KR20200028320A - 알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단 - Google Patents

알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단 Download PDF

Info

Publication number
KR20200028320A
KR20200028320A KR1020190110823A KR20190110823A KR20200028320A KR 20200028320 A KR20200028320 A KR 20200028320A KR 1020190110823 A KR1020190110823 A KR 1020190110823A KR 20190110823 A KR20190110823 A KR 20190110823A KR 20200028320 A KR20200028320 A KR 20200028320A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
replaced
alzheimer
disease
biomarker
Prior art date
Application number
KR1020190110823A
Other languages
English (en)
Inventor
이정호
박준성
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Publication of KR20200028320A publication Critical patent/KR20200028320A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 가족력이 없거나 가족력이 있음에도 원인 유전자가 불분명한 알츠하이머병 환자들의 뇌 조직에서 새로운 원인 유전변이들 확인하고, 이를 활용하여 알츠하이머병 환자들에게서 검출하기 위한 바이오마커, 및 상기 바이오마커를 검출하여 알츠하이머의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

Description

알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단{Biomarker for detecting Alzheimer's disease and diagnosis for Alzheimer's disease}
본 발명은 알츠하이머병 질환 및 이와 관련한 질환, 예를 들면 알츠하이머성 치매 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단 조성물에 관한 것으로서, 가족력이 없거나 가족력이 있음에도 원인 유전자가 불분명한 알츠하이머병의 새로운 원인 유전변이 확인을 위한 검사용 바이오마커의 개발에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's Disease)은 노인성 치매의 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. 이 질환에 소모되는 비용은 전 세계 GDP의 1%를 차지할 정도로 사회 경제적 소모비용이 크며, 이는 꾸준히 증가할 전망이다. 그러나 수십 년간 지속된 연구에도 불구하고, 여전히 알츠하이머병을 일으키는 분자 유전학적 원인은 명확하게 규명되지 않고 있다. 전체 알츠하이머병 환자의 5% 미만에 해당되는 가족력이 있는 알츠하이머병(Familial AD)에서는 질병 원인 유전자인 APP 또는 PSEN1/2이 발굴되어 알츠하이머병 질환 원인 연구에 발전이 있었다. 반면, 알츠하이머병의 대부분을 차지하는 가족력이 없는 산발성(Sporadic AD)의 경우, 2013년 IGAP(International Genomic Alzheimer's Project)가 AD 환자 74,000명의 말초조직에서 대규모로 GWAS(Genome-wide Association Study) 분석결과를 통해 APOE-ε4(ε4/ε4-전체 인구집단의 2%, AD 발병위험도 10배 증가)를 찾아냈고, 이후에 이뤄진 말초조직 대상 차세대염기서열분석에서 TREM2-R47H(전체 인구집단의 0.3%, AD 발병위험도 3배 증가) 정도를 발견하는데 그쳤다. 이는 현재 알츠하이머병의 발병 원인 유전자 규명 연구의 패러다임 전환이 필요함을 암시한다.
알츠하이머병은 신경섬유매듭(neurofibrilary tangle)의 축적이 점진적으로 뇌 전체에 확산되는 것이 특징이며, 이는 노인성 치매의 중증도와 밀접한 연관성이 있다 (Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2010). 특히, 산발적으로 나타나는 노인반(senile plaque)과는 달리 신경섬유매듭은 내후각피질(entorhinal cortex, 이하 EC)에서 시작되어 소뇌를 제외한 뇌 전체로 점차 확산되는 일정한 패턴으로 나타난다. 그러나 아직도 신경섬유매듭이 왜 해마형성체(Hippocampal Formation) 내 내후각피질에서 시작되는지 알려진 바가 전혀 없다.
수정 후 인간의 모든 장기는 발달 및 노화 과정에서 언제든지 유전변이를 획득할 수 있으며, 이들을 체성 유전변이(somatic mutation)이라고 함. 특히 세포분열이 빈번한 줄기세포에서는 체성 유전 변이의 빈도가 높다고 알려져 있다. 과거 한번 만들어진 성인의 뇌 세포는 재생되지 않는다고 생각하였으나, 최근 성인의 뇌에서도 줄기세포가 존재하는 것이 알려졌다. 특히, 측뇌실(lateral ventricle) 주변의 뇌실하 영역(subventricular zone, 이하 SVZ)과 해마 형성체(hippocampal formation, 이하 HIF)의 치상회(dendate gyrus, 이하 DG)에 성체 줄기세포가 존재한다는 것은 잘 알려져있다. 추측컨대, 노화과정에 따라 SVZ와 DG 유래 세포는 주변 조직보다 더 빈번하게 체성 유전변이를 축적할 것으로 생각된다. 만약, 발달 과정 및 노화 과정 중에서 DG와 EC를 포함한 해마 형성체가 획득한 체성 유전변이들이 단백질 응집체를 유발하는 환경(niche)을 제공한다면, 이는 신경섬유매듭 같은 비정상 단백질 응집체의 생성과 전파를 촉진하고 그에 따른 뇌 기능의 점진적 이상으로 알츠하이머병을 유발할 수 있을 것이다.
체성 유전변이(Somatic mutation)는 발생 및 노화과정 중 어느 조직에서나 발생할 수 있기에 그 빈도 및 분포 양상을 고전적인 시퀀싱(sanger sequencing) 방법으로는 예측하기 어려움이 있다. 최근 5 년 이내에, 학계에서 뇌의 병변부위에 저빈도로 존재하는 체성 유전변이가 각종 신경질환을 유발할 수 있다는 보고들이 있었다: Sturge Weber Syndrome(빈도=1~18.1%; 환자=50명), Autism spectrum disorder(빈도=~5%, 환자=55명), Focal Cortical Dysplasia(빈도=1.46~9.63%, 환자=77명) (Shirley et. al, NEJM, 2013) (D'Gama et. al, Neuron, 2015) (Lim et. al, Nature Medicine, 2015). 이들 연구결과는 차세대염기서열분석법을 이용해 병변부위에서 분리한 gDNA를 고심도(high read depth)로 읽어냈기에 저빈도(low allele frequency)로 존재하는 원인유전변이를 찾아낼 수 있었다. 따라서 고심도 차세대염기서열분석법을 통한 유전체 분석은 고착된 상태의 알츠하이머병 원인 규명에 실마리를 줄 수 있을 것임을 기대할 수 있다.
미국 NIH-NIA에서 2014-16년 동안 연구기금을 받아간 프로젝트 중에는 "Somatic Mutations in Brain in Alzheimer's disease"-7명의 알츠하이머병 환자와 7명의 대조군의 뇌(temporal cortex)에서 Whole Genome Sequencing을 통해 체성 유전변이와 구조변이를 확인할 예정(http://grantome.com/grant/NIH/R21-AG045789-01A1)-을 진행 중인 미국 연구진들도 있었다. 따라서 본 발명의 아이디어가 현 학계의 최신 동향과 전혀 동떨어지지 않았음을 보여준다. 하지만 비암성 신경질환의 발병 및 관련 기작에 체성 유전변이의 중요함이 대두됨에도 불구하고, 여전히 세계적으로 알츠하이머병 뇌 유전체 연구가 절대적으로 부족한 상황이며 분석기술 역시 완벽히 정립되어 있지 않다. 2014-17 년에 알츠하이머병 뇌 체성 유전변이 연구와 관련하여 3 편의 논문이 나온 정보를 수집하였다. 그러나 관련 논문들에서는 단순히 유전변이의 존재 정도만 확인 하는 수준에 머물러 있을뿐더러 다음의 한계점이 있었다: 1) 체성 유전변이 확인을 위해 말초조직을 포함하지 않고 affected sample 만을 사용함; 2) 저빈도 체성 유전변이를 확인하는데 적합하지 않은 germline caller를 사용함; 3) 저빈도 체성 유전변이를 확인하기에는 낮은 시퀀싱 read-depth 및 affected 샘플을 따로 enrichment하지 않고 bulk sampling함.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 알츠하이머병 환자 52 명의 뇌 조직 시료(brain tissue)에 대하여, 고심도 전체 엑솜 염기서열 분석기법을 이용하여 해마 형성체의 뇌-특이적 저빈도 체성 유전변이를 발굴하였고, 이러한 체성 유전변이들 중 일부가 알츠하이머병의 병인기전 중 하나인 신경섬유매듭 형성에 연관성이 높음을 확인하였다. 해당 유전변이들을 포함한 유전자 패널의 발명을 통해 더 많은 환자들을 진단하기 위한 바이오마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 목적은, 알츠하이머를 포함하는 치매의 진단을 위한 바이오마커 패널, 상기 바이오마커를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물, 상기 바이오패널 및/또는 상기 진단용 조성물을 이용한 알츠하이머병을 포함하는 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 상기 바이오마커를 포함하는 알츠하이머병 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 알츠하이머병에서 뇌-특이적 체성 유전변이의 존재 및 질병 연관성을 52 명의 알츠하이머병 환자에서 발견한 새로운 유전자들로 구성된 30개의 유전자 패널을 통하여 규명하고자 함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 가족력이 없거나 가족력이 있음에도 원인 유전자가 불분명한 알츠하이머병 환자들의 뇌 조직에서 새로운 원인 유전변이들의 후보를 찾고, 이를 더 많은 알츠하이머병 환자들에서 검출하기 위함이다.
본 발명은 알츠하이머를 포함하는 치매 진단을 위한 바이오마커 패널, 상기 바이오마커 패널을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트 및 상기 바이오마커 패널을 이용한 알츠하이머의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 알츠하이머병 질환 (Alzheimer's disease) 또는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dimentia) 진단을 위한 바이오마커 또는 상기 바이오마커를 포함하는 알츠하이머병 및/또는 치매 진단용 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 바이오마커는 1종 또는 2종 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 바이오마커의 조합 사용의 이점은 개시된 검정의 민감도 및/또는 특이성을 증가시킨다는 점이다.
본 발명에서 알츠하이머병 또는 알츠하이머성 치매는 가족력이 있는 알츠하이머(Familial AD) 및/또는 가족력이 없는 산발성 알츠하이머병(Sporadic AD)일 수 있으며, 65세 이상의 고령 환자에게서 발병하는 것일 수 있다. 상기 알츠하이머병은 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle)의 축적에 의해 발병하는 것일 수 있으며, 상기 신경섬유매듭은 해마형성체(Hippocampal formation) 내 내후각피질에서 시작되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 바이오마커는 PI3K-AKT, MAPK, AMPK 신호전달 경로에 관여하는 유전자, 상기 유전자의 변이유전자, 상기 유전자로부터 발현되는 단백질, 및/또는 상기 변이 유전자로부터 발현되는 단백질을 포함할 수 있다.
상기 PI3K-Akt, MAPK, AMPK 신호전달 경로의 유전자 및/또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 Tau 단백질의 활성에 관여할 수 있으며, 예를 들어, 타우(Tau) 단백질의 인산화 증가 및/또는 Tau 단백질 다량체의 수준 증가를 유발할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 PI3K-Akt, MAPK, AMPK 신호전달 경로의 유전자는 PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 PI3K-Akt, MAPK, AMPK 신호전달 경로의 유전자는 PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, 및 IGF1R로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자; MOS, PLEC, 및 ZSWIM6로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자; 및/또는 PIN1 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 상기 바이오마커로서 염기서열의 변이가 일어난 상기 PI3K-Akt, MAPK, AMPK 신호전달 경로의 유전자는 PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자 또는 상기 서열의 변이가 일어난 PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자로부터 발현되는 아미노산 서열의 변이가 일어난 단백질을 제공하는 것이다.
보다 상세하게는, 상기 바이오마커의 뉴클레오타이드 변이는, PPP2R1A(NCBI Accession No. NM_014225.5) 유전자의 83번째 G가 A로 치환 (c.83G>A), COL6A1(NCBI Accession No. NM_001848.2) 유전자의 160번째 C가 A로 치환 (c.160C>A), CACNA1I(NCBI Accession No. NM_021096.3) 유전자의 5194번째 C가 A로 치환 (c.5194C>A), RAPGEF2(NCBI Accession No. NM_014247.2) 유전자의 3752번째 C가 A로 치환 (c.3752C>A), VEGFC(NCBI Accession No. NM_005429.4) 유전자의 629번째 G가 T로 치환 (c.629G>T), SRF(NCBI Accession No. NM_003131.3) 유전자의 1262번째 C가 A로 치환 (c.1262C>A), MOS(NCBI Accession No. NM_005372.1) 유전자의 423번째 C가 A로 치환 (c.423C>A), MOS(NCBI Accession No. NM_005372.1) 유전자의 151번째 G가 A로 치환 (c.151G>A), PTPN5(NCBI Accession No. NM_006906.1) 유전자의 1627번째 G가 T로 치환 (c.1627G>T), TAOK3(NCBI Accession No. NM_016281.3) 유전자의 37번째 G가 T로 치환 (c.37G>T), MAP2K4(NCBI Accession No. NM_003010.3) 유전자의 1169번째 C가 A로 치환 (c.1169C>A), CPT1A(NCBI Accession No. NM_001876.3) 유전자의 1252번째 G가 T로 치환 (c.1252G>T), ITGB4(NCBI Accession No. NM_000213.3) 유전자의 3136번째 C가 A로 치환 (c.3136C>A), FGF16(NCBI Accession No. NM_003868.2) 유전자의 553번째 C가 A로 치환 (c.553C>A), HGF(NCBI Accession No. NM_000601.4) 유전자의 1117번째 C가 T로 치환 (c.1117C>T), COL6A2(NCBI Accession No. NM_001849.3) 유전자의 1998번째 C가 A로 치환 (c.1998C>A), MTOR(NCBI Accession No. NM_004958.3) 유전자의 7405번째 A가 T로 치환 (c.7405A>T), PFKL(NCBI Accession No. NM_002626.5) 유전자의 137번째 C가 G로 치환 (c.137C>G), ITGA1(NCBI Accession No. NM_181501.1) 유전자의 2399번째 A가 C로 치환 (c.2399A>C), PPP2CA(NCBI Accession No. NM_002715.2) 유전자의 889번째 G가 A로 치환 (c.889G>A), LAMA1(NCBI Accession No. NM_005559.3) 유전자의 5611번째 G가 T로 치환 (c.5611G>T), THBS1(NCBI Accession No. NM_003246.2) 유전자의 863번째 G가 A로 치환 (c.863G>A), RASGRF2(NCBI Accession No. NM_006909.2) 유전자의 1412번째 C가 A로 치환 (c.1412C>A), TAB2(NCBI Accession No. NM_015093.4) 유전자의 1535번째 C가 A로 치환 (c.1535C>A), FN1(NCBI Accession No. NM_002026.2) 유전자의 5444번째 G가 A로 치환 (c.5444G>A), PIK3CA(NCBI Accession No. NM_006218.2) 유전자의 3140번째 A가 G로 치환 (c.3140A>G), CACNA1C(NCBI Accession No. NM_000719.6) 유전자의 304번째 C가 T로 치환 (c.304C>T), IGF1R(NCBI Accession No. NM_000875.4) 유전자의 1033번째 A가 T로 치환 (c.1033A>T), PLEC(NCBI Accession No. NM_201380.3) 유전자의 11656번째 C가 T로 치환 (c.11656C>T), PLEC(NCBI Accession No. NM_201380.3) 유전자의 3262번째 C가 T로 치환 (c.3262C>T), ZSWIM6(NCBI Accession No. NM_020928.1) 유전자의 2066번째 C가 A로 치환 (c.2066C>A), ZSWIM6(NCBI Accession No. NM_020928.1) 유전자의 3268번째 A가 G로 치환 (c.3268A>G), 및 PIN1(NCBI Accession No. NM_006221.3) 유전자의 455번째 C가 T로 치환 (c.455C>T)된 변이로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이이다.
또한, 상기 유전자 변이를 포함하는 유전자로부터 발현되는 단백질 변이는, PPP2R1A유전자 (NCBI Accession No. NM_014225.5)로부터 발현되는 아미노산 서열의 28번째 아르기닌(R)이 히스티딘(H)으로 치환, COL6A1유전자 (NCBI Accession No. NM_001848.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 54번째 프롤린(P)이 트레오닌(T)으로 치환, CACNA1I유전자 (NCBI Accession No. NM_021096.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1732번째 히스티딘(H)이 아스파라긴(N)으로 치환, RAPGEF2유전자 (NCBI Accession No. NM_014247.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1251번째 세린(S)이 결실, VEGFC유전자 (NCBI Accession No. NM_005429.4)로부터 발현되는 아미노산 서열의 210번째 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환, SRF유전자 (NCBI Accession No. NM_003131.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 421번째 세린(S)이 결실, MOS유전자 (NCBI Accession No. NM_005372.1)로부터 발현되는 아미노산 서열의 141번째 페닐알라닌(F)이 류신(L)으로 치환, MOS유전자 (NCBI Accession No. NM_005372.1)로부터 발현되는 아미노산 서열의 51번째 알라닌(A)이 트레오닌(T)으로 치환, PTPN5유전자 (NCBI Accession No. NM_006906.1)로부터 발현되는 아미노산 서열의 543번째 글루탐산(E)이 결실, TAOK3유전자 (NCBI Accession No. NM_016281.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 13번째 아스파라긴산(D)이 티로신(Y)으로 치환, MAP2K4유전자 (NCBI Accession No. NM_003010.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 390번째 알라닌(A)이 아스파라긴산(D)으로 치환, CPT1A유전자 (NCBI Accession No. NM_001876.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 418번째 발린(V)이 류신(L)으로 치환, ITGB4유전자 (NCBI Accession No. NM_000213.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1046번째 류신(L)이 메티오닌(M)로 치환, FGF16유전자 (NCBI Accession No. NM_003868.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 185번째 히스티딘(H)가 아스파라긴(N)으로 치환, HGF유전자 (NCBI Accession No. NM_000601.4)로부터 발현되는 아미노산 서열의 373번째 아르기닌(R)이 결실, COL6A2유전자 (NCBI Accession No. NM_001849.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 666번째 세린(S)이 아스파라긴(R)으로 치환, MTOR유전자 (NCBI Accession No. NM_004958.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 2469번째 리신(K)이 결실, PFKL유전자 (NCBI Accession No. NM_002626.5)로부터 발현되는 아미노산 서열의 46번째 알라닌(A)이 글리신(G)로 치환, ITGA1유전자 (NCBI Accession No. NM_181501.1)로부터 발현되는 아미노산 서열의 800번째 글루탐산(E)이 알라닌(A)으로 치환, PPP2CA유전자 (NCBI Accession No. NM_002715.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 297번째 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환, LAMA1유전자 (NCBI Accession No. NM_005559.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1871번째 알라닌A이 세린(S)으로 치환, THBS1유전자 (NCBI Accession No. NM_003246.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 288번째 아르기닌(R)이 히스티딘(H)으로 치환, RASGRF2유전자 (NCBI Accession No. NM_006909.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 471번째 세린(S)이 티로신(Y)으로 치환, TAB2유전자 (NCBI Accession No. NM_015093.4)로부터 발현되는 아미노산 서열의 512번째 알라닌(A)이 글루탐산(E)으로 치환, FN1유전자 (NCBI Accession No. NM_002026.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1815번째 세린(S)이 아스파라긴(N)으로 치환, PIK3CA유전자 (NCBI Accession No. NM_006218.2)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1047번째 히스티딘(H)이 아르기닌(R)으로 치환, CACNA1C유전자 (NCBI Accession No. NM_000719.6)로부터 발현되는 아미노산 서열의 102번째 아르기닌(R)이 결실, IGF1R유전자 (NCBI Accession No. NM_000875.4)로부터 발현되는 아미노산 서열의 345번째 트레오닌(T)이 세린(S)으로 치환, PLEC유전자 (NCBI Accession No. NM_201380.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 3886번째 아르기닌(R)이 트립토판(W)으로 치환, PLEC유전자 (NCBI Accession No. NM_201380.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1088번째 아르기닌(R)이 트립토판(W)으로 치환, ZSWIM6유전자 (NCBI Accession No. NM_020928.1)로부터 발현되는 아미노산 서열의 689번째 트레오닌(T)이 리신(K)으로 치환, ZSWIM6유전자 (NCBI Accession No. NM_020928.1)로부터 발현되는 아미노산 서열의 1090번째 이소류신(I)이 발린(V)으로 치환, 및 PIN1유전자 (NCBI Accession No. NM_006221.3)로부터 발현되는 아미노산 서열의 152번째 트레오닌(T)이 메티오닌(M)으로 치환 되는 변이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이이다.
본 발명의 일 실시예에서 기존에 알려진 germline AD risk factors와 본 발명자들이 확인한 Tau 인산화 조절에 영향을 미치는 고위험 체성 유전변이의 존재를 분석을 진행한 모든 시료에서 확인하였다(도 3). Alzgene 데이터베이스(https://www.alzforum.org/mutations)에 등록된 pathogenic germline risk factor 및 APOE e4 대립인자를 두 세트 가진 환자들은 23.1%(16/52)의 비율로 관찰되었다. 반면, Tau 단백질의 인산화의 이상조절에 관여할거라 예상되는 뇌 체성유전변이는 26.9%(14/52)에서 확인되었다. 이들 중, 오로지 고위험 뇌 체성유전변이로만 알츠하이머병 진행이 설명될 수 있는 환자는 17.3%(9/52)에 달했다(도 4). 따라서 상기 저빈도 고위험 뇌 체성유전변이들이 속한 유전자들은 알츠하이머병 발병기작을 설명할 수 있는 새로운 바이오마커로서 사용될 충분할 가치가 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 PIN1 유전자에서 발견된 비동의치환-희귀-고위험 유전변이는 152번째 트레오닌(Threonine) 잔기를 메티오닌(Methionine)으로 바꾸게 되는데, 이를 세포주 실험을 통해 확인해본 결과 해당 돌연변이형은 야생형보다 PIN1 단백질 발현량이 95% 이상 감소했다. 해당 돌연변이형으로 야기된 결과를 녹다운실험을 통해 PIN1 단백질 발현량을 50% 정도 감소시키는 방향으로 모방했을때, Tau 단백질의 231번째 트레오닌에서 인산화가 1.5배 증가했으며, 다량체 Tau 단백질도 증가함을 관찰할 수 있었다. 고로, PIN1 유전자에서 발견된 해당 유전변이 또한 신경섬유매듭형성과 관련하여 새로운 바이오마커로서 사용될 가치가 있다.
알츠하이머병의 원인 유전변이는 전체 알츠하이머병 환자의 5% 미만에 해당하는 가족력이 있는 환자들(familial AD)에서 발견된 상염색체 우성(Autosomal dominant) 형태로 APP, PSEN1, PSEN2 유전자들에서 발견되었거나, 가족력이 없는 산발성 환자들(Sporadic AD)의 일부에서는 APOE (2%), TREM2 (0.3%) 에 변이를 갖고 있는데 그쳤다. 따라서 알츠하이머병의 발병과 관련된 새로운 원인 유전자를 찾기 위해 연구 커뮤니티에서는 기존의 말초조직을 이용한 분석방법을 탈피하여, 알츠하이머병 관련 병변이 처음 나타나는 내후각피질(Entorhinal cortex)을 시료로 이용하여 해당 부위에 특이적으로 존재하는 체성 유전변이를 찾는 방법론이 대두되고 있다.
본 발명자들은 52명의 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 해마 형성체를 레이저 현미 해부법을 통해 분리하여 해당 영역에 존재하는 저빈도 뇌-체성 유전변이를 약 79.8% 의 정확도로 찾아냈다 (도 2). 이러한 체성 유전변이들 중, 비동의치환-희귀-고위험(Non-synonymous, rare, pathogenic) 형태로 존재하는 변이들이 속한 유전자들은 통계적으로 유의하게 PI3K-Akt, MAPK, AMPK pathway에 enrich되어있음이 확인되었다 (도 3). 상기 생물학적 경로(biological pathway)들은 Tau 단백질을 직간접적으로 인산화시키는데 관여하며, 이들이 속한 유전자에 생긴 고위험 유전변이는 Tau 단백질의 인산화 조절 변화 및 신경섬유매듭 형성을 야기할 수 있다.
기존에 알려진 germline AD risk factors와 본 발명에서 분석한 Tau 인산화 조절에 영향을 미치는 고위험 체성 유전변이의 존재를 분석을 진행한 모든 시료에서 확인하였다 (도 4). Alzgene 데이터베이스(https://www.alzforum.org/mutations)에 등록된 병원성 생식세포 pathogenic germline risk factor 에 pathogenic risk factor로 알려진 290 개의 SNP 및 APOE e4 대립인자를 두 세트 가진 환자들은 23.1%(16/52)의 비율로 관찰되었다. 반면, Tau 단백질의 인산화의 이상조절에 관여할거라 예상되는 뇌 체성유전변이는 26.9%(14/52)에서 확인되었다. 이들 중, 오로지 고위험 뇌 체성유전변이로만 알츠하이머병 진행이 설명될 수 있는 환자는 17.3% (9/52)에 달했다 (도 4). 따라서 상기 저빈도 고위험 뇌 체성유전변이들이 속한 유전자들은 알츠하이머병 발병기작을 설명할 수 있는 새로운 바이오마커로서 사용될 충분할 가치가 있다.
더불어, PIN1 유전자에서 발견된 비동의치환-희귀-고위험 유전변이는 152번째 트레오닌(Threonine) 잔기를 메티오닌(Methionine)으로 바꾸게 되는데, 이를 세포주 실험을 통해 확인해본 결과 해당 돌연변이형은 야생형보다 PIN1 단백질 발현량이 95% 이상 감소했다. 해당 돌연변이형으로 야기된 결과를 세포주에서 녹다운실험을 통해 PIN1 단백질 발현량을 50% 정도 감소시키는 방향으로 모방했을때, Tau 단백질의 231번째 트레오닌에서 인산화가 1.8배 증가했으며, 다량체 Tau 단백질도 2.4배 증가함을 관찰할 수 있었다 (도 5). 고로, PIN1 유전자에서 발견된 해당 유전변이 또한 신경섬유매듭형성과 관련하여 새로운 바이오마커로서 사용될 가치가 있다.
종합해보면, 생물정보학분석을 통하여 29개의 Tau 단백질의 인산화 조절에 직간접적으로 관여하거나 여러 환자에서 recurrent하게 나타난 유전자들을 찾았고, in vitro 실험을 통하여 추가적으로 1개의 유전자를 찾았다.
일 예에서, 본원에서 상기 각 바이오마커 유전자의 변이 부위를 검출하는 데 사용되는 제제는 상기 변이 부위에 특이적인 프라이머, 안티센스 핵산, 및/또는 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 DNA 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling) 되어 있어서 특정 DNA 또는 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 및/또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 유전변이가 관찰된 30개 유전자에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화 (capping), 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 본원에서 상기 각 바이오마커 단백질 변이 부위를 검출하는 데 사용되는 제제는 상기 유전자 변이에 의해 암호화되는 단백질 변이 부위에 특이적인 항체, 또는 압타머일 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제는 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 상술한 바이오마커 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있다. 본 발명의 키트에는 각 바이오마커 유전자를 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 핵산, 또는 각 바이오마커 단백질을 검출하기 위한 항체 또는 압타머를 포함할 수 있고, 이 외에 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 바이오마커 패널 유전자를 검출하기 위한 키트는 DNA 칩(chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 바이오마커 패널 유전자를 검출하기 위한 제제가 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제 및 효소로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 구성을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편을 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있다. 또한, 바이오마커 패널 유전자를 검출하기 위한 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 변이 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너(container), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할수 있다. 바람직하게는, 다중 PCR 을 통하여 각 바이오마커 패널 유전자들을 동시에 증폭 및 분석할 수 있는 다중 PCR 키트일 수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 바이오마커 패널 단백질을 검출하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본원에서, 개체의 시료로부터 바이오마커 패널을 검출하는 방법에서, 개체의 시료로부터 게놈(genome) DNA 또는 총 단백질(total protein)의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체의 시료"란 바이오마커 패널 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 조직, 세포와 같은 시료 등을 포함한다. 바람직하게, 뇌 조직 시료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 개체의 시료로부터 바이오마커 패널 유전자를 검출하는 방법은, 환자의 시료로부터 핵산을 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 핵산을 증폭하는 단계는, 중합효소 연쇄반응(PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, 테일-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계는, 생거(Sanger) 시퀀싱, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 샷건(Shotgun) 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, TaqMan 기법, 자동염기서열분석, 또는 차세대 염기서열 분석에 의하여 수행될 수 있다. 차세대 염기서열 분석은, 당업계에 널리 사용되는 염기서열 분석 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Roche 사의 454 GS FLX, Illumina 사의 Genome Analyzer, Applied Biosystems 사의 SOLid Platform 등을 이용할 수 있다.
또 다른 일 예로, 환자의 시료로부터 바이오마커 패널 단백질을 검출하는 방법은, 해당 아미노산 변이를 특이적으로 검출하는 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 변이 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 확인할 수 있고, 변이 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 판단하여, 알츠하이머를 진단할 수 있다.
본원에서 "항원-항체 복합체"란 변이 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 여부는 검출 라벨(detection label)의 시그널을 통해서 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스(redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, α-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
일 구체예로, 바이오마커 패널 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 바이오마커패널 단백질과 항체의 복합체 형성을 확인하여, 알츠하이머의 발병 여부를 확인할 수 있다.
다른 일 구체예로, 바이오마커패널 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 예를 들어, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킬 수 있다. 생성된 항원-항체 복합체를 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 변이 유전자의 발현에 의해 생성된 변이 단백질의 양을 확인하여, 알츠하이머병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 변이 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 조사하는 방법으로 이루어질 수 있다.
또한, 다른 일 구체예로, 바이오마커 패널 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재를 확인하여, 알츠하이머의 발병 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 알츠하이머의 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "바이오마커 패널"은 본원에 개시된 바이오마커들 중 하나 이상을 포함한다. 이들 바이오마커 패널은 시료 내에 존재하는 바이오마커 단백질 또는 유전자들과 직접적으로 또는 간접적으로 결합하거나 연합될 수 있는 검출 제제(또는 검출 시약)을 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명에서 용어 "바이오마커" 또는 "마커"는 유기 생체 분자, 특히 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 특정 병태를 갖지 않는 대상체 (예를 들어, 환자가 알츠하이머에 대한 검사를 받았는 지 여부에 따라, 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상체, 또는 알츠하이머가 아닌 환자)로부터 취해진 필적하는 샘플과 비교하여 상기 병태를 갖는 대상체로부터 취한 샘플에 차별적으로 존재한다. 예를 들어, 마커는 음성 진단을 가진 환자의 샘플과 비교하여 알츠하이머병 환자의 샘플 중에서 상승되거나 감소된 수준으로 존재하는 (특정한 겉보기 분자량을 갖는) 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 폴리사카라이드일 수 있다.
본 발명의 일 예는, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계 및 상기 추출된 DNA로부터 PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 변이를 검출하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 유전자의 변이 및 상기 변이를 검출하는 방법은 상술한 바와 같다.
상기 생물학적 시료는 환자로부터 분리된 뇌 조직 시료, 혈액 및/또는 뇌척수액과 같은 말초조직 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자의 변이가 검출되는 경우, 해당 환자를 알츠하이머병 또는 산발성 알츠하이머병으로 결정할 수 있다.
본 발명은 가족력이 없거나 가족력이 있음에도 원인 유전자가 불분명한 알츠하이머병 환자들의 뇌 조직에서 새로운 원인 유전변이들의 후보를 찾고, 이를 더 많은 알츠하이머병 환자들에서 검출하기 위함이다.
본 발명은 알츠하이머병을 비롯한 치매, 예를 들면 가족력이 없거나 가족력이 있음에도 원인 유전자가 불분명한 알츠하이머병의 새로운 원인 유전변이 확인을 위한 검사용 유전자 마커에 관한 것이다.
도 1은 알츠하이머병 및 대조군 환자에서 뇌-체성 유전변이를 확인하기 위한 분석 파이프라인(A) 및 최종 유전자 패널 구성(B)을 나타낸 그림이다.
도 2는 전장 엑솜 유전체 분석 파이프라인의 정확도를 나타낸 그림이다.
도 3은 비동의치환-희귀-고위험 체성 유전변이를 이용한 enrichment test 결과(a 패널), 알츠하이머병 환자 및 대조군의 뇌 조직에서 발견된 germline risk factor(b) 및 고위험 체성 유전변이를 나타낸 landscape(c)을 나타낸 것이다.
도 4는 PIN1 유전자에서 발견된 비동의치환-희귀-고위험 체성 유전변이의 고위험 정도, 해마 형성체 내의 분포정도 및 해당 변이의 PIN1 단백질의 발현량과의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 5는 PIN1 녹다운실험을 통해 확인된 Tau 단백질의 과인산화와 다량체 Tau 단백질의 관찰결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뇌 시료 준비
도 1은 알츠하이머병 및 대조군 환자에서 뇌-체성 유전변이를 확인하기 위한 분석 파이프라인 및 최종 유전자 패널 구성을 나타낸 그림이다. 구체적으로, 조직은행 두 곳(Netherlands Brain Bank, UCLA Brain Bank)에서 수령한 52 명의 알츠하이머병 및 15 명의 혈액 및 뇌 조직 시료를 확보 하였고, 레이저 현미 해부법을 통해 뇌 조직 시료에서는 해마 형성체를 수확 후 Bead를 이용한 조직 파쇄법을 거쳐 분쇄된 조직을 Spin-column based isolation을 통해 genomic DNA를 추출하였다. 마찬가지로, Spin-column based isolation을 통해 혈액 시료에서도 genomic DNA를 추출하였다.
본 발명자들은 52명의 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 해마 형성체를 레이저 현미 해부법을 통해 분리하였다. 구체적으로, 환자 뇌로부터 분리된 해마 조직은 영하 80℃에서 보관하였으며, 샘플링 전 2 내지 3시간 전에 영하 20℃로 옮겨 보관하였다. 샘플링은 동결절편(cryosection)을 통해 20um 두께의 절편으로 절단하여 0.1mmPEN 슬라이드에 붙였다. 상기 슬라이드는 75%(v/v) EtOH-1%(v/v) Cresyl Violet 시약으로 염색하였고, 한 환자 당 6 내지 10개의 슬라이드를 제작하였다.
레이저 현미 해부 전에 Zeiss 사의 PalmRobo에 부착된 광학 현미경을 통해 해마 형성체들의 각 영역을 확인 후, 화면 상에서 잘라낼 영역을 표시하였다. 레이저 조사 후, 절제된 영역들은 sterile 된 미세한 포셉으로 lysis buffer로 옮겨지고, 56℃에서 12시간 보관 후, 지르코니아 비드 비팅(zirconia bead bitting)을 통해 파쇄된다. 최종적으로 Qiagen 사의 QIAmp DNA micro kit을 통해 genomic DNA를 추출하였다
마우스 및 인간 유래 세포주는, 10%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin)을 포함한 DMEM 미디어에서 상온 37℃ 및 이산화탄소 농도 5%로 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다.
실시예 2. 저빈도(희귀) 뇌-체성 유전 변이 탐색
실험예 1의 방법으로 준비된 시료로부터 Qiagen 사의 QIAmp DNA micro kit를 이용하여 유전체 DNA를 분리하고, Agilent 사의 V4 혹은 V5+UTR exome+UTR 프로브를 이용하여 시퀀싱 라이브러리를 제작하였으며, Illumina 사의 Hiseq2000 혹은 2500 시퀀서를 이용해 시퀀싱을 수행하였다. 도 2에 전장 엑솜 유전체 분석 파이프라인의 정확도 그래프를 나타내었다. 이는 엑솜 유전체 분석결과 확보한 단일 염기서열 돌연변이들 중 약 10%를 다른 시퀀싱 플랫폼인 Targeted amplicon sequencing을 통해 확인한 결과, 그중 79.8%가 실제 존재하며 (도 2 A), 각 플랫폼에서 확인된 variant allele frequency도 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 가짐을 보여주고 있다 (도 2 B).
200ng - 1ug 이상 확보된 genomic DNA를 대상으로 Agilent 사의 V4/V5+UTR exome+UTR 프로브를 통해 엑솜 라이브러리를 합성했으며, 이를 Illumina 사의 Hiseq2000/2500 시퀀서로 고심도 전장 엑솜 유전체 시퀀싱시 진행했을 때, 뇌 조직 시료에서는 평균 리드 수가 x565, 혈액 조직 시료에서는 평균 리드 수가 x599 로 확인되었다. 생산된 raw Fastq 파일은 GRCh38/hg38을 reference genome build로 삼아 Broad Institute의 Best Practice(v3.5)를 통해 Bam file로 변환되었고, Bam files은 MuTect (v1.1.7)의 input 파일로 사용되었다. 뇌 조직과 혈액에서 확보된 Bam file이 둘 다 있는 환자의 경우 MuTect raw call은 다음의 조건을 만족할 경우, filter-in 하였다: a) Read Depth 35 이상, b) Variant Allele Fraction 0.5 미만, c) Empirical Bayesian filter(EBscore) 2.396 초과, d) average base position이 1 이상 혹은 100 이하, e) IGVviewer를 통해 Bam file을 확인했을 때, 각 리드의 blat score(Second highest blat score <900) 및 50% 이상의 altered allele을 가지고 있는 read(최소 3개 이상)가 해당 allele 주변에 변이가 없는지 확인하였다.
Targeted Amplicon sequencing 을 통해 약 79.8%의 post-filter call을 거친 variant가 실제 true call 임을 확인하였으며, 최종적으로 52명의 알츠하이머병 환자 뇌 시료에는 634 개의 체성 유전변이가 존재함을 확인하였다 (도 1 A).
또한 알츠하이머병 뇌 체성 유전변이 중, 비동의치환(Non-synonymous: dbNSFP 를 통해 annotation이 가능한 경우), 희귀(Rare: gnomAD 데이터베이스 상에서 전체 인구집단에서 해당 변이가 나타나는 빈도가 0.01% 미만일 경우), 고위험(Pathogenic: CADD score가 20 초과일 경우) 체성 유전변이를 확인하였다. 이들 중, 일부는 gene-list enrichment test를 통해 Tau 단백질의 인산화 조절에 관련된 생물학적 경로인 PI3K-Akt, MAPK, AMPK pathway에 속한 유전자임을 확인하였으며, PIN1 단백질에 존재하는 변이를 확인하였다. 더불어, 2명 이상의 환자에서 동일한 유전자에 발견된 recurrent 체성 유전변이들도 함께 확인하였다. 이를 종합해 알츠하이머병 뇌 체성 유전변이 검출을 위한 유전자 패널을 구성하기 위한 30 개 유전자의 정보를 확보하였다 (도 1, 아래).
도 3에 비동의치환-희귀-고위험 체성 유전변이를 이용한 enrichment test 결과 그래프로 나타내었다(도 3, A 패널). 체성 유전변이들 중, 비동의치환-희귀-고위험(Non-synonymous, rare, pathogenic) 형태로 존재하는 변이들이 속한 유전자들은 통계적으로 유의하게 PI3K-Akt, MAPK, AMPK 신호전달 경로(pathway)에 enrich되어있음이 확인되었다 (도 3, A 패널)
실시예 3. 고위험(pathogenic) 체성 유전변이 분석
기존에 알려진 germline AD risk factors와 본 발명자들이 이번 분석에서 발견한 Tau 인산화 조절에 영향을 미치는 고위험 체성 유전변이의 존재를 분석을 진행한 모든 시료에서 확인해 보았다. 구체적으로 gene-list enrichment test를 위해 분석 파이프라인에서 확인한 비동의치환-희귀-고위험(Non-synonymous, rare, pathogenic) 형태로 존재하는 변이들을 알츠하이머병 환자와 정상인 대조군의 뇌 및 혈액에서 각각 확인하여, 이를 4 개의 군으로 삼아 EnrichR 툴(McDermott, M. G., et al., (2016). Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research, 44(W1), W90-W97)을 이용해 KEGG 데이터베이스 상에 biological pathways에 얼마나 유의하게 각 군에 속한 변이들이 enrich되는지 확인하였다. 나머지 3개의 군(알츠하이머병 환자의 혈액, 정상인 대조군의 뇌, 정상이 대조군의 혈액)과는 달리 알츠하이머병 환자의 뇌에서 유래한 비동의치환-희귀-고위험 변이들은 Tau 단백질의 인산화에 관련된 PI3K-Akt, MAPK, AMPK pathway에 adjusted p-value 0.01 미만으로 enrich됨을 확인하였다. 알츠하이머병 환자의 뇌에서 유래한 변이들의 enrichment test 결과를 Random permutation을 통해 각 생물학적 경로에 포함된 유전자의 개수가 우연한 기회에 유의하게 나타난 게 아님을 추가로 확인하였다.
본 발명자들은 뇌 조직은행들에서 수령한 52 명의 알츠하이머병 환자 및 11명의 대조군(비 알츠하이머병 환자, 정상인)의 뇌 조직 시료를 분석한 결과, 해마 형성체 내에 뇌 체성 유전변이가 존재함을 발견하였다. 이러한 뇌 체성 유전변이들 중, 단백질 발현에 영향을 줄 수 있는 비동의치환(Non-synonymous), 인구집단에서 0.01% 미만으로 존재하는 희귀(Rare), 보존된 아미노산 서열의 변화 혹은 단백질 구조 및 발현에 치명적인 변화를 일으키는 고위험(Pathogenic) 변이들이 신경섬유성매듭을 형성에 기여하는 Tau 단백질의 과인산화와 통계적으로 유의하게 관련되어 있음을 확인하였다.
하기 표 1에 52명의 알츠하이머병 환자 뇌 조직에서 발견된 28개의 비동의치환, 희귀, 고위험 뇌-체성 유전변이를 나타내었다. 또한, 3개의 유전자에서 발견된 6개의 고위험 변이들은 2명 이상의 환자들에서 발견되었다 (표 2).
하기 표 2에 2명 이상의 알츠하이머병 환자에서 발견된 6개의 비동의치환, 희귀, 고위험 뇌-체성 유전변이를 나타내었다. 더불어, 알츠하이머병 환자의 뇌에서 PIN1 단백질의 발현량 감소와 PIN1-녹아웃마우스의 뇌 조직에서 Tau 단백질의 과인산화 및 다량체 Tau 단백질이 관찰되었다 (표 3).
환자 유전자 종류 유전자변이 단백질변이 CADD score Mutated Allele Frequency (%) gnomAD Allele Frequency (%) 연관KEGG Pathway
AD_195 PPP2R1A NM_014225.5:c.83G>A R28H 28.7 11.7% 0.000406% PI3K-Akt; AMPK
AD_195 COL6A1 NM_001848.2:c.160C>A P54T 27.6 1.5% Not reported PI3K-Akt
AD_195 CACNA1I NM_021096.3:c.5194C>A H1732N 26.7 1.1% Not reported MAPK
AD_192 RAPGEF2 NM_014247.2:c.3752C>A S1251* 38 2.1% Not reported MAPK
AD_192 VEGFC NM_005429.4:c.629G>T R210L 24.4 1.1% 0.00163% PI3K-Akt
AD_192 SRF NM_003131.3:c.1262C>A S421* 37 1.7% Not reported MAPK
AD_192 MOS NM_005372.1:c.423C>A F141L 21 0.8183% Not reported MAPK
AD_192 PTPN5 NM_006906.1:c.1627G>T E543* 42 1.1% Not reported MAPK
AD_192 TAOK3 NM_016281.3:c.37G>T D13Y 24.7 0.6667% 0.00122% MAPK
AD_192 MAP2K4 NM_003010.3:c.1169C>A A390D 22.8 1.6% Not reported MAPK
AD_197 CPT1A NM_001876.3:c.1252G>T V418L 20.2 1% Not reported AMPK
AD_197 ITGB4 NM_000213.3:c.3136C>A L1046M 24.5 3.1% Not reported PI3K-Akt
AD_190 FGF16 NM_003868.2:c.553C>A H185N 25.5 1.5% Not reported PI3K-Akt; MAPK
AD_193 HGF NM_000601.4:c.1117C>T R373* 42 1.9% Not reported PI3K-Akt
AD_199 COL6A2 NM_001849.3:c.1998C>A S666R 28.4 1.1% Not reported PI3K-Akt
AD_1441 MTOR NM_004958.3:c.7405A>T K2469* 47 2.4% Not reported PI3K-Akt; AMPK
AD_1441 PFKL NM_002626.5:c.137C>G A46G 24.6 2.1% Not reported AMPK
AD_309 ITGA1 NM_181501.1:c.2399A>C E800A 21.2 4.7% Not reported PI3K-Akt
AD_309 PPP2CA NM_002715.2:c.889G>A E297K 22.4 0.909% Not reported PI3K-Akt; AMPK
AD_303 LAMA1 NM_005559.3:c.5611G>T A1871S 21.9 2.5% Not reported PI3K-Akt
AD_304 THBS1 NM_003246.2:c.863G>A R288H 23.6 1% 0.00934% PI3K-Akt
AD_1445 RASGRF2 NM_006909.2:c.1412C>A S471Y 22.4 1.7% Not reported MAPK
AD_1445 TAB2 NM_015093.4:c.1535C>A A512E 22.4 0.636% Not reported MAPK
AD_307 FN1 NM_002026.2:c.5444G>A S1815N 31 2.7% 0.000406% PI3K-Akt
AD_307 PIK3CA NM_006218.2:c.3140A>G H1047R 23 0.62% 0.000408% PI3K-Akt; AMPK
AD_1446 CACNA1C NM_000719.6:c.304C>T R102* 39 1.9% Not reported MAPK
AD_1438 MOS NM_005372.1:c.151G>A A51T 23.7 2.1% 0.000417% MAPK
AD_1438 IGF1R NM_000875.4:c.1033A>T T345S 22.5 3.2% Not reported PI3K-Akt; AMPK
환자 유전자 종류 유전자변이 단백질변이 CADD score Mutated Allele Frequency (%) gnomAD Allele Frequency (%) 연관KEGG Pathway
AD_192 MOS NM_005372.1:c.423C>A F141L 21 0.8183% Not reported MAPK
AD_1438 MOS NM_005372.1:c.151G>A A51T 23.7 2.1% 0.000417% MAPK
AD_303 PLEC NM_201380.3:c.11656C>T R3886W 31 2.5% 0.00126% -
AD_1453 PLEC NM_201380.3:c.3262C>T R1088W 25.5 3.6% Not reported -
AD_1445 ZSWIM6 NM_020928.1:c.2066C>A T689K 22.3 1.1% Not reported -
AD_1438 ZSWIM6 NM_020928.1:c.3268A>G I1090V 20.8 2% 0.00132% -
도 3에 알츠하이머병 환자 및 대조군의 뇌 조직에서 발견된 germline risk factor 및 고위험 체성 유전변이를 나타낸 landscape 그래프를 나타내었다(B 패널). 도 4에는 알츠하이머병 환자들에게서 발견된 유전 변이의 종류를 나타내었다. 구체적으로, Alzgene 데이터베이스(https://www.alzforum.org/mutations)에 등록된 pathogenic germline risk factor 및 APOE e4 대립인자를 두 세트 가진 환자들은 23.1%(12/52)의 비율로 관찰되었다. 반면, Tau 단백질의 인산화의 이상조절에 관여할거라 예상되는 뇌 체성유전변이는 26.9%(14/52)에서 확인되었다. 이들 중, 오로지 고위험 뇌 체성유전변이로만 알츠하이머병 진행이 설명될 수 있는 환자는 17.3% (9/52)에 달했다 (도 4). 따라서 상기 표 1 및 표 2의 저빈도 고위험 뇌 체성유전변이들이 속한 유전자들은 알츠하이머병 발병기작을 설명할 수 있는 새로운 바이오마커로서 사용될 충분할 가치가 있다.
실시예 4: PIN1 유전자 변이와 Tau 단백질의 활성과의 관계
알츠하이머병 환자의 뇌에서 PIN1 단백질의 발현량 감소와 PIN1-녹아웃마우스의 뇌 조직에서 Tau 단백질의 과인산화 및 다량체 Tau 단백질이 관찰된 바 있다. PIN1 유전자에서 발견된 비동의치환, 희귀, 고위험 뇌-체성 유전 변이는 NCBI accession number NM_006221.3 유전자의 433번 시토신이 티민으로 치환된 것으로서, 해당 유전자에 의해 발현되는 단백질은 152번 트레오닌(T)이 메티오닌(M)으로 치환된 것이다.
PIN1 유전자에서 발견된 비동의치환, 희귀, 고위험 뇌-체성 유전변이 목록을 표 3에 나타내었다.
환자 유전자 종류 유전자변이 단백질변이 CADD score Mutated Allele Frequency (%) gnomAD Allele Frequency (%) 연관
KEGG Pathway
AD_1444 PIN1 NM_006221.3:c.455C>T T152M 26.7 1.8% Not reported RIG1-like
돌연변이형 PIN1 단백질의 발현량을 확인하기 위하여, pCIG2-C1 벡터의 Xho1/EcoR1 사이트에 N'-3xFLAG-human PIN1 혹은 human PIN1-3xFLAG-C'을 삽입하였고, 이를 마우스 유래 N2a 세포주에 transfection 시켜 발현시켰다. Transfection 72 시간 이후, 야생형 및 돌연변이형 PIN1 단백질을 발현시킨 N2a 세포주의 whole cell lysate에서 단백질을 수확하여 western blot을 통해 야생형과 돌연변이형의 단백질 발현량을 anti-Flag M2 (Cell Signaling, M2)와 anti-Pin1 (Santa Cruz, 46660)을 통해 확인하였다.
녹다운실험을 위해, murine Pin1 을 타겟팅하는 후보군 shRNA 의 서열정보들을 GPP web portal(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/gene/search)에서 확인하여 N2a 세포주에 pLKO.1-mPin1 shRNA 형태로 transfection 후, Pin1 단백질 발현량을 50% 감소시키는 shRNA 서열을 실험적으로 확인하였다. 이후, 해당 shRNA 와 scramble 대조군을 마우스 유래 HT22 세포주에 각각 transfection 시킨 후, western blot을 통하여 Tau 단백질의 231번째 트레오닌 잔기의 인산화를 확인할 수 있는 항체를 이용해 인산화 정도를 비교하였다.
Pin1 녹다운으로 인한 다량체(Oligomeric) Tau 단백질의 확인을 위해서 Bi-FC assay를 진행하였으며, 이를 위해 tau-BiFC를 발현하고 있는 마우스 유래 HT22에 mPin1-shRNA와 scramble 대조군을 각각 transfection 시킨 후, 녹색 형광의 intensity를 형광 이미징을 통해 확인 비교하였다.
도 5에 PIN1 유전자에서 발견된 비동의치환-희귀-고위험 체성 유전변이의 고위험 정도, 해마 형성체 내의 분포정도, PIN1 단백질의 발현량과의 상관관계 및 PIN1 녹다운실험을 통해 확인된 Tau 단백질의 과인산화와 다량체 Tau 단백질의 관찰결과를 나타내었다.
세포주 실험을 통해 확인한 결과 해당 돌연변이형은 야생형보다 PIN1 단백질 발현량이 95% 이상 감소했다. 해당 돌연변이형으로 야기된 결과를 녹다운실험을 통해 PIN1 단백질 발현량을 50% 정도 감소시키는 방향으로 모방했을때, Tau 단백질의 231번째 트레오닌에서 인산화가 1.5배 증가했으며, 다량체 Tau 단백질도 증가함을 관찰할 수 있었다. 따라서, PIN1 유전자에서 발견된 해당 유전변이 또한 신경섬유매듭형성과 관련하여 새로운 바이오마커로서 사용될 가치가 있다.
본 명세서에 기재된 데이터의 통계적 분석에는 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) 혹은 R(v3.4.3)이 사용되었으며, Paired T-test 혹은 One-way ANOVA가 통계적 유의성을 판별하기 위해 사용되었다. Gene list enrichment test 에서 통계적 유의성 판별을 위해서 Benjamini-Hochberg 법을 이용해 계산된 adjusted p-value를 사용하였다.

Claims (12)

  1. PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커 유전자의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 제제 또는 상기 바이오마커 유전자가 암호화하는 바이오마커 단백질의 아미노산 서열의 변이를 검출하는 제제를 포함하며,
    상기 바이오마커는 타우 단백질의 인산화 증가 또는 타우 단백질 다량체의 증가를 유발하는 것인, 알츠하이머병 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커 유전자의 뉴클레오타이드 변이는 하기 뉴클레오타이드 변이들로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 변이인 것인, 조성물:
    PPP2R1A 유전자의 83번째 G가 A로 치환,
    COL6A1 유전자의 160번째 C가 A로 치환,
    CACNA1I 유전자의 5194번째 C가 A로 치환,
    RAPGEF2 유전자의 3752번째 C가 A로 치환,
    VEGFC 유전자의 629번째 G가 T로 치환,
    SRF 유전자의 1262번째 C가 A로 치환,
    MOS 유전자의 423번째 C가 A로 치환,
    MOS 유전자의 151번째 G가 A로 치환,
    PTPN5 유전자의 1627번째 G가 T로 치환,
    TAOK3 유전자의 37번째 G가 T로 치환,
    MAP2K4 유전자의 1169번째 C가 A로 치환,
    CPT1A 유전자의 1252번째 G가 T로 치환,
    ITGB4 유전자의 3136번째 C가 A로 치환,
    FGF16 유전자의 553번째 C가 A로 치환,
    HGF 유전자의 1117번째 C가 T로 치환,
    COL6A2 유전자의 1998번째 C가 A로 치환,
    MTOR 유전자의 7405번째 A가 T로 치환,
    PFKL 유전자의 137번째 C가 G로 치환,
    ITGA1 유전자의 2399번째 A가 C로 치환,
    PPP2CA 유전자의 889번째 G가 A로 치환,
    LAMA1 유전자의 5611번째 G가 T로 치환,
    THBS1 유전자의 863번째 G가 A로 치환,
    RASGRF2 유전자의 1412번째 C가 A로 치환,
    TAB2 유전자의 1535번째 C가 A로 치환,
    FN1 유전자의 5444번째 G가 A로 치환,
    PIK3CA 유전자의 3140번째 A가 G로 치환,
    CACNA1C 유전자의 304번째 C가 T로 치환,
    IGF1R 유전자의 1033번째 A가 T로 치환,
    PLEC 유전자의 11656번째 C가 T로 치환,
    PLEC 유전자의 3262번째 C가 T로 치환,
    ZSWIM6 유전자의 2066번째 C가 A로 치환,
    ZSWIM6 유전자의 3268번째 A가 G로 치환, 및
    PIN1 유전자의 455번째 C가 T로 치환 된 변이.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 제제는 상기 바이오마커 유전자의 변이 부위에 특이적인 프라이머, 안티센스 핵산 또는 프로브인, 알츠하이머병의 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 변이를 검출하는 제제는 변이 부위에 특이적인 항체, 또는 압타머인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병은 산발성 알츠하이머병 또는 알츠하이머성 치매인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병은 65세 이상의 환자에게서 발병하는 것인, 조성물.
  7. PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커 유전자의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 제제 또는 상기 바이오마커 유전자가 암호화하는 바이오마커 단백질의 아미노산 서열의 변이를 검출하는 제제를 포함하며,
    상기 바이오마커는 타우(Tau) 단백질의 인산화 증가 또는 타우 단백질 다량체의 증가를 유발하는 것인, 알츠하이머병의 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 진단용 키트는 상기 바이오마커 유전자의 변이 부위에 특이적인 프라이머, 안티센스 핵산 및 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는 DNA 패널을 포함하는 것인, 키트.
  9. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 DNA로부터 PPP2R1A, COL6A1, CACNA1I, RAPGEF2, VEGFC, SRF, MOS, PTPN5, TAOK3, MAP2K4, CPT1A, ITGB4, FGF16, HGF, COL6A2, MTOR, PFKL, ITGA1, PPP2CA, LAMA1, THBS1, RASGRF2, TAB2, FN1, PIK3CA, CACNA1C, IGF1R, PLEC, ZSWIM6, 및 PIN1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 변이를 검출하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 환자는 알츠하이머병의 가족력이 없는 환자인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 유전자 변이는 하기 나열된 유전자 변이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 변이인 것인, 방법:
    PPP2R1A 유전자의 83번째 G가 A로 치환,
    COL6A1 유전자의 160번째 C가 A로 치환,
    CACNA1I 유전자의 5194번째 C가 A로 치환,
    RAPGEF2 유전자의 3752번째 C가 A로 치환,
    VEGFC 유전자의 629번째 G가 T로 치환,
    SRF 유전자의 1262번째 C가 A로 치환,
    MOS 유전자의 423번째 C가 A로 치환,
    MOS 유전자의 151번째 G가 A로 치환,
    PTPN5 유전자의 1627번째 G가 T로 치환,
    TAOK3 유전자의 37번째 G가 T로 치환,
    MAP2K4 유전자의 1169번째 C가 A로 치환,
    CPT1A 유전자의 1252번째 G가 T로 치환,
    ITGB4 유전자의 3136번째 C가 A로 치환,
    FGF16 유전자의 553번째 C가 A로 치환,
    HGF 유전자의 1117번째 C가 T로 치환,
    COL6A2 유전자의 1998번째 C가 A로 치환,
    MTOR 유전자의 7405번째 A가 T로 치환,
    PFKL 유전자의 137번째 C가 G로 치환,
    ITGA1 유전자의 2399번째 A가 C로 치환,
    PPP2CA 유전자의 889번째 G가 A로 치환,
    LAMA1 유전자의 5611번째 G가 T로 치환,
    THBS1 유전자의 863번째 G가 A로 치환,
    RASGRF2 유전자의 1412번째 C가 A로 치환,
    TAB2 유전자의 1535번째 C가 A로 치환,
    FN1 유전자의 5444번째 G가 A로 치환,
    PIK3CA 유전자의 3140번째 A가 G로 치환,
    CACNA1C 유전자의 304번째 C가 T로 치환,
    IGF1R 유전자의 1033번째 A가 T로 치환,
    PLEC 유전자의 11656번째 C가 T로 치환,
    PLEC 유전자의 3262번째 C가 T로 치환,
    ZSWIM6 유전자의 2066번째 C가 A로 치환,
    ZSWIM6 유전자의 3268번째 A가 G로 치환, 및
    PIN1 유전자의 455번째 C가 T로 치환 된 변이.
  12. 제9항에 있어서, 상기 유전자 변이를 검출하는 단계는 상기 바이오마커 유전자의 변이 부위에 특이적인 프라이머, 안티센스 핵산 및 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이 검출용 제제를 이용하여 수행되는 것인, 방법.
KR1020190110823A 2018-09-06 2019-09-06 알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단 KR20200028320A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180106733 2018-09-06
KR1020180106733 2018-09-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200028320A true KR20200028320A (ko) 2020-03-16

Family

ID=69948744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190110823A KR20200028320A (ko) 2018-09-06 2019-09-06 알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20200028320A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230166531A (ko) 2022-05-31 2023-12-07 인하대학교 산학협력단 Itgb4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230166531A (ko) 2022-05-31 2023-12-07 인하대학교 산학협력단 Itgb4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105143467B (zh) 用于预测间质性肺炎的风险的方法
US8481701B2 (en) Process and method for diagnosing Alzheimer&#39;s disease
US20170369945A1 (en) Methods of diagnosing autism spectrum disorders
JP2011505579A (ja) 眼圧を変調し、ステロイドの応答者と非応答者とを鑑別するための分子標的
JP5031581B2 (ja) Ａｍｌ、ｂ−ａｌｌおよびｔ−ａｌｌの診断用マーカー
KR20160080165A (ko) 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법
KR101801980B1 (ko) 중추신경계 림프종 진단용 조성물 및 이를 이용한 중추신경계 림프종 진단 키트
JP6449147B2 (ja) Ｔ細胞リンパ腫の検出方法
KR102210530B1 (ko) 뇌전증의 진단 마커 및 이의 용도
KR20200028320A (ko) 알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단
US20120190577A1 (en) Processes and methods for diagnosis of alzheimer&#39;s disease
EP2521919B1 (en) Method for diagnosing and monitoring schizophrenia and tauopathies
KR102294939B1 (ko) Lats1 유전자 변이 마커 기반의 근위축성 측삭경화증의 진단방법
KR101547307B1 (ko) 뇌전증 진단용 바이오마커
US20150065380A1 (en) Brain somatic mutations associated to epilepsy and uses thereof
CN109182513B (zh) 生物标志物scfd2在阿尔茨海默诊治中的应用
JP2007166962A (ja) アルツハイマー病の予測または診断の方法
JP6338872B2 (ja) 視神経障害発症リスクの判定方法
RU2821573C1 (ru) Способ поиска мутаций гена ATP7B для постановки диагноза болезни Вильсона (Вильсона-Коновалова)
KR102658117B1 (ko) 조기발병연령을 가진 우울증 예측용 유전바이오마커, 상기 바이오마커를 이용한 조기발병연령을 가진 우울증진단에 대한 정보제공방법 및 진단키트
KR20230028619A (ko) 아토피성 피부염 진단용 바이오마커 및 이의 용도
JP3876301B2 (ja) ２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置、ダウン症候群の診断装置
CN116445605A (zh) 检测阿尔兹海默症症的标志物及其用途
WO2014182726A2 (en) Genetic markers for macular degeneration disorder treatment
KR20200109245A (ko) 알츠하이머병의 진단용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application