JP2023522964A - 無細胞ｄｎａプロファイリングを使用して組織損傷、移植片対宿主疾患および感染を検出する方法 - Google Patents

無細胞ｄｎａプロファイリングを使用して組織損傷、移植片対宿主疾患および感染を検出する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）プロファイリングを使用して被検体における組織損傷、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、微生物感染、腫瘍の存在および生着の減少を検出する新奇の方法を対象とする。本開示の方法は、一部に、（例えば造血細胞移植における）損傷組織、感染時の微生物、腫瘍およびドナー細胞がｃｆＤＮＡの小さな断片を血液循環物中に放出するという認識に基づく。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０２０年４月２４日に出願された米国仮出願第６３／０１５，０９５号の優先権の利益を主張するものである。
連邦政府が資金提供した研究または開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号第ＤＰ２ＡＩ１３８２４２およびＲ０１ＡＩ１４６１６５の下での政府支援によりなされたものである。政府は、発明に一定の権利を有する。
同種造血細胞移植（ＨＣＴ）は、血液悪性疾患および免疫障害の有効な治療法である。免疫合併症および感染に対するモニタリングは、ＨＣＴ後治療の重要な構成要素であるが、現行の診断選択肢は限定されている。
様々な悪性および非悪性血液疾患の治療のために世界で毎年３万人以上の患者が同種造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。しかし、ＨＣＴ後に免疫に関連する合併症が頻繁に発生する。患者の最大５０％が、移植後１年目に移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を経験している。ＧＶＨＤは、ドナー免疫細胞が患者の本来の組織を攻撃する場合に発生する。治療判断の情報を与え、臓器不全および死亡を含む重度の長期的な合併症を予防するためには、ＧＶＨＤの早期の正確な診断が重要である。残念なことに、ＧＶＨＤの症状の発症後極めて早期に患者を確実に識別する非侵襲的診断選択肢はほとんどない。現行の臨床診療では、ＧＶＨＤの診断が臨床判断基準にほぼ全面的に依存しており、胃腸管、皮膚または肝臓の生検のような侵襲的手順による確認を必要とする場合が多い。
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の小断片が血中を循環する。疾患が存在しなければ、ｃｆＤＮＡは、造血系の細胞のアポトーシスに主に由来する。疾患時は、有意な比率のｃｆＤＮＡが罹患組織に由来し得る。固形臓器移植（ＳＯＴ）では、血中の移植ドナー由来ｃｆＤＮＡが固形臓器移植傷害の定量的非侵襲的マーカーとなることが示された。
本開示の一態様は、被検体における組織損傷を検出する方法であって、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；および対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子の（ｉ）レベルまたは（ｉｉ）レベルの増加が、前記識別された原発組織における損傷を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーは、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化（ＧｌｃＮＡｃｙｌａｔｉｏｎ）、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルを決定する工程は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素的ＤＮＡメチル化分析によって決定される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）、選択的標識アッセイ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）、または酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイ（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって決定される。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される。いくつかの実施形態において、ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される。
いくつかの実施形態において、アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後または約９０日後に被検体から取得される。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を有さない被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベルである。
いくつかの実施形態において、原発組織は固形臓器を含む。いくつかの実施形態において、固形臓器は、腎臓、肝臓、脾臓および膵臓から選択される臓器である。いくつかの実施形態において、原発組織は腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、膀胱または膵臓から選択される１つまたはそれ以上の臓器からのものである。
いくつかの実施形態において、被検体に組織損傷がある場合は、該方法は、被検体における損傷組織を改善するための治療により被検体を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、該治療は、免疫調節剤を被検体に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、損傷組織は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、小腸、大腸、膀胱および膵臓から選択され、免疫調節剤は、組織傷害のパターンに基づいて選択される。
いくつかの実施形態において、ＨＣＴの約３０日後の組織損傷の検出は、臓器拒絶反応、または臓器拒絶反応を発症するリスクを示唆する。
いくつかの実施形態において、組織損傷は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を示唆する。いくつかの実施形態において、該方法は、被検体にＧＶＨＤが存在する場合に免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、組織損傷は、微生物感染を示唆する。いくつかの実施形態において、該方法は、抗生物質または抗ウイルス薬で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、組織損傷は、薬物毒性を示唆する。
本開示の別の態様は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けた被検体をモニタリングする方法であって、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；および対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が移植片対宿主疾患を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーは、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素ＤＮＡメチル化分析によって決定される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）、選択的標識アッセイ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）、または酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイ（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって決定される。いくつかの実施形態において、ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される。いくつかの実施形態において、ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される。
いくつかの実施形態において、アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後または約９０日後に被検体から取得される。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を有さない被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベルである。
いくつかの実施形態において、原発組織は固形臓器を含む。いくつかの実施形態において、固形臓器は、腎臓、肝臓、脾臓および膵臓から選択される臓器である。いくつかの実施形態において、原発組織は腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、膀胱または膵臓から選択される１つまたはそれ以上の臓器からのものである。
いくつかの実施形態において、該方法は、被検体に移植片対宿主疾患が存在する場合に免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約３０日後に被検体から取得される。
本開示の別の態様は、被検体の生体サンプルにおける微生物感染を検出する方法であって、生体サンプルから無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子を取得すること；ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定すること；および微生物種のｃｆＤＮＡ配列の存在を識別することにより、微生物種の感染を検出することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定する前にバイサルファイト処理される。
いくつかの実施形態において、該方法は、生体サンプルにおいて微生物ｃｆＤＮＡ配列が識別された場合に抗微生物剤で被検体を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗微生物剤は、抗菌剤または抗真菌剤である。いくつかの実施形態において、抗微生物剤は、抗ウイルス剤である。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
本開示の別の形態は、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が、前記識別された原発組織における損傷を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定すること、および生体サンプルにおける微生物ｃｆＤＮＡの存在を識別することを含む方法である。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、バイサルファイト処理されている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルにおける微生物ｃｆＤＮＡの存在の識別は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
本開示の別の態様は、被検体における腫瘍を検出する方法であって、被検体の生体サンプルから無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子を取得すること；腫瘍特異的ＤＮＡ変化に基づいて腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子の存在を識別すること；および対照レベルと比較した場合の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が被検体における腫瘍の存在を示唆する、またはより早期のレベルと比較した場合の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が被検体における腫瘍の進行を示唆する腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、腫瘍特異的ＤＮＡ変化は、腫瘍特異的欠失、腫瘍特異的増幅または腫瘍特異的点変異から選択される。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子がバイサルファイト処理される。
いくつかの実施形態において、腫瘍特異的ＤＮＡ変化は、腫瘍特異的ＤＮＡメチル化である。
いくつかの実施形態において、腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が検出された場合は、該方法は、化学療法、放射線療法または組合せ療法で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、化学療法は、ＤＮＡアルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、分裂抑制剤またはコルチコステロイドから選択される。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
本開示の別の態様は、ドナーからの造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けた被検体における生着をモニタリングする方法であって、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；被検体とドナーと間の異なるプロファイルを有する、ｃｆＤＮＡ分子中のマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の起源を識別すること；およびドナーのｃｆＤＮＡ分子に対する被検体のｃｆＤＮＡ分子の割合の対照割合と比較した場合の増加が生着の減少を示唆する、被検体のｃｆＤＮＡ分子のレベルおよびドナーのｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、マーカーは、性染色体、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である。
いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素的ＤＮＡメチル化分析によって決定される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ、選択的標識アッセイまたは酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される。いくつかの実施形態において、ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される。
いくつかの実施形態において、決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される。いくつかの実施形態において、アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液、血漿または血清サンプルである。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後、約７５日後、約９０日後、約１０５日後または約１２０日後に被検体から取得される。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体のサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、生着の減少がなかった被検体のサンプルにおけるｃｆＤＮＡのレベルである。
いくつかの実施形態において、該方法は、生着の減少が生じている場合に免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約３０日後に被検体から取得される。
特許または出願ファイルには、カラーで完備された少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を有するこの特許または特許出願公報のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
図１Ａ～１Ｆは、試験ワークフロー。（Ａ）造血細胞移植レシピエント（ｎ＝１８）の血液サンプルを予め６つの時点で採取した。（Ｂ）患者の血漿から抽出されたｃｆＤＮＡに対してＷＧＢＳを実施する。配列決定されたｃｆＤＮＡを、特注のバイオインフォマティクスパイプラインを介して処理する。（Ｃ）、（Ｄ）配列決定されたｃｆＤＮＡのｈｇ１９配列カバレッジ（Ｃ）およびバイサルファイト変換効率（Ｄ）（ｎ＝１０６）。赤色の線は、中央値を示す。（Ｅ）バイサルファイト処理後の１０６のｃｆＤＮＡサンプルの断片長さプロファイル。挿入図：フーリエ解析により、バイサルファイト処理ｃｆＤＮＡの断片長さプロファイルに１０．４ｂｐの周期性が認められる。（Ｆ）細胞および組織メチル化プロファイルのＵＭＡＰ次元縮小。４つの角の各々がシアン、マゼンタ、イエローまたはブラックのいずれかである線形勾配を用いたＵＭＡＰ座標により個々の組織を着色した。 図２Ａ～２Ｃは、ＨＣＴ前後の宿主由来ｃｆＤＮＡの動態。（Ａ）、（Ｂ）ｃｆＤＮＡ組成物（Ａ）および絶対濃度（Ｂ）に対するコンディショニングおよびＨＣＴ注入の影響。（Ｃ）血漿における固形臓器由来ｃｆＤＮＡの濃度。上の行：暗色の線は、患者の時点毎の平均固形臓器ｃｆＤＮＡおよび移植後日数を表す。エラーバーは標準誤差を表す。下の行：時点毎の固形臓器ｃｆＤＮＡ。ａＧＶＨＤ診断後に血漿を採取したらサンプルを分析から除外する。＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．０１。 図３Ａ～３Ｄは、固形臓器ｃｆＤＮＡ濃度動態。（Ａ）ＧＶＨＤ陰性の個体における固形臓器ｃｆＤＮＡ濃度。（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）３人のＧＶＨＤ患者における固形臓器ｃｆＤＮＡ濃度。青色の線は、ＧＶＨＤ陰性の患者における局所回帰平滑化（ｌｏｅｓｓ－ｓｍｏｏｔｈｅｄ）固形臓器ｃｆＤＮＡを表す。 図４Ａ～４Ｃは血漿インフェクトーメ（ｉｎｆｅｃｔｏｍｅ）。時点毎の微生物ｃｆＤＮＡ濃度。（Ｂ）ＨＣＴの前後の血漿におけるポリオーマウイルス、アネロウイルスおよびヒトヘルペスウイルスの存在度。（Ｃ）時点毎に患者１人当たりに検出されたヒトヘルペスウイルスおよびポリオーマウイルス種（ｎ＝１５）（検出可能なヘルペスウイルスおよびヒトポリオーマウイルスを有さない患者（ｎ＝３）は示されていない）。エラーバーは標準誤差を表す。 図５Ａ～５Ｇは、（Ａ）血液中の可能性のある無細胞ＤＮＡ源の概略：造血細胞移植（ＨＣＴ）ドナー（ブルー）、ＨＣＴレシピエント（すなわち患者）の非腫瘍組織（オレンジ）、腫瘍組織から（グリーン、悪性疾患の場合）。（Ｂ）および（Ｃ）経時的な患者のドナー分率（ｄｏｎｏｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）測定値。（Ｂ）性不一致患者のドナー分率測定値。移植前はドナー分率が０である（ドナー由来のＤＮＡが存在しないが、（移植片が一定の量の血液細胞を産生する臨床的兆候が認められる場合）生着においてかなり上昇する）。（Ｃ）患者が、ドナー分率測定値により把握することが可能なぶり返し（血液障害の再発）を経験した２つの例。（Ｄ）コピー数変化を利用して、無細胞ＤＮＡにおける腫瘍分率を推定することが可能である。測定可能なコピー数変化を伴う悪性血液障害を有さない患者もいた。しかし、腫瘍がコピー数変化を示す場合は、それらの変化を利用して、その腫瘍の存在および進行をモニタリングできる。ブルー：悪性血液障害；オレンジ：非悪性血液障害。検出の下限を実験的に決定する。（Ｅ）および（Ｆ）検出されたｃｆＤＮＡ断片をヒトゲノムに対してマッピングすることにより作成されたゲノム規模のカバレッジプロット。（Ｅ）患者００８は、非悪性血液障害の例であり、コピー数変化を伴わない例を示す。（Ｆ）３つの異なる時点の患者０３１（ＨＣＴレシピエント患者）を示す：プレコンディショニング：ＨＣＴ受容前、生着時、および生着の６か月後。（Ｇ）ベースラインではコピー数変化を示さなかったが、１つの染色体７のコピーを突然失った患者の別の例。 図５－１の続き。 図５－２の続き。 図５－３の続き。
発明人らは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）プロファイリングを使用して被検体における組織損傷、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、微生物感染、腫瘍の存在および生着の減少を検出する新奇の方法を開発した。本開示の方法は、一部に、（例えば造血細胞移植における）損傷組織、感染時の微生物、腫瘍およびドナー細胞がｃｆＤＮＡの小さな断片を血液循環物中に放出するという認識に基づく。発明人らは、損傷組織からの血液中のｃｆＤＮＡの量が、組織の損傷の拡大とともに増加することを見いだした。発明人らは、感染時に微生物ｃｆＤＮＡが血液中を循環することを見いだした。また、本開示は、造血細胞移植（ＨＣＴ）後に患者をモニタリングし、ｃｆＤＮＡプロファイリングによってＧＶＨＤまたは生着の減少を検出する方法を対象とする。
定義
生体サンプル
「生体サンプル」という用語は、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液および組織培地のような生体液、ホモジナイズされた組織および細胞抽出物のような組織抽出物を含む動物の身体サンプルを含む。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血清、血漿または尿サンプルである。「動物」という用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジを含む。
エピジェネティックマーカープロファイリング
本明細書に用いられている「エピジェネティックマーカー」という用語は、遺伝子コードによって直接制御されない核酸またはポリペプチドの特性を指す。いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーは、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列の決定を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素的ＤＮＡメチル化分析によって決定される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオソームポジショニングの探査は、（バイサルファイト処理を行わずに）無細胞ＤＮＡの配列決定を行うことによって達成される。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ、選択的標識アッセイまたは酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される。
いくつかの実施形態において、ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される。
本明細書に用いられている「バイサルファイト処理」という語句は、核酸における非メチル化シトシンをバイサルファイトイオンの存在下でウラシル塩基に変換するための反応を指す。５－メチルシトシン塩基は、バイサルファイト処理時に有意にウラシル塩基に変換されない。その全体が参照により本明細書に組み入れられるＧｒｕｎａｕ、Ｃ．ら、（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２９（２００１年）、ｅ６５～５、１～７頁）には、バイサルファイト処理の実験パラメータが開示されている。
ＤＮＡメチル化の酵素的分析は、メチル化感受性制限酵素に依存する。いくつかの実施形態において、メチル化感受性酵素は、メチル化されていなければＧＴＴ＾ＡＡＣ部位を認識して切断するＨｐａＩである。いくつかの実施形態において、メチル化感受性酵素はＨｐａＩＩである。ＨｐａＩＩは、メチル化されていればそのＣＣＧＧ認識部位を切断しない。ＭｓｐＩは、メチル化にかかわらずＣＣＧＧ認識部位を切断する。ＣＣＧＧ部位で領域を確認する場合は、断片がＨｐａＩＩで切断されていればメチル化されておらず、切断されていなければメチル化されている。サンプルは、正常な消化に対する対照としてのＭｓｐＩでも消化される。いくつかの実施形態において、いくつかの密に関連した酵素分析技術でこれらの酵素が使用される。ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＨＥＬＰ）アッセイによるＨｐａＩＩ小断片濃縮では、ＨｐａＩＩおよびＭｓＰＩに消化されたＤＮＡにアダプタを結合した後、ＰＣＲ増幅を行う。次いで、マイクロアレイ（ＨＥＬＰ－チップ）またはシークエンシング（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）を使用して断片を識別する。いくつかの実施形態において、酵素的分析技術は、二次元ゲル上に断片を通過させて、多くの領域のメチル化を同時に検出することを含むＲＬＧＳ（制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法）である。いくつかの実施形態において、酵素的分析技術は、リアルタイムＰＣＲを使用すること以外はＨＥＬＰに酷似しているＤＮＡメチル化制限酵素分析（ＭＳＲＥ）である。いくつかの酵素分析技術の詳細は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．およびＧｒｅａｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．（（２０１０年）、ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｉｎｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ （ＨＥＬＰ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ５２、２１８～２２２頁）；Ｏｄａ，Ｍ．およびＧｒｅａｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．（（２００９年）、ＨＥＬＰ ａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０７、７７～８７頁）；Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．ら、（（２００８年）、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｔｕａｌ ｉｍａｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｌａｎｄｍａｒｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ（Ｖｉ－ＲＬＧＳ）、ＦＥＢＳ Ｊ．２７５、１６０８～１６１６頁）；ならびにＡｎｄｏ，Ｙ．およびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．（（２００６年）、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｌａｎｄｍａｒｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１、２７７４～２７８３頁）に見られる。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックプロファイリングは、メチル化マーカーの代替を含む。いくつかの実施形態において、組織特異的であり無細胞ＤＮＡに維持される他のエピジェネティックマークが本開示の方法に使用される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックプロファイリングは、ＤＮＡヒドロキシメチル化プロファイリングを含む。ヒドロキシメチル化は、遺伝子が活性化していることを示唆すると考えられるシトシン上に存在する化学的修飾である。文献には、この化学的修飾が組織特異的であると記載されている。例えば、それらの全体が本明細書に組み入れられる、Ｓｏｎｇ，Ｃｈｕｎ－Ｘｉａｏら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７．１０（２０１７年）：１２３１～１２４２頁；Ｎｅｓｔｏｒ，Ｃｏｌｍ Ｅ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２．３（２０１２年）：４６７～４７７頁を参照されたい。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイルの決定は、プルダウンアッセイによって達成される。いくつかの実施形態において、プルダウンアッセイは、ヒドロキシメチル化率の高い無細胞ＤＮＡを捕捉するのに使用できるヒドロキシメチル化シトシンに特異的な改変抗体を利用する。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイルの決定は、選択的標識アッセイ（ヒドロキシメチル化シトシンの選択的化学標識）によって達成される。いくつかの実施形態において、選択的標識は、ヒドロキシメチル化シトシンにビオチン基を付加するＢ－グルコシルトランスフェラーゼ酵素によって達成される。ストレプタビジンビーズをビオチン基に結合させて、ヒドロキシメチル化率の高いｃｆＤＮＡを引き抜くことができる。次いで、プルダウンされたｃｆＤＮＡの配列決定を行う。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡのヒドロキシメチル化プロファイルの決定は、酸化的バイサルファイトシークエンシングによって達成される。いくつかの実施形態において、酸化的バイサルファイトシークエンシングは、ａ）ｃｆＤＮＡを２つのグループに分割すること；ｂ）ｃｆＤＮＡサンプルの半分をバイサルファイト処理して、どのシトシンがメチル化またはヒドロキシメチル化されたかを明らかにすること；ｃ）他方の半分を酸化し（ヒドロキシメチル基を除去し）、次いで酸化した半分をバイサルファイト処理することを含む。これにより、どのシトシンがメチル化されたかが明らかになり；ｄ）分割されたサンプルの配列決定を行うことで、どのシトシンがメチル化され、どのシトシンがヒドロキシメチル化されたかを明らかにする。ヒドロキシメチル化部位およびメチル化部位の双方に単一塩基対分解能が付与される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックプロファイリングは、ヒストン修飾を含む。ゲノムのＤＮＡがヌクレオソームに巻き付いている。ヌクレオソームは、８つのヒストンから構成されている。ヒストン修飾は、遺伝子発現を伴い、それらの存在を検出して、無細胞ＤＮＡの原発組織を推定することができる。ＤＮＡが（例えばアポトーシスにより）細胞外にある場合は、分解されている。しかし、ヒストンに巻き付いたＤＮＡは、分解から保護されやすいため、捕捉および配列決定され得る（配列決定したｃｆＤＮＡの多くがヒストンに巻き付いたものである）。これらのヒストンに対する修飾は、原発組織を示唆する。その全体が本明細書に組み入れられるＳａｄｅｈ，Ｒｏｎｅｎら、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０１９年）：６３８６４３を参照されたい。
いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡにおけるヒストン修飾の探査は以下によって達成される。
１－ヒストン修飾に特異的な抗体を使用してプルダウンアッセイを実施する。いくつかの実施形態において、それらの抗体は、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化または異性化に特異的である。いくつかの実施形態において、ヒストンメチル化特異的抗体は、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３またはＨ３Ｋ３６Ｍｅ３修飾に対する抗体を含む。
２－プルダウンされたｃｆＤＮＡの配列決定を行う。
いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡにおけるヒストン修飾の探査は、ヌクレオソームポジショニングによって達成される。ヌクレオソームにおいて巻き付いたＤＮＡはＲＮＡに変換できない。それを酵素で解いて転写する必要がある。したがって、細胞が死に、そのゲノムが放出されると。転写されていた領域が（転写されなくなるため）分解される。配列決定するｃｆＤＮＡは転写されていなかった。理論上は、見られなかったゲノムの領域は、盛んに転写されると想定できる。これらのパターンは、組織特異的であることが示された。それらの全体が組み込まれているＳｎｙｄｅｒ，Ｍａｔｔｈｅｗ Ｗ．ら、Ｃｅｌｌ、１６４．１～２（２０１６年）：５７～６８頁；Ｓｕｎ，Ｋｕｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９．３（２０１９年）：４１８～４２７頁を参照されたい。
配列決定を行わずにエピジェネティックプロファイルを決定する
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡの配列決定を行わずにエピジェネティックプロファイリングを決定することができる。いくつかの実施形態において、エピジェネティックプロファイリングは、（いずれもそれらの全体が本明細書に組み入れられるＳｈｅｍｅｒ，Ｒ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２７．１（２０１９年）：ｅ９０；およびＺｅｍｍｏｕｒ，Ｈａｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、９．１（２０１８年）：１～９頁に記載されている）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施することによって決定される。いくつかの実施形態において、エピジェネティックプロファイリングは、サンプルから無細胞ＤＮＡを単離すること；特異的エピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡを増幅させること；修飾エピジェネティックマーカーと非修飾エピジェネティックマークとを区別することができるプローブを使用して組織特異的領域における修飾または非修飾エピジェネティックマークを検出すること；およびｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲアッセイを使用して出力を検出することを含む。いくつかの実施形態において、プライマおよび／またはプローブは蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、プローブからの蛍光信号は、出力として測定され、ｃｆＤＮＡの組織組成が出力から推測される。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックプロファイルは、ＤＮＡメチル化プロファイルである。いくつかの実施形態において、メチル化プロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡの配列の決定を含まない。
いくつかの実施形態において、バイサルファイト処理後に、ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲを使用して、組織特異的な特異的メチル化マーカーを含む領域を増幅させる。増幅の程度を測定して、無細胞ＤＮＡに対する組織特異的な寄与を推定することができる。
いくつかの実施形態において、メチル化プロファイルの決定は、無細胞ＤＮＡをサンプルから単離すること；メチル化特異的マーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡを増幅させること；組織特異的領域におけるメチル化を検出すること；およびｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲアッセイを使用して蛍光信号を出力し、蛍光信号を使用してｃｆＤＮＡの組織組成を推測することを含む。いくつかの実施形態において、組織特異的領域におけるメチル化の決定は、メチル化または非メチル化シトシンに結合するプローブを使用することによって達成される。
免疫調節剤
本明細書に用いられている「免疫調節剤」という語句は、免疫系の活性を調節する薬剤を指す。いくつかの実施形態において、免疫調節剤は免疫反応を抑制する。
いくつかの実施形態において、免疫調節剤は、抗炎症薬、ステロイド（例えばグルココルチコイド）、抗体または小分子薬から選択される。
いくつかの実施形態において、ステロイド薬は、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、エタメタゾネブ（ｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅｂ）、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロンまたはデキサメタゾンから選択される。
いくつかの実施形態において、抗体薬は、インターロイキン－２受容体抗体、ブレンツキシマブ、アレムツズマブまたはトシリズマブから選択される。
いくつかの実施形態において、小分子薬は、タクロリムス、シロリムス、シクロスポリン、ゾタロリムスまたはエベロリムスから選択される。本明細書における「小分子」という用語は、一般には分子量が２０００ダルトン未満、１５００ダルトン未満、１０００ダルトン未満、８００ダルトン未満または６００ダルトン未満の小さな有機化学化合物を指す。
いくつかの実施形態において、免疫調節剤は、ルキソリチニブ。イブルチニブ、ミコフェノール酸モフェチル、エタネルセプト、ペントスタチン、アルファ－１抗トリプシン、シロリムス、体外フォトフェレ－シス、抗胸腺細胞グロブリン、間葉系間質細胞、およびインターロイキン－２受容体抗体、ブレンツキシマブ、アレムツズマブまたはトシリズマブなどのモノクローナル抗体から選択される。
組織損傷を検出する方法
発明人らは、組織損傷があると、ｃｆＤＮＡ分子が損傷組織から放出されることを認識した。発明人らは、組織特異的ｃｆＤＮＡが組織損傷の量と相関していること、すなわち組織が損傷するほど多くのｃｆＤＮＡが放出されることを認識した。各組織型は他の組織型と異なる特異的かつ独特なエピジェネティックマーカープロファイルを有し、ｃｆＤＮＡのエピジェネティックマーカープロファイルを使用してｃｆＤＮＡ源を決定することができる。
本開示の一態様は、被検体における組織損傷を検出する方法であって、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；および対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子の（ｉ）レベルまたは（ｉｉ）レベルの増加が、前記識別された原発組織における損傷を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される。
いくつかの実施形態において、アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後または約９０日後に被検体から取得される。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を有さない被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベルである。
いくつかの実施形態において、原発組織は固形臓器を含む。いくつかの実施形態において、固形臓器は、腎臓、肝臓、脾臓または膵臓から選択される臓器である。いくつかの実施形態において、原発組織は、肺、胃、小腸、大腸、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、膀胱および膵臓のうちの１つまたはそれ以上の組織を含む。いくつかの実施形態において、原発組織は、腫瘍組織を含む。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子は、肺、胃、小腸、大腸、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、膀胱または膵臓から選択される１つまたはそれ以上の臓器からのものである。
いくつかの実施形態において、被検体に組織損傷がある場合は、該方法は、被検体における損傷組織を改善するための治療により被検体を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、該治療は、免疫調節剤を被検体に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＣＴの約３０日後の組織損傷の検出は、臓器拒絶反応、または臓器拒絶反応を発症するリスクを示唆する。いくつかの実施形態において、組織損傷の検出は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を示唆する。いくつかの実施形態において、被検体にＧＶＨＤが存在する場合は、該方法は、免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、組織損傷の検出は、微生物感染を示唆する。いくつかの実施形態において、微生物感染が関係している場合は、該方法は、微生物感染を治療するのに好適な抗生物質または抗ウイルス薬を被検体に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、組織損傷の検出は、薬物毒性を示唆する。いくつかの実施形態において、薬物毒性が関係している場合は、毒性が疑われる薬物の投与が中断される、またはその用量が減じられる。
ＧＶＨＤについてＨＣＴ患者をモニタリングする方法
ＨＣＴレシピエント（患者）についての考えられる問題は、ドナー免疫細胞が宿主組織および臓器を攻撃および損傷するＧＶＨＤである。ＨＣＴ患者をモニタリングして、深刻または永続的な損傷が発生する前にＧＶＨＤを検出することが非常に重要である。
本開示の別の態様は、ＨＣＴを受けた被検体をモニタリングする方法であって、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；および対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が移植片対宿主疾患を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される。
いくつかの実施形態において、アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後または約９０日後に被検体から取得される。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を有さない被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベルである。
いくつかの実施形態において、原発組織は固形臓器を含む。いくつかの実施形態において、固形臓器は、腎臓、肝臓、脾臓または膵臓から選択される臓器である。いくつかの実施形態において、原発組織は、肺、胃、小腸、大腸、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、膀胱および膵臓のうちの１つまたはそれ以上の組織を含む。いくつかの実施形態において、原発組織は、腫瘍組織を含む。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子は、肺、胃、小腸、大腸、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、膀胱または膵臓から選択される１つまたはそれ以上の臓器からのものである。
いくつかの実施形態において、ＨＣＴの約３０日後の組織損傷の検出は、臓器拒絶反応、または臓器拒絶反応を発症するリスクを示唆する。いくつかの実施形態において、組織損傷の検出は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を示唆する。いくつかの実施形態において、被検体にＧＶＨＤが存在する場合は、該方法は、免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む。
生着の減少についてＨＣＴ患者をモニタリングする方法
ＨＣＴ患者についての別の考えられる問題は、その後に血液癌がぶり返してもしなくてもよい、生着の減少としても知られるドナー造血細胞の減少である。
本開示の別の態様は、ドナーからの造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けた被検体における生着をモニタリングする方法であって、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；被検体とドナーと間の異なるプロファイルを有する、ｃｆＤＮＡ分子中のマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の起源を識別すること；およびドナーのｃｆＤＮＡ分子に対する被検体のｃｆＤＮＡ分子の割合の対照割合と比較した場合の増加が生着の減少を示唆する、被検体のｃｆＤＮＡ分子のレベルおよびドナーのｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される。
いくつかの実施形態において、アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後または約９０日後に被検体から取得される。
いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、生着の減少がなかった被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベルである。
いくつかの実施形態において、該方法は、生着の減少がある場合に免疫調節薬で被検体を処置することをさらに含む。
微生物感染を検出する方法
本開示の別の態様は、被検体の生体サンプルにおける微生物感染を検出する方法であって、生体サンプルから無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子を取得すること；ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定すること；および微生物種のｃｆＤＮＡ配列の存在を識別することにより、微生物種の感染を検出することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、該方法は、生体サンプルにおいて微生物ｃｆＤＮＡ配列が識別された場合に抗微生物剤で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、抗微生物剤は、抗菌剤または抗真菌剤である。いくつかの実施形態において、抗微生物剤は、抗ウイルス剤である。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液または血清サンプルである。
本開示の別の態様は、エピジェネティックマーカープロファイル分析を利用して、微生物感染を検出する。
いくつかの実施形態において、本開示は、被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が、前記識別された原発組織における損傷を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定すること；および生体サンプルにおける微生物ｃｆＤＮＡの存在を識別することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、生体サンプルにおける微生物ｃｆＤＮＡの存在の識別は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む。いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
被検体における腫瘍を検出またはモニタリングする方法
本開示の別の態様は、被検体における腫瘍を検出する方法であって、被検体の生体サンプルから無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子を取得すること；腫瘍特異的ＤＮＡ変化に基づいて腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子の存在を識別すること；および対照レベルと比較した場合の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が被検体における腫瘍の存在を示唆する、またはより早期のレベルと比較した場合の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が被検体における腫瘍の進行を示唆する腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される。
いくつかの実施形態において、腫瘍特異的ＤＮＡ変化は、腫瘍特異的欠失、腫瘍特異的増幅または腫瘍特異的点変異から選択される。
いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡ分子がバイサルファイト処理される。
いくつかの実施形態において、腫瘍特異的ＤＮＡ変化は、腫瘍特異的ＤＮＡメチル化である。
いくつかの実施形態において、腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が検出された場合は、該方法は、化学療法、放射線療法または組合せ療法で被検体を処置することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、化学療法は、アルキル化剤（例えばニトロソウレア）、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質（例えばアントラサイクリン）、トポイソメラーゼ阻害剤、分裂抑制剤（例えば、タキサンおよびビンカアルカロイド）またはコルチコステロイドである。
いくつかの実施形態において、被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている。
別段の指定がなければ、本明細書に用いられているすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野に熟達した者に一般に理解されているのと同様の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のあらゆる方法および材料を本発明の実践または試験に使用することもできるが、ここでは好適な方法および材料について記載する。本明細書に記載のすべての出版物は、それらの出版物を引用せしめる方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み入れられる。
以下に記載する具体的な例は、例示にすぎず、限定するものでは決してない。
実施例１：材料および方法
研究コホート
ダナ・ファーバー癌研究所にて同種異系ＨＣＴを受けた成人患者の前向きコホートについてネスティドケースコントロール研究を実施した。ＨＣＴ後６か月間患者を観察した。患者を受け入れ順にこの研究のために選択し、ＨＣＴ後の最初の６か月以内に疾患の臨床所見に基づいてＧＶＨＤ例と対照群に判別した。６回の試験時点（プレコンディショニング、移植日、生着、１、２および３か月）のうちの少なくとも５回について血液サンプルを提供しなかった個人は、この研究から除外された。この研究は、ダナ・ファーバー／ハーバード癌センター臨床試験研究所（Ｈａｒｖａｒｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ’ｓ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔｕｄｉｅｓ）に認可された。いずれの患者も同意書を提出した。
この研究では、２０１８年８月から２０１９年４月にかけて１８人の同種異系ＨＣＴレシピエントから採取された１０６の血液サンプルを使用した。ベースラインでの患者の特性を記録した。対象となる共変量としては、ＨＬＡの一致、ドナーとの近縁性およびドナーとレシピエントの性の不一致が含まれた。ＧＶＨＤの発症日、ならびにＧＶＨＤの予防および治療レジメンを記した。ＧＶＨＤを臨床的および病理学的に診断した。ＧＶＨＤの重症度をグラックスバーグの基準に準じて等級分けした。対象となる他の臨床事象としては、血流感染、ＢＫポリオーマウイルス疾患、および他のＤＮＡウイルスによる臨床的疾患の発症が含まれた。
生着
血液サンプルが個別の２つの測定値で血液１マイクロリットル当たり５００個以上の絶対好中球数を含む場合に好中球生着を考慮した。
ＢＫポリオーマウイルス疾患の識別
患者が尿または血液での陽性ＢＫ ｑＰＣＲ検査と相関するＢＫ関連泌尿器症状を示し（尿でのコピー数が１ｍＬあたり１０５個を超え、血液でのコピー数が１ｍＬあたり０個を超える；Ｖｉｒａｃｏｒ ＢＫ ｑＰＣＲ検査、参照番号＃２５００）を示し、症状の発症時には他のいかなる泌尿生殖器病の原因の兆候を有さない場合に、それらの患者をＢＫウイルス疾患で陽性と認定した。
血液サンプルの採取および血漿の抽出
来院時、ＥＤＴＡチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、参照番号＃３６６６４３）にて標準的な静脈穿刺により血液サンプルを、コンディショニング化学療法の開始前；コンディショニング化学療法の完了後のＨＣＴの日、生着時（通常はＨＣＴの１４～２１日後）、ならびにＨＣＴの１、２および３か月後に採取した。血液遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ遠心分離機を使用して２０００ｒｐｍにて１０分間）を行うことにより血漿を抽出し、０．５～２ｍＬの分別量で－８０℃にて保管した。血漿サンプルをドライアイスに乗せてＤＦＣＩからコーネル大学に向けて出荷した。
核酸コントロールの調製
合成オリゴを調製し（ＩＤＴ）、同じ比率で混合し、およそ１５０ｎｇ／ｕｌに希釈した。ｃｆＤＮＡ抽出時に、コントロール８μｌを１×ＰＢＳ １９９２μＬに添加し、すべての下流の実験においてサンプルとして処理した。
無細胞ＤＮＡの抽出
メーカーの推奨に準じてｃｆＤＮＡを抽出した（キアゲン循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ）、参照番号＃５５１１４、溶出体積４５μｌ）。Ｑｕｂｉｔ３．０蛍光光度計を使用して溶出ＤＮＡを定量した（溶出ＤＮＡ２μＬを使用して）。以下の式を用いて、測定ｃｆＤＮＡ濃度を求めた：
ｃｆＤＮＡ濃度＝（（溶出ｃｆＤＮＡ濃度）×（溶出体積））／（（血漿体積））
全ゲノムバイサルファイトシークエンシング。メーカーの推奨に準じてｃｆＤＮＡおよび核酸コントロールをバイサルファイト処理した（Ｚｙｍｏメチレーションライトニングキット（Ｚｙｍｏ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、参照番号＃Ｄ５０３０）。先述の一本鎖ライブラリ調製プロトコル２１を用いてシークエンシングライブラリを調製した。ライブラリをＤＮＡ断片分析（アジレント断片分析装置）により品質管理し、２×７５ｂｐリードを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５５０装置にて配列決定した。核酸コントロールを全シークエンシングレーンの１％以下で配列決定した。
ヒトゲノム調整
ＢＢツールを使用してアダプタ配列をトリミングした。ビスマーク調整ツールを使用して、リードをヒトゲノム（バージョンｈｇ１９）に合わせて調整し、ＰＣＲ複製物を除去し、メチル化密度を算出した。
参考組織のメチル化プロファイルおよび原発組織の測定。参考組織のメチロームを公開源から取得した。異なる起源からのゲノム座標を正規化し、ｈｇ１９集合体座標を使用して標準４カラムベッドファイル（カラム：染色体、開始、終了、メチル化分率）に変換した。メチル化プロファイルを組織型毎にグループ分けし、メチレンを使用して、メチル化の程度が異なる領域を確認した。原発の組織および細胞型を、二次計画法を使用して決定した。
微生物ｃｆＤＮＡのメタゲノム調整および定量
ＷＧＢＳの後に、ＢＢツールを使用して、リードをアダプタでトリミングし、短いリードをＦＬＡＳＨと統合させた。ビスマークを使用して、Ｃ－Ｔ変換されたゲノムに合わせて配列を調整した。マッピングされていないリードを、ｈｓ－ｂｌａｓｔｎを使用して、Ｃ－Ｔ変換された微生物参考ゲノムのリストにＢＬＡＳＴした。ＧＲＡＭＭｙを使用して検出されたすべての有機体の相対的存在度を決定し、相対的ゲノム存在度を測定した。配列決定されたリードの全数で、（参考集合における各微生物ゲノムの長さの調整後に）微生物種にマッピングしたリードの固有の数を除することによって微生物ｃｆＤＮＡ分率を算出した。１から微生物分率を減じた値をヒト分率と推定する。次いで、先述の方法（ＬＢＢＣ、ＰＮＡＳ）を使用して、微生物種を環境汚染および調整ノイズに対してフィルタリングした。ウイルス種の識別のために（図４Ｃ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＮＣ＿００１５３８．１）、サイトメガロウイルス（ＮＣ＿００６２７３．１）、ヘルペスウイルス６Ａ（ＮＣ＿００１６６４．４）および６Ｂ（ＮＣ＿００８９８．１）、ヒトポリオーマウイルス６（ＮＣ＿０１４４０６．１）および７（ＮＣ＿０１４４０７．１）ならびにエプステイン－バールウイルス（ＮＣ＿００７６０５）についての代表的なゲノムから特注のゲノム参考を生成した。次いで、これらの種にＢＬＡＳＴしたリードをビスマークにより再調整し、４０００万の全配列決定リード毎に１つのマッピング配列の閾値を用いて、血漿サンプル中のウイルス種を陽性識別した。
ｃｆＤＮＡ濃度
特異的組織または微生物のｃｆＤＮＡ濃度を以下のように算出する：
正規化ｃｆＤＮＡ濃度＝（（ｃｆＤＮＡ濃度）×（核酸コントロール入力質量））／（核酸コントロール出力質量）
組織特異的ｃｆＤＮＡ濃度＝（正規化ｃｆＤＮＡ濃度）×（ヒトリード分率）×（組織割合）
微生物ｃｆＤＮＡ濃度＝（正規化ｃｆＤＮＡ濃度）×（微生物リード分率）
カバレッジの深さ
複製物除去後のヒトゲノム上の各々のマッピングされた塩基対についてのカバレッジの深さを合計し、ヒトゲノム（未知の塩基を含まないｈｇ１９）の全長で除することによってシークエンシングの深さを測定した。
バイサルファイト変換効率
哺乳動物ゲノムでは希にしかメチル化しないヒト調整リードにおけるＣ［Ａ／Ｔ／Ｃ］メチル化の速度を（ＭｅｔｈＰｉｐｅを使用して）定量することによって、バイサルファイト変換効率を推定した。
統計学的分析
統計学的分析をＲ（バージョン３．５）にて実施した。いずれの試験も両側ウイルコクソン検定によって実施した。
実施例２
発明人らは、同種異系ＨＣＴ後の合併症を予測およびモニタリングするために、ｃｆＤＮＡの有効性を推定するための前向きコホート研究を実施した。この研究では、発明人らは、同種異系ＨＣＴを受けた１８人の成人を選択し、コンディショニング化学療法の前、造血細胞注入の前を除く当日、好中球生着後（好中球数が１マイクロリットル当たり５００を超える）、ならびにＨＣＴの１、２および３か月後を含む６つの所定の時点で採取された全体で１０６の連続血漿サンプルを検定した（図１Ａ）。試験コホートは、悪性血液障害を有する患者（ｎ＝１４）および非悪性血液障害を有する患者（ｎ＝４）の両方を含んでいた。全体で、９人の患者が急性ＧＶＨＤを発症しており（ＧＶＨＤ＋）、９人が発症しておらず（ＧＶＨＤ－）、２人が血流感染を発症しており、２人がＢＫウイルス疾患を発症していた。
発明人らは、血漿からｃｆＤＮＡ（１サンプル当たり０．５ｍＬ～１．９ｍＬ）を単離し、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを実施して、ｃｆＤＮＡに含まれるシトシンメチル化マークをプロファイリングした（図１Ｂ）。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製物を使用して、バイサルファイト変換後の配列情報を取得した。このｓｓＤＮＡライブラリ調製物により、バイサルファイト変換前のメチル化アダプタのライゲーションに依存するＷＧＢＳライブラリ調製物に共通するアダプタ結合分子の分解が回避され、ランダムなプライミングを実施するＷＧＢＳライブラリ調製物に固有の増幅バイアスが回避される。発明人らは、０．９±０．３倍の塩基毎ヒトゲノムカバレッジ（図１Ｃ）に対応する４１００万±１５００万のペアエンドリードをサンプル毎に取得し、高いバイサルファイト変換効率を達成した（９９．４％±０．５％、図１Ｄ）。ペアエンドリードマッピングを用いて、単一ヌクレオチド解像でのバイサルファイト処理ｃｆＤＮＡの長さを特徴づけ、バイサルファイト処理によるｃｆＤＮＡの分解の可能性を調べた。この分析により、バイサルファイト処理が施されていない血漿ｃｆＤＮＡについての断片化プロファイルと類似した断片化プロファイルが明らかになった。１００ｂｐより長い断片のモードは１６５ｂｐ±７ｂｐ（図１Ｅ）であり、フーリエ分析により、断片長さプロファイルにおける１０．４ｂｐの周期性が明らかになった（図１Ｅ、挿入図）。断片長さプロファイルでの６０～９０ｂｐにおける第２のピークは、一本鎖ライブラリ調製方法に特徴的なものであり、既に報告されている。全体的に、発明人らは、バイサルファイト処理による有意なｃｆＤＮＡ断片化の兆候を見いだしていない。
コンディショニング療法およびＨＣＴに対する反応における時間的動態
発明人らは、異なる血管付き組織および造血細胞型に由来するｃｆＤＮＡの相対的比率を定量するために、純粋な細胞および組織型のメチル化プロファイルの参考集合に対して、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを分析した（１３８の参考組織、方法および図１を参照）。発明人らは、組織特異的ｃｆＤＮＡの比率に全宿主由来ｃｆＤＮＡの濃度を乗じることによって、組織特異的ｃｆＤＮＡの絶対濃度を計算した（実施例１の方法参照）。図２Ａ～２Ｃは、すべての患者および時点についてこれらの測定値を集約し、化学療法およびＨＣＴの両方に対する反応において、ｃｆＤＮＡの原発組織での動態が高いことを明らかにしている（図２Ａ～２Ｃ）。それらのデータに見られる最も顕著な特徴としては、ｉ）想定されたように、患者自身の免疫細胞を欠失させるために実施されたコンディショニング療法に対する反応における血液細胞特異的なｃｆＤＮＡの減少（図１Ｇ、図２Ａ）、ｉｉ）生着時の全ｃｆＤＮＡ濃度の増加（図１Ｈ、図２Ｂ）、ｉｉｉ）多くの患者での６０日後の全ｃｆＤＮＡ濃度の低下（図１Ｈ）、およびｉｖ）組織特異的なｃｆＤＮＡとＧＶＨＤの発生との関連性が挙げられる。
次に、発明人らは、これらの特徴をより詳細に調査して、ＨＣＴの免疫関連合併症をモニタリングするためのこれらの測定の有効性を調べた（図２Ａ～２Ｃ）。コンディショニングの前は、好中球、赤血球前駆体および単球が、血漿におけるｃｆＤＮＡの主要な要因であった（それぞれ２３．０％、１２．３％および１１．７％、平均ｃｆＤＮＡ濃度は、血漿１ｍＬ当たり２７２±３０５ｎｇ）。臓器毒性および骨髄抑制の程度が異なる様々なＨＣＴコンディショニングレジメンが開発されている。コホートにおいて患者の大多数が、強度の低いコンディショニング療法を受けた（ＲＩＣ、ｎ＝１７）のに対して、１人の患者は、骨髄機能廃絶コンディショニング療法を受けた（ＩＤ番号００５）。コンディショニング前後の血漿中のｃｆＤＮＡ原発組織を比較したところ、コンディショニング療法についての機能から想定されるように血液由来ｃｆＤＮＡが有意に減少したことが分かった（造血細胞ｃｆＤＮＡの平均比率が７９％±１０％から５９％±２０％に減少した。ｐ値＝０．００１４、図２Ａ）。生着時は、血液由来ｃｆＤＮＡの比率が８４％±１０％に増加した（ｐ値＝５．６×１０－５、図２Ａ）。幹細胞注入および生着の最も顕著な効果は、ｃｆＤＮＡの絶対濃度の有意な増加であった（平均ヒト由来ｃｆＤＮＡ濃度が、移植日の２５６ｎｇ／ｍＬから生着時の２１４９ｎｇ／ｍＬに増加［ｐ値＝０．０１３］、図２Ｂ）。
性能分析
次に、発明人らは、ＧＶＨＤを予測するためのｃｆＤＮＡ原発組織測定の性能を評価した（図２Ｃ）。発明人らは、ここでのＧＶＨＤを、ＨＣＴ後の最初の６か月以内における疾患の任意の段階の臨床所見として定義した（ＧＶＨＤ＋、実施例１の方法参照）。発明人らは、ＧＶＨＤ診断後に採取されたサンプルを、これらの患者が追加的なＧＶＨＤ治療を受けていたため除外した。生着時、ならびに１、２および３か月目では、ＧＶＨＤ＋群における患者についての固形臓器特異的ｃｆＤＮＡの濃度が有意に上昇した（ｐ値は、それぞれ０．１７、０．０１２、０．００７０および０．０２０）が、２つの移植前時点では上昇していなかった（コンディショニング前はｐ＝０．６６、造血細胞注入前はｐ＝０．８０）ことを発明人らは見いだした。ＧＶＨＤの予測マーカーとしてのｃｆＤＮＡの性能の受信者動作特性分析により、生着時および１、２および３か月目の曲線下面積（ＡＵＣ）がそれぞれ０．７、０．９、０．９および０．９であることが示された。これらの結果は、ｃｆＤＮＡが、ＨＣＴ後１か月という早さでＧＶＨＤの発生を予測するという見解を裏づける（ＧＶＨＤ＋およびＧＶＨＤ－では平均固形臓器ｃｆＤＮＡが血漿１ｍＬ当たりそれぞれ９９５および５０ｎｇ；ＡＵＣ＝０．９、ｐ値＜０．０１２、図２Ｃ）。
発明人らは、ＧＶＨＤの発生部位を突き止めるこのアッセイの能力を評価するために、ＧＶＨＤ陰性の個人（ｎ＝９）および皮膚のＧＶＨＤを発症した個人（ｎ＝８）の血液における皮膚由来ｃｆＤＮＡの負荷を定量した。ＧＶＨＤを有する個人の血漿サンプルは、皮膚ＧＶＨＤを発症していない個人のサンプルと比較して皮膚由来ｃｆＤＮＡの負荷が高いことを発明人らは見いだした（平均皮膚ｃｆＤＮＡは、それぞれ血漿１ｍＬ当たり２０．６ｎｇおよび３．２ｎｇ、移植後および診断前に採取したサンプルのｐ値＝０．０１５）。肝臓ＧＶＨＤおよび胃腸ＧＶＨＤと診断された患者のサンプルの数は、肝臓または腸のＧＶＨＤ関連傷害を突き止めるアッセイの性能を試験するのに不十分であった（それぞれｎ＝１およびｎ＝３）。
次に、発明人らは、サンプルおよびｃｆＤＮＡの原発組織の分析がＧＶＨＤ診断の後に行われた３人の類似患者（ＲＩＣ化学療法が施され、ＧＶＨＤ診断時点が類似している男性患者）のＧＶＨＤ治療に対する反応について検討した。これらの患者は、ＨＣＴ後２８日目と３９日目の間にＧＶＨＤと診断され、各患者について診断後の２つの血漿サンプルが入手できた。第１の患者は、軽度ＧＶＨＤと診断され（皮膚症ステージ１、総合グレードＩ；治癒までの日数９８）、ｃｆＤＮＡの原発組織は、ＧＶＨＤ陰性患者について観察されたのと類似のパターンを示した（図３Ａおよび３Ｂ）。第２の患者は、中度ＧＶＨＤと診断された（皮膚症ステージ３、総合グレードＩＩ；治癒までの日数１３７）。ｃｆＤＮＡ原発組織プロファイリングでは、診断後の固形臓器由来ｃｆＤＮＡの増加が確認された（診断時が３６．５ｎｇ／ｍＬ、２および３か月目がそれぞれ１９９．４ｎｇ／ｍＬおよび２５４．１ｎｇ／ｍＬ；図３Ｃ）。第３の患者は、重度ＧＶＨＤと診断された（皮膚症ステージ４、総合グレードＩＶ；不治；９１日目に死亡；図３Ｄ）。この患者の診断後のサンプルに対するｃｆＤＮＡ原発組織プロファイリングにより、ＧＶＨＤ治療を強めていったにもかかわらずこの患者の血液中の固形臓器由来ｃｆＤＮＡが増加したことが明らかになった（１か月目は２３３．８ｎｇ／ｍＬ、２か月目は１２１７．７ｎｇ／ｍＬ；１か月目はタクロリムス、２か月目はタクロリムス、シロリムス、ルキソリチニブおよびグルココルチコイド）。これらの３つの例は、ＧＶＨＤ治療反応および成果をモニタリングするｃｆＤＮＡ原発組織プロファイリングの有効性の可能性を示すものである。
ＨＣＴ後の血漿インフェクトーム
ＤＮＡを血液中に放出するのはヒト宿主細胞だけでなく；ウイルスおよび細菌からのｃｆＤＮＡも循環物中で検出されて、メタゲノムｃｆＤＮＡシークエンシングを介して感染をスクリーニングするための手段を提供することができる。これは、感染合併症の発生率が高く、広範な微生物がＨＣＴにおける疾患の原因となり得ることを考慮すると、ＨＣＴに関して特に強力な手法になり得る。発明人らは、この概念を試験するために、微生物に由来する配列についてすべての患者からのすべてのデータを掘り出した。発明人らは、ＷＧＢＳ後の微生物由来ｃｆＤＮＡを識別するために、最初に宿主関連配列を識別および除去し、次いで発明人らは、残留する非マッピングリードを微生物参考ゲノムの集合に合わせて調整した（全リードの０．９±０．４％、材料および方法）。発明人らは、調整ノイズおよび環境汚染による影響を除くためにバックグラウンド補正アルゴリズムを実行した。
発明人らは、この手順を用いて、ＨＣＴ後のＤＮＡウイルスに由来するｃｆＤＮＡの負荷の有意な増加を認めたが（移植日および３か月目のウイルスｃｆＤＮＡ量がそれぞれ１．４×１０－３ｎｇ／ｍＬおよび１．５×１０－２ｎｇ／ｍＬ、ｐ値＝０．００８２、図４Ａ）、細菌ｃｆＤＮＡでは認められなかった（移植日および３か月目の細菌ｃｆＤＮＡ量がそれぞれ９．８×１０－３ｎｇ／ｍＬおよび３．３×１０－２ｎｇ／ｍＬ、ｐ値＝０．０５０）。発明人らは、固形臓器移植およびＨＣＴにおけるアネロビリダエ（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）の血漿中存在度と免疫抑制の程度との関連性を発見した。これらの観察に従って、ＤＮＡウイルスに由来するｃｆＤＮＡの増加は、主に、ＨＣＴ後の最初の月におけるアネロビリダエｃｆＤＮＡの負荷の増加に起因するものであった（図４Ｂ）。ヘルペスビリダエ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）およびポリオーマビリダエ（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）は、しばしば、成人における潜在的感染を確立するとともに、同種異系ＨＣＴ後に再活性化し得る。発明人らは、１８人の患者のうちの１５人の１０６のサンプルのうちの３５においてヒトヘルペスビリダエおよびポリオーマビリダエからｃｆＤＮＡを識別した（図４Ｃ）。アネロビリダエとは対照的に、発明人らは、ＨＣＴ後にこれらのウイルスからｃｆＤＮＡの負荷の一貫した増加を観察しなかった（図４Ｂ）。ＢＫポリオーマウイルスの検出は、ＢＫウイルス疾患の臨床診断と一致する。コホートの中の４人が、ここでは臨床ＢＫポリオーマウイルス疾患の症状と泌尿生殖器病の他の原因が存在しない場合における血液または尿ＢＫ ＰＣＲ検査での陽性との組合せとして定義されるＢＫポリオーマウイルス疾患と診断された（方法参照）。即時メタゲノムアッセイでは、ＢＫ血液検査で陽性（スピアマンのローが０．７９、ｐ値＜２．２×１０－１６）の５人の患者のうちの４人の血漿にＢＫポリオーマウイルスｃｆＤＮＡが検出されたが、血液検査が陰性で尿検査が陽性の患者（ｎ＝１５）では検出されなかった。
発明人らは、７つの異なる細菌属（１０種）からｃｆＤＮＡを識別した。興味深いことに、識別した種類のいずれもが、ＧＶＨＤに伴う腸血管隔壁の完全性の低下に関連して広く掲載されている腸共生有機体である。発明人らは、不治のステージＩＶ皮膚ＧＶＨＤの１人の患者について、発明人らは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による血流感染の可能性を識別した。このコホートにおける２人の患者は、移植後の最初の６か月以内に臨床的に診断されるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）血流感染を発症した。発明人らは、感染症の時点が、最近の血漿採取時点から少なくとも６日離れており、ストレプトコッカス種による血流感染が、抗微生物治療の開始後速やかに消える可能性があるため、これらの２人の患者について、メタゲノムｃｆＤＮＡシークエンシングによるストレプトコッカスｃｆＤＮＡの検出を行わなかった。
発明人らは、ここでは、同種異系ＨＣＴ後のＧＶＨＤ関連傷害および感染の両方を検出する可能性を有するｃｆＤＮＡアッセイについて説明した。発明人らは、ｃｆＤＮＡがＨＣＴ後のＧＶＨＤによる血管付き組織に対する傷害についての情報をも与え得ることを論証した。発明人らは、任意の組織に由来するｃｆＤＮＡを定量するために、ｃｆＤＮＡのバイサルファイトシークエンシングを実施して、ｃｆＤＮＡに含まれるとともに細胞、組織および臓器型に特異的であるシトシンメチル化マークをプロファイリングした。ヒドロキシメチル化およびヒストン修飾を含むいくつかの他のエピジェネティックマークは、ｃｆＤＮＡの原発組織についての情報を与えることが可能であり、これらのマークのプロファイリングは、ＨＣＴ後のＧＶＨＤをモニタリングするのに有益でもあり得る。
近年、いくつかのタンパク質バイオマーカーがＧＶＨＤの診断について調査されている。プロテオミクス手法は、ＧＶＨＤの病因に直接関与しないが、末端臓器損傷の結果として分泌される候補マーカーを生成してきた。いずれも胃腸管に由来するＳＴ２およびＲＥＧ３αは、最強の予測力を有する２つの当該バイオマーカーである。ここで提示されるｃｆＤＮＡアッセイは、タンパク質バイオマーカー技術を超える固有の利点を提供することができる。第一に、組織特異的ＤＮＡの濃度が細胞傷害の程度に直接関連し得るため、このアッセイは、容易に理解され、原則的に経時観察できる傷害の尺度を提供する。第二に、ここで探査されるｃｆＤＮＡアッセイは、任意の組織に対する傷害を測定するための一般化可能な手法を提供するのに対して、タンパク質傷害マーカーは、すべての細胞および組織型に利用できるわけではない。第三に、このアッセイは、デジタルおよび定量的ＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシングを含む様々な定量的核酸測定技術との相溶性を有する。第四に、このアッセイは、特異性および再現性の課題を伴う抗体に依存しない。
全ゲノムバイサルファイトシークエンシングは、ヒト宿主由来ｃｆＤＮＡのみならず、血液循環物中に存在し得る微生物ｃｆＤＮＡにも反応する。発明人らは、ｃｆＤＮＡのバイサルファイトシークエンシングによりＨＣＴレシピエントの血漿中の微生物およびウイルス由来ｃｆＤＮＡをスクリーニングする可能性を調べた。この手法を、血液においてＢＫウイルス陽性であるサンプルに使用し、尿においてのみＢＫウイルス陽性であるサンプルに使用せずに、ＢＫウイルスｃｆＤＮＡを検出した。また、発明人らは、免疫抑制時におけるヘルペスウイルスゲノム存在度の増加を認識する一方で、溶解感染および潜伏感染、ならびに対応する宿主反応の差別化が、患者のケアを向上させる上で重要であると考える。したがって、ここで報告するアッセイは、宿主ｃｆＤＮＡの原発組織からのＧＶＨＤ、および微生物ｃｆＤＮＡのメタゲノム分析からの感染に関する情報を同時に与える可能性を有する。このアッセイは、従来のメタゲノムシークエンシングと比較して、およそ２時間以内で完了することができ、多数の既存の次世代の配列決定ワークフローと相溶性を有する、ｃｆＤＮＡのバイサルファイト変換の１つのさらなる実験工程を必要とする。
実施例３
血液中の可能性のある無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）源の概略を図５Ａに示す。ｃｆＤＮＡは、造血細胞移植（ＨＣＴ）ドナー、ＨＣＴレシピエント（すなわち患者）自身の非腫瘍組織、腫瘍組織または微生物感染に由来し得る。同種異系ＨＣＴのいずれの場合にも、ｃｆＤＮＡドナー分率を測定することができる。一般に、これは、ＨＣＴ患者とドナーとの遺伝子的差異を識別し、ｃｆＤＮＡ分子においてそれらの差異を探すことによって実施可能である。ドナーとレシピエントの性が不一致の場合は、ＸおよびＹ染色体からのｃｆＤＮＡ断片の数を計数することにより、ドナー分率が容易に求められる（図５Ａ、上挿入図）。特定の悪性血液障害の場合は、腫瘍でしか生じない遺伝子変化により、腫瘍由来ｃｆＤＮＡを検出することができる。例えば、これは、単一ヌクレオチドの多型またはコピー数変化として生じ得る（染色体の減少もしくは増加、または染色体の一部の減少もしくは増加）（図５Ａ、下挿入図）。
経時的な患者のドナー分率の測定
図５Ｂおよび５Ｃは、性不一致患者のドナー分率測定値を示す。移植前はドナー分率が０である（ドナー由来のＤＮＡが存在しないが、（移植片が一定の量の血液細胞を産生する臨床的兆候が認められる）生着においてかなり上昇する）。図５Ｃは、患者が、ドナー分率測定値により把握することが可能なぶり返し（血液障害の再発）を経験した２つの例を示す。ぶり返しが生じると、ドナー分率が減少し、寛解が生じると、ドナー分率が増加する。
腫瘍分率を推定するためのコピー数変化（ＣＮＡ）の利用
図５Ｄは、コピー数変化を利用して、無細胞ＤＮＡにおける腫瘍分率を推定できることを証明している。すべての患者が、測定可能なコピー数変化を伴う悪性血液障害を有しているわけではなかった。しかし、腫瘍にコピー数変化があると、それらの変化を利用して、その腫瘍の存在および進行をモニタリングすることができる。
ｃｆＤＮＡのゲノム規模のカバレッジプロットによりＣＮＡを確認可能
図５Ｅおよび５Ｆは、検出されたｃｆＤＮＡ断片をヒトゲノムにマッピングすることによって作成されたゲノム規模のカバレッジプロットを示す。患者００８は、コピー数変化を示さない非悪性血液障害を有する（図５Ｅ）。一方で、患者０３１はＨＣＴ患者である（図５Ｆ）。３つの異なる時点：プレコンディショニング：ＨＣＴを受ける前、生着時および生着の６か月後の３つの異なる時点での患者０３１が示されている。プレコンディショニング：移植を受ける前に、この個人は、５つのコピー変化を示していた（この患者は、２Ｘ染色体の代わりに１つのＸ染色体および１つのＹ染色体を有する男性であったため、Ｘ染色体におけるコピー数変化がカウントされていない）。発明人らは、移植前の比較として臨床試験（ラピドヘムパネル（Ｒａｐｉｄ Ｈｅｍｅ Ｐａｎｅｌ））も実施し、本明細書に記載の方法では、同じコピー数変化などが確認された。ラピドヘムパネルが９５の遺伝子しかプロファイリングしないのに対して、現行のｃｆＤＮＡベースの方法は、ゲノム全体をプロファイリングするためより優れている。移植全体を通じて患者をモニタリングするのに使用された即時ｃｆＤＮＡアッセイにより、患者０３１において新たなコピー数変化の発生を捉えた。患者は、６か月目までに、これまで未検出であった多数のコピー数変化を示した。これにより、新たな癌の発症、およびサブクローナル集団の選択が示唆されることになる。
本明細書に記載の手法を使用して、経時的な患者のゲノム変化を追跡することも可能である。図５Ｇは、ベースラインではコピー数変化を示さなかったが、染色体７の１つのコピーを突然失った患者の例を示す。

Claims (90)

  1. 被検体における組織損傷を検出する方法であって、
    被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；
    組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；
    決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；および
    対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子の（ｉ）レベルまたは（ｉｉ）レベルの増加が、前記識別された原発組織における損傷を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定すること
    を含む方法。
  2. エピジェネティックマーカーは、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である、請求項２に記載の方法。
  4. ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  5. エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む、請求項２に記載の方法。
  6. ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素ＤＮＡメチル化分析によって決定される、請求項３に記載の方法。
  7. ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ、選択的標識アッセイ、または酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイによって決定される、請求項３に記載の方法。
  8. ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される、請求項４に記載の方法。
  9. ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される、請求項２に記載の方法。
  10. エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される、請求項２に記載の方法。
  11. 決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される、請求項１０に記載の方法。
  12. アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される、請求項１に記載の方法。
  14. 被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている、請求項１に記載の方法。
  15. 生体サンプルは、血液または血清サンプルである、請求項１４に記載の方法。
  16. 生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後または約９０日後に被検体から取得される、請求項１４に記載の方法。
  17. 対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を有さない被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベルである、請求項１４に記載の方法。
  18. 原発組織は固形臓器を含む、請求項１に記載の方法。
  19. 固形臓器は、腎臓、肝臓、脾臓および膵臓から選択される臓器である、請求項１８に記載の方法。
  20. 原発組織は腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
  21. ｃｆＤＮＡ分子は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、膀胱または膵臓から選択される１つまたはそれ以上の臓器からのものである、請求項１に記載の方法。
  22. 被検体に組織損傷がある場合は、被検体における損傷組織を改善するための治療により被検体を処置することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  23. 前記治療は、免疫調節剤を被検体に投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 損傷組織は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、小腸、大腸、膀胱および膵臓から選択され、免疫調節剤は、抗炎症薬、ステロイド、抗体または小分子薬である、請求項２３に記載の方法。
  25. ＨＣＴの約３０日後の組織損傷の検出は、臓器拒絶反応、または臓器拒絶反応を発症するリスクを示唆する、請求項１に記載の方法。
  26. 組織損傷は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を示唆する、請求項１に記載の方法。
  27. 被検体にＧＶＨＤが存在する場合に免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 組織損傷は、微生物感染を示唆する、請求項１に記載の方法。
  29. 抗生物質または抗ウイルス薬で被検体を処置することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 組織損傷は、薬物毒性を示唆する、請求項１に記載の方法。
  31. 造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けた被検体をモニタリングする方法であって、
    被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；
    組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；
    決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；および
    対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が移植片対宿主疾患を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法。
  32. エピジェネティックマーカーは、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である、請求項３２に記載の方法。
  34. ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  35. エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む、請求項３２に記載の方法。
  36. ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素ＤＮＡメチル化分析によって決定される、請求項３３に記載の方法。
  37. ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ、選択的標識アッセイ、または酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイによって決定される、請求項３３に記載の方法。
  38. ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される、請求項３２に記載の方法。
  39. ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される、請求項３２に記載の方法。
  40. 決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される、請求項３１に記載の方法。
  41. エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される、請求項３２に記載の方法。
  42. 決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される、請求項４１に記載の方法。
  43. アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む、請求項４１に記載の方法。
  44. 生体サンプルは、血液、血漿または血清サンプルである、請求項３１に記載の方法。
  45. 生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後、約７５日後、約９０日後、約１０５日後または約１２０日後に被検体から取得される、請求項３１に記載の方法。
  46. いくつかの実施形態において、対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を有さない被検体からのサンプルにおけるｃｆＤＮＡのレベルである、請求項３１に記載の方法。
  47. 原発組織は固形臓器を含む、請求項３１に記載の方法。
  48. 固形臓器は、腎臓、肝臓、脾臓および膵臓から選択される臓器を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. ｃｆＤＮＡ分子は、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、膀胱および膵臓から選択される臓器からのものである、請求項３１に記載の方法。
  50. 被検体に移植片対宿主疾患が存在する場合に免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  51. 生体サンプルは、ＨＣＴの約３０日後に被検体から取得される、請求項３１に記載の方法。
  52. 被検体の生体サンプルにおける微生物感染を検出する方法であって、
    生体サンプルから無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子を取得すること；
    ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定すること；および
    微生物種のｃｆＤＮＡ配列の存在を識別することにより、微生物種の感染を検出することを含む方法。
  53. 決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される、請求項５２に記載の方法。
  54. ｃｆＤＮＡ分子は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定する前にバイサルファイト処理される、請求項５２に記載の方法。
  55. 生体サンプルにおいて微生物ｃｆＤＮＡ配列が識別された場合に抗微生物剤で被検体を処置することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  56. 抗微生物剤は、抗菌剤または抗真菌剤である、請求項５５に記載の方法。
  57. 抗微生物剤は、抗ウイルス剤である、請求項５５に記載の方法。
  58. 被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている、請求項５２に記載の方法。
  59. 生体サンプルは、血液または血清サンプルである、請求項５８に記載の方法。
  60. 被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；
    組織特異的プロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ分子中のエピジェネティックマーカーのプロファイルを決定すること；
    決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の原発組織を識別すること；
    対照レベルと比較した場合の識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が、前記識別された原発組織における損傷を示唆する、前記識別された原発組織のｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定すること；および
    生体サンプルにおける微生物ｃｆＤＮＡの存在を識別することを含む方法。
  61. 生体サンプルは、バイサルファイト処理されている、請求項６０に記載の方法。
  62. 生体サンプルにおける微生物ｃｆＤＮＡの存在の識別は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む、請求項６０に記載の方法。
  63. 被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている、請求項６０に記載の方法。
  64. 被検体における腫瘍を検出する方法であって、
    被検体の生体サンプルから無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子を取得すること；
    腫瘍特異的ＤＮＡ変化に基づいて腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子の存在を識別すること；および
    対照レベルと比較した場合の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が被検体における腫瘍の存在を示唆する、または被検体におけるより早期のレベルと比較した場合の腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が被検体における腫瘍の進行を示唆する腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法。
  65. 決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される、請求項６４に記載の方法。
  66. 腫瘍特異的ＤＮＡ変化は、腫瘍特異的欠失、腫瘍特異的増幅または腫瘍特異的点変異から選択される、請求項６５に記載の方法。
  67. ｃｆＤＮＡ分子がバイサルファイト処理される、請求項６５に記載の方法。
  68. 腫瘍特異的ＤＮＡ変化は、腫瘍特異的ＤＮＡメチル化である、請求項６７に記載の方法。
  69. 腫瘍由来ｃｆＤＮＡ分子のレベルの増加が検出された場合は、化学療法、放射線療法または組合せ療法で被検体を処置することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  70. 化学療法は、ＤＮＡアルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、分裂抑制剤またはコルチコステロイドから選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 被検体は、造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている、請求項６４に記載の方法。
  72. 生体サンプルは、血液または血清サンプルである、請求項６４に記載の方法。
  73. ドナーからの造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けた被検体における生着をモニタリングする方法であって、
    被検体の生体サンプルからｃｆＤＮＡ分子を取得すること；
    被検体とドナーと間の異なるプロファイルを有する、ｃｆＤＮＡ分子中のマーカーのプロファイルを決定すること；
    決定されたプロファイルに基づいてｃｆＤＮＡ分子の起源を識別すること；および
    ドナーのｃｆＤＮＡ分子に対する被検体のｃｆＤＮＡ分子の割合の対照割合と比較した場合の増加が生着の減少を示唆する、被検体のｃｆＤＮＡ分子のレベルおよびドナーのｃｆＤＮＡ分子のレベルを測定することを含む方法。
  74. 決定の前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリ調製方法を使用してｃｆＤＮＡ分子のライブラリが調製される、請求項７３に記載の方法。
  75. マーカーは、性染色体、ＤＮＡ修飾、ヒストン修飾およびヌクレオソームポジショニングからなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
  76. ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡヒドロキシメチル化である、請求項７５に記載の方法。
  77. ヒストン修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＧｌｃＮアシル化、シトルリン化、クロトニル化および異性化からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
  78. エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することを含む、請求項７５に記載の方法。
  79. ＤＮＡメチル化のプロファイルは、バイサルファイト処理または酵素的ＤＮＡメチル化分析によって決定される、請求項７６に記載の方法。
  80. ＤＮＡヒドロキシメチル化のプロファイルは、プルダウンアッセイ、選択的標識アッセイまたは酸化的バイサルファイトシークエンシングアッセイによって決定される、請求項７６に記載の方法。
  81. ヒストン修飾のプロファイルは、プルダウンアッセイによって検出される、請求項７７に記載の方法。
  82. ヌクレオソームポジショニングは、ヌクレオソームポジショニングアッセイによって決定される、請求項７５に記載の方法。
  83. エピジェネティックマーカーのプロファイルの決定は、ｃｆＤＮＡ分子の配列を決定することなく達成される、請求項７５に記載の方法。
  84. 決定は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）から選択されるＰＣＲアッセイによって達成される、請求項８３に記載の方法。
  85. アッセイは、特定のエピジェネティックマーカーを有するゲノムの領域のｃｆＤＮＡ分子を増幅させることを含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 生体サンプルは、血液、血漿または血清サンプルである、請求項７４に記載の方法。
  87. 生体サンプルは、ＨＣＴの約１５日後、約３０日後、約４５日後、約６０日後、約７５日後、約９０日後、約１０５日後または約１２０日後に被検体から取得される、請求項７４に記載の方法。
  88. 対照レベルは、（ｉ）ＨＣＴの前の被検体のサンプルにおけるｃｆＤＮＡ分子のレベル、または（ｉｉ）ＨＣＴを受けたが、生着の減少がなかった被検体のサンプルにおけるｃｆＤＮＡのレベルである、請求項７４に記載の方法。
  89. 生着の減少が生じている場合に免疫調節剤で被検体を処置することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
  90. 生体サンプルは、ＨＣＴの約３０日後に被検体から取得される、請求項７４に記載の方法。
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