707,555, 50,707,571, 50,707,574, 50,707,584, 50,707,589, 50,707,592, 50,707,596, 50,707,610, 50,707,629, 50,707,637, 50,707,639, 50,707,658, 50,707,660, 50,707,662, 50,707,673, 50,707,679, 50,707,688, 50,707,697, 50,707,699, 50,707,707, 50,707,711, 50,707,713, 50,707,735, 50,707,741, 50,707,744, 50,707,748, 50,707,753, 50,707,760, 50,707,790, 50,707,792, 50,707,795 및 50,707,798으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 표시되는 SNX20 (Sorting nexin 20) 유전자 엑손의 메틸화 수준을 측정하는 단계.
제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 비만 의심 또는 진단 대상 개체 유래인 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 메틸화는 SNX20 유전자의 프로모터, 5' 비전사 영역 (5'Untranslated region), 인트론 및 엑손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위에 존재하는 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 방법은 정상 대조군의 SNX20 유전자의 메틸화 수준과 시료로부터 측정된 SNX20 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정하는 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인, 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.