CN104293937B - 一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。本发明利用锁核酸能灵活修饰探针的特点，设计出用于检测地中海贫血基因点突变的探针，这些探针分别与不同编码的微珠进行耦联；然后设计本发明的特异性引物对突变位点进行扩增得到PCR产物，将其与耦联有探针的微珠进行杂交，再用荧光标记试剂进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪进行突变位点的检测。本发明基于LNA增敏的探针较常规的探针长度缩短，但仍能保持较高的Tm值，使得完全匹配的探针和错配的探针杂交信号比值从原来的不到2倍提高到超过4倍以上的差异，因而容易区分。
Description
技术领域：
本发明属于分子诊断领域，具体涉及一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
地中海贫血(Thalassemia)是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分α地中海贫血(简称α地贫)和β地中海贫血(β地贫)两种类型。本病主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国，是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，全世界约有九千万地贫基因突变携带者。我国以南方地区多见，是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，尤以广西、广东和海南为甚，广西地中海贫血以α地贫为主，基因携带率约为18％，广东省地贫的基因携带率约为16％，海南省约为7％，还有四川、湖南以及江西省，基因携带率约为人群的2％左右。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致产后大出血等严重的产科并发症，另一方面，重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响人口素质。因此，在全国乃至东南亚地贫高发地区有效开展婚前、孕前以及产前地贫基因检测，对防止重型地贫患儿出生，减少出生缺陷以及优生优育具有重要意义。
地贫的发病分子机制经过多年研究已非常清楚，α基因与β基因序列也非常明确。地贫基因突变的类型有明显种族与地域差异性，在全世界已发现200多种突变，而中国至今发现三十余种基因突变，但是98％左右集中在23种类型的突变，并在东南亚地区范围内，其分子机制大致相同。α地贫有三种比较常见的点突变，分别是122CAC→CAG,125CTG→CCG,142TAA→CAA点突变；β地贫的分子基础以点突变为主，其中常见的为17种:-32(C>A),-30(T>C),-29(A>G),-28(A>G),CAP+40-+43(-AAAC),Initiation codon ATG>AGG,CD14/15(+G),CD17(A>T),CD26(G>A),CD27/28(+C),IVS-1-1(G>T),IVS-1-5(G>C),CD31(-C)，CD41-42(-TCTT)，CD43(G>T)，CD71/72(+A),IVS-2-654(C>T)。
目前已经有基于荧光定量PCR，反相斑点膜杂交方法，以及液相芯片方法和试剂盒来检测以上地贫基因点突变。反向斑点膜杂交方法，最终的检测结果是基于目测杂交点的杂交信号深浅度来判断，因此膜芯片上只设计了针对检测突变的探针；而液相芯片检测结果是把杂交的荧光信号转化数字信号，因此液相芯片检测点突变时，需要设计针对野生型的探针，和针对突变型的探针，最终计算野生型探针和突变型探针信号的比值来确定样本的基因型。在检测基因点突变时，最关键的因素是需要保证探针杂交的特异性，最理想的结果就是野生型探针只与野生型DNA片段杂交；突变型探针只与突变型DNA片段杂交，但实际工作中不会出现以上绝对的情形，总会有一些非特异性的背景信号产生。检测地贫基因型的准确度取决于特异性信号所产生的信号值是否较非特异性探针产生的信号值有较大的差异，以便容易区分。若野生型和突变型DNA有时只存在一个碱基的不同，按照常规方法设计的探针，往往会产生较高的非特异性杂交信号，导致不能明显地区分野生型还是突变型DNA片段。
锁核酸(LNA-Locked Nucleic Acid，简称LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架,故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。锁核酸修饰的探针在降低了探针的长度时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的熔解温度(Tm值)，并且由于LNA碱基可以在探针的任何位置进行修饰，因此锁核酸修饰的探针在增加检测基因点突变的特异性方面具有很大的灵活性。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针。本发明的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针上在合适的位置进行锁核酸修饰，以增加探针的特异性，本发明的探针适用于微珠液相芯片杂交方法，该组探针包括地中海贫血基因突变中常见的发生单碱基突变的18种突变类型，对野生型、突变型检测的特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因突变类型。
本发明的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的探针如表1所示：
表1.基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针序列及其检测的突变位点
注：其中N表示针对野生型的探针；M表示针对突变型的探针；“+”符号3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。
所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示。核苷酸中核糖2'位置的氧原子和4’位置的碳原子之间形成亚甲基键锁住了3'位置磷酸骨架的移动，随着碱基不同，可以形成A/T/C/G锁核酸碱基。
探针的5’端带有连接臂，可以和液相芯片所用的微珠生的-COOH基团发生化学耦合反应，使得探针连接到微珠上。
所述的连接臂，优选为NH2-C12连接臂。
本发明的第二个目的是提供一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物如表2所示：
表2.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物序列
在下游引物的5’端带有荧光标记修饰。
所述的荧光标记修饰，优选为生物素荧光标记修饰。
本发明的第三个目的是提供一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测试剂盒，包括多重PCR反应液、耐热DNA聚合酶、微珠、引物及探针，其特征在于，所述的引物序列上述表2所示，所述的探针序列如上述表1所示。
本发明的第四个目的是提供一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、探针耦联：合成上述针对18个地中海贫血基因点突变位点的探针，将探针分别连接到不同编码的微珠上，探针与微珠耦联的步骤参考专利：ZL201110084698.6；
(2)、样本PCR扩增：提取样本基因组DNA，利用上述针对18个地中海贫血基因点突变位点的引物，通过多重PCR的方法把要检测的突变位点一次性全部扩增出来，得到PCR产物；
(3)、PCR产物和耦联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号：在杂交缓冲液中加入步骤(1)中得到耦联有探针的微珠，得到杂交缓冲液和微珠的混合液，然后将PCR产物与杂交缓冲液和微珠的混合液进行杂交，得到杂交产物，将杂交产物与荧光标记试剂混合进行反应，通过液相芯片检测仪分析每个样本的荧光强度中位数，当样本的荧光强度中位数高于平均背景的荧光强度中位数加10倍标准差，则是特异性杂交，完全匹配杂交的探针的杂交信号会强于不完全匹配的杂交信号，通过比较针对同一基因位点完全匹配的探针，和带有突变的探针的杂交信号，判断出样本中该突变位点的基因型。
所述步骤(2)中的样本PCR的扩增体系，优选为：总PCR反应体系为25μl，包括0.2mMdNTPs、2mM Mg2+、1U·TaqHS，以及25ng标本基因组DNA，空白对照用无菌水代替标本基因组DNA。
所述步骤(2)中的样本PCR的扩增程序，优选为：95℃5分钟；95℃30秒、50℃45秒、72℃30秒，30次循环；95℃30秒、65℃45秒、72℃30秒，20次循环；72℃10分钟。
所述步骤(3)中在杂交缓冲液中加入步骤(1)中得到耦联有探针的微珠，优选为每15ml的1.5×TMAC TE(Tris-EDTA)杂交缓冲液中，加入每种耦联有探针的微珠2000个，得到杂交缓冲液和微珠的混合液。
所述步骤(3)中PCR产物和耦联好探针的微珠进行杂交，具体杂交体系及程序优选为：，每个反应孔加入杂交缓冲液和微珠的混合液45μl，然后取2.5μlPCR反应产物加入反应孔，在55℃下进行杂交反应15min后，加入100μl预热至55℃的双蒸水终止反应，得到杂交产物，杂交产物与50μl荧光标记试剂溶液进行反应，55℃10min。
所述步骤(3)中的荧光标记试剂，优选为链亲和素-R-藻红蛋白，其浓度为每毫升1×TMAC中含10ng链亲和素-R-藻红蛋白。
本发明的克服现有技术的不足和缺点，在提高液相芯片检测地中海贫血基因突变的准确度方面体现出以下优势：本发明的基于LNA增敏的探针较常规的探针长度缩短，但仍能保持较高的Tm值，使得完全匹配的探针和错配的探针杂交信号比值从原来的不到2倍提高到超过4倍以上的差异，因而容易区分。
附图说明：
图1是针对-32(C>A)突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图2是针对-30(C>A)突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图3是针对-29(C>A)突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图4是针对-28(C>A)突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图5是针对Initiation codon(ATG>AGG)突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中比值的对比图；
图6是针对CD14/15(+G)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图7是针对CD17(A>T)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图8是针对CD26(G>A)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图9是针对CD27/28(+C)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图10是针对IVS-1-1(G>T)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图11是针对IVS-1-5(G>C)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图12是针对CD31(-C)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图13是针对CD43(G>T)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图14是针对CD71/72(+A)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图15是针对IVS-2-654(C->T)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图16是针对codon 122(CAC->CAG)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图17是针对codon 125(CTG->CCG)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；
图18是针对codon 142(TAA->CAA)突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、探针耦联
在合成表1所列出的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针时，在探针的5’端带上NH2-C12连接臂，NH2可以和液相芯片所用的微珠生的-COOH基团发生化学耦合反应，使得探针连接到Luminex公司MicroPlex微珠上。不同编码的微珠耦联不同的探针，如表3所示。探针与微珠耦联的步骤为：取出40μl(1×105个)需要的微珠，12000rpm离心2min后弃上清，加入5μl 0.1M MES pH4.5，混匀。将所用的探针稀释至0.1mM，在耦联体系中加入1μl。第一次加入2.5μl 10mg/ml EDC，混匀后避光放置30min。重复再加入一次EDC，混匀避光放置30min。用0.2ml 0.02％Tween和0.1％SDS各洗一次，最后将微珠重新悬浮于10μl TE(pH 8.0)溶液中，混匀后使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微珠个数)。4℃避光保存。混合耦联好的探针的微珠，使用1.5×TMAC稀释至每种微珠的浓度是150个/μl(参考专利：ZL 201110084698.6)。
表3.不同编码的微珠所耦联的探针
2、样本PCR扩增
设计并合成本发明的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的引物，引物序列如表2所示。提取样本的基因组DNA，针对所检测的突变位点，先通过PCR把包含突变位点的片段进行PCR扩增，采用多重PCR的方法在一个离心管中把本发明探针所检测的如表1所列的18个突变位点全部扩增出来。总PCR反应体系为25μl，包括0.2mM dNTPs、2mMMg2+、1U·TaqHS，以及25ng标本基因组DNA(空白对照用无菌水代替标本基因组DNA)。PCR扩增条件为：95℃5分钟；(95℃30秒、50℃45秒、72℃30秒)×30次循环；(95℃30秒、65℃45秒、72℃30秒)×20次循环；72℃10分钟。PCR引物的5’端带有生物素修饰，以便后续的杂交荧光标记。
3、PCR产物和耦联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号
为同时检测96个样本，在15ml的1.5×TMAC TE(Tris-EDTA)杂交缓冲液中，加入每种耦联有探针的微珠2000个进行建库，得到杂交缓冲液和微珠的混合液。将杂交缓冲液和微珠的混合液分装到反应孔，每孔45μl，PCR产物95℃变性后迅速置于4℃冰水浴，取2.5μlPCR产物加入反应孔。在55℃下进行杂交反应15min后，加入100μl预热至55℃的双蒸水终止反应，得到杂交产物。杂交产物在50μl新鲜的链亲和素-R-藻红蛋白(streptavidin-R-phycoerythrin)溶液中进行反应，链亲和素-R-藻红蛋白溶液浓度为每毫升1×TMAC中含10ng链亲和素-R-藻红蛋白，55℃反应10min。该过程在液相芯片检测仪Luminex 200(Luminex Corp.,Austin,TX,USA)上实现(检测参数见表4)。杂交后分析每个样本的荧光强度中位数，当样本的荧光强度中位数高于平均背景的荧光强度中位数加10倍标准差，认为是特异性杂交。由于控制好了杂交的严谨度，完全匹配杂交的探针的杂交信号会强于不完全匹配的杂交信号。通过比较针对同一基因位点完全匹配的探针，和带有突变的探针的杂交信号，就能判断出样本中该突变位点的基因型。在相同的试验条件下将常规探针与本发明的探针的检测结果进行对比，结果如图1～18所示，本发明的探针能增加N/M探针信号的比值在野生型样本和突变携带者之间的差异，使得检测准确度增加。
表4.液相芯片检测仪Luminex 200检测参数
Claims (6)
1.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的探针序列如下所示：
其中N表示针对野生型的探针；M表示针对突变型的探针；“+”符号3’端的碱基为锁核酸修饰碱基，探针的5’端带有连接臂。
2.根据权利要求1所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示：
3.根据权利要求1所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的连接臂为NH2-C12连接臂。
4.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物序列如下所示：
P1-F：5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCAG-3’，P1-R：5’-CCTCAGGAGTCAGATGCACC-3’；
P2-F：5’-AGAAGTCTGCCGTTACTGCC-3’，P2-R：5’-ATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’；
P3-F：5’-ACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3’，P3-R：5’-TGAGGTTGTCCAGGTGAGC-3’；
P4-F：5’-CATGCCTCTTTGCACCATTCTA-3’，P4-R：5’-TAGCTGGATTGTAGCTGCTATTAG-3’；
P5-F：5’-TAAGCCACTGCCTGCTGGT-3’，P5-R：5’-CAGGAGGAACGGCTACCGA-3’；
在下游引物的5’端带有荧光标记修饰。
5.根据权利要求4所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的荧光标记修饰为生物素荧光标记修饰。
6.一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测试剂盒，包括多重PCR反应液、耐热DNA聚合酶、微珠、引物及探针，其特征在于，所述的引物为权利要求4所述的引物，所述的探针为权利要求1所述的探针。
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