PL209415B1 - Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV - Google Patents

Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV

Info

Publication number
PL209415B1
PL209415B1 PL371806A PL37180603A PL209415B1 PL 209415 B1 PL209415 B1 PL 209415B1 PL 371806 A PL371806 A PL 371806A PL 37180603 A PL37180603 A PL 37180603A PL 209415 B1 PL209415 B1 PL 209415B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hpv
seq
probe
specific
dna
Prior art date
Application number
PL371806A
Other languages
English (en)
Other versions
PL371806A1 (pl
Inventor
Csaba Jeney
Tibor Takács
Original Assignee
Genoid Kft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genoid Kft filed Critical Genoid Kft
Publication of PL371806A1 publication Critical patent/PL371806A1/pl
Publication of PL209415B1 publication Critical patent/PL209415B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

Description

Przedmiotem wynalazku jest mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania jednego lub większej liczby genotypów HPV w próbkach biologicznych i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV.
Ustalono wiele sekwencji wirusa brodawczaka, patrz publikacje przytoczone tu jako pozycje literaturowe: HPV-6: de Villiers i in., J. Virology, 40 (1981); HPV-11: Dartmann i in., Virology 151, 124-130 (1986); HPV-16: Seedorf i in., Virology 145, 181-185 (1985); HPV-18: Cole i Danos, Journal of Molecular Biology 93, 599-608 (1987); HPV-31: Goldsborough i in., Virology 171, 306-311 (1989); HPV-33:
Cole i Streeck, J. Virology, 58, 991-995 (1986); HPV-54: Favre i in., J. Cancer 45, 40-46 (1990); HPV-56: Lorincz, J. Gen. Virol. 70, 3099 (1989).
Wykrywanie i typowanie HPV opisano w kilku publikacjach, przy czym oprócz metody Southerna i innych technik hybrydyzacyjnych, najszerzej stosowanymi technikami są metody oparte na PCR, gdyż te metody równocześnie zapewniają wysoką czułość, specyficzność i elastyczność testu, co zapewnia większą kontrolę spełniania wymagań analitycznych.
Ludzki wirus brodawczaka, członek rodziny Papillomaviridae, jest onkogennym wirusem DNA, o kolistym genomie wielkości 8000 pz. Wirus wykazuje silny tropizm nabłonkowy i proliferuje tylko w zróżnicowanych komórkach nabłonka. Wirus brodawczaka jest podejrzewany o odgrywanie roli etiologicznej w wielu różnych chorobach ludzi, np. różnych chorobach skóry, czyli w brodawkach, kłykcinie kończystej i nowotworach skóry oraz innych stanach, takich jak rak szyjki macicy, raki odbytowo-płciowe, rak krtani. Istnieją dowody, że ludzki wirus brodawczaka wykazuje silną korelację z występowaniem tych nowotworów i jest to nawet prawdziwe w przypadku zmian przedrakowych (CIN, VIN, VAIN, PIN, PAIN). HPV można wykryć u 99% pacjentek z rakiem szyjki macicy. Ta ścisła zależność statystyczna jest prawdopodobnie wywołana przyczynową rolą HPV w tworzeniu raka szyjki macicy. Na podstawie danych epidemiologicznych, pacjentki zakażone różnymi genotypami HPV nie mają takiego samego poziomu ryzyka rozwinięcia raka szyjki macicy. Zgodnie z tymi odkryciami genotypy sklasyfikowano na klasy niskiego ryzyka, średniego ryzyka i wysokiego ryzyka, a oprócz nich istnieją także niesklasyfikowane genotypy. Ze względu na to, że ryzyko różni się w dużym stopniu i częstość zakażenia HPV jest bardzo wysoka, określenie genotypu ma duże znaczenie.
Wirus HPV nie może być hodowany. Diagnoza serologiczna zakażenia HPV jest ograniczona do wykrycia wystawienia na działanie wirusa (zakażenia w przeszłości lub obecnie), ale nie jest w stanie dokładnie zdefiniować genotypu, a jej rola jest głównie ograniczona do badań epidemiologicznych.
W przypadku wirusów brodawczaka nie istnieje dokładna klasyfikacja serologiczna (serotypowanie) i genotypowanie jest powszechnie zaakceptowaną metodą klasyfikacji. Można je podzielić na dwie grupy, zależnie od tego czy wykrycie jest poprzedzane przez amplifikację, czy nie. W jednej postaci tej ostatniej metody stosuje się sondy pełnej długości genomowego RNA do wykrycia genomów HPV w zdenaturowanych DNA, a heterodupleks wykrywa się za pomocą specyficznych przeciwciał (Hybrid Capture-Digene). Zgodnie z inną metodą, do wykrywania i genotypowania genotypów HPV stosuje się metodę Southerna. Te metody są niekorzystne gdyż są stosunkowo nieczułe i częściowo niespecyficzne. W przypadku metody Hybrid Capture wiele publikacji opisuje różne reakcje krzyżowe, powodujące fałszywe dodatnie wyniki w warunkach klinicznych. Autorzy opisali, że reakcje krzyżowe były akceptowalne tylko przy kontrolnym odcięciu wysokiego stężenia DNA (1 ng/ml), co podkreśla niepożądane sprzężenie pomiędzy czułością a specyficznością.
W przypadku metod amplifikacji ten problem nie istnieje, gdyż reakcję odpowiedzialną za czułość (amplifikację) prowadzi się osobno.
Ogólnie techniki amplifikacji różnią się pod względem wybranego amplifikowanego segmentu genomu, liczby starterów i zastosowanej techniki wykrywania. Najczęściej stosowanymi starterami są
GP5+ - GP6+, MY9-MY11 oraz różne reakcje PCR specyficzne dla typu.
Najczęściej stosowanymi technikami wykrywania są hybrydyzacja specyficzna dla sekwencji, polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) i test z sondą liniową (LiPA, ang. line probe assay). Oprócz tych testów wykorzystuje się także, ale rzadziej, sekwencjonowanie amplikonów i rozkład tymidyny w wyniku wbudowania dUTP.
Charakterystyka analityczna technik amplifikacji różni się w szerokim zakresie. Metody można scharakteryzować uwzględniając amplifikowane genotypy, czułość analityczną amplifikacji genotypu oraz specyficzność i wiarygodność wykrywania. Pod tym względem układ zdegenerowanych starterów
MY9-MY11 uważa się za reakcję odniesienia. W przypadku układu MY9-MY11 istnieje system wykryPL 209 415 B1 wania przez hybrydyzację LiPA (Innogenetics). Główną wadą układu MY9-MY11 jest to, że trudno jest kontrolować syntezę zdegenerowanych starterów, toteż względny stosunek rodzajów starterów wytworzonych w syntezie zmienia się z syntezy na syntezę, co może powodować nieprzewidywalne zmiany w analitycznym przebiegu reakcji PCR; po drugie reakcja ta moż e zamplifikować najmniejszą liczbę typów w porównaniu z innymi szeroko stosowanymi reakcjami. Dobrze wiadomo z literatury, że układ może zamplifikować genotyp 51 tylko w tym przypadku, gdy startery specyficzne dla genotypu 51 HPV zostaną dodane do reakcji. Przy zastosowaniu syntezy zdegenerowanych starterów względny stosunek rodzajów starterów nie może być zmieniony i nie jest możliwe dopasowanie stosunku starterów, aby osiągnąć lepszą sprawność analityczną i zrównoważoną amplifikację genotypów.
Reakcja GP5+ - GP6+ rozwiązuje ten problem tylko dzięki użyciu dwóch par starannie dobranych starterów - optymalizowanych dla sekwencji płciowych HPV - układy dwóch starterów są łatwe w obsłudze, jednak elastyczność układu jest niższa. Układ GP5+ - GP6+ może amplifikować wiele znanych genotypów HPV, ale cechy analityczne układu nie są optymalne (czułość nie jest zrównoważona dla różnych genotypów), a podejście z użyciem dwóch starterów jest ograniczone pod względem optymalizacji, np. zrównoważenie czułości wykrywania dla poszczególnych genotypów jest bardzo problematyczne (za wyjątkiem ograniczonej optymalizacji temperatury topnienia i stężenia MgCl2). Trudno jest dostosować układ GP5+ - GP6+ do amplifikacji innych genotypów, co w każdym przypadku wpłynie na jego przyszłe stosowanie, gdyż stale pojawia się potrzeba wykrywania nowych genotypów. Identyfikacja genotypów nie jest prawidłowo rozwiązana.
Inną szeroko znaną metodą amplifikacji specyficzną dla genotypu jest metoda L1C: układ dwustarterowy, w dwóch wersjach, w jednej stosuje się (ze starterem LC1) starter L1C2 lub nowy L1C2, do amplifikacji kolejnych genotypów. Szczegółowy opis amplikonu L1C można znaleźć w literaturze [Jpn. J. Cancer Research 82, 524-531 (1991)].
Zasadniczo dwa kryteria muszą zostać spełnione w przypadku wykrywania sposobami postamplifikacyjnymi: możliwość zastosowania w rutynowej diagnostyce (łatwość, koszty, czas) oraz wymaganie odpowiedniego poziomu zdolności rozróżniania. Znacząca liczba metod nie jest odpowiednia w odniesieniu do zdolnoś ci rozróż niania. Zatem zastosowanie RFLP jest ograniczone, ponieważ ze względu na krótkie amplifikowane regiony liczba diagnostycznych miejsc restrykcyjnych nie jest wystarczająca, a zatem często genotypy można sklasyfikować tylko na grupy. W innym przykładzie, w technice SSCP trudno jest odnieść zł oż one wzory SSCP do genotypów, a ponadto pewność tej reakcji nie jest zadowalająca.
Zdolność rozróżniania jest szczególnie ważna z punktu widzenia diagnostyki, aby spełniać wymagania ustawodawców. Pod względem prostoty i zdolności rozróżniania sekwencjonowanie jest idealnym rozwiązaniem, gdyż zostało ono zautomatyzowane i można w ten sposób wykryć wiele genotypów (lub nawet ich podtypów), jeżeli próbka nie stanowi mieszaniny genotypów. Jednak w praktyce nie jest ono szeroko stosowane, gdyż jest drogie i czasochłonne, jego stosowanie w rutynowych laboratoriach diagnostycznych jest nie do zaakceptowania, a w przypadku mieszanych próbek nie można określić żadnego z genotypów.
Zaletą metod hybrydyzacyjnych jest możliwość łatwego zmieniania ich zdolności rozróżniania lub ostrości warunków, gdyż kilka parametrów reakcji może się różnić w szerokim zakresie oraz pewne rozwiązania można łatwo zautomatyzować, reakcja jest mniej kosztowna, a w przypadku równoległego wprowadzania (dla niektórych postaci) nawet wymagany czas nie jest znaczący.
Zatem, istnieje potrzeba opracowania nowego sposobu amplifikacji/wykrywania HPV, który eliminowałaby wady obecnych metod oraz był tani, łatwy do powtórzenia i zautomatyzowania. Wynalazek umożliwia przeprowadzenie testu polegającego na amplifikacji i hybrydyzacji, w którym startery stanowią niezależnie zsyntetyzowane cząsteczki tak, że ich względny stosunek można łatwo kontrolować i optymalizować, a amplifikacja ma zrównoważoną czułość. Reakcje hybrydyzacji prowadzi się w dużym stopniu w podobny sposób spełniający kryterium taniej, szybkiej, elastycznej i dającej się zautomatyzować reakcji.
Obecnie opracowano ulepszony sposób wykrywania i genotypowania ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV). Zdefiniowano regiony genomowe HPV, które są odpowiednie do projektowania sond oligonukleotydowych specyficznych dla rodzaju HPV i specyficznych dla genotypu HPV oraz dogodnie znajdują się blisko siebie oraz w jednym amplikonie. Ujawniono sekwencje sond specyficznych dla rodzaju i specyficznych dla genotypu. Opracowano również zoptymalizowany zestaw preparatu odczynników oraz sposób, odpowiednie do amplifikacji i wykrywania poszerzonego zestawu genotypów HPV („zestawu”).
PL 209 415 B1
Wynalazek dotyczy mieszaniny starterów do amplifikacji, zawierającej startery L1C1, L1C2, nowy L1C2 o SEQ ID NO: 73-75, SEQ ID NO: 37-40 i SEQ ID NO: 35 oraz ewentualnie co najmniej jeden starter wybrany z grupy obejmującej startery SEQ ID NO: 70-72 oraz SEQ ID NO: 1-34 i 36.
Wynalazek dotyczy także zastosowania mieszaniny starterów zdefiniowanej powyżej do amplifikacji genotypów 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 i 77 ludzkiego wirusa brodawczaka.
Wynalazek dotyczy również sposobu wykrywania jednego lub większej liczby genotypów HPV w próbkach biologicznych, obejmuj ą cego etapy, w których:
a) przygotowuje się jeden lub większą liczbę amplikonów z użyciem mieszaniny starterów zdefiniowanej w zastrz. 1, z cząsteczek kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z próbki biologicznej; oraz b1) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą do hybrydyzacji specyficzną dla rodzaju genotypu; oraz ewentualnie b2) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą specyficzną dla rodzaju HPV.
Korzystnie, sondę specyficzną dla rodzaju HPV stanowi:
i) konsensusowa sonda lub starter dla HPV hybrydyzujący z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80,
82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110;
ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 41-49.
Korzystnie, sondę do hybrydyzacji specyficzną dla genotypu stanowi:
i) sonda specyficzna dla genotypu HPV hybrydyzująca z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83,
85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111;
ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 50-57.
Korzystnie, sposobem wykrywa się grupy genotypów HPV niskiego i wysokiego ryzyka. Korzystnie, sposób obejmuje ponadto wykrywanie syntetycznego oligonukleotydu jako wzorca wewnętrznego.
Korzystnie, jako wzorzec wewnętrzny stosuje się sekwencję SEQ ID NO: 68, a do jej wykrywania stosuje się SEQ ID NO: 69 jako sondę do hybrydyzacji.
Wynalazek dotyczy ponadto zestawu odczynników do wykrywania i typowania HPV zawierającego:
i) mieszaninę starterów zdefiniowaną w zastrz. 1;
ii) ewentualnie oligonukleotyd jako wzorzec wewnętrzny, korzystnie o SEQ ID NO: 68;
iii) sondy do hybrydyzacji zawierające lub hybrydyzujące z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81,
83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111 oraz ewentualnie z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110; oraz iv) ewentualnie sondy do hybrydyzacji, korzystnie o SEQ ID NO: 69, wykrywające wzorzec wewnętrzny.
W niniejszym opisie ujawniono regiony genomowe ludzkiego wirusa brodawczaka, które znajdują się w konsensusowym amplikonie (czyli w regionie, który można amplifikować przy użyciu starterów wiążących się z konserwowanymi sekwencjami flankującymi amplikon), przy czym te regiony genomowe charakteryzują się tym, że zawierają sekwencję DNA specyficzną dla genotypu, która jest przydatna do projektowania sond do hybrydyzacji specyficznych dla genotypu.
W opisie ujawniono takż e inny region genomowy HPV w tym amplikonie konsensusowym, przy czym te regiony genomowe charakteryzują się tym, że zawierają konserwowaną sekwencję DNA, specyficzną dla rodzaju HPV, która jest przydatna do projektowania sond do hybrydyzacji specyficznych dla rodzaju.
Zasadniczym elementem rozwiązania według wynalazku jest obecność dwóch segmentów genomowych wewnątrz jednego konsensusowego amplikonu, który jest odpowiedni do zaprojektowania sond do hybrydyzacji specyficznych dla rodzaju oraz genotypu.
Ogólnie, sposób według wynalazku można stosować do amplifikacji/wykrycia danej grupy genotypów HPV, co prowadzi do wykrycia genomowego DNA HPV za pomocą sond specyficznych względem rodzaju oraz zbiorowego (grupowego) lub indywidualnego genotypowania genomów HPV. Sposób ten można stosować do określenia ryzyka lub ustalenia tych osobników, u których istnieje ryzyko
PL 209 415 B1 wystąpienia późniejszych stanów lub chorób, wywołanych przez wirusy HPV lub związanych z wirusami HPV znalezionymi u pacjentów, w danym momencie, a w szczególności z ich wykryciem specyficznym względem typu. Sposób według wynalazku jest także odpowiedni do przesiewowego zbadania danej populacji pod względem obecności HPV, a także wzmocnienia, wsparcia lub potwierdzenia diagnozy cytologicznej u danego osobnika (badanie przesiewowe).
Aby ułatwić lepsze zrozumienie wynalazku poniżej zdefiniowano kilka określeń.
Określenia „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” dotyczą sond, starterów i innych krótkich DNA, RNA, PNA (peptydowy kwas nukleinowy) oraz innych oligomerów chemicznych, które są zdolne do specyficznego względem sekwencji wiązania matrycy (cząsteczki docelowej) DNA, RNA lub PNA.
Określenie „hybrydyzacja” dotyczy specyficznego względem sekwencji wiązania dwóch sekwencji kwasu nukleinowego. Stosowane warunki w znacznym stopniu determinują ostrość hybrydyzacji, tak więc hybrydyzacja może zachodzić w mniej ostrych warunkach, nawet jeżeli kwasy nukleinowe nie są dokładnie komplementarne. W niektórych przypadkach konieczne może być, aby sonda kwasu nukleinowego wiązała się z grupą sekwencji, które są bliżej lub dalej ze sobą spokrewnione. Fachowcy w dziedzinie technologii kwasów nukleinowych mogą określić warunki, przy spełnieniu których wiązanie będzie wystarczająco specyficzne lub aspecyficzne.
Określenie „sonda” dotyczy zestawu oligonukleotydów, które wykazują hybrydyzację specyficzną względem sekwencji w obecności komplementarnych lub częściowo komplementarnych kwasów nukleinowych. Strukturę oligonukleotydów można zmodyfikować, aby umożliwić zajście etapów występujących po hybrydyzacji lub zmienić ich właściwości hybrydyzacyjne.
Określenie „sonda specyficzna względem typu” dotyczy zestawu oligonukleotydów, które w ostrych warunkach wiążą się tylko z docelowym regionem, który jest do nich dokładnie komplementarny. Warunki hybrydyzacji odpowiednie do spełnienia tego wymogu są dobrze znane (patrz np. Sambrook i in., 1985, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. USA). Ogólnie, ostre warunki wybiera się jako temperaturę o około 5°C niższą niż temperatura topnienia (Tm) specyficznej sekwencji przy określonej sile jonowej i wartości pH. Tm jest temperaturą (przy określonej sile jonowej i pH), w której 50% sondy jest związane w obecności odpowiedniej komplementarnej cząsteczki docelowej. Złagodzenie ostrości warunków hybrydyzacji (np. zwiększenie stężenia soli lub obniżenie temperatury) pozwoli na związanie się niedokładnie komplementarnych sekwencji. W przypadku niedokładnie komplementarnej matrycy, nukleotydy, które nie mogą związać się z matrycowym kwasem nukleinowym w matrycy są „niedopasowanymi nukleotydami”.
Określenie „starter” dotyczy nukleotydów, które mogą działać jako punkt inicjacji syntezy DNA (startu) w warunkach, w których synteza produktu wydłużania startera komplementarnego do nici kwasu nukleinowego jest indukowana na matrycy kwasu nukleinowego, czyli w obecności czterech różnych trifosforanów nukleozydów i środka polimeryzującego (czyli polimerazy DNA lub odwrotnej transkryptazy) w odpowiednim buforze i w odpowiedniej temperaturze. Starterem jest korzystnie jednoniciowa cząsteczka DNA. Odpowiednia długość startera zazwyczaj wynosi 15-40 nukleotydów. Starter nie musi odzwierciedlać dokładnej sekwencji matrycy, a zatem przez zmianę temperatury wiązania (reakcji) grupa podobnych cząsteczek docelowych może służyć za matrycę dla syntezy (konsensusowy amplikon). Grupy chemiczne o pewnych korzystnych cechach można zastosować do znakowania oligonukleotydu startera, aby umożliwić jego wiązanie z fazą stała lub w innych celach.
Określenie „starter” w niniejszym opisie dotyczy także grupy sekwencyjnie pokrewnych oligonukleotydów, przy czym grupa oligonukleotydów jest w stanie zainicjować syntezę (jak to opisano powyżej) na pewnej grupie sekwencji matrycowych. Ponadto, członkowie grupy mogą obejmować oligonukleotydy, które mogą tworzyć niedopasowania z niektórymi lub wszystkimi członkami danego zestawu matrycowych kwasów nukleinowych. Jednakże, w odpowiednich warunkach te startery mogą także uczestniczyć w inicjowaniu syntezy. Określenie „startery konsensusowe” dotyczy startera lub grupy starterów, które można stosować do zainicjowania syntezy pewnych regionów pokrewnych matrycowych kwasów nukleinowych. Cechą charakterystyczną tych regionów jest to, że ich zmienność jest znacznie niższa niż zmienność całego kwasu nukleinowego, czyli są one konserwowane, a zatem na tych sekwencjach wybrane startery konsensusowe mogą inicjować syntezę dla całej grupy sekwencji matrycowych kwasów nukleinowych. Starter konsensusowy nie musi być pojedynczym starterem, może stanowić grupę starterów.
Określenie „termostabilny enzym polimeraza” dotyczy enzymu, który jest stosunkowo stabilny w 95°C i katalizuje polimeryzację trifosforanów nukleozydów z wytworzeniem produktów wydłuż ania startera, które są komplementarne do jednej z nici kwasu nukleinowego sekwencji docelowej. Oczysz6
PL 209 415 B1 czony termostabilny enzym polimeraza opisano w opisie patentowym US nr 4 889 818, który przytacza się tu jako pozycję literaturową i jest on dostępny w handlu np. z Applera.
Zgodnie z wynalazkiem, amplifikację DNA prowadzi się drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ujawnionej w opisach patentowych US nr 4 683 195, 4 683 202 i 4 965 188.
Zgodnie z wynalazkiem, opracowano zoptymalizowane warunki PCR dla celów amplifikacji większej liczby różnych genotypów HPV z optymalizacją stężeń starterów, sekwencji starterów i warunków cykli temperaturowych. W pierwszej części amplifikacji zachodzi amplifikacja przy stale rosnącej ostrości, w tym celu, że amplifikacja genotypów, dla których startery zawierają więcej niedopasowanych nukleotydów, może zacząć następować z taką samą wydajnością jak w przypadku innych genotypów, ale później wzrastająca temperatura wiązania przesuwa reakcję w kierunku wykorzystywania tych starterów, które występują w większych ilościach. Przy zoptymalizowanej mieszaninie starterów ten proces teoretycznie będzie przesuwać wiązanie starterów do sekwencji w kierunku sekwencji konsensusowej, w ten sposób stwarzając możliwość amplifikacji genotypów ze zrównoważoną czułością.
Choć reakcja łańcuchowa polimerazy jest korzystną metodą amplifikacji, wspomniane regiony genomowe i oligonukleotydy można stosować w jakiejkolwiek znanej metodzie. Przykładowo, reakcja łańcuchowa ligazy (Wu i Wallace 1989, Genomics 4: 560-569), układ amplifikacji TAS (Kwoh i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177) oraz samopodtrzymująca się replikacja sekwencji (Guatelli i in., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878) mogą być także odpowiednie do prawidłowej amplifikacji docelowej sekwencji. Podobnie, w układzie z Q-e-replikazą (Kramer i Lizardi, 1989, Nature 339: 401-402) można amplifikować sondy specyficzne względem sekwencji.
Zgodnie z wynalazkiem, startery wybiera się z grupy w większym lub mniejszym stopniu komplementarnych sekwencji odpowiednich do amplifikacji konsensusowych amplikonów HPV. Skuteczne inicjowanie syntezy osiąga się w obecności niedopasowanego nukleotydu stosując dokładnie dobraną temperaturę hybrydyzacji i względne stężenia starterów.
W korzystnej postaci wynalazku, startery według wynalazku (SEQ ID NO: 1-40, 70-72) stosuje się ze znanymi starterami (SEQ ID NO: 73-75) w postaci odpowiednich odczynników. Umożliwia to wykrycie poszerzonego zestawu genotypów HPV, przynajmniej 47 znanych genotypów. Z przykładu 4 wynika, że amplifikację genotypu HPV-35 zgodnie z wynalazkiem można przeprowadzić włączając do reakcji starter o SEQ ID NO: 37. Bez tego startera i w obecności w reakcji tylko znanych starterów, genotyp HPV-35 nie jest amplifikowany. Inna postać wynalazku dotyczy starterów specyficznych względem typu dla genu HPV L1, które obejmują sekwencje nukleotydów opisane w sekwencjach SEQ ID NO: 1-36.
W innej postaci wynalazek dotyczy mieszaniny starterów obejmującej startery L1C1, L1C2 lub nowy L1C2 i startery wybrane z SEQ ID NO: 1-40, 70-72. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania takiej mieszaniny starterów do amplifikacji genotypów HPV 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20,
24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 lub 77.
W wyniku amplifikacji z użyciem wspomnianej mieszaniny starterów według wynalazku wytwarzane są amplikony. Zasadniczym elementem rozwiązania według wynalazku jest obecność w amplikonach segmentów genomowych specyficznych dla rodzaju i dla typu. Te segmenty genomowe umożliwiają realizację wysoce specyficznej hybrydyzacji i wykrywania. Charakteryzują się one genotypowo-specyficznym, zmiennym wydłużeniem segmentu genomowego na 3'-końcu amplikonu (w kierunku 3'-5') od -80 pz do -30 pz. Te segmenty genomowe o długości około 40 pz, są dwuniciowymi sekwencjami DNA, przedstawionymi w sekwencjach SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111.
Wykrywanie umożliwia także obecność innego segmentu genomowego amplikonów, rozciągającego się od 3'-końca amplikonu (w kierunku 3'-5') od -150 pz do -105 pz i charakteryzującego się mało złożonymi, wysoce konserwowanymi pomiędzy genotypami sekwencjami, które wykazują specyficzność względem rodzaju HPV. Te segmenty genomowe są dwuniciowym DNA, zazwyczaj zawierają 23 pz, a ich górna nić ma następujące sekwencje: SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.
Podczas hybrydyzacyjnego wykrywania amplikonów stosuje się sondy rodzajowe lub specyficzne dla typu, zaprojektowane dla wyżej wspomnianych segmentów genomowych. Rodzajowe sondy oligonukleotydowe mają ogólne zastosowanie do wykrywania amplikonu HPV, czyli zamplifikowanego DNA HPV, podczas gdy sondy specyficzne dla typu można stosować do dalszego ich typowania, czyli
PL 209 415 B1 wykrywania poszczególnych genotypów. Obydwie sondy hybrydyzacyjne mogą mieć naturę DNA, RNA lub PNA.
Sondy rodzajowe stosowane w sposobie według wynalazku mają podobne właściwości do konsensusowych starterów, z tą różnicą, że 5'-koniec nie jest preferowany jako pozycja źle dopasowanej pary nukleotydów. W wynalazku stosuje się je jako sondy, przy czym te sondy rodzajowe można stosować zarówno jako sondy hybrydyzacyjne, jak i startery.
Rodzajowymi (konsensusowymi) sondami hybrydyzacyjnymi lub starterami są oligonukleotydy, które zawierają jedną z sekwencji wymienionych w sekwencjach SEQ ID NO: 41-49
W korzystnym sposobie według wynalazku jako sondy rodzajowe stosuje się następujące sondy: SEQ ID NO: 41-49.
W przypadku sond specyficznych dla typu, sondy są w 100% komplementarne do sekwencji odpowiadającego genotypu. Podczas ich projektowania ważne jest wykluczenie możliwości, że inne genotypy wykazują wysoki stopień komplementarności z sondą lub jej częścią. Ponieważ segment specyficzny dla typu ma długość około 40 pz w amplikonach według wynalazku, możliwe jest wybranie nawet nachodzących na siebie sekwencji sond, które są najbardziej odpowiednie zarówno teoretycznie, jak i doświadczalnie.
W przykładzie 5 wykazano, że moż na zaprojektować i stosować odpowiednie sondy, które mają wysoką specyficzność (w porównaniu z badanymi 70 genotypami) i zachowują swoją specyficzność nawet przy stosowaniu hybrydyzacji w warunkach temperatury pokojowej. Ponieważ hybrydyzacja sond jest dogodnie specyficzna w identycznych warunkach hybrydyzacji, można stosować mieszaninę sond. Zatem z praktycznego punktu widzenia można stosować bardziej równomierne warunki reakcji. Tak więc, w celu realizacji wynalazku ujawniono sekwencje sond specyficznych dla typu, które można stosować w amplifikacji oraz testach wykrywania i genotypowania HPV, przy czym obejmują one sekwencje podane w SEQ ID NO: 50-67.
Chociaż wynalazek dotyczy dowolnej postaci hybrydyzacji, w warunkach przemysłowych korzystna jest hybrydyzacja na fazie stałej.
W tak zwanej hybrydyzacji na fazie stałej (do przodu) wiąże się sondy z unieruchomionym docelowym kwasem nukleinowym (amplikonem), podczas gdy w odwrotnej hybrydyzacji wiąże się docelowy kwas nukleinowy (amplikon) z unieruchomionymi sondami. W tym procesie niezwiązane produkty reakcji usuwa się za pomocą różnych roztworów przemywających. W pierwszym przypadku sonda musi być odpowiednio znakowania do dalszego wywołania, podczas gdy w postaci odwrotnej znakowany jest amplikon. Obydwa sposoby można realizować na płytkach do mikromianowania. Ponieważ zdolność do unieruchomienia jest ograniczona, w przypadku wynalazku sposób hybrydyzacji do przodu jest korzystny, ze względu na stosowanie dużej liczby poszczególnych sond tworzących mieszaninę sond.
Przydatny może być także sposób opisany w opisie patentowym US nr 6 214 979, w którym sondy dodaje się do reakcji podczas amplifikacji. Podczas procesu aktywność 5'-3' egoznu - kleazowa polimeraza Taq powoduje rozkład sond i wykrywanie wytworzonych produktów rozkładu można zastosować do wykrycia obecności docelowego kwasu nukleinowego. Jednakże, znane są także inne, w większości przypadków oparte na hybrydyzacji, tak zwane systemy detekcji w czasie rzeczywistym, ale różnią się one tylko sposobem realizacji i detekcji, ale nie teoretycznie inną realizacją specyficznego dla sekwencji wiązania sonda-amplikon.
W celu unieruchomienia amplikony mogą być znakowane. Z różnych możliwości w przypadku wynalazku korzystne jest znakowanie starterów biotyną i wykorzystanie znakowanego startera w reakcjach amplifikacji. W obecności awidyny lub streptawidyny zaadsorbowanych na fazie stałej, biotyna powoduje unieruchomienie amplikonu, w wyniku wysoce specyficznego i bardzo stabilnego wiązania awidyna-biotyna. W danej reakcji tylko startery hybrydyzujące do jednej lub drugiej nici są biotynylowane tak, że drugą nić można usunąć przed hybrydyzacją.
Dla celów wykrywania sondy mogą być znakowane, przy czym znaczniki można wykrywać różnymi metodami, np. metodami detekcji opartymi na fluorescencji, radioaktywności, kolorymetrii, dyfrakcji rentgenowskiej, absorpcji, magnetyzmie, aktywności enzymatycznej, itd. Zatem, odpowiednie znakowanie może obejmować, ale nie jest ograniczone do następujących: fluorofory, chromofory, izotopy, substancje o dużej gęstości elektronowej, enzymy lub ligandy zdolne do tworzenia specyficznego wiązania. Można także stosować połączenia tych wyżej wspomnianych metod.
Można stosować specyficzne wiązanie fluoresceiny z przeciwciałem przeciw fluoresceinieHRPO, które jest wykrywane w reakcji utlenienia przez peroksydazę chrzanową w obecności substra8
PL 209 415 B1 tu HPPA i H2O2 (patrz przykład 2). Można również stosować biotynylowane startery do przodu lub do tyłu. Zarówno znakowane sondy, jak i przeciwciało przeciw fluoresceinie-HRPO są dostępne w handlu. Odczynniki chemiczne potrzebne do przemywania i różne roztwory są także ogólnie dostępne. Można także wytworzyć lub zastosować układ wykorzystujący fosfatazę alkaliczną lub jakikolwiek inny enzym, którego aktywność może być wykryta. Ponadto dopuszczalnymi metodami detekcji do stosowania w diagnostyce medycznej są także luminometria z detekcją fluorescencji lub kolorymetria.
Włączenie wzorca wewnętrznego podczas diagnostycznego stosowania sposobu według wynalazku umożliwia rozpoznanie fałszywych negatywnych reakcji i jest korzystne z diagnostycznego punktu widzenia. Różne DNA pochodzenia sztucznego i naturalnego można stosować jako wzorzec wewnętrzny.
Korzystne są te układy, które nie zwiększają liczby starterów stosowanych w reakcji, a ilość i wł a ś ciwoś ci analityczne docelowego kwasu nukleinowego jako wzorca wewnę trznego są dogodnie znormalizowane. Zgodnie z wynalazkiem sztuczną sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 68) dodaje się do próbki w postaci rekombinowanego plazmidu (przykład 6).
Zgodnie z wynalazkiem wykrywanie wzorca wewnętrznego prowadzi się równolegle z hybrydyzacyjnym wykrywaniem DNA HPV i tylko wywołanie substratów jest rozdzielone. Sonda jest znakowana digitoksygeniną (SEQ ID NO: 69) i wykrywana za pomocą przeciwciała przeciw digitoksygeninie sprzężonego z fosfatazą alkaliczną.
Jednak, inne metody wykrywania są także odpowiednie do wykrywania wewnętrznej sondy.
Jednak, wykrywanie wzorca wewnętrznego można także przeprowadzić na podstawie różnic w ruchliwoś ci stosują c elektroforezę w ż elu agarozowym lub inne odpowiednie metody.
W przypadku amplifikacji i wykrywania DNA HPV sposób wedł ug wynalazku jest odpowiedni do otrzymania zharmonizowanej jednostki odczynników (zestawu). W tej postaci zestaw może zawierać wszystkie następujące odczynniki lub dowolne ich połączenie oraz inne odczynniki: startery, mieszaninę starterów, bufory, termostabilną polimerazę, DNA HPV jako pozytywną kontrolę, DNA nie-HPV, DNA jako wzorzec wewnętrzny, sondy lub mieszaninę sond, koniugat przeciwciało-enzym.
Opis sekwencji starterów i sond według wynalazku jest jedynie przykładowy. Fachowiec może zaprojektować wiele wariantów sond rodzajowych, jak i specyficznych dla typu, z wykorzystaniem rodzajowego lub specyficznego dla typu regionu genomowego HPV, a zatem zakresem wynalazku są objęte warianty, pod warunkiem, że są wybrane z regionu genomowego ujawnionego w opisie.
Wynalazek przedstawiono bardziej szczegółowo w poniższych przykładach ilustrujących wynalazek. Jakkolwiek sposób, który stanowi podstawę wynalazku, jest przydatny do amplifikacji jakiegokolwiek genomu HPV, w poniższych przykładach zastosowano tylko genomy płciowych HPV, które mają większe znaczenie medyczne.
P r z y k ł a d 1. Synteza starterów oligonukleotydowych
Startery oligonukleotydowe stosowane w sposobie według wynalazku otrzymano ze źródła handlowego (IDT, USA). Startery zsyntetyzowano z 5'-grupą aminową. NHS-ester zastosowano do znakowania biotyną, fluoresceiną i digitoksygeniną. Znakowane nukleotydy oczyszczono metodą HPLC.
P r z y k ł a d 2. Obróbka próbek, preparowanie DNA
Próbki pobrane przez ginekologów za pomocą szczoteczki typu Cytobrush transportowano w roztworze PBS (10 mM sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH = 7,4, Sigma, NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM). Wstępną obróbkę próbek wykonywano w probówkach testowych: przed lizą próbki odwirowano (2000 g, 10 minut), supernatanty odrzucono i dodano 1 ml roztworu PBS, zwirowano w aparacie vortex i ponownie odwirowano odrzucając supernatrant. Na koniec, do próbek dodano 250 μΐ roztworu lizującego (0,5 mg/ml proteinazy-K, 0,01 M TRIS-HCl pH = 8, 0,001 M EDTA pH = 8, w wodzie destylowanej), przy czym roztwór ten zawierał wzorzec wewnętrzny dla testu HPV (SEQ ID NO: 68), roztwór zwirowano w aparacie vortex i inkubowano przez 30 minut w 56°C. Od tego momentu wszystkie operacje na próbkach w stanie ciekłym wykonywano w robocie TECAN RSP150,: dodano 200 μl roztworu wiążącego (5,5 M GUSCN, 20 mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl pH = 6,5, 65 mM ditiotreitol, g/l krzemionki, SIGMA nr katalogowy: 28,851-3, woda destylowana) i krzemionkę oddzielono przez filtrację próżniową od rozpuszczalnych składników.
Ponownie przeprowadzono filtrację dla dwukrotnego przemycia krzemionki 200 μl roztworu wiążącego bez krzemionki (5,5 M GUSCN, 20 mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl pH = 6,5, 65 mM ditiotreitol, woda destylowana) oraz dwukrotnie użyto 200 μl roztworu przemywającego (25% alkohol izopropylowy, 25% 96% etanolu, 50% wody destylowanej, 0,1M NaCl), ostatecznie użyto 200 μl 96% etanolu.
PL 209 415 B1
Po wysuszeniu krzemionki na powietrzu DNA wyeluowano 200 μl roztworu 10 mM TRIS pH = 8,0. Wyeluowany DNA przechowywano w stanie zamrożonym w -20°C do dalszego stosowania.
P r z y k ł a d 3. Ogólny opis wykrywania HPV
Amplifikacja
Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 25 pl, przy czym zawierała ona następujące składniki: 10 pl DNA, 2,5 pl 10 x buforu do polimerazy (końcowe stężenie: 10 mM TRIS-HCl (pH = 9,0), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100 (Promega)), 2 mM MgCl2, 250 pM każdy dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP), 4 pM mieszanina starterów: SEQ ID NO: 35, 37-40, 73-75 i 1U polimerazy DNA Taq (Promega). Reakcję przeprowadzono w termocyklerze GeneAmp 9700 PCR przy następujących parametrach: cykl 1: 4 minuty w 95°C; cykle 2-40: 30 s w 94°C, 1 minuta w 48°C i 45 s w 72°C; cykl 41: 3 minuty w 72°C.
Hybrydyzacja i wykrywanie
Hybrydyzację przeprowadzono na fazie stałej. 24 godziny wcześniej, czarne, 96-studzienkowe płytki polistyrenowe (Costar) powleczono streptawidyną (0,02 mg/ml streptawidyny w roztworze PBS). Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej i w 24 godziny później płytki przemyto 250 pl roztworu przemywającego [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3% Tween-20]. 20 pl produktu reakcji PCR rozcieńczono 140 pl wody destylowanej i 5 pl tego roztworu zmieszano z 45 pl buforu do wiązania [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM EDTA-Na2, 5 x roztwór Denhardta, 0,1% Tween-20] i rozdzielono do studzienek płytki powleczonej streptawidyną.
Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut w trakcie stałego wytrząsania. Następnie do mieszaniny dodano 50 pl buforu wymywającego [100 mM NaOH, 300 mM NaCl], inkubowano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i płytki przemyto trzykrotnie 250 pl roztworu przemywającego [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3% Tween-20]. Po przemyciu do studzienek dodano 50 pl buforu do hybrydyzacji (5 x SSC (0,3M cytrynian Na, pH = 7, 3 M NaCl), 1 x roztwór Denhardta, 0,1% SDS], zawierającego sondy znakowane fluoresceiną (5 nM na sondę).
Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w 50°C w trakcie stałego wytrząsania i przemyto sześciokrotnie 250 pl roztworu przemywającego o wysokiej ostrości [0,05 x SSC, 0,3% Tween-20]. Następnie, dodano 50 pl buforu do sprzęgania [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,3% Tween-20, 1% BSA] zawierającego przeciwciało anty-Fluorescence-POD (Roche) (0,0015 E/reakcję).
Płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w trakcie stałego wytrząsania i przemyto sześciokrotnie 250 pl roztworu przemywającego o wysokiej ostrości [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3% Tween-20]. W celu wywołania dodano 135 pl roztworu substratu (5 objętości [45 mM kwas hydroksyfenylopropionowy (HPPA), rozpuszczony w 0,1M buforze TRIS-HCl pH = 9,0] + 1 objętość [0,6 g/litr H2O2 w 20 mM buforze cytrynianowo-fosforanowym]).
Aby przerwać reakcję po 20 minutach do mieszaniny reakcyjnej dodano 65 pl roztworu stop [0,75M glicyna, pH = 10,3]. Sygnał fluorescencji zmierzono za pomocą fluorymetru do płytek SpectraMax przy 324/410 nm. Próbki uważano za pozytywne, gdy ich wartość była wyższa niż trzykrotność wartości średniej z trzech równoległych negatywnych próbek kontrolnych.
P r z y k ł a d 4. Badanie porównawcze amplifikacji
Do próbek dodano 10 ng/reakcję plazmidów zawierających sklonowany region HPV L1 z różnych genotypów i stosowano do amplifikacji i wykrywania DNA HPV sposobem według wynalazku. Reakcję PCR i hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 3, z tym, że zmieniono skład starterów. Reakcja bez L1F2 (SEQ ID NO: 37) nie spowodowała amplifikacji genotypu HPV 35, podczas gdy starter L1F2 zapewniał skuteczne wykrycie genotypu HPV 35.
P r z y k ł a d 5. Wykrywanie kilku genotypów HPV
Do próbek dodano 10 ng/reakcję plazmidów zawierających sklonowany region HPV L1 z różnych genotypów i stosowano do amplifikacji i wykrywania DNA HPV sposobem według wynalazku. Reakcję PCR i hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 3.
Wykonano próby amplifikacji i typowania następujących genotypów HPV: 1-24, 26-42, 45, 47-68, 72-74, 76-77, 86. Amplifikację następujących genotypów wykazano metodą elektroforezy w żelu agarozowym: 3, 6-7, 10-11, 13-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-36, 39-40, 42, 45, 51, 52-55, 58-62, 6668, 72. Przy użyciu mieszaniny sond hybrydyzacyjnych specyficznych względem rodzaju SEQ ID NO: 41-49 (w warunkach opisanych w przykładzie 3) można było wykryć następujące genotypy: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77.
Dane wykazują, że część genotypów może być tylko wykryta przez hybrydyzację, co nie jest zaskakujące, gdyż hybrydyzacja jest około 10-100 razy bardziej czuła niż elektroforeza w żelu agaro10
PL 209 415 B1 zowym. Z danych tych wynika także, że hybrydyzacja specyficzna dla rodzaju umożliwia wykrycie wszystkich genotypów pozytywnych w elektroforezie w żelu agarozowym, co wskazuje na jej rzeczywiście specyficzną dla rodzaju naturę.
P r z y k ł a d 6. Wykrywanie typu HPV-35
Do próbek dodano 10 ng/reakcję plazmidów zawierających sklonowany region HPV L1 z różnych genotypów i stosowano do amplifikacji i wykrycia DNA HPV sposobem według wynalazku. Reakcje PCR i hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 3. Sondę do hybrydyzacji stanowił oligonukleotyd zaprojektowany dla genotypu HPV 35 (SEQ ID NO: 58). Przeprowadzono próby wykrycia następujących amplikonów: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Sonda wykrywała tylko amplikon odpowiadający genotypowi HPV 35.
P r z y k ł a d 7. Wykrywanie HPV z wzorcem wewnętrznym
Wykrywanie dla próbek przygotowanych zgodnie z przykładem 2 przeprowadzono zgodnie z przykładem 3, z tym, ż e sondę wzorca wewnętrznego znakowaną digitoksygeniną (jej ilość była taka sama jak sond specyficznych dla typu) zastosowano z sondami specyficznymi dla typu, a w etapie sprzęgania były równocześnie obecne przeciwciała przeciw fluoresceinie-POD i przeciw alp-ALP [1: 2000, Jackson Immuno Research].
Po wywołaniu reakcji POD (patrz przykład 2), przeprowadzono wywołanie ALP w następujący sposób: roztwór substratu zawierał 6,25 mg/100 ml fosforanu 4-metyloumbeliferylu w buforze 100 mM i TRIS pH = 9,0, 0,5 mM MgCl2.
Po wywołaniu HPPA płytkę do mikromianowania przemyto jednorazowo [25 mM TRIS pH = 7,5,
125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3% Tween-20] i do każdej studzienki reakcyjnej dodano 150 μΐ roztworu substratu.
Po 30 minutach inkubacji sygnał fluorescencji zmierzono za pomocą fluorymetru do płytek SpectraMax przy 355/460 nm. Próbki uznano za pozytywne, gdy ich wartość była wyższa niż trzykrotność wartości średniej z trzech równoległych negatywnych próbek kontrolnych.
Sondy specyficzne dla typów wykryły tylko odpowiednie typy. Wykrywanie kontroli wewnętrznej było pozytywne w każdej reakcji, za wyjątkiem tych reakcji, w których wystąpiło silne współzawodnictwo pomiędzy amplifikacją HPV a kontrolą wewnętrzną. Nie było zahamowanych reakcji (DNA HPV lub DNA kontroli wewnętrznej zamplifikował się we wszystkich próbkach). Kontrola wewnętrzna odpowiednio wykluczyła możliwość wyników fałszywych negatywnych.
PL 209 415 B1
<210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR (L.1CR11)
PL 209 415 B1
PL 209 415 B1
<211> <212> <213> 21 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR (L1CR16)
<400> 10
caatacaggg tatttagaat a
<210> <211> <212> <213> 11 25 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR (L1CF1B)
<400> 11
cgtaaacgtg ttccctattt ttttg 25
<210> <211> <212> <213> 12 21 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR (L1CR18)
<400> 12
caatatagag tatttagggt g 21
<210> <211> 13 24
<212> <213> DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR (L1CF31)
<400> 13
cgtaaacgtg tatcatattt tttt 24
<210> <211> <212> <213> 14 21 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR (L1CR31)
<400> 14
caatataggg tatttagggt t 21 <210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Starter PCR (L1CF33)
PL 209 415 B1
PL 209 415 B1
<210> 26 <211> 21 <212> DNA
PL 209 415 B1
PL 209 415 B1
PL 209 415 B1
<210> 42 <211> 23
PL 209 415 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK2) <400> 42 cgcacaagca tctattatta tgc <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK3) <400> 43 cgcacaagca tattttatca tgc <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK4) <400> 44 cgcaccagta tattttatca tgc <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK5) <400> 45 cgcacaagca tttactatca tgc <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK6) <400> 46 cgcaccaact acttttacca tgc
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
PL 209 415 B1 <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK7) <400> 47 cgtaccagta ttttctacca cgc <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK8) <400> 48 cgcacaggca tatattacta tgc <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem rodzaju (PK9) <400> 49 cgcaccaaca tatattatca tgc <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-S (P6) <400> 50 ttttgttagc ccgttttatg <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-11 (Pil) <400> 51 acaactgttt ttgttaactt ttt <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-42 (P42) <400> 52 tgtcttattt ggcctttttg
PL 209 415 B1 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-44 (P44)
<400> 53
gtcttgtttg ctggtcgtat 20
<210> 54
<211> 25
<212> □NA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-1S (P15)
<400> 54
ctaatatttt gttattgtta ggttt 25
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-18 (P18)
<400> 55
tatcctgctt attgccacc 19
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-31 (P31)
<400> 55
ggattgtcag atttaggtat gg 22
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-33 (P33)
<400> 57 tttttagcgt tagtaggatt ttt 23 .-9 ι η.. R fi
PL 209 415 B1 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-35 (P35)
<400> 58
tgctatttta ttagaatctt gtttt 25
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-39 (P39)
<400> 59
accaccattc atacccact 19
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-45 (P45)
<400> 60
acctgcacca ttaggtacaa 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-51 (P51)
<400> 61
gcgttgaggt tttaggtatt 20
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-52 (P52)
<400> 62 caattaccac tactggtgtt t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 209 415 B1 <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-56 (P56) <400> 63 tgtttgtttt ggtattgtcc t <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-58 (ΡΞ8) <400> 64 gttattggga cttttgatgg <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-59 (P59) <400> 65 tcctgtctac cattaccacc <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-66 (P66) <400> 66 ttggtaccag atttggaaac <210> 67 <211> 20 <21?> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> sonda hybrydyzacyjna specyficzna względem HPV-68 (P68) <400> 67 cccagacata ggaaccttaa <210> 68 <211> 198 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Cząsteczka oligonukleotydu wewnętrznej kontroli <400> 68
PL 209 415 B1
cgtaaacgtt ttccctattt ttttagtcaa tgagacgggt aatgacgata cagtatgacg 60
atagagtaga tagatagaga tagataccca tatacagata atgacataga tccccataga 120
cagtttatac agatcagtag cagtttttat atatgagatg atgataggac acaccagcaa 180
tatagggtat ttagggta 198
<210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sonda hybrydyzacyjna wewnętrznej kontroli specyficzna względem amplikonu (IC-P1) <400> 69 tgacatagat ccccatagac a <210> 70 <211> 24 <212> DNA
213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR (L1F5) <400> 70 cgtaaacgta ttccctattt tttt <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR (L1F6) <400> 71 cgtaaacgtt ttccatattt tttt <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR (L1R3) <400> 72 cagtacagag tttttagagt g <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 209 415 B1 <220>
<223> Starter PCR (LICI) <400> 73 cgtaaacgtt ttccctattt tttt <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR (L1C2) <400> 74 caatacagag tatttagggt a 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR (new L1C2) <400> 75 caatataggg tatttagggt a <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 6 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-6 specyficznego względem rodzaj u <400> 76 cgcaccaaca tattttatca tgc <210> 77 <211> 39 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 6 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-6 specyficznego względem typu <400> 77 ccttattttt ccataaaacg ggctaacaaa actgttgtg < 2 10 > <211> <212> <213>
DNA
Ludzki wirus brodawczaka typu 11 <220>
PL 209 415 B1 <221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-11 specyficznego względem rodzaju <400> 78 cgcaccaaca tattttatca tgc <210> 79 <211> 39 <212 > DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 11 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-11 specyficznego względem typu <400> 79 ccatattact ctatcaaaaa agttaacaaa acagttgta <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 42 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-42 specyficznego względem rodzaj u <400> 80 cgcaccaact acttttacca tgc <210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 42 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-42 specyficznego względem typu <400> 81 ccttattact ctattacaaa aagccaaata agacatctat cc <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 44 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-44 specyficznego względem rodzaju .
<400> 82 cgcaccaaca tatattacca tgc
PL 209 415 B1 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<223>
DNA
Ludzki wirus brodawczaka typu 44 różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-44 specyficznego względem typu <400> 83 ccttattttg ccatacgacc agcaaacaag acacttgtg 39
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 16
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu rodzaj u
<400> 84
cgcacaaaca tatattatca tgc specyficznego względem <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<223>
DNA
Ludzki wirus brodawczaka typu 16 różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-16 specyficznego względem typu <400> 85 ttttcctatt aaaaaaccta acaataacaa aatattagtt <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 18 <220>
<221>
<223>
różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-18 specyficznego względem rodzaj u <400> 86 cccacaagca tattttatca tgc <210> 87 <211> 41 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 18 <220>
<221> różne cechy
PL 209 415 B1 <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-18 specyficznego względem typu <400> 87 attttagggt tcctgcaggt ggtggcaata agcaggatat t 41 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 31 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-31 specyficznego względem rodzaj u <400> 88 cgaaccaaca tatattatca cgc 23 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 31 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-31 specyficznego względem typu <400> 89 ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta 40 <210> 90 <211> 23 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 33 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-33 specyficznego względem rodzaju <400> 90 cgcacaagca tttattatta tgc 23 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 33 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-33 specyficznego względem typu <400> 91 ttctattaaa aatcctacta acgctaaaaa attattggta 40
PL 209 415 B1 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<223>
DNA
Ludzki wirus brodawczaka typu 35 różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-35 specyficznego względem rodzaj u <400> 92 cgcacaaaca tctactatca tgc 23 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 35 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-35 specyficznego względem typu <400> 93 ctatgctatt aaaaaacaag attctaataa aatagcagta
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 39
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu rodzaju
<400> 94
cgcacaggca tatattatta tgc <210> 95 <211> 41 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 39 <220> <221> <223 >
różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-39 specyficznego względem typu <400> 95 attttaaagt gggtatgaat ggtggtcgca agcaggacat t <210>
<211>
<212>
DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 45 <220>
<221> różne cechy
PL 209 415 B1
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-45 rodzaju specyficznego względem
<400> 96
cgcacaagca tattttatca tgc 23
<210> 97
<211> 40
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 45
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-45 specyficznego względem
typu
<400> 97
tagggttgta cctaatggtg caggtaataa acaggctgtt 40
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 51
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-51 specyficznego względem
rodzaju
<400> 98
cgcaccggca tatattacta tgc 23
<210> 99
<211> 40
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 51
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-51 specyficznego względem typu
<400> 99
ctattttcca atacctaaaa cctcaacgcg tgctgctatt 40
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 52
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-52 specyficznego względem
rodzaj u <400> 100 cgcacaagca tctattatta tgc 23 <210> 101
PL 209 415 B1 <211>
<212>
DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 52 <220>
<221> różne cechy <223 > Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-52 specyficznego względem typu <400> 101 taaaaacacc agtagtggta atggtaaaaa agttttagtt c 41 <210>
<211>
<212>
102
DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 56 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-56 specyficznego względem rodzaju <400> 102 cgcactagta tattttatca tgc 23 <210> 103 <211> 41 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 56 <220>
<221>
<223>
różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-56 specyficznego względem typu <400> 103 ctattactct gtgactaagg acaataccaa aacaaacatt c <210>
<211>
<212>
<213>
104
DNA
Ludzki wirus brodawczaka typu 58 <220>
<221>
<223>
różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-58 specyficznego względem rodzaju <400> 104 cgcacaagca tttattatta tgc <210> 105 <211> 41 <212> DNA <213 > Ludzki wirus brodawczaka typu 58 <220>
<221>
<223>
różne cechy
Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-58 specyficznego względem typu
PL 209 415 B1
<400> 105 ttccatcaaa agtcccaata acaataaaaa agtattagtt c 41
<210> <211> <212> <213> 106 23 DNA Ludzki wirus brodawczaka typu 59
<220> <221> <223> różne cechy Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-59 rodzaju specyficznego względem
<400> 106 cgtaccagta ttttctacca cgc 23
<210> 107
<211> 41
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 59
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-59 specyficznego względem typu
<400> 107
ttttaaagta cctaaaggtg gtaatggtag acaggatgtt c 41
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 66
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-66 specyficznego względem rodzaju
<400> 108
cgtaccagta tattttatca tgc 23
<210> 109
<211> 41
<212> DNA
<213> Ludzki wirus brodawczaka typu 66
<220>
<221> różne cechy
<223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-66 specyficznego względem typu
<400> 109
ttattactct gtttccaaat ctggtaccaa aacaaacatc c 41
<210> 110 <211> 23 <212> DNA
PL 209 415 B1 <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 68 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-68 specyficznego względem rodzaj u <400> 110 cgcactggca tgtattacta tgc 23 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 68 <220>
<221> różne cechy <223> Miejsce wiązania sondy amplikonu HPV-68 specyficznego względem typu <400> 111 ttttaaggtt cctatgtctg ggggccgcaa gcagggcatt 40 <210> 112 <211> 244 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 44 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-44 <400> 112
cgtaaacgtg tttccttgtt ttttgcagat gtggcggcct agtgaaaacc aggtatatgt 60
gcctcctccc gccccagtat ccaaagtaat acctacggat gcctatgtca aacgcaccaa 120
catatattac catgctagca gttctagact tcttgctgtg ggcaaccctt attttgccat 180
acgaccagca aacaagacac ttgtgcctaa ggtttcggga tttcaatata gggtttttaa 240
gatg 244
<210> 113 <211> 253 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 35 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-35 <400> 113
cgtaaagcta tcccatattt ttttgcagat gtctctgtgg cggtctaacg aagccactgt 60
ctacctgcct ccagtgtcag tgtctaaggt tgttagcact gatgaatatg taacacgcac 120
aaacatctac tatcatgcag gcagttctag gctattagct gtgggtcacc catactatgc 180
tattaaaaaa caagattcta ataaaatagc agtacccaag gtatctggtt tgcaatacag 240
PL 209 415 B1 agtatttaga gta 253 <210> 114 <211> 253 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 39 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-39 <400> 114
cgtaaacgta ttccctattt tttttcagat ggctatgtgg cggtctagtg acagcatggt 60
gtatttgcct ccaccttctg tggcgaaggt tgtcaatact gatgattatg ttacacgcac 120
aggcatatat tattatgctg gcagctctag attattaaca gtaggacatc catattttaa 180
agtgggtatg aatggtggtc gcaagcagga cattccaaag gtgtctgcat atcaatatag 240
ggtatttcgc gtg 253
<210> 115 <211> 25S <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 45 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-45 <400> 115
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggctttgtgg cggcctagtg acagtacggt 60
atatcttcca ccaccttctg tggccagagt tgtcagcact gatgattatg tgtctcgcac 120
aagcatattt tatcatgcag gcagttcccg attattaact gtaggcaatc catattttag 180
ggttgtacct aatggtgcag gtaataaaca ggctgttcct aaggtatccg catatcagta 240
tagggtgttt agagta 256
<210> 116 <211> 250 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 51 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-51 <400> 116
cgtaaacgta taccctattt ttttacagat ggcattgtgg cgcactaatg acagcaaggt 60
gtatttgcca cctgcacctg tgtctcgaat tgtgaataca gaagaatata tcacacgcac 120
cggcatatat tactatgcag gcagttccag actaataaca ttaggacatc cctattttcc 180
aatacctaaa acctcaacgc gtgctgctat tcctaaagta tctgcatttc aatacagggt 240
atttagggta 250
PL 209 415 B1 <210> 117 <211> 250 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 56 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-56 <400> 117
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggcgacgtgg cggcctagtg aaaataaggt 60
gtatctacct ccaacacctg tttcaaaggt tgtggcaacg gattcctatg taaaacgcac 120
tagtatattt tatcatgcag gcagttcacg attgcttgcc gtaggaoatc cctattactc 180
tgtgactaag gacaatacca aaacaaacat tcccaaagtt agtgcatatc aatatagggt 240
atttagggta 250
<210> 118 <211> 253 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 59 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-59 <400> 118
ctgaaactgg ttccctattt ttttacagat ggctctatgg cgttctagtg acaacaaggt 60
gtatctacct ccaccttcgg tagctaaggt tgtcagcact gatgagtatg tcacccgtac 120
cagtattttc taccacgcag gcagttccag acttcttaca gttggacatc catattttaa 180
agtacctaaa ggtggtaatg gtagacagga tgttcctaag gtgtctgcat atcaatacag 240
agtatttagg gtt 253
<210> 119 <211>
<212>
250
DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 66 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-66 <400> 119
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggcgatgtgg cggcctagtg acaataaggt 60
gtacctacct ccaacacctg tttcaaaggt tgtggcaacg gatacatatg taaaacgtac 120
cagtatattt tatcatgcag gtagctctag gttgcttgct gttggccatc cttattactc 180
tgtttccaaa tctggtacca aaacaaacat ccctaaagtt agtgcatatc agtatagagt 240
gtttagggta 250
PL 209 415 B1 <210> 120 <211> 253 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 68 <220>
<221> różne cechy <223> amplikon HPV-68 <400> 120
cgtaaacacc ttccttattt ttttacagat ggcattgtgg cgagctagcg acaacatggt 60
gtatttgcct cccccctcag tggcgaaggt tgtcaataca gatgattatg tgacacgcac 120
tggcatgtat tactatgctg gtacatctag gttattaact gtaggccatc catattttaa 180
ggttcctatg tctgggggcc gcaagcaggg cattcctaag gtgtctgcat atcaatacag 240
agtgtttagg gtt 253
Zastrzeżenia patentowe

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Mieszanina starterów do amplifikacji, znamienna tym, że zawiera startery L1C1, L1C2, nowy L1C2 o SEQ ID NO: 73-75, SEQ ID NO: 37-40 i SEQ ID NO: 35 oraz ewentualnie co najmniej jeden starter wybrany z grupy obejmującej startery SEQ ID NO: 70-72 oraz SEQ ID NO: 1-34 i 36.
  2. 2. Zastosowanie mieszaniny starterów zdefiniowanej w zastrz. 1 do amplifikacji genotypów 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 i 77 ludzkiego wirusa brodawczaka.
  3. 3. Sposób wykrywania jednego lub większej liczby genotypów HPV w próbkach biologicznych, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:
    a) przygotowuje się jeden lub większą liczbę amplikonów z użyciem mieszaniny starterów zdefiniowanej w zastrz. 1, z cząsteczek kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z próbki biologicznej; oraz b1) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą do hybrydyzacji specyficzną dla rodzaju genotypu; oraz ewentualnie b2) hybrydyzuje się amplikon otrzymany w (a) w ostrych warunkach z sondą specyficzną dla rodzaju HPV.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że sondę specyficzną dla rodzaju HPV stanowi:
    i) konsensusowa sonda lub starter dla HPV hybrydyzujący z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110;
    ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 41-49.
  5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że sondę do hybrydyzacji specyficzną dla genotypu stanowi:
    i) sonda specyficzna dla genotypu HPV hybrydyzująca z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111;
    ii) sonda komplementarna do sondy w (i); albo iii) sekwencja wybrana spośród SEQ ID NO: 50-67.
  6. 6. Sposób według zastrz. 3 albo 4, albo 5, znamienny tym, że wykrywa się grupy genotypów HPV niskiego i wysokiego ryzyka.
  7. 7. Sposób według zastrz. 3 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że obejmuje ponadto wykrywanie syntetycznego oligonukleotydu jako wzorca wewnętrznego.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako wzorzec wewnętrzny stosuje się sekwencję SEQ ID NO: 68, a do jej wykrywania stosuje się SEQ ID NO: 69 jako sondę do hybrydyzacji.
    PL 209 415 B1
  9. 9. Zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV, znamienny tym, że zawiera:
    i) mieszaninę starterów zdefiniowaną w zastrz. 1;
    ii) ewentualnie oligonukleotyd jako wzorzec wewnętrzny, korzystnie o SEQ ID NO: 68;
    iii) sondy do hybrydyzacji zawierające lub hybrydyzujące z sekwencją SEQ ID NO: 77, 79, 81,
    83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 lub 111 oraz ewentualnie z sekwencją SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 lub 110; oraz iv) ewentualnie sondy do hybrydyzacji, korzystnie o SEQ ID NO: 69, wykrywające wzorzec we-
PL371806A 2002-03-14 2003-03-10 Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV PL209415B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU0200981A HUP0200981A3 (en) 2002-03-14 2002-03-14 Pcr reactions with hybridizing probes using primers with broad genotype-specificity for detection of human papilloma-viruses and typing amplificates by using specifically hybridizing oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL371806A1 PL371806A1 (pl) 2005-06-27
PL209415B1 true PL209415B1 (pl) 2011-08-31

Family

ID=89980267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL371806A PL209415B1 (pl) 2002-03-14 2003-03-10 Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7294488B2 (pl)
EP (1) EP1504127B1 (pl)
JP (1) JP4358637B2 (pl)
CN (1) CN100529104C (pl)
AT (1) ATE338144T1 (pl)
AU (1) AU2003209517B2 (pl)
CA (1) CA2479045C (pl)
CY (1) CY1105782T1 (pl)
DE (1) DE60308017T2 (pl)
DK (1) DK1504127T3 (pl)
EA (1) EA008388B1 (pl)
ES (1) ES2271617T3 (pl)
HK (1) HK1073333A1 (pl)
HR (1) HRP20040948B1 (pl)
HU (1) HUP0200981A3 (pl)
IL (1) IL164055A0 (pl)
MX (1) MXPA04008955A (pl)
NO (1) NO332319B1 (pl)
NZ (1) NZ535469A (pl)
PL (1) PL209415B1 (pl)
PT (1) PT1504127E (pl)
SI (1) SI1504127T1 (pl)
WO (1) WO2003076667A1 (pl)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2546804C (en) * 2005-03-14 2011-03-08 Sungkyunkwan University Primer for detection of human papillomavirus
PL1844164T3 (pl) 2005-11-15 2010-12-31 Genoid Kft Sposób wykrywania patogenów z zastosowaniem sond typu "latarni molekularnych"
KR101451780B1 (ko) * 2007-03-06 2014-10-16 주식회사 파나진 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브,키트 및 방법
JP5302519B2 (ja) * 2007-08-03 2013-10-02 倉敷紡績株式会社 ヒトパピローマウイルスを検出するためのプライマーセット及びプローブ
EP2034032A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-11 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des Öffentlichen Rechts Composition comprising an oligonucleotide mixture for improved detection of human papillomavirus genotypes
CN101487042B (zh) * 2008-01-18 2012-05-30 中山大学达安基因股份有限公司 Hpv高危和低危亚型分型dna微阵列芯片
KR20090091068A (ko) * 2008-02-21 2009-08-26 (주)차바이오메드 Ｈｐｖ 지노타이핑용 칩
KR100894682B1 (ko) * 2008-06-19 2009-04-24 주식회사 코젠바이오텍 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
WO2011094528A2 (en) * 2010-01-29 2011-08-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an hpv in a sample
EP2576840B1 (en) 2010-05-25 2018-10-17 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
CN101942440B (zh) * 2010-09-28 2012-06-20 深圳华大基因科技有限公司 检测和定型食管hpv病毒的引物和方法
CN101956024B (zh) * 2010-10-18 2012-10-10 中国科学院微生物研究所 用于检测人乳头瘤病毒的试剂
CN103072832B (zh) 2011-10-26 2016-02-17 夏普株式会社 供纸装置以及具备该供纸装置的图像形成装置
EP2820157B1 (en) * 2012-03-02 2019-05-01 Winthrop-University Hospital Method for using probe based pcr detection to measure the levels of circulating demethylated beta cell derived dna as a measure of beta cell loss in diabetes
CN103540682A (zh) * 2012-07-13 2014-01-29 钟建 用于人乳头瘤病毒16基因检测的生物试剂
CN105018584A (zh) * 2014-04-30 2015-11-04 天津安必森生物技术有限公司 用于K-ras基因突变检测的生物试剂
CN104651531B (zh) * 2015-01-24 2017-03-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的试剂盒

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
AU615159B2 (en) 1986-03-21 1991-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ltd Determined dna sequences derived from a papillomavirus genome, their uses for in vitro diagnostic purposes and the production of antigenic compositions
US4889818A (en) * 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
CA1337336C (en) 1987-05-26 1995-10-17 Attila T. Lorincz Human papillomavirus nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same
US5182377A (en) 1988-09-09 1993-01-26 Hoffmann-La Roche Inc. Probes for detection of human papillomavirus
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5840306A (en) * 1995-03-22 1998-11-24 Merck & Co., Inc. DNA encoding human papillomavirus type 18
EP1201771A3 (en) * 1997-09-16 2002-10-23 Innogenetics N.V. Detection and identification of human papillomavirus by PCR and type-specific reverse hybridization

Also Published As

Publication number Publication date
ES2271617T3 (es) 2007-04-16
ATE338144T1 (de) 2006-09-15
US20050250092A1 (en) 2005-11-10
WO2003076667A1 (en) 2003-09-18
JP4358637B2 (ja) 2009-11-04
HU0200981D0 (pl) 2002-05-29
IL164055A0 (en) 2005-12-18
EP1504127A1 (en) 2005-02-09
CN1646705A (zh) 2005-07-27
PL371806A1 (pl) 2005-06-27
AU2003209517B2 (en) 2006-11-02
AU2003209517A1 (en) 2003-09-22
MXPA04008955A (es) 2005-06-17
DE60308017D1 (de) 2006-10-12
DK1504127T3 (da) 2007-01-02
CA2479045C (en) 2011-01-18
EP1504127B1 (en) 2006-08-30
CA2479045A1 (en) 2003-09-18
NO332319B1 (no) 2012-08-27
US7294488B2 (en) 2007-11-13
HUP0200981A2 (hu) 2003-09-29
JP2005519611A (ja) 2005-07-07
CY1105782T1 (el) 2011-02-02
EA008388B1 (ru) 2007-04-27
NO20044355L (no) 2004-10-13
NZ535469A (en) 2007-04-27
DE60308017T2 (de) 2007-04-05
CN100529104C (zh) 2009-08-19
HRP20040948B1 (hr) 2013-02-28
HUP0200981A3 (en) 2004-06-28
EA200401207A1 (ru) 2005-06-30
PT1504127E (pt) 2007-01-31
SI1504127T1 (sl) 2007-02-28
HRP20040948A2 (en) 2004-12-31
HK1073333A1 (en) 2005-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5595276B2 (ja) 子宮頸部ｈｐｖの新たな検出方法
RU2410441C2 (ru) Наборы и способ детектирования папилломавируса человека с помощью набора олигонуклеотидных гранул
PL209415B1 (pl) Mieszanina starterów do amplifikacji, jej zastosowanie, sposób wykrywania genotypów HPV i zestaw odczynników do wykrywania i typowania HPV
US10988816B2 (en) Compositions and methods for detecting human papillomavirus nucleic acid
EP0477972B1 (en) Nucleotide sequences useful as type-specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods
CA2617978A1 (en) In vitro diagnostic kit for identification of human papillomavirus in clinical samples
CA2929741A1 (en) Assay for detecting and quantifying hiv-1
US8741568B2 (en) Detection of human papillomavirus
AU2008212633B2 (en) Detection of human papillomavirus
AU2011253599B2 (en) Assay for detecting and quantifying HIV-1
WO2005100610A2 (en) Virus detection method, primers therefor and screening kit
WO2010125420A1 (en) A method for detection and identification of hpv16 variants using primers and probes

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification