CN111948404B - 用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及其应用。本发明首先公开了用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物，包括α‑珠蛋白、β‑珠蛋白、δ‑珠蛋白、γ‑珠蛋白和/或碳酸酐酶I，其序列分别如SEQ ID NO.1‑5所示。本发明进一步公开了包含上述标记组合物的质谱模型及在制备筛查地中海贫血的产品中的应用。本发明基于MALDI‑TOF质谱技术通过对不同特征蛋白的质谱峰面积以及比率分析，可筛查β地中海贫血、同时携带α和β地中海贫血、α地中海贫血、异常血红蛋白样本，具有样本前处理简便、检测通量高、试剂耗材少、成本低、取样量少、灵敏度高等特点，可在地中海贫血高发地区进行大规模人群筛查。

Description

用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及其应用。
背景技术
地中海贫血(简称地贫)，又称珠蛋白生成障碍性贫血，是一种遗传性溶血性贫血疾病，α地贫和β地贫是其中最主要的疾病类型。α地贫是由于α珠蛋白基因的缺失或突变而导致α珠蛋白链合成障碍所引起的遗传性溶血性贫血。根据基因缺陷类型，α地贫分为缺失型和非缺失型。中国最常见的缺失型α地贫包括--SEA、-α3.7和-α4.2，非缺失型α地贫包括HbConstant Spring(HbCS)、Hb Quong Sze(HbQS)和Hb Westmead(HbWS)。根据基因的缺陷程度不同，临床上将α地贫分为静止型(-α3.7和-α4.2)、轻型(--SEA)、中间型(HbH病)和重型(HbBart’s)。α地贫的临床表现与α珠蛋白链的合成减少程度相关，静止型和轻型α地贫携带者可能无明显临床症状，如果父母双方均为α地贫携带者，其下一代有可能是重型的α地贫患者。β地贫是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链合成减少或缺失所引起的遗传性溶血性贫血。根据表型分类，完全不能合成β链的称为β0地贫，能部分合成β链的称为β+地贫。β地贫最常见的突变类型是点突变，目前全世界已发现数百种突变类型，其中有17种突变在中国南方地区最常见。
由于地贫高发地区的人群地贫携带率高，该病患儿的治疗费用昂贵且难以治愈，α、β地贫已成为中国南方控制出生缺陷的重大区域性疾病对象。通过人群筛查和产前诊断阻止患儿出生是目前国内外公认的首选预防措施，因此在中国南方地贫高发区进行地贫筛查和产前诊断尤为必要。
目前，地贫的传统筛查技术以血液学分析为主，检测地贫基因突变所引起的个体血液学指标的改变。血液学分析包括全血细胞分析和血红蛋白组分分析，主要反映小细胞低色素贫血特征性的指标，如红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)和血红蛋白A2(HbA2)含量等。血红蛋白组分分析主要采用血红蛋白电泳和高效液相色谱(HPLC)技术，对于β地贫和临床症状明显的中间型、重型α地贫，上述方法筛查成功率较高。但是对于表型不明显的轻型α地贫，上述方法易发生漏筛。此外，传统的地贫筛查技术单独应用时，由于其特异性和灵敏度较低，尚不能满足临床需要。多种技术联合检测能够提高筛查效果，存在流程复杂、耗时长、成本高、存在一定的漏筛率、对检验人员技术经验要求高等问题，限制了其在大规模人群筛查中的应用。
地贫筛查阳性的个体被认为是疑似病例，进一步的确诊需要进行基因诊断。基因诊断技术主要包括跨越断裂点PCR法(Gap-PCR)、DNA测序和反向点杂交法(RDB)等。其中DNA测序可以鉴定未知突变，是基因检测的金标准。Gap-PCR只能诊断缺失纯合子，通常用于--SEA型α地贫的筛查，反向点杂交法通常用于检测基因突变。不过，由于基因诊断的方法复杂、技术要求高以及费用昂贵等原因，目前主要应用于医院的临床诊断，尚不能作为常规的大规模筛查手段。因此，开发更加准确、高效、经济且简便的地贫筛查手段十分必要。
异常血红蛋白是由于基因变异而造成血红蛋白分子的结构或合成异常，可能会导致溶血性贫血等临床症状。此外，异常血红蛋白的存在，常常会干扰临床上糖化血红蛋白(HbA1c)的检测。目前已有的血红蛋白成分分析技术，例如毛细管电泳和离子交换层析-HPLC，基于不同血红蛋白组分的电荷差异，可检测出部分异常血红蛋白。对于常规方法未检出的异常血红蛋白，需要基于其他检测原理的方法来进行补充。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，是一种软电离技术，适用于分析生物大分子。原理是将待测分子与基质混合形成共结晶，激光照射结晶时，基质吸收激光能量并传递给待测分子，并使待测分子获得或失去质子，从而发生离子化。离子化的待测物质通过电场加速后进入飞行管中，依据质荷比差异造成飞行时间不同而被分离。该技术灵敏度和分辨率高、通量高、操作简便且分析速度快，近年来在基因分型、生物标志物鉴定、病原体鉴定、质谱成像等方向的快速发展，使其在临床检测等领域正发挥着越来越重要的作用。
因此，急需基于MALDI-TOF MS技术对地中海贫血进行筛查的质谱模型及其相关技术，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及应用，以实现β地中海贫血、同时携带α和β地中海贫血、α地中海贫血、异常血红蛋白样本等地中海贫血的筛查。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了一种用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物，所述地中海贫血包括α地中海贫血、β地中海贫血和同时携带α和β地中海贫血；该特征蛋白标记组合物包括α-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白、γ-珠蛋白和/或碳酸酐酶I(Carbonic AnhydraseⅠ，CAⅠ)，其中，所述α-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白、γ-珠蛋白和碳酸酐酶I的序列分别如SEQ IDNO.1-5所示。
进一步，所述α-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白、γ-珠蛋白和碳酸酐酶I质谱检测的质荷比(m/z)分别为：15127m/z(α珠蛋白)、15868m/z(β珠蛋白)、15924m/z(δ珠蛋白)、15995m/z(γ珠蛋白)和28762m/z(碳酸酐酶I)，允许的质荷比误差为±0.1％。
进一步，所述地中海贫血还包括非缺失型α地中海贫血Hb Constant Spring(HbCS)，所述特征蛋白标记组合物还包括用于筛查非缺失型α地中海贫血Hb CS的α珠蛋白变体，其序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述非缺失型α地中海贫血Hb CS的α珠蛋白变体质谱检测的质荷比(m/z)为18480m/z，允许的质荷比误差为±0.1％。
本发明进一步提供了一种用于筛查地中海贫血的特征蛋白的质谱模型，该质谱模型包括上述特征蛋白标记组合物；
其中，所述质谱模型的制备方法包括如下步骤：
1)收集待测患者和正常人的血液样本分别作为待测样本和对照样本，并对待测样本和对照样本进行前处理；
2)对前处理后的待测样本和对照样本进行质谱检测并采集待测样本和对照样本的质谱图；
3)对采集的质谱图进行数据分析，筛选出具有下列质荷比的特征蛋白的质谱峰：表征α珠蛋白质谱峰的15127m/z、表征β珠蛋白质谱峰的15868m/z、表征δ珠蛋白质谱峰的15924m/z、表征γ珠蛋白质谱峰的15995m/z和/或表征碳酸酐酶I质谱峰的28762m/z，允许的质荷比误差为±0.1％，获得对应特征蛋白的质谱峰面积，根据特征蛋白的质谱峰、质谱峰面积及δ/β比率和CA I/δ比率建立用于筛查地中海贫血的质谱模型；其中，δ/β比率为δ珠蛋白的质谱峰面积与β珠蛋白的质谱峰面积的比值，CAI/δ比率为碳酸酐酶I的质谱峰面积与δ珠蛋白的质谱峰面积的比值。
进一步，在质谱模型中设定δ/β比率的临界值为0.1573，当待测样本的δ/β比率>0.1573时，则判读该待测样本为β地中海贫血或同时携带α和β地中海贫血；当待测样本的δ/β比率≤0.1573时，则利用二元逻辑回归模型分析δ/β和CA I/δ比率，得到预测概率并设定预测概率的临界值为0.45，当预测概率≤0.45时，判读该待测样本为正常；当预测概率>0.45时，判读该待测样本为α地中海贫血，所述α地中海贫血包括轻型α地中海贫血(--SEA)和中间型α地中海贫血(HbH病)。
进一步，所述制备方法还包括比较待测样本相对于对照样本的质谱图的γ珠蛋白的质谱峰，在质谱模型中当待测样本的质谱图相对于对照样本的质谱图的γ珠蛋白的质谱峰异常升高时，判读该待测样本为β地中海贫血或遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)。
在本发明中，由于非缺失型α地中海贫血Hb CS存在α珠蛋白变体，由于α珠蛋白基因的终止密码子突变，使其蛋白序列延长了31个氨基酸，分子量为18480Da，通过质谱检测，在质荷比为18480m/z附近发现该样本特异的质谱峰，可作为筛查Hb CS的依据。因此，质谱模型的制备方法还包括筛选质荷比为18480m/z的表征非缺失型α地中海贫血Hb CS的α珠蛋白变体的质谱峰，在质谱模型中当待测样本的质谱图相对于对照样本的质谱图中出现α珠蛋白变体的质谱峰时，判读该待测样本为非缺失型α地中海贫血Hb CS。
进一步，所述制备方法还包括筛选待测样本相对于对照样品的异常质荷比的质谱峰，在质谱模型中当待测样本的质谱图相对于对照样本的质谱图中出现异常质荷比的质谱峰时，判读该待测样本中存在异常血红蛋白。
进一步，在质谱模型的制备方法中，步骤1)中对待测样本和对照样本进行前处理为对待测样本和对照样本进行稀释处理，具体为使用去离子水作为样本稀释液，通过改变红细胞膜内外的渗透压，使红细胞胀破，释放出其中的血红蛋白和碳酸酐酶I。血红蛋白是由4条珠蛋白链非共价相互作用组成的四聚体，在步骤2)进行质谱检测和采集过程中的激光会将四聚体解构，最后检测得到珠蛋白链的而不是血红蛋白四聚体的质谱图；步骤3)对采集的质谱图进行数据分析为对特征蛋白的质谱峰进行峰面积积分，得到每个特征蛋白的质谱峰面积，使用质谱峰面积值表征相应特征蛋白的质谱信号强度，进而计算不同特征蛋白的质谱峰面积的比值。
本发明质谱检测是基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱检测，在质谱检测时质谱仪器各参数的设置如下表：
Figure BDA0002615229120000051
上述特征蛋白标记组合物或质谱模型在制备筛查地中海贫血的产品中的应用也在本发明的保护范围之内，所述地中海贫血为α地中海贫血、β地中海贫血、同时携带α和β地中海贫血；优选的，所述地中海贫血还可以为非缺失型α地中海贫血Hb CS。
本发明筛查地中海贫血症的产品，所述产品除包括上述特征蛋白标记组合物或质谱模型外，还包括：样品前处理试剂、质谱检测系统和/或软件分析系统；其中，所述样本前处理试剂包括样本稀释液和/或质谱基质液；所述质谱检测系统包括质谱检测专用靶板、进样系统、离子源、飞行管、质量探测器、数字采集卡、采集控制软件等；所述软件分析系统可包括对特征蛋白的质谱峰进行识别的软件或芯片、对识别的质谱峰进行峰面积积分得到特征蛋白的质谱峰面积的软件或芯片等。
进一步，所述产品还包括自动鉴定软件系统，该系统包括特征蛋白标记组合物和/或质谱模型判读待测样本的地中海贫血类型的软件或芯片。
本发明的有效技术效果如下：
1、本发明基于用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物建立了用于筛查地中海贫血的质谱模型，基于MALDI-TOF质谱技术通过对不同特征蛋白的质谱峰面积以及比率进行分析，可筛查β地中海贫血、同时携带α和β地中海贫血、α地中海贫血(轻型α地中海贫血和中间型α地中海贫血)、非缺失型α地中海贫血Hb CS、异常血红蛋白样本，具有样本前处理简便、检测通量高、试剂耗材少、成本低、取样量少、灵敏度高等特点，具备在地中海贫血高发地区进行大规模人群筛查的基础。
2、本发明建立了筛查地中海贫血的产品，该产品包括样本前处理试剂、质谱检测系统、软件分析系统和软件鉴定系统。基于该产品，可实现快速高效的样本前处理、质谱检测和结果鉴定，成本低、通量高、流程简单，有利于应用转化，具有广阔的临床筛查和应用前景。
3、本发明基于用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物建立了用于筛查地中海贫血的质谱模型采用的MALDI-TOF质谱平台，区别于其他技术，检测的是游离珠蛋白链而不是血红蛋白四聚体。基于异常血红蛋白肽链和正常血红蛋白肽链的分子量差异，对异常血红蛋白进行检测，可提高异常血红蛋白的筛查效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为正常对照样本的飞行时间质谱图。图中m/z＝15127质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15868质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15925质谱峰为δ珠蛋白，m/z＝28762质谱峰为碳酸酐酶I(CAI)。
图2为β-地贫携带样本的飞行时间质谱图。m/z＝15128质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15868质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15924质谱峰为δ珠蛋白。相对于正常对照样本，β地贫携带样本的δ珠蛋白峰相对强度升高。
图3为β地贫患者的飞行时间质谱图。m/z＝15127质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15867质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15925质谱峰为δ珠蛋白，m/z＝15996质谱峰为γ珠蛋白。相对于正常对照样本，β地贫患者样本的β珠蛋白峰相对强度降低，γ珠蛋白峰相对强度升高。
图4为同时携带α和β地贫的飞行时间质谱图。m/z＝15128质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15868质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15924质谱峰为δ珠蛋白。相对于正常对照样本，该样本的δ珠蛋白峰相对强度升高。
图5为β地贫样本的统计分析结果。图a显示β地贫和α/β地贫的δ/β比率明显高于正常对照样本，t-检验分析表明它们之间存在显著性差异(p<0.001)。图b为使用接受者操作特性曲线(ROC曲线)分析δ/β比率区分β地贫样本。
图6为轻型α地贫(--SEA)样本的飞行时间质谱图。m/z＝15127质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15868质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15925附近质谱峰为δ珠蛋白，m/z＝28764质谱峰为碳酸酐酶I(CAI)。相对于正常对照样本，轻型α地贫的δ珠蛋白峰相对强度降低，CAI峰相对强度升高。
图7为中间型α地贫(HbH病)样本的飞行时间质谱图。m/z＝15127质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15867质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15925附近质谱峰为δ珠蛋白，m/z＝28761质谱峰为碳酸酐酶I(CAI)。相对于正常对照样本，中间型α地贫的α、δ珠蛋白峰相对强度降低，CAI峰相对强度升高。
图8为α地贫样本的统计分析结果。a显示轻型α地贫和中间型α地贫的δ/β比率明显低于正常对照样本，t-检验分析显示它们之间存在显著性差异(p<0.001)；b显示轻型α地贫和中间型α地贫的CAI/δ比率明显高于正常对照样本，t-检验分析显示它们之间存在显著性差异(p<0.001)。
图9为非缺失型α地贫Hb Constant Spring(Hb CS)样本的鉴定结果。a显示m/z＝18480质谱峰为Hb CS峰，只在Hb CS样本中存在，正常对照样本中没有该峰；b显示该样本胰酶酶切后产生的理论肽段，Hb CS样本存在3个异常肽段，分子量分别为1638.9Da、1123.6Da、647.3Da；c显示Hb CS样本胰酶酶切后的质谱结果，相对正常对照样本，Hb CS样本中分子量为1639Da、1123Da、647Da的谱峰异常升高。
图10为异常血红蛋白的质谱结果。
图11为地中海贫血筛查的质谱模型图。
图12为遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)的飞行时间质谱图。m/z＝15128质谱峰为α珠蛋白，m/z＝15868质谱峰为β珠蛋白，m/z＝15994质谱峰为γ珠蛋白。相对于正常对照样本，HPFH样本的β珠蛋白峰相对强度降低，γ珠蛋白峰相对强度升高。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
以下实施例中所需试剂、耗材及仪器：
试剂：去离子水、乙腈、三氟乙酸、芥子酸(SA)。
耗材：离心管、移液器枪头、质谱配套96孔靶板(质谱检测专用靶板)。
仪器：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)、超声清洗仪、涡旋振荡仪、离心机、移液器、计算机。
实施例1地中海贫血的特征蛋白质组合的MALDI-TOF质谱检测方法的建立和不同蛋白质谱峰面积比率的计算
(1)试剂配制
样本稀释液：去离子水，用于血液样本的稀释。
质谱基质液：10mg/mL的芥子酸(SA)溶液(乙腈：0.1％三氟乙酸＝4:6)。
(2)样本前处理
①样本为含EDTA的抗凝管采集的静脉血，并在48小时内放入-80℃保存。用移液器吸取2μL混匀后的血液样本于1.5mL EP管中，向管中加入998μL样本稀释液，涡旋混匀后，3000(转/分钟)离心30秒。
②取离心后的上层液体与10mg/mL质谱基质液按体积比1:9混合，涡旋混匀。
③采用干燥液滴法，吸取2.5μL样本与基质混合液点在靶板上。每个样本重复点2个靶孔，点样完毕后室温放置干燥。
④将制备完成的靶板加载到质谱仪中，待测。
(3)质谱检测系统
利用质谱检测系统(包括进样系统、离子源、飞行管、质量探测器、数字采集卡、采集控制软件等)进行质谱检测并采集质谱图。
采用线性正离子模式，仪器参数如表1所示。
表1.质谱仪器参数
Figure BDA0002615229120000081
(4)软件分析系统
使用质谱仪配套的分析软件，对采集的质谱图进行数据分析。
①特征蛋白的质谱峰识别。
通过软件分析系统识别特征蛋白的质谱峰。
本发明关注的目标物是血液中的血红蛋白肽链，包括α、β、δ、γ珠蛋白链以及碳酸酐酶I。通过对采集的质谱图进行叠加、平滑、基线校正和质量校正处理等数据分析，筛选出最终检测的质荷比(m/z)分别为：α珠蛋白＝15127m/z、β珠蛋白＝15868m/z、δ珠蛋白＝15924m/z、γ珠蛋白＝15995m/z、碳酸酐酶I＝28762m/z，允许的质荷比误差为±0.1％(如图1、图3)。
②特征蛋白的质谱峰面积积分。
软件分析系统对上述识别的质谱峰进行峰面积积分，得到特征蛋白的质谱峰面积值。软件分析系统计算不同特征蛋白之间的质谱峰面积比值，用来表示不同特征蛋白之间的质谱峰面积的比率：δ/β比率即为δ珠蛋白质谱峰面积与β珠蛋白质谱峰面积的比值，CAI/δ比率即为CA I质谱峰面积与δ珠蛋白质谱峰面积的比值。
实施例2地中海贫血筛查的质谱模型的建立
(1)利用实施例1中建立的检测方法，分析正常对照样本100例，β地贫样本52例(β地贫携带样本50例和β地贫患者样本2例)，同时携带α和β地贫(α/β地贫)样本35例。
通过软件分析系统识别样本中的特征蛋白(α珠蛋白＝15127m/z、β珠蛋白＝15868m/z、δ珠蛋白＝15924m/z、γ珠蛋白＝15995m/z、碳酸酐酶I＝28762m/z，允许的质荷比误差为±0.1％)质谱峰。正常对照样本如图1所示，相对于正常对照样本，β地贫携带(如图2所示)的δ珠蛋白峰的相对强度明显升高。β地贫患者(如图3所示)的β珠蛋白峰的相对强度明显降低，γ珠蛋白峰的相对强度明显升高。同时携带α和β地贫样本(如图4所示)的δ珠蛋白峰相对强度明显升高。
通过软件分析系统自动计算上述样本的δ/β比率，并进行统计学分析，结果如图5中a所示，β地贫样本和α/β地贫样本的δ/β比率明显高于正常对照样本，t-检验分析显示正常它们之间存在显著性差异(p<0.001)。使用δ/β比率区分正常对照样本和β地贫样本，并进行接受者操作特性曲线(ROC曲线)分析，如图5-b所示，曲线下面积AUC值为0.998(一般认为AUC>0.9则该指标具有很好的区分效果)。ROC分析δ/β比率对于β地贫样本和α/β地贫样本的区分效果，如表2所示，当设定δ/β比率临界值为0.1573时，正常对照样本的区分正确率为92.0％，β地贫的区分正确率为100.0％，同时携带α和β地贫的区分正确率为85.7％，该方法的灵敏度和特异性分别为94.3％和92.0％。
表2.β地贫的区分结果汇总
Figure BDA0002615229120000101
(2)利用实施例1中建立的检测方法，分析正常对照样本100例，α地贫样本100例(--SEA轻型α地贫样本80例和中间型α地贫-HbH病样本20例)。
通过软件分析系统识别样本中的特征蛋白(α珠蛋白＝15127m/z、β珠蛋白＝15868m/z、δ珠蛋白＝15924m/z、γ珠蛋白＝15995m/z、碳酸酐酶I＝28762m/z，允许的质荷比误差为±0.1％)质谱峰。正常对照样本如图1所示，相对于正常对照样本，轻型α地贫样本(如图6所示)的δ珠蛋白峰相对强度降低，CA I峰相对强度升高。中间型α地贫(HbH病)(如图7所示)的α、δ珠蛋白峰相对强度降低，CA I峰相对强度升高。
通过软件分析系统自动计算δ/β和CA I/δ比率，对上述样本的δ/β和CA I/δ比率进行统计学分析，轻型α地贫和中间型α地贫的δ/β比率(如图8中a所示)明显低于正常对照样本，t-检验分析显示它们之间存在显著性差异(p<0.001)。轻型α地贫和中间型α地贫的CAI/δ比率(如图8中b所示)明显高于正常对照样本，t-检验分析显示它们之间存在显著性差异(p<0.001)。
二元逻辑回归分析δ/β和CA I/δ比率对于α地贫样本的区分效果，如表3所示，当设定预测概率的临界值为0.45时，正常对照样本的区分正确率为85.0％，轻型α地贫的区分正确率为83.8％，中间型α地贫的区分正确率为100.0％。该方法的灵敏度和特异性分别为87.0％和85.0％。
表3.α地贫的区分结果汇总
Figure BDA0002615229120000102
(3)利用实施例1中建立的检测方法，分析正常对照样本5例，非缺失型α地贫样本Hb CS 5例。
通过软件分析系统识别样本中的特征蛋白质谱峰。m/z＝18480质谱峰只在非缺失型α地贫Hb CS(如图9中a所示)中存在，正常对照样本(如图1所示)中没有该峰。图9中b为非缺失型α地贫样本胰酶酶切后产生的理论肽段，存在3个异常肽段，分子量分别为1638.9Da、1123.6Da、647.3Da。图9中c为非缺失型α地贫样本胰酶酶切后的质谱结果，相对正常对照样本，Hb CS样本中分子量为1639Da、1123Da、647Da的谱峰异常升高。因此，通过识别质谱图中的m/z＝18480谱峰，可筛查非缺失型α地贫样本(Hb CS)。
(4)利用实施例1中建立的检测方法，通过软件分析系统识别样本中的特征蛋白质谱峰，若出现异常质荷比的谱峰，则判读该样本可能存在异常血红蛋白。如图10所示，以该例样本举例说明，谱图分析发现样本中出现m/z＝15900的异常峰，相对于β珠蛋白(m/z＝15868)，分子量增加了32Da，判读该样本中存在异常血红蛋白。基因测序结果显示该样本为异常血红蛋白Hb Owari，β珠蛋白基因发生突变，导致β链第109位的缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)，分子量增加32Da，这与质谱结果相符。而HPLC分析该样本，未检出异常血红蛋白。
(5)基于上述针对不同类型地贫样本的筛查结果，建立地贫筛查的质谱模型，模型流程如图11所示，对于未知疾病类型的待测样本，参照实施例1中建立的检测方法检测待测样本的特征蛋白组合并测定不同特征蛋白的质谱峰面积比率。当待测样本的δ/β比率>0.1573时，则判读该待测样本为β地贫或同时携带α和β地贫。当待测样本的δ/β比率≤0.1573时，则利用二元逻辑回归模型分析δ/β和CA I/δ比率，得到预测概率并设定临界值为0.45：当预测概率≤0.45时，判读该待测样本为正常；当预测概率>0.45时，判读该待测样本为α地贫。如果该样本相对于正常对照样本的质谱图中若出现明显的γ峰，则判读该样本为β地贫(如图3所示)或遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)(如图12所示)，若出现m/z＝18480质谱峰时，则判读该样本为非缺失型α地贫Hb CS样本，若出现其他异常质荷比的质谱峰，则判读该样本可能存在异常血红蛋白，需进一步验证。
实施例3方法学的重复性评价
基于实施例1中建立的检测方法，选取3例正常对照样本和3例α地贫样本，在相同的实验条件下，对样本进行8次批间重复测定，得到样本的δ/β和CA I/δ比率。计算结果的平均值(AVG)和相对标准偏差(RSD)，评价实验流程的重复性，如表4所示，δ/β的RSD在4.66％-5.14％之间，CA I/δ的RSD在3.15％-6.53％之间，表明本方法测定的δ/β和CA I/δ比率的重复性较好，满足临床筛查要求。
表4.δ/β和CA I/δ比率的重复性分析
Figure BDA0002615229120000121
实施例4地中海贫血筛查的质谱模型的效果验证
针对实施例2中建立的质谱模型，选取正常对照样本100例，β地贫携带样本50例，同时携带α和β地贫(α/β地贫)样本35例，α地贫样本100例(--SEA轻型α地贫样本82例，中间型α地贫-HbH病样本18例)，对质谱模型的筛查效果进行验证。
参照实施例1中建立的检测方法，对于未知疾病类型的待测样本，检测样本的特征蛋白质组合并测定不同蛋白质的比率。根据实施例2中建立的模型流程(图11)，当样本的δ/β比率>0.1573时，则判读该样本为β地贫或α和β同时携带样本。当δ/β比率≤0.1573时，则利用二元逻辑回归模型分析δ/β和CA I/δ比率，得到预测概率，设定临界值为0.45。当预测概率≤0.45时，判读该样本为正常。当预测概率>0.45时，判读该样本为α地贫。当样本的质谱图中出现m/z＝18480质谱峰时，判读该样本为非缺失型α地贫样本(Hb CS)。质谱模型的验证结果如表5所示，β地贫的区分正确率为96.0％，同时携带α和β地贫的区分正确率为97.1％，轻型α地贫的区分正确率为81.7％，中间型α地贫的区分正确率为100.0％。该方法的灵敏度和特异性分别为90.3％和76.0％。
表5.质谱模型的验证结果汇总
Figure BDA0002615229120000131
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 融智生物科技（青岛）有限公司
<120> 用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及其应用
<130> JLP20I0671
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly
1               5                   10                  15
Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
            20                  25                  30
Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp
        35                  40                  45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala
    50                  55                  60
Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro
                85                  90                  95
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala
            100                 105                 110
His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
        115                 120                 125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
    130                 135                 140
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp
1               5                   10                  15
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
            20                  25                  30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
    50                  55                  60
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
65                  70                  75                  80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
                85                  90                  95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
            100                 105                 110
Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln
        115                 120                 125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
    130                 135                 140
Lys Tyr His
145
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Thr Ala Val Asn Ala Leu Trp
1               5                   10                  15
Gly Lys Val Asn Val Asp Ala Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
            20                  25                  30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Ser Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
    50                  55                  60
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
65                  70                  75                  80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ser Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
                85                  90                  95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
            100                 105                 110
Cys Val Leu Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Gln Met Gln
        115                 120                 125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
    130                 135                 140
Lys Tyr His
145
<210> 4
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp
1               5                   10                  15
Gly Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu
            20                  25                  30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn
        35                  40                  45
Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
    50                  55                  60
Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp
65                  70                  75                  80
Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
                85                  90                  95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln
        115                 120                 125
Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Ala Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser
    130                 135                 140
Arg Tyr His
145
<210> 5
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Ser Pro Asp Trp Gly Tyr Asp Asp Lys Asn Gly Pro Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Ser Lys Leu Tyr Pro Ile Ala Asn Gly Asn Asn Gln Ser Pro Val
            20                  25                  30
Asp Ile Lys Thr Ser Glu Thr Lys His Asp Thr Ser Leu Lys Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Val Ser Tyr Asn Pro Ala Thr Ala Lys Glu Ile Ile Asn Val Gly
    50                  55                  60
His Ser Phe His Val Asn Phe Glu Asp Asn Asp Asn Arg Ser Val Leu
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Pro Phe Ser Asp Ser Tyr Arg Leu Phe Gln Phe His Phe
                85                  90                  95
His Trp Gly Ser Thr Asn Glu His Gly Ser Glu His Thr Val Asp Gly
            100                 105                 110
Val Lys Tyr Ser Ala Glu Leu His Val Ala His Trp Asn Ser Ala Lys
        115                 120                 125
Tyr Ser Ser Leu Ala Glu Ala Ala Ser Lys Ala Asp Gly Leu Ala Val
    130                 135                 140
Ile Gly Val Leu Met Lys Val Gly Glu Ala Asn Pro Lys Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Asp Ala Leu Gln Ala Ile Lys Thr Lys Gly Lys Arg Ala Pro
                165                 170                 175
Phe Thr Asn Phe Asp Pro Ser Thr Leu Leu Pro Ser Ser Leu Asp Phe
            180                 185                 190
Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr His Pro Pro Leu Tyr Glu Ser Val
        195                 200                 205
Thr Trp Ile Ile Cys Lys Glu Ser Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu
    210                 215                 220
Ala Gln Phe Arg Ser Leu Leu Ser Asn Val Glu Gly Asp Asn Ala Val
225                 230                 235                 240
Pro Met Gln His Asn Asn Arg Pro Thr Gln Pro Leu Lys Gly Arg Thr
                245                 250                 255
Val Arg Ala Ser Phe
            260
<210> 6
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly
1               5                   10                  15
Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
            20                  25                  30
Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp
        35                  40                  45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala
    50                  55                  60
Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro
                85                  90                  95
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala
            100                 105                 110
His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
        115                 120                 125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gln Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Ser Val Ala Val Pro Pro Ala Arg Trp Ala Ser Gln Arg Ala
145                 150                 155                 160
Leu Leu Pro Ser Leu His Arg Pro Phe Leu Val Phe Glu
                165                 170

Claims (8)

1.用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物，所述地中海贫血包括α地中海贫血、β地中海贫血和/或同时携带α和β地中海贫血；其特征在于，所述特征蛋白标记组合物包括α-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白、γ-珠蛋白和/或碳酸酐酶I，其中，所述α-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白、γ-珠蛋白和碳酸酐酶I的序列分别如SEQ ID NO.1-5所示；
所述α-珠蛋白、β-珠蛋白、δ-珠蛋白、γ-珠蛋白和碳酸酐酶I质谱检测的质荷比分别为：15127m/z、15868m/z、15924m/z、15995m/z和28762m/z，允许的质荷比误差为±0.1％。
2.根据权利要求1所述的特征蛋白标记组合物，其特征在于，所述地中海贫血还包括非缺失型α地中海贫血Hb CS，所述特征蛋白标记组合物还包括用于筛查非缺失型α地中海贫血Hb CS的α珠蛋白变体，其序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的特征蛋白标记组合物，其特征在于，所述α珠蛋白变体的质谱检测的质荷比为18480m/z，允许的质荷比误差为±0.1％。
4.用于筛查地中海贫血的质谱模型，其特征在于，所述质谱模型包括权利要求1-3任一所述的特征蛋白标记组合物；
其中，所述质谱模型的制备方法包括：
1)收集待测患者和正常人的血液样本分别作为待测样本和对照样本，并对待测样本和对照样本进行前处理；
2)对前处理后的待测样本和对照样本进行质谱检测并采集待测样本和对照样本的质谱图；
3)对采集的质谱图进行数据分析，筛选出具有下列质荷比的特征蛋白的质谱峰：表征α珠蛋白质谱峰的15127m/z、表征β珠蛋白质谱峰的15868m/z、表征δ珠蛋白质谱峰的15924m/z、表征γ珠蛋白质谱峰的15995m/z和/或表征碳酸酐酶I质谱峰的28762m/z，允许的质荷比误差为±0.1％，获得对应特征蛋白的质谱峰面积，根据特征蛋白的质谱峰、质谱峰面积及δ/β比率和CA I/δ比率建立用于筛查地中海贫血的质谱模型；其中，δ/β比率为δ珠蛋白的质谱峰面积与β珠蛋白的质谱峰面积的比值，CA I/δ比率为碳酸酐酶I的质谱峰面积与δ珠蛋白的质谱峰面积的比值；
在质谱模型中设定δ/β比率的临界值为0.1573，当待测样本的δ/β比率>0.1573时，则判读该待测样本为β地中海贫血或同时携带α和β地中海贫血；当待测样本的δ/β比率≤0.1573时，则利用二元逻辑回归模型分析δ/β和CA I/δ比率，得到预测概率并设定预测概率的临界值为0.45，当预测概率≤0.45时，判读该待测样本为正常；当预测概率>0.45时，判读该待测样本为α地中海贫血。
5.根据权利要求4所述的质谱模型，其特征在于，所述制备方法还包括筛选质荷比为18480m/z的表征非缺失型α地中海贫血Hb CS的α珠蛋白变体的质谱峰，在质谱模型中当待测样本的质谱图相对于对照样本的质谱图中出现非缺失型α地中海贫血Hb CS的α珠蛋白变体的质谱峰时，判读该待测样本为非缺失型α地中海贫血Hb CS，
和/或，
所述制备方法还包括比较待测样本相对于对照样本的质谱图的γ珠蛋白的质谱峰，在质谱模型中当待测样本的质谱图相对于对照样本的质谱图的γ珠蛋白的质谱峰异常升高时，怀疑该待测样本为β地中海贫血或遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症；
和/或，
所述制备方法还包括筛选待测样本相对于对照样本的异常质荷比的质谱峰，在质谱模型中当待测样本的质谱图相对于对照样本的质谱图中出现异常质荷比的质谱峰时，怀疑该待测样本中存在异常血红蛋白。
6.权利要求1-3任一所述的特征蛋白标记组合物或权利要求4-5任一所述的质谱模型在制备筛查地中海贫血症的产品中的应用。
7.一种筛查地中海贫血症的产品，其特征在于，所述产品除包括权利要求1-3任一所述的特征蛋白标记组合物或权利要求4-5任一所述的质谱模型外，还包括：样品前处理试剂、质谱检测系统和/或软件分析系统。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品还包括自动鉴定软件系统。
CN202010767467.4A 2020-08-03 2020-08-03 用于筛查地中海贫血的特征蛋白标记组合物、质谱模型及其应用 Active CN111948404B (zh)

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