CN1646705A - 检测和分型人乳头瘤病毒的扩增－杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测和分型人乳头瘤病毒(HPV)的扩增和杂交方法，以及本方法中使用的引物和杂交探针。本发明涉及适于设计HPV属特异和HPV基因型特异寡核苷酸杂交探针的HPV基因组的具体部分。
Description
发明领域
本发明提供了改进的检测和分型人乳头瘤病毒(HPV)的方法。
本发明的一个方面定义了这样的HPV基因组区域，其适用于设计HPV属特异和HPV基因型特异的杂交寡核苷酸探针，有利地是这些基因组区域互相靠近并在一个扩增子中。
本发明的另一方面涉及属特异和基因型特异探针的序列。
本发明的另一方面涉及适用于扩增HPV基因型并检测HPV基因型扩增产物的优化方法及试剂的优化配制(试剂盒)。
发明背景
已确定很多的乳头瘤病毒序列，见此处引用作为参考的出版物：HPV-6：de Villiers等人，J.Virology，40(1981)；HPV-11：Dartmann等人，Virology
151，124-130(1986)；HPV-16：Seedorf等人，Virology
145，181-185(1985)；HPV-18：Cole和Danos，Journal of Molecular Biology
93，599-608(1987)；HPV-31：Goldsborough等人，Virology
171，306-311(1989)；HPV-33：Cole和Streeck，J.Virology，
58，991-995(1986)；HPV-54：Favre等人，J.Cancer
45，40-46(1990)；HPV-56：Lrincz，J.，Gen.Virol.
70，3099(1989)。
在多数出版物中已报道HPV的检测和分型，除了Southern印迹和其它杂交技术外，最广泛使用的是基于PCR的方法，因为此类方法可同时提供高灵敏性和特异性，以及该测试法的灵活性使之可根据分析需要而进行较多控制。
人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。该病毒显示强烈的上皮细胞嗜性，并且仅在分化的上皮细胞中增殖。怀疑乳头瘤病毒在多种不同的人类疾病中扮演病因学角色，例如，在不同的皮肤病例如在疣、尖锐湿疣和皮肤肿瘤及其它疾病如宫颈癌、肛门生殖癌、喉癌中。已公知，人乳头瘤病毒与这些肿瘤的发病率显示强烈的相关，这点甚至对这些肿瘤的癌前期损害(CIN，VIN，VAIN，PIN，PAIN)也是如此。HPV在99％宫颈癌病人中可检测到。在宫颈癌的形成中，这种紧密的统计学关系可能是HPV的作用导致的。但以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。
HPV病毒不可培养。在HPV的诊断中，可使用HPV血清学试验，该试验可检测与病毒(过去或现在感染)的接触，但不能确切鉴定基因型，并且不能证明现在的感染，这就是为什么它们的作用主要限于流行病学研究。
对乳头瘤病毒而言，不存在准确的血清学分类(血清型)，所以检测该病毒DNA基因组的方法用于确定其型别。根据检测是否通过扩增进行，这些可分为2组。在后来方法的一个实施方案中，使用全长基因组RNA探针检测变性的HPV DNA基因组，并用特异抗体(Hibrid Capture-Digene)检测异源二聚体。根据另一个方法，Southern印迹法用于检测不同的HPV基因型。这些方法的缺点是相对不敏感和部分缺少特异性。在杂交捕获方法中，许多出版物报道不同的交叉反应，从而在临床条件下导致假阳性。作者报道，仅在使用高(1ng/ml)DNA浓度的临床对照，该方法的交叉反应是可接受的，其中交叉反应表明灵敏性和特异性之间存在不希望有的联系。
通过扩增方法，该问题未出现，因为与灵敏性(扩增)相关的反应分别从与特异性(检测)相关的反应中实施而来。通常扩增技术在选择的扩增基因组片段、引物数和应用的检测技术方面不同。使用最频繁的引物是GP5+-GP6+、MY9-MY11和不同的型特异PCR反应。使用最频繁的检测技术是序列特异杂交、限制片段长度多态性(RFLP)和线性探针试验(LiPA)。除了这些技术外，也使用(但较不常用)对扩增子进行测序和通过dUTP掺入产生的胸苷模式。
扩增技术的分析特征在很宽的范围内变化。该方法的特征在于可扩增的基因型、基因型扩增的分析灵敏性、检测的特异性及可信度。在该领域中，考虑将MY9-MY11简并引物系统作为参照反应。在MY9-MY11系统的情况下，存在LiPA杂交检测系统(Innogenetics)。但在该系统中，控制引物的简并合成是困难的，这是因为合成中产生的引物种类的相对比例在每次的合成中是变化的，这会导致对PCR反应进行分析的不可预测的变化，第二，与其它普及的反应比较，该反应可扩增最少的型别。从文献中已众所周知，如果HPV基因型51型特异引物加入反应中，该系统仅可在这种情况下扩增基因型51。使用简并的引物合成时，引物种类的相对比例不可改变，并且不能改变引物比率以获得基因型较好的分析特性和均衡扩增。
仅通过使用仔细选择的、优化的生殖器HPV序列的引物对，GP5+-GP6+反应可解决相同的问题，这两个引物系统易于处理，但灵活性较低。GP5+-GP6+系统可扩增许多已知的HPV基因型，但该系统的分析特征未优化(灵敏性对不同的基因型不平衡)，并且除了对解链温度和Mg2+浓度进行有限的优化外，对两引物法的优化是受限的，例如对个体基因型检测的灵敏性进行平衡是非常困难的。将GP5+-GP6+系统应用于扩增其它基因型是困难的，在任何情况下，这将影响其将来的应用，因为检测新基因型的需要是长期存在的。基因型的鉴定还未充分得到解决。
另一个众所周知广泛的基因型特异扩增方法是L1C方法：具有2种形式的双引物系统用于扩增更多的基因型，一种形式是使用(带有LC1引物)L1C2或新L1C2引物。L1C扩增子的详细描述见文献[Jpn.J.CancerResearch
82，524-531(1991)]。
基本上，扩增后的检测法必须满足2条要求：常规诊断的适用性(简单、成本、时间)和需要适当水平的分辨能力。相当多的方法由于其辨别能力而不适用，因此使用RFLP是受限的，因为扩增区很短、无足够的诊断用限制性位点、以及基因型常常仅分为小组。同样的，将SSCP的复杂模式适应于具体基因型是困难的，此外，这些反应的稳定性也不令人满意。从诊断上来说为了满足常规需求，分辨能力是尤其重要的。从简单性和分辨能力的方面来说，如果样本不是基因型的混合物，测序是理想的方法，因为自动化得到解决，并且可检测每种基因型(或其亚型)。但实际上，它并未得到广泛使用，因为它很昂贵且费时，在常规诊断实验室它的应用不可接受，并且在为混合样本的情况下，不能确定任何基因型。杂交方法的优点是它们的分辨能力或严格性可轻易得到改变，因为反应的几个参数可在广泛的范围内改变，一些杂交形式易于自动化、不是很昂贵，并且在平行进行(一些杂交形式)的情况下，即使费时也是无关紧要的。
因此，需要新的HPV扩增检测方法，这些方法应能消除当前方法的缺点，这些方法应便宜、易于重复和自动化。本发明描述了引物是独立合成的分子的扩增和杂交测试法，因此，它们的相对比例可轻易得到控制和优化，并且扩增具有平衡的灵敏性。杂交反应是以高度平行模式实施的，其为低花费、快速、灵活和可自动化的反应。
发明概述
本发明提供/定义了位于一致扩增子(consensus amplicon)内部的人乳头瘤病毒基因组区域(它是一个这样的区域，用与该扩增子侧翼的保守序列结合的引物可扩增该区域)。其中这些基因组区域的特征在于其具有基因型特异的DNA序列，所述基因型特异的DNA序列适用于设计基因型特异的杂交探针。
本发明的另一方面提供/定义了在该一致扩增子中的另外HPV基因组区域，其中这些基因组区域的特征在于其具有HPV属特异的保守DNA序列，所述HPV属特异的保守DNA序列适用于设计属特异的杂交探针。
本发明的一个基本组成部分是在一个一致扩增子中存在2个基因组片段，所述2个基因组片段适用于设计属特异的和基因型特异的杂交探针。
在另一方面，本发明提供了在扩增反应中引物的用途，扩增中可优化DNA序列和其浓度，以及反应循环的条件，用于人乳头瘤病毒基因型的均衡的灵敏性扩增。
本发明提供检测和基因分型人乳头瘤病毒(HPV)的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)从生物样本中分离的核酸分子使用本发明的引物混合物扩增，并且结果产生双链扩增产物，
b1)在严谨条件下，将上述扩增产物与HPV属特异杂交探针或与其混合物杂交，并检测给定情况下HPV一致扩增子的存在；和/或
b2)在严谨条件下，将上述扩增产物与本发明的基因型特异杂交探针混合物杂交，并检测相应的HPV基因型组；和/或
b3)在严谨条件下，将上述扩增产物与本发明的型特异杂交探针或其混合物杂交，并检测和确定给定情况下中存在的HPV基因型。
总之本发明的方法可用于扩增/检测HPV基因型的特定组、采用属特异探针对HPV基因组DNA进行检测、对HPV基因组进行集合的(组的)或个别的基因分型。该方法可用于评估或确定在特定时间发现患者感染的HPV病毒所导致的或相关的后期疾病的风险，并且尤其采用型特异检测。本发明提供的方法适用于在特定群体中筛选HPV的存在，并且也适用于在特定个体中加强、支持或证实细胞学诊断(筛选)。
发明详述
为有助于理解本发明，几个术语定义如下。
术语“核酸”和“寡核苷酸”指探针、引物和其它短DNA、RNA、PNA(肽核酸)以及其它化学寡聚体，其中它们可序列特异地结合于DNA、RNA或PNA模板(靶分子)上。
术语“杂交”指两个核酸序列的序列特异性结合。使用的条件相当程度上决定了杂交的严谨性，因此杂交可在较低严谨性条件下进行，即使核酸并非正好互补。在一些情况下，核酸探针与一组彼此之间相关性较近或较远的序列结合是必要的。熟悉核酸技术领域的技术人员可确定这些条件，如果满足这些条件，则结合适当地是特异的或非特异的。
术语“探针”指一组与互补和部分互补核酸显示序列特异杂交的寡核苷酸。为实施杂交后的步骤，或为改变它们的杂交特性，可修饰寡核苷酸的结构。
术语“型特异性探针”指一组在严谨条件下仅与与它们精确互补的靶区域结合的寡核苷酸。适用于这种需要的杂交条件在本领域已众所周知(见，如Sambrook等，1985，Molecular Cloning Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.USA)。一般地，在规定的离子强度和pH下，严谨条件选择为低于特异序列的解链温度(Tm)约5℃。Tm是在存在适当的互补靶分子时，50％探针是结合状态的温度(在规定的离子强度和pH下)。降低杂交条件的严谨性(例如提高盐浓度或降低温度)将允许与非精确互补序列结合。假如为非精确互补模板，不与模板中的模板核酸结合的核苷酸是“错配核苷酸”。
术语“引物”指在一定条件下可作为DNA合成(启动)起始点的核苷酸，其中在该条件下，与核酸链互补的引物延伸产物的合成在核酸模板上得到诱导，即在四种不同核苷三磷酸和用于聚合的试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下、在适当的缓冲液和适合的温度下。引物优选为单链DNA分子。引物的适当长度一般为15-40个核苷酸。引物不需要反映模板的确切序列，因此，通过改变结合(反应)温度，类似的靶分子组可作为合成(一致扩增子)的模板。为使它可与固相结合以及为了其它目的，具有化学特征的基团可连接至引物寡核苷酸。
本发明中的术语“引物”也指一组连续相关的寡核苷酸，其中该组寡核苷酸可引发某组模板序列(如上所述)。另外，该组的成员由这样的寡核苷酸组成，所述寡核苷酸可与一组给定模板核酸中的一些或所有成员形成错配。但在适当的条件下，这些引物也可参与启动。术语“一致引物(consensus primer)”指可用于引发相关模板核酸的特定区域的引物或引物组。这些区域的特征是，它们的变异性显著低于全部核酸的变异性，即它们是保守的，因此在这些序列上所选择的一致引物可引发模板核酸序列的所有组。一致引物不必要是单一引物，它可是一组引物。
术语“热稳定聚合酶”指在95℃保持相对稳定、并可催化核苷三磷酸聚合以形成与靶序列的一条核酸链互补的引物延伸产物的酶。纯化的热稳定聚合酶在美国专利号4,889,818中进行了描述，此处引用作为参考，并且商业上可从例如Applera获得。
在本发明中，DNA的扩增通过聚合酶链式反应(PCR)实施，已在美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中公开。
本发明研发了优化的PCR条件，用于扩增大量不同的HPV基因型，所述优化为优化引物浓度、引物序列和循环条件。扩增的第一部分用稳定上升的严谨性进行，目标在于：对基因型的扩增(其中对基因型，引物包含多的错配核苷酸)始于与其它基因型相同的扩增效率进行，但随后升高的结合温度使反应有利于所用的较大量引物。当引物的最佳混合存在时，理论上该方法的引物结合序列将移向共有序列，因此对基因型进行均衡的灵敏性扩增是可能的。
虽然聚合酶链式反应是优选的扩增方法，但在任何公知的方法中可使用提及的基因组区域和寡核苷酸。例如，连接酶链式反应(Wu和Wallace1989，Genomics 4：560-569)、TAS扩增系统(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)和自我维持的序列复制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)也可用于靶序列的正确扩增。同样，在Q-β-复制酶系统(Kramer和Lizardi，1989，Nature 339：401-402)中，可扩增序列特异的探针。
在本发明中，引物选自一组或多或少互补的、适于扩增HPV一致扩增子的序列。有效的引发是在存在错配核苷酸时使用精心设计的退火温度和合适的引物浓度进行的。
在本发明的一个优选的实施方案中中，本发明的引物(SEQ.ID.NO：1-40，70-72)与已知引物(SEQ.ID.NO：73-75)以合适的试剂形式使用。这允许检测更多的HPV基因型，至少为47种已知的基因型。从实施例4中可看出，在反应中包括引物SEQ.ID.NO.37，可实施扩增根据本发明的HPV-35基因型。在反应中没有该引物而仅包括已知的引物则不能扩增HPV-35基因型。本发明的另一方面涉及HPV L1基因的型特异引物，其包括SEQ.ID.NO：1-36序列中所述的核苷酸序列之一。
本发明的另一方面涉及这样的引物混合物，其中包括L1C1、L1C2或新L1C2引物以及选自SEQ.ID.NO：1-40，70-72的引物。此外，本发明涉及应用这种引物混合物用于HPV 3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、16、18、20、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、39、39、40、41、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、49、60、61、66、67、68、72、74或77基因型的扩增。
本发明的另一方面涉及采用本发明的引物混合物扩增产生的扩增子，如上面提及，但HPV-6、-11、-16、-18、-31、-33、-42、-52、和-58扩增子除外。
本发明的关键组成部分是在扩增子中属和型特异基因组片段的存在。这些基因组片段可实现杂交和检测的高度特异性。因此，本发明也涉及扩增子的基因组片段，所述片段的特征在于是自扩增子3′末端(3’-5’)从-80bp至-30bp延伸的基因型特异的不同基因组片段。这些基因组片段是长约40bp的双链DNA片段，其序列在SEQ.ID.NO：77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109和111序列中给出。
本发明的另一方面涉及扩增子的另一基因组片段，其自扩增子的3’末端以3′-5′方向从-150bp至-105bp延伸，其特征在于为基因型中高度保守的低复杂序列，显示的是HPV属特异性。这些基因组片段为双链DNA，通常包含23bp，并且它们的上链具有下述序列之一：SEQ.ID.NO：76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110。
在扩增子的杂交检测期间，使用了设计用于上面提及的基因组片段的属或型特异的杂交探针。所述属寡核苷酸探针通常用于检测HPV扩增子(其为扩增的HPV DNA)，而型特异的探针可用于进一步检测个体基因型的分型。上述两种杂交探针可以是DNA、RNA或PNA。
本发明方法中使用的属探针具有类似于一致引物的性能，差别在于其5’末端不是优选的错配核苷酸对的位置。这些属探针可作为杂交探针和引物使用，在本发明中它们用作探针。
因此，本发明涉及包括SEQ.ID.NO：41-49序列中所列出序列之一的属(一致)杂交探针或引物。
在本发明的优选方法中，探针SEQ.ID.NO：41-49作为属探针使用。
在型特异探针的情况下，探针与对应的基因型序列100％互补。在它们的设计中，重要的是排除以下可能性，即是否其它基因型与该探针或其部分显示高水平的互补性。由于在本发明扩增子中的型特异片段长约40bp，可选择重叠探针，这在理论上和实验上都是充分可行的。在实施例5中证明，可设计和使用适当的具有高特异性(与已研究的70个基因型比较)的探针，并且在使用的杂交条件下，即使在室温下它们也保持它们的特异性。因为在同样杂交条件下，探针的杂交是特异的，所以也可使用探针混合物。因此，从实践的观点，可使用较一致的反应条件。因此，本发明涉及型特异探针的序列，其可用于HPV扩增和检测以及基因分型试验，并且包括SEQ.ID.NO：50-67中所列出的序列之一。
虽然本发明涉及杂交的任一实施方案，但在商业上固相杂交是优选的。
此处所称的固相(正向)杂交为将探针结合至固定的靶核酸(扩增子)，而反向杂交为将靶核酸(扩增子)结合至固定的探针。在本方法中，采用不同的洗涤溶液移去未结合的反应产物。在第一种情况下，探针的标记必须适合后期的显示，而在反向形式中标记扩增子。两种系统均可在微量滴定板中实现。由于固定能力有限，在本发明中正向杂交系统是优选的，因为大量的各种探针组成了使用的探针混合物。
在US 6,214,979中描述的方法可同样进行应用，在该方法中，在扩增期间将探针加至反应中。在该进程期间，Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性分解探针，并且检测产生的分解产物可用于检测靶核酸的存在。其它方法有已知的主要是基于杂交的称为实时检测系统，但这些方法仅在它们的实施和检测方法中不同，在理论上序列特异探针-扩增子的结合是相同的。
对于固定，可对扩增子进行标记。从本发明的多种可能性，优选用生物素标记引物，并在扩增反应中使用经标记的引物。当存在吸附于固相的亲和素或链亲和素时，生物素导致扩增子的固定，这是因为亲和素和生物素结合的高特异和稳定性。在给定的反应中，仅与一条或另一条链杂交的引物得到生物素标记，所以在杂交前可移去另一条链。
为了检测目的，可对探针进行标记，其中标记物可用不同的方法检测，例如检测方法可基于荧光、放射性、比色法、X-射线衍射、吸附、磁力、酶活性等。因此，合适的标记物包括但并不限于荧光团、发色团、同位素、电浓缩物质、酶或可形成特异结合的配体。也可使用上面提及的系统组合。在本发明中，优选荧光素与抗荧光素-HRPO抗体的特异结合，所述结合通过在存在HPPA底物和H2O2时进行辣根过氧化物酶氧化反应而检测(见实施例2)。在本发明中，使用生物素标记的正向或反向引物。经标记引物和抗荧光素-HRPO均为商业可获得的。用于洗涤的化学品和多种溶液也一般是可获得的。也可构建或使用利用碱性磷酸酶或任何其它可根据其活性而检测的酶系统。除荧光检测外，发光法和比色法也是可接受的检测方法，这些方法用于本系统医学诊断应用。
在诊断期间包括内对照的本发明方法可识别假阴性反应，并且从诊断学观点来看这是优选的。多种人工或天然DNA可用作内对照。那些不增加反应使用的引物数量、以及内对照的量和分析性能的系统是优选的，靶核酸适合于标准化。在本发明中，如上面提及，在将以重组质粒形式(实施例6)的人工制备的核酸序列(SEQ.ID.NO：68)加至样本。在本发明中，与HPV DNA的杂交检测相平行来实施内对照的检测，并且仅底物的显影是分开的。探针是洋地黄皂苷元标记(SEQ.ID.NO：69)的，并且可采用结合抗洋地黄皂苷元抗体的碱性磷酸酶进行检测。但其他检测技术也适用于检测内部探针。
但使用琼脂糖凝胶电泳或其它合适的技术，也可根据迁移率的差别实施对内对照的检测。
对于HPV DNA的扩增和检测，本发明的方法适于产生试剂的一致单位(试剂盒)。在这种形式中，试剂盒包含所有的下述试剂或任何它们的组合和其它试剂：引物、引物混合物、缓冲液、热稳定聚合酶、阳性对照HPVDNA、非HPV DNA、内对照DNA、探针或探针混合物、抗体-酶结合物。
本发明引物和探针序列的描述是例证性的。许多属和型特异的探针变体可采用属或型特异HPV基因组区域进行设计，因此，对于变体只要它们选自本发明的基因组区域，均在本发明的范围内。
利用下述实施例对本发明进行更详细的阐述。虽然根据本发明的方法应用在任何HPV基因组的扩增，但在下述实施例中仅使用医学上更为重要的生殖器HPV基因组。应当注意到，这些实施例仅是例证性的，并非为限制本发明的范围而构建的。
实施例1
合成寡核苷酸引物
本发明方法使用的寡核苷酸引物是商业来源的(IDT，USA)。合成的引物具有5’氨基。使用NHS-酯用于生物素、荧光素和洋地黄皂苷元标记。标记的核苷酸经HPLC纯化。
实施例2
样本的处理、DNA的制备
妇科专家采用细胞刷取出样本，并转移入PBS溶液(10mM磷酸盐缓冲液pH＝7.4，Sigma，NaCl 138mM、KCl 2.7mM)中。在样本管中对样本进行预处理。在裂解前，离心(2000g，10分钟)样本，弃上清，并加入1ml PBS溶液，涡旋，再次离心，弃上清。在处理的最后，向样本中加入250μL裂解液(0.5mg/ml蛋白酶K、0.01M TRIS-HCl pH＝8、0.001M EDTA pH＝8，溶于蒸馏水中)，其中包含HPV试验的内对照(SEQ.ID.NO：68)，涡旋，在56℃孵育30分钟。此后在TECAN RSP150遥控仪器上进行进一步的液体处理：加入200μL结合液(5.5M GUSCN、20mM EDTA、10mM TRIS-HClpH＝6.5、65mM二硫苏糖醇、40克/升二氧化硅，SIGMA Cat.No.：28，851-3、蒸馏水)，并通过柱过滤从可溶组分中分离二氧化硅。再次过滤，用200μl无二氧化硅的结合液(5.5M GUSCN、20mM EDTA、10mMTRIS-HCl pH＝6.5、65mM二硫苏糖醇、蒸馏水)洗涤二氧化硅2次，并再次使用200μl洗涤液洗涤2次(25％异丙醇、25％96％乙醇、50％蒸馏水、0.1M NaCl)，最后采用200μl 96％乙醇。风干二氧化硅后，用200μl 10mMTRIS溶液pH＝8.0洗脱DNA。洗脱的DNA冷冻储存于-20℃，直至进一步使用。
实施例3
HPV检测的概述
扩增
总反应体积是25μl，包括下述组分：10μl DNA、2.5μl 10×聚合酶缓冲液(终浓度：10mM TRIS-HCl(pH＝9.0)、50mM KCl、0.1％TritonX-100(Promega)、2mM MgCl2)、每种dNTP(ATP、CTP、GTP、TTP)250μM、4μM引物混合物：SEQ.ID.NO：35、37-40、73-75和1U Taq DNA聚合酶(Promega)。反应在GeneAmp 9700 PCR热循环仪上进行，参数如下：
循环1：95℃ 4分钟；
循环2-40：94℃ 30秒，48℃ 1分钟和72℃ 45秒；
循环41：72℃ 3分钟。
杂交和检测
在固相上进行杂交。24小时前，用链亲和素(0.02mg/ml链亲和素，溶于PBS溶液中)包被96孔聚苯乙烯板(Costar)。在室温孵育板，并且在24小时后用250μl洗涤液(25 mM TRIS pH＝7.5、125mM NaCl、20mM MgCl2、3％Tween-20)洗涤板2次。将上面提及的PCR反应的20μl产物用140μl蒸馏水稀释，从该溶液中取5μl与45μl结合缓冲液(25mM TRIS pH＝7.5、125mM NaCl、5mM EDTA-Na2、5×Denhardt溶液、0.1％Tween-20)混合，并加入链亲和素包被板的孔中。在振摇下于室温孵育30分钟。然后将50μl洗脱缓冲液(100mM NaOH、300mM NaCl)加至混合物中，在室温再孵育3分钟，并且用250μl洗涤液(25mM TRIS pH＝7.5、125mMNaCl、20mM MgCl2、3％Tween-20)洗涤板3次。洗涤后，加入50μl杂交缓冲液(5×SSC(0.3 M柠檬酸钠pH＝7、3M NaCl)、1×Denhardt溶液、0.1％SDS)，其中含荧光素标记的探针(每种探针5nM)。混合物在50℃、持续摇动下孵育30分钟，并用250μl高严谨性洗涤液(0.05×SSC、0.3％Tween-20)洗涤6次。此后，向反应中加入50μl结合缓冲液(25mM TRISpH＝7.5、125mM NaCl、2mM MgCl2、0.3％Tween-20、1％BSA)，其中含抗荧光素-POD(Roche)抗体(0.0015 E/反应)。板在室温孵育30分钟，持续摇动，并用250μl高严谨性洗涤液(0.05×SSC、0.3％Tween-20)洗涤6次。用135μl底物溶液显色(5体积[45mM羟基苯基丙酸(HPPA)，溶于0.1M TRIS-HCl pH＝9.0]+1体积[0.6克/升H2O2，溶于20mM柠檬酸-磷酸缓冲液])。孵育20分钟后，向反应混合物中加入65μl终止液[0.75M甘氨酸，pH＝10.3]。荧光信号采用SpectraMax板荧光计在324/410nm下测量。如果样本值是3个平行阴性对照样本平均值的3倍以上，样本认定为阳性。
实施例4
扩增的比较研究
将含有来自不同基因型的经克隆HPV L1区的质粒作为样本，并且将它们应用在反应(10ng/反应)中，使用本发明方法扩增并检测HPV DNA。根据实施例3的描述实施PCR反应和杂交，不同之处在于引物的组成改变。无L1F2(SEQ.ID.NO：37)的反应不会导致基因型HPV35的扩增，而使用L1F2引物导致基因型HPV35的有效检测。
实施例5
几种HPV基因型的检测
将含有来自不同基因型的经克隆HPV L1区的质粒作为样本，并且将它们应用在反应(10ng/反应)中，使用本发明方法扩增并检测HPV DNA。根据实施例3的描述实施PCR反应和杂交。用制备的包含克隆HPV L1区的质粒尝试对下述HPV基因型的扩增和分型：1-24、26-42、45、47-68、72-74、76-77和86。采用琼脂糖凝胶电泳证明下述基因型的扩增：3、6-7、10-11、13-14、16、18、20、24、26、29、30-36、39-40、42、45、51、52-55、58-62、66-68和72。使用SEQ.ID.NO：41-49属特异杂交探针混合物(使用实施例3所述的条件)可检测到下述基因型：3-4、6-7、9-14、16、18、20、24、26、29、30-37、39-42、45、51、52-55、58-62、66-68、72、74和77。数据显示，部分基因型仅可通过杂交检测，这不令人惊讶，因为杂交的灵敏性是琼脂糖凝胶电泳的10-100倍。也可从数据看出，属特异杂交检测了所有琼脂糖凝胶电泳阳性基因型，表明它确实是属特异的。
实施例6
检测HPV-35型
将含有来自不同基因型的经克隆HPV L1区的质粒作为样本，并且将它们应用在反应(10ng/反应)中，使用本发明方法扩增并检测HPV DNA。根据实施例3的描述实施PCR反应和杂交。杂交探针是为基因型HPV35设计的寡核苷酸(SEQ.ID.NO：58)。尝试对下列基因型的扩增子进行检测：3-4、6-7、9-14、16、18、20、24、26、29、30-37、39-42、45、51、52-55、58-62、66-68、72、74、77。该探针仅检测对应的HPV35基因型扩增子。
实施例7
采用内对照检测HPV
根据实施例3，对实施例2制备的样本进行检测，不同之处在于除型特异探针和抗荧光素POD以及抗洋地黄皂苷元-ALP(1∶2000，JacksonImmuno Research)抗体外，在结合步骤中同时存在采用洋地黄皂苷元(其量与型特异探针的量相同)标记的内对照探针。POD反应(见实施例2)显影后，按照如下实施ALP显影：底物溶液是用100mM TRIS pH＝9.0、0.5mM MgCl2缓冲液配制的6.25mg/100ml 4-甲基-7-羟基香豆素(umbelliferil)-磷酸。HPPA显影后，微量滴定板用(25mM TRIS pH＝7.5、125mM NaCl、20mM MgCl2、3％Tween-20)洗涤一次，将150μl底物溶液加至每个反应孔。孵育30分钟后，采用SpectraMax板荧光计在355/460nm下测量荧光信号。如果样本值是3个平行阴性对照样本平均值的3倍以上，认定样本为阳性。
型特异探针可检测足够型别。除了HPV扩增和内对照之间存在强竞争的情况外，在每一反应中对内对照的检测为阳性。没有被抑制的反应(HPV DNA或内对照DNA在所有样本中扩增)。内对照充分排除了假阴性结果的可能性。
序列表
<110>类基因有限责任公司
<120>检测和分型人乳头瘤病毒的扩增-杂交方法
<130>P36945WO
<140>PCT/HU03/00020
<141>2003-03-10
<150>HU P0200981
<151>2002-03-14
<160>120
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CF6)
<400>1
cgtaaacgta ttcccttatt tttt 24
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>2
caatacaggg tatttaaggt g 21
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>3
cgtaaacgta ttcccttatt tttta 25
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>4
caatatagag tgtttagggt a 21
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<212>DNA
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<212>DNA
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<211>21
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caatataggg tttttaagat g 21
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<211>24
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<213>人工序列
<220>
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<400>9
cgtaaacgtt taccatattt tttt 24
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<211>21
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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cgtaaacgtg tatcatattt tttt 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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caatataggg tatttagggt t 21
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<212>DNA
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<211>21
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<213>人工序列
<220>
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<400>16
caatataggg tttttagggt c 21
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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cgtaaagcta tcccatattt tttt 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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caatacagag tatttagagta 21
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<213>人工序列
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<211>21
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<213>人工序列
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caatataggg tatttcgcgt g 21
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CR45)
<400>22
cagtataggg tgtttagagt a 21
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CF51)
<400>23
cgtaaacgta taccctattt tttt 24
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CR51)
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caatacaggg tatttagggt a 21
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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gcgtaaacgt tttccatatt ttttt 25
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<211>21
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caatacaggg tatttagaat t 21
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<211>25
<212>DNA
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<220>
<223>PCR引物(L1CF56)
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<211>22
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<213>人工序列
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<223>PCR引物(L1CR56)
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CF58)
<400>29
acgtaaacgt tttccatatt ttttt 25
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CR58)
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<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CF59)
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>PCR引物(L1CR59)
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caatacagag tatttagggt t 21
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>PCR引物(L1CF66)
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ccgtaaacgt attccctatt ttttt 25
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CR66)
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CF68)
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1CR68)
<400>36
caatacagag tgtttagggt t 21
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1F2)
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1F3)
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1F4)
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1R2)
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK1)
<400>41
cgcaccaaca tattttatta tgg 23
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK2)
<400>42
cgcacaagca tctattatta tgc 23
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK3)
<400>43
cgcacaagca tattttatca tgc 23
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK4)
<400>44
cgcaccagta tattttatca tgc 23
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK5)
<400>45
cgcacaagca tttactatca tgc 23
<210>46
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK6)
<400>46
cgcaccaact acttttacca tgc 23
<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK7)
<400>47
cgtaccagta ttttctacca cgc 23
<210>48
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK8)
<400>48
cgcacaggca tatattacta tgc 23
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>属特异的杂交探针(PK9)
<400>49
cgcaccaaca tatattatca tgc 23
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-6型特异的杂交探针(P6)
<400>50
ttttgttagc ccgttttatg 20
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-11型特异的杂交探针(P11)
<400>51
acaactgttt ttgttaactt ttt 23
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-42型特异的杂交探针(P42)
<400>52
tgtcttattt ggcctttttg 20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-44型特异的杂交探针(P44)
<400>53
gtcttgtttg ctggtcgtat 20
<210>54
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-16型特异的杂交探针(P16)
<400>54
ctaatatttt gttattgtta ggttt 25
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-18型特异的杂交探针(P18)
<400>55
tatcctgctt attgccacc 19
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-31型特异的杂交探针(P31)
<400>56
ggattgtcag atttaggtatgg 22
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-33型特异的杂交探针(P33)
<400>57
tttttagcgt tagtaggatt ttt 23
<210>58
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-35型特异的杂交探针(P35)
<400>58
tgctatttta ttagaatctt gtttt 25
<210>59
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-39型特异的杂交探针(P39)
<400>59
accaccattc atacccact 19
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-45型特异的杂交探针(P45)
<400>60
acctgcacca ttaggtacaa 20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-51型特异的杂交探针(P51)
<400>61
gcgttgaggt tttaggtatt 20
<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-52型特异的杂交探针(P52)
<400>62
caattaccac tactggtgtt t 21
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-56型特异的杂交探针(P56)
<400>63
tgtttgtttt ggtattgtcc t 21
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-58型特异的杂交探针(P58)
<400>64
gttattggga cttttgatgg 20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-59型特异的杂交探针(P59)
<400>65
tcctgtctac cattaccacc 20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-66型特异的杂交探针(P66)
<400>66
ttggtaccag atttggaaac 20
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HPV-68型特异的杂交探针(P68)
<400>67
cccagacata ggaaccttaa 20
<210>68
<211>198
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内对照寡核苷酸分子
<400>68
cgtaaacgtt ttccctattt ttttagtcaa tgagacgggt aatgacgata cagtatgacg 60
atagagtaga tagatagaga tagataccca tatacagata atgacataga tccccataga 120
cagtttatac agatcagtag cagtttttat atatgagatg atgataggac acaccagcaa 180
tatagggtat ttagggta 198
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内对照扩增子特异的杂交探针(IC-P1)
<400>69
tgacatagat ccccatagac a 21
<210>70
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1F5)
<400>70
cgtaaacgta ttccctattt tttt 24
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1F6)
<400>71
cgtaaacgtt ttccatattt tttt 24
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1R3)
<400>72
cagtacagag tttttagagt g 21
<210>73
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1C1)
<400>73
cgtaaacgtt ttccctattt tttt 24
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(L1C2)
<400>74
caatacagag tatttagggt a 21
<210>75
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(new L1C2)
<400>75
caatataggg tatttagggt a 21
<210>76
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒6型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-6扩增子的属特异探针结合位点
<400>76
cgcaccaaca tattttatca tgc 23
<210>77
<211>39
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒6型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-6扩增子的型特异探针结合位点
<400>77
ccttattttt ccataaaacg ggctaacaaa actgttgtg 39
<210>78
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒11型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-11扩增子的属特异探针结合位点
<400>78
cgcaccaaca tattttatca tgc 23
<210>79
<211>39
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒11型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-11扩增子的型特异探针结合位点
<400>79
ccatattact ctatcaaaaa agttaacaaa acagttgta 39
<210>80
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒42型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-42扩增子的属特异探针结合位点
<400>80
cgcaccaact acttttacca tgc 23
<210>81
<211>42
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒42型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-42扩增子的型特异探针结合位点
<400>81
ccttattact ctattacaaa aagccaaata agacatctat cc 42
<210>82
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒44型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-44扩增子的属特异探针结合位点
<400>82
cgcaccaaca tatattaccatgc 23
<210>83
<211>39
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒44型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-44扩增子的型特异探针结合位点
<400>83
ccttattttg ccatacgacc agcaaacaag acacttgtg 39
<210>84
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒16型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-16扩增子的属特异探针结合位点
<400>84
cgcacaaaca tatattatca tgc 23
<210>85
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒16型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-16扩增子的型特异探针结合位点
<400>85
ttttcctatt aaaaaaccta acaataacaa aatattagtt 40
<210>86
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒18型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-18扩增子的属特异探针结合位点
<400>86
cccacaagca tattttatca tgc 23
<210>87
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒18型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-18扩增子的型特异探针结合位点
<400>87
attttagggt tcctgcaggt ggtggcaata agcaggatat t 41
<210>88
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒31型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-31扩增子的属特异探针结合位点
<400>88
cgaaccaaca tatattatca cgc 23
<210>89
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒31型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-31扩增子的型特异探针结合位点
<400>89
ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta 40
<210>90
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒33型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-33扩增子的属特异探针结合位点
<400>90
cgcacaagca tttattatta tgc 23
<210>91
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒33型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-33扩增子的型特异探针结合位点
<400>91
ttctattaaa aatcctacta acgctaaaaa attattggta 40
<210>92
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒35型
<220>
<221>misc_feature
<223>：HPV-35扩增子的属特异探针结合位点
<400>92
cgcacaaaca tctactatca tgc 23
<210>93
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒35型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-35扩增子的型特异探针结合位点
<400>93
ctatgctatt aaaaaacaag attctaataa aatagcagta 40
<210>94
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒39型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-39扩增子的属特异探针结合位点
<400>94
cgcacaggca tatattatta tgc 23
<210>95
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒39型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-39扩增子的型特异探针结合位点
<400>95
attttaaagt gggtatgaat ggtggtcgca agcaggacat t 41
<210>96
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒45型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-45扩增子的属特异探针结合位点
<400>96
cgcacaagca tattttatca tgc 23
<210>97
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒45型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-45扩增子的型特异探针结合位点
<400>97
tagggttgta cctaatggtg caggtaataa acaggctgtt 40
<210>98
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒51型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-51扩增子的属特异探针结合位点
<400>98
cgcaccggca tatattacta tgc 23
<210>99
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒51型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-51扩增子的型特异探针结合位点
<400>99
ctattttcca atacctaaaa cctcaacgcg tgctgctatt 40
<210>100
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒52型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-52扩增子的属特异探针结合位点
<400>100
cgcacaagca tctattatta tgc 23
<210>101
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒52型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-52扩增子的型特异探针结合位点
<400>101
taaaaacacc agtagtggta atggtaaaaa agttttagtt c 41
<210>102
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒56型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-56扩增子的属特异探针结合位点
<400>102
cgcactagta tattttatca tgc 23
<210>103
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒56型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-56扩增子的型特异探针结合位点
<400>103
ctattactct gtgactaagg acaataccaa aacaaacatt c 41
<210>104
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒58型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-58扩增子的属特异探针结合位点
<400>104
cgcacaagca tttattatta tgc 23
<210>105
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒58型
<220>
<221>misc_faature
<223>HPV-58扩增子的型特异探针结合位点
<400>105
ttccatcaaa agtcccaata acaataaaaa agtattagtt c 41
<210>106
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒59型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-59扩增子的属特异探针结合位点
<400>106
cgtaccagta ttttctacca cgc 23
<210>107
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒59型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-59扩增子的型特异探针结合位点
<400>107
ttttaaagta cctaaaggtg gtaatggtag acaggatgtt c 41
<210>108
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒66型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-66扩增子的属特异探针结合位点
<400>108
cgtaccagta tattttatca tgc 23
<210>109
<211>41
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒66型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-66扩增子的型特异探针结合位点
<400>109
ttattactct gtttccaaat ctggtaccaa aacaaacatc c 41
<210>110
<211>23
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒68型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-68扩增子的属特异探针结合位点
<400>110
cgcactggca tgtattacta tgc 23
<210>111
<211>40
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒68型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-68扩增子的型特异探针结合位点
<400>111
ttttaaggtt cctatgtctg ggggccgcaa gcagggcatt 40
<210>112
<211>244
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒44型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-44扩增子
<400>112
cgtaaacgtg tttccttgtt ttttgcagat gtggcggcct agtgaaaacc aggtatatgt 60
gcctcctccc gccccagtat ccaaagtaat acctacggat gcctatgtca aacgcaccaa 120
catatattac catgctagca gttctagact tcttgctgtg ggcaaccctt attttgccat 180
acgaccagca aacaagacac ttgtgcctaa ggtttcggga tttcaatata gggtttttaa 240
gatg 244
<210>113
<211>253
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒35型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-35扩增子
<400>113
cgtaaagcta tcccatattt ttttgcagat gtctctgtgg cggtctaacg aagccactgt 60
ctacctgcct ccagtgtcag tgtctaaggt tgttagcact gatgaatatg taacacgcac 120
aaacatctac tatcatgcag gcagttctag gctattagct gtgggtcacc catactatgc 180
tattaaaaaa caagattcta ataaaatagc agtacccaag gtatctggtt tgcaatacag 240
agtatttaga gta 253
<210>114
<211>253
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒39型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-39扩增子
<400>114
cgtaaacgta ttccctattt tttttcagat ggctatgtgg cggtctagtg acagcatggt 60
gtatttgcct ccaccttctg tggcgaaggt tgtcaatact gatgattatg ttacacgcac 120
aggcatatat tattatgctg gcagctctag attattaaca gtaggacatc catattttaa 180
agtgggtatg aatggtggtc gcaagcagga cattccaaag gtgtctgcat atcaatatag 240
ggtatttcgc gtg 253
<210>115
<211>256
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒45型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-45扩增子
<400>115
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggctttgtgg cggcctagtg acagtacggt 60
atatcttcca ccaccttctg tggccagagt tgtcagcact gatgattatg tgtctcgcac 120
aagcatattt tatcatgcag gcagttcccg attattaact gtaggcaatc catattttag 180
ggttgtacct aatggtgcag gtaataaaca ggctgttcct aaggtatccg catatcagta 240
tagggtgttt agagta 256
<210>116
<211>250
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒51型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-51扩增子
<400>116
cgtaaacgta taccctattt ttttacagat ggcattgtgg cgcactaatg acagcaaggt 60
gtatttgcca cctgcacctg tgtctcgaat tgtgaataca gaagaatata tcacacgcac 120
cggcatatat tactatgcag gcagttccag actaataaca ttaggacatc cctattttcc 180
aatacctaaa acctcaacgc gtgctgctat tcctaaagta tctgcatttc aatacagggt 240
atttagggta 250
<210>117
<211>250
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒56型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-56扩增子
<400>117
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggcgacgtgg cggcctagtg aaaataaggt 60
gtatctacct ccaacacctg tttcaaaggt tgtggcaacg gattcctatg taaaacgcac 120
tagtatattt tatcatgcag gcagttcacg attgcttgcc gtaggacatc cctattactc 180
tgtgactaag gacaatacca aaacaaacat tcccaaagtt agtgcatatc aatatagggt 240
atttagggta 250
<210>118
<211>253
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒59型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-59扩增子
<400>118
ctgaaactgg ttccctattt ttttacagat ggctctatgg cgttctagtg acaacaaggt 60
gtatctacct ccaccttcgg tagctaaggt tgtcagcact gatgagtatg tcacccgtac 120
cagtattttc taccacgcag gcagttccag acttcttaca gttggacatc catattttaa 180
agtacctaaa ggtggtaatg gtagacagga tgttcctaag gtgtctgcat atcaatacag 240
agtatttagg gtt 253
<210>119
<211>250
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒66型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-66扩增子
<400>119
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggcgatgtgg cggcctagtg acaataaggt 60
gtacctacct ccaacacctg tttcaaaggt tgtggcaacg gatacatatg taaaacgtac 120
cagtatattt tatcatgcag gtagctctag gttgcttgct gttggccatc cttattactc 180
tgtttccaaa tctggtacca aaacaaacat ccctaaagtt agtgcatatc agtatagagt 240
gtttagggta 250
<210>120
<211>253
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒68型
<220>
<221>misc_feature
<223>HPV-68扩增子
<400>120
cgtaaacacc ttccttattt ttttacagat ggcattgtgg cgagctagcg acaacatggt 60
gtatttgcct cccccctcag tggcgaaggt tgtcaataca gatgattatg tgacacgcac 120
tggcatgtat tactatgctg gtacatctag gttattaact gtaggccatc catattttaa 180
ggttcctatg tctgggggcc gcaagcaggg cattcctaag gtgtctgcat atcaatacag 240
agtgtttagg gtt 253
Claims (20)
1.人乳头瘤病毒(HPV)L1基因的一致引物，其中所述引物由下述核苷酸序列之一组成：SEQ.ID.NO：37-40或SEQ.ID.NO：70-72。
2.人乳头瘤病毒(HPV)L1基因的型特异引物，其中所述引物由下述核苷酸序列之一组成：SEQ.ID.NO：1-36。
3.扩增用引物混合物，其中所述混合物由一条或多条以下引物组成：SEQ.ID.NO：37-40、70-72和/或SEQ.ID.NO：1-36以及L1C1、L1C2或新L1C2引物。
4.权利要求3的引物混合物的用途，用于扩增人乳头瘤病毒的基因型3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、16、18、20、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、66、67、68、72、74或77。
5.使用权利要求3的引物混合物通过扩增可制备的扩增子，其中HPV-6、-11、-1 6、-18、-31、-33、-42、-52和-58型的扩增子除外。
6.根据权利要求5的扩增子，其核苷酸序列包括SEQ.ID.NO：112-120序列之一。
7.基因型3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、16、18、20、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、66、67、68、72、74或77的扩增子的基因组区域，其是使用权利要求3的引物混合物通过扩增可制备的扩增子的特征片段，该特征片段自扩增子的3′末端从-80bp延伸至-30bp，以及每一HPV基因型的不同特征性片段。
8.权利要求7的基因组区域，其具有以下所列出的序列之一：SEQ.ID.NO：77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109和111。
9.使用权利要求3的引物混合物通过扩增可制备的扩增子的基因组片段，其自扩增子的3′末端从-150bp至-105bp延伸，HPV的一致片段。
10.权利要求9的基因组片段，其具有以下所列出的序列之一：SEQ.ID.NO：76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110。
11.杂交探针，其是HPV基因型特异的，并与权利要求8的序列之一互补。
12.如权利要求11所述的杂交探针，其具有以下所列出的序列之一：SEQ.ID.NO：50-67。
13.杂交探针或引物，其是HPV一致探针或引物，并与权利要求10的序列之一互补。
14.如权利要求13所述的杂交探针，其具有以下所列出的序列之一：SEQ.ID.NO：41-49。
15.如权利要求11或13的杂交探针，其是DNA、RNA或PNA。
16.从生物样本中检测多种HPV基因型的方法，其包括以下步骤：
a)使用权利要求3的引物混合物，对从生物样本中提取的核酸分子进行扩增而制备一种或多种扩增子；和
b1)在严谨条件下与权利要求14的探针杂交，或与其混合物杂交，并检测在给定情况下存在的HPV基因型；和/或
b2)在严谨条件下与权利要求12的探针混合物杂交，并分离和检测HPV基因型组；和/或
b3)在严谨条件下与权利要求12的探针杂交，并检测和分型在给定情况下存在的HPV基因型。
17.如权利要求16所述的方法，其包括检测低和高风险HPV基因型组。
18.权利要求16或17的方法，其还包括检测作为内对照的合成寡核苷酸。
19.权利要求18的方法，其中SEQ.ID.NO：68序列用作内对照，并且将SEQ.ID.NO：69作为杂交探针用于检测。
20.检测和分型HPV的试剂盒，其包括：
i)权利要求1、2或3的引物；
ii)任选地内对照引物；
iii)权利要求12或14的杂交探针；
iv)任选地检测内对照的杂交探针；以及
v)常规的扩增和杂交试剂。
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