NO332319B1 - Amplifiseringsprimerblanding, fremgangsmate for pavisning og typebestemmelse av humant papillomavirus, og et sett som omfatter amplifiseringsprimerblandingen og hybridiseringsprober. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en amplifiserings- og hybridiseringsfremgangsmåte for påvisning og typebestemmelse av humant papillomavirus (HPV) og primerne og hybridisenngsprobene som anvendes i fremgangsmåten. Oppfinnelsen gjelder et bestemt område av HPVgenomet som er egnet for utforming av HPVslektsspesifikke og HPV-genotypespesifikke hybridiserings-oligonukleotidprober.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for forbedret påvisning og genotyping av humant papillomavirus (HPV).

En annen utførelse av oppfinnelsen gjelder optimalisert utforming av reagenser og en fremgangsmåte som er egnet for amplifisering og påvisning av et utvidet sett av HPV-genotyper ("et sett").

Oppfinnelsens bakgrunn

En rekke papillomavirussekvenser er bestemt, se publikasjonene: HPV-6: de Villiers et al., J. Virology, 40 (1981); HPV-11: Dartmann et al., Virology 151, 124-130

(1986); HPV-16: Seedorf et al., Virology 145, 181-185 (1985); HPV-18: Cole og Danos, Journal of Molecular Biology 93, 599-608 (1987); HPV-31: Goldsborough et al., Virology 171, 306-311 (1989); HPV-33: Cole og Streeck, J. Virology, 58,991-995

(1986); HPV-54: Favre et al., J. Cancer 45,40-46 (1990); HPV-56: Lorincz, J., Gen. Virol. 70, 3099 (1989).

Påvisning og typebestemmelse av HPV rapporteres i en rekke publikasjoner. I tillegg til Soutern-blotting og andre hybridiseringsteknikker er de hyppigst anvendte teknikkene PCR-baserte fremgangsmåter, siden disse fremgangsmåtene samtidig gir høy følsomhet og spesifisitet, samtidig som analysens fleksibilitet gir bedre kontroll for tilpasning til de analytiske krav. Kleter et al, Amer. J. Pathol. 153,1731-1739 (1998) beskriver HVP PCR primere for sensitiv deteksjon av alle slimhinne HPV typer. PCR primerne er kalt SPF1 og SPF2 og de er designet slik at de er spesifikke for LI regionen til HPV genomet. Primerne amplifiserer et kort PCR fragment på bare 65 bp.

WO 99/14377beskriver en metode for a detektere og identifisere HPV i en biologisk prøve, ved å amplifisere opp et kort fragment av LI området ved å bruke generelle PCR primere. Amplikonene detekteres ved hjelp av spesifikke prober som hybridiserer til korte fragmenter av LI området.

Humant papillomavirus, et medlem av Papillomaviridae- familien er et DNA-tumorvirus med et sirkulært genom på 8000 bp. Viruset viser kraftig epitelisk tropisme og prolifererer kun i differensierte epitelceller. Papillomavirus mistenkes for å spille en etiologisk rolle for mange forskjellige sykdommer hos mennesket, f. eks. i forskjellige hudsykdommer, nærmere bestemt verruca, kondyloma acuminatum og hudtumorer, og for andre tilstander som cervikal karsinom, anogenitale karsinomer og laryngal karsinom. Det er veletablert at humant papillomavirus viser en kraftig korrelasjon med forekomsten av disse tumorene, og dette gjelder også for de precancerøse lesjonene (CIN, VIN, VAIN, PIN, PAIN). HPV kan påvises hos 99 % av cervikale karsinompasienter. Dette tette statistiske forhold skyldes muligens at HPV har en utløsende rolle for dannelse av cervikalt karsinom. Basert på de epidemiologiske resultatene har pasienter som infiseres av forskjellige HPV-genotyper ikke den samme grad av risiko for utvikling av cervikalt karsinom. Ifølge disse funn kan genotypene klassifiseres i en lavrisikoklasse, en klasse med middels risiko og en høyrisikoklasse, og i tillegg til disse foreligger det også ikke klassifiserte genotyper. Siden risikoen er svært forskjellig og forekomsten av HPV-infeksjon er svært høy, er bestemmelse av genotypen av stor betydning.

HPV-viruset kan ikke dyrkes. Den serologiske diagnose av HPV-infeksjon er begrenset til å påvise eksponering overfor viruset (tidligere eller foreliggende infeksjon), men kan ikke nøyaktig påvise genotypen, slik at rollen til den serologiske diagnose hovedsakelig er begrenset til epidemiologiske undersøkelser.

For papillomavirus, hvor en nøyaktig serologisk klassifisering (serotyping) ikke forefinnes, er genotyping den best aksepterte klassifiseringsfremgangsmåte. Fremgangsmåter for genotyping kan deles i to grupper ut fra hvorvidt amplifisering går forut for påvisningen eller ikke. I én utførelse av denne siste fremgangsmåten benyttes fullengde genomiske RNA-prober for påvisning av denaturerte HPV-DNA-genomer, og heterodupleksen påvises med spesifikke antistoffer (Hybrid Capture - Digene). Ifølge en annen fremgangsmåte anvendes Southern-blotteknikken for påvisning og genotyping av HPV-genotypene. Ulempen med disse fremgangsmåtene er at de er relativt lite følsomme og delvis mangler spesifisitet. Når det gjelder Hybrid Capture-fremgangsmåten rapporterer mange publikasjoner forskjellige kryssreaksjoner som gir falske positive reaksjoner under kliniske betingelser. Forfatterne rapporterte at kryssreaksjonene kun var akseptable med en avslutningskontroll med høy (1 ng/ml) DNA-konsentrasjon, noe som understreker den uønskede kobling mellom følsomhet og spesifisitet.

For amplifiseringsfremgangsmåtene opptrer ikke dette problem, siden reaksjonen som er ansvarlig for følsomheten (amplifiseringen) utføres separat.

Generelt avviker amplifiseringsteknikkene fra hverandre når det gjelder det utvalgte amplifiserte genomsegment, antall primere og den benyttede deteksjonsteknikk. De hyppigst anvendte primerne er GP5+ - GP6+, MY9-MY11 og de forskjellige typespesifikke PCR-reaksj onene.

De hyppigst anvendte deteksjonsteknikkene er sekvensspesifikk hybridisering, restriksjonsfragmentlengde-polymorfi (RFLP) og linjeprobeanalysen (LiPA). I tillegg til disse benyttes sekvensering av amplikoner og fordelingen av tymidin vist ved inkorporering av dUTP, men mindre hyppig.

De analytiske egenskapene til amplifiseringsteknikkene varierer innen vide grenser. Fremgangsmåtene kan være særpreget ved de amplifiserbare genotypene, den analytiske følsomhet av genotypeamplifiseringen og påvisningens spesifisitet og pålitelighet. Innen dette feltet anses det degenererte primersystem MY9-MY11 å være referansereaksjonen. Når det gjelder MY9-MY11-systemet foreligger det et LiPA-hybridiseringspåvisningssystem (Innogenetics). Hovedulempen med MY9-MY11-systemet er at det er vanskelig å kontrollere den degenererte syntese av primerne, dvs. hvorfor det relative forhold mellom primertypene som dannes i syntesen varierer fra syntese til syntese, noe som kan føre til uforutsigbare endringer i PCR-reaksjonens analytiske adferd, for det andre kan denne reaksjonen amplifisere de færreste typene sammenlignet med andre hyppig anvendte reaksjoner. Det er velkjent fra litteraturen at systemet kun kan amplifisere genotype 51 dersom HPV genotype 51-typespesifikke primere tilsettes til reaksjonen. Ved anvendelse av degenerert primersyntese kan det relative forhold mellom primertypene ikke endres, og det er umulig å skreddersy primerforholdet slik at man oppnår bedre analytisk yteevne og en balansert amplifisering av genotyper.

GP5+ - GP6+-reaksjonen løser problemet kun ved anvendelse av to nøye utvalgte primerpar - optimalisert for genitale HPV-sekvenser - de to primersystemene er lette å håndtere, imidlertid er fleksibiliteten lavere. GP5+ - GP6+-systemet kan amplifisere en rekke kjente HPV-genotyper, men systemets analytiske egenskaper er ikke optimale (følsomheten er ikke balansert med forskjellige genotyper), og toprimertilnærmingen er begrenset når det gjelder optimalisering, for eksempel er balansering av påvisnings-sensitiviteten for de enkelte genotypene svært problematisk (bortsett fra begrenset optimalisering av smeltetemperatur og MgCl2-konsentrasjon). Det er vanskelig å tilpasse GP5+ - GP6+-systemet til amplifisering av andre genotyper, noe som i alle tilfeller vil påvirke fremtidig anvendelse av systemet siden behovet for påvisning av nye genotyper stadig oppstår. Identifisering av genotypene er ikke løst på en adekvat måte.

En annen velkjent amplifiseringsfremgangsmåte med bred genotypespesifisitet er LlC-fremgangsmåten: Et toprimersystem som foreligger i to versjoner, én som anvender (sammen med LCl)-primeren) primeren L1C2 og én som benytter primeren newLlC2 for amplifisering av ytterligere genotyper. Den detaljerte beskrivelse av LIC-amplikonet foreligger i litteraturen [Jpn. J. Cancer Research 82, 524-531 (1991)].

I bunn og grunn må to kriterier oppfylles av fremgangsmåter for påvisning etter amplifisering: anvendbarhet i rutinemessig diagnose (enkel utførelse, kostnader, tid) og kravet om et egnet nivå når det gjelder diskrimineringsevne. En signifikant gruppe av fremgangsmåter er ikke egnet når det gjelder diskrimineringsevne. Følgelig er anvendelse av RFLP-fremgangsmåten begrenset grunnet de korte amplifiserte områdene og mangelen på et tilstrekkelig antall diagnostiske restriksjonsseter, slik at genotypene ofte kun kan klassifiseres i grupper. Som et annet eksempel er det i SSCP-teknikken vanskelig å oversette de kompliserte SSCP-mønstrene til genotyper, og videre er disse reaksjonenes robusthet heller ikke tilfredsstillende.

Diskrimineringsevnen er spesielt viktig fra et diagnostisk synspunkt for å oppfylle kravene fra de regulatoriske myndigheter. Når det gjelder enkel utførelse og diskrimineringsevne er sekvensering den ideelle tilnærming, siden automatisering av sekvensering er løst og siden fremgangsmåten kan påvise hver enkelt genotype (eller til og med subtyper av disse) dersom prøven ikke er en blanding av genotyper. Men i praksis benyttes sekvensering ikke hyppig siden teknikken er kostbar og tidkrevende, og anvendelse av denne i diagnostiske rutinelaboratorier er ikke akseptabelt, og når det gjelder blandede prøver kan ingen av genotypene bestemmes.

Fordelen med hybridiseringsfremgangsmåter er at deres diskrimineringsevne eller stringens lett kan endres siden flere reaksjonsparametre kan varieres innen vide grenser, og noen former er lette å automatisere, reaksjonen er mindre kostbar og når det gjelder parallell implementering (for noen former) er også tiden som kreves ubetydelig.

Det foreligger derfor et behov for en ny HPV-amplifiserings/detekter-ingsfremgangsmåte som fjerner ulempene med dagens fremgangsmåter og som er billig, lett å reprodusere og lett å automatisere. I Foreliggende oppfinnelse beskriver en amplifiserings- og hybridiseringsanalyse hvori primerne er uavhengig syntetiserte molekyler, slik at det relative forhold mellom dem lett kan kontrolleres og optimaliseres, og amplifiseringen har en balansert følsomhet. Hybridiseringsreaksjoner utført på en svært parallellisert måte oppfyller kriteriene når det gjelder en reaksjon med lave kostnader som er hurtig, fleksibel og automatiserbar.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende spesifikasjonen beskriver et genomisk område i humant papillomavirus som ligger inne i et konsensusamplikon (dvs. et område som kan amplifiseres med primere som bindes til konserverte sekvenser som flankerer amplikonet), hvori disse genomiske områdene særpreges ved at de har en genotype-spesifikk DNA-sekvens som er egnet for utforming av genotypespesifikke hybridiseringsprober.

Det er et annet genomisk HPV-område i dette konsensusamplikon hvori de genomiske områdene særpreges ved at de har en HPV-slektsspesifikk, konservert DNA-sekvens som er egnet for utforming av slektsspesifikke hybridiseringsprober.

Et essensielt element av oppfinnelsen er nærvær av to genomiske segmenter innen ett konsensusamplikon som er egnede for utforming av slekts- og genotypespesifikke hybridiseringsprober.

Oppfinnelsen beskriver anvendelse av primere i en amplifiseringsreaksjon hvis DNA-sekvenser og konsentrasjoner, samt betingelsene for reaksjonssyklusen er optimaliserte for amplifisering med balansert følsomhet av humant papillomavirus-genotypene. I et aspekt ved oppfinnelsen fremskaffes en amplifiseringsprimerblanding, kjennetegnet ved at den består av primerne L1C1, L1C2 og newLlC2 (SEQ. ID. NO: 73-75), primerne som har SEQ. ID. NO: 37-40 og SEQ. ID. NO: 35, og om ønskelig én eller flere primere valgt fra gruppen som består av SEQ. ID. NO: 70-72, SEQ. ID. NO: 1-34 og SEQ. ID. NO: 36. Denne primerblandingen kan benyttes for amplifisering av genotypene 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11,12, 13,14, 16, 18,20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

39, 40,41,42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 og 77 av humant papillomavirus.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for påvisning og genotyping av humant papillomavirus (HPV), hvor fremgangsmåten omfatter trinnene: a) fremstilling av ett eller flere amplikoner som kan erholdes ved anvendelse av primerblandingen ifølge krav 1 fra nukleinsyremolekyler ekstrahert fra

den biologiske prøven, og

bl) hybridisering av amplikonet erholdt i (a) under stringente betingelser til en

genotypespesifikk hybridiseringsprobe; og eventuelt

b2) hybridisering av amplikonet erholdt i (a) under stringente betingelser til en HPV-slektsspesifikk probe.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen er et sett for påvisning og typebestemmelse av HPV som er kjennetegnet ved at det omfatter:

i) primerblandingen ifølge krav 1,

ii) om ønskelig interne kontrollprimere,

iii) hybridiseringsprober som omfatter eller hybridiserer til hvilke som helst av SEQ. ID. NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103, 105, 107, 109 eller 111, og eventuelt hvilke som helst av SEQ. ID. NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 eller 110; og iv) om ønskelig hybridiseringsprober for påvisning av den interne kontroll.

I oppsummering kan fremgangsmåten som tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse anvendes for amplifisering/påvisning av en gitt gruppe av HPV-genotypene, noe som fører til påvisning av genomisk HPV-DNA med slektsspesifikke prober og samlet (gruppert) eller individuell genotyping av HPV-genomene. Fremgangsmåten kan anvendes for å anslå risikoen for senere tilstander eller sykdommer eller for å fastslå hvilke individer som er utsatt for risiko for senere tilstander og sykdommer som skyldes eller er forbundet med HPV-virusene som forefinnes i pasientene på et gitt tidspunkt, og særlig for typespesifikk påvisning derav. Fremgangsmåten som tilveiebringes av oppfinnelsen er også egnet for analyse av nærvær av HPV i en gitt populasjon, og også for å supplere, understøtte eller bekrefte en cytologisk diagnose i et gitt individ (analyse).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som en hjelp til forståelse av oppfinnelsen defineres flere begreper nedenfor.

Begrepene "nukleinsyre" og "oligonukleotid" viser til prober, primere og andre korte DNA-, RNA-, PNA (peptidnukleinsyre)-oligomerer og oligomerer av andre kjemikalier som er i stand til sekvensspesiflkk binding til et DNA-, RNA- eller PNA-templat (målmolekyl).

Begrepet "hybridisering" viser til sekvensspesiflkk binding av to nukleinsyrese-kvenser til hverandre. Betingelsene som anvendes har vesentlig innflytelse på hybridiseringsstringensen, derfor kan hybridisering skje under mindre stringente betingelser selv om nukleinsyrene ikke er eksakt komplementære. I noen tilfeller kan det være nødvendig at nukleinsyreproben bindes til en gruppe av sekvenser som er nære eller fjernere slektninger av hverandre. Fagfolk innen nukleinsyreteknologi kan fastslå betingelsene som gir binding med egnet spesifisitet eller mangel på spesifisitet.

Begrepet "probe" viser til et sett av oligonukleotider som viser sekvenspesifikk hybridisering i nærvær av komplementære og delvis komplementære nukleinsyrer. Strukturen av oligonukleotidene kan være modifisert for å muliggjøre utførelse av trinnene etter hybridiseringen eller for å endre hybridiseringsegenskapene.

Begrepet "typespesifikk probe" viser til et sett av oligonukleotider som under stringente betingelser kun bindes til målområdet som er nøyaktig komplementært med probene. Hybridiseringsbetingelser som er egnede for dette krav er velkjente innen faget (se f.eks. Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. USA). Generelt utvelges stringente betingelser slik at temperaturen er tilnærmet 5 °C under smeltepunktet (Tm) for den angjeldende sekvens ved definert ionestyrke og pH. Tm er den temperatur (ved definert ionestyrke og pH) ved hvilken 50 % av proben foreligger i et hybrid i nærvær av et egnet, komplementært målmolekyl. Reduksjon av hybridiseringsbetingelsenes stringens (f.eks. økning av saltkonsentrasjonen eller reduksjon av temperaturen) vil tillate binding av sekvenser som ikke er nøyaktig komplementære. For et ikke nøyaktig komplementært templat er nukleotidene som ikke kan bindes til templatnukleinsyren i templatet "mismatch-nukleotidene".

Begrepet "primer" viser til nukleotider som kan virke som et initieringspunkt for DNA-syntese (priming) under betingelser ved hvilke syntese av et primerforleng-elsesprodukt som er komplementær til en nukleinsyretråd induseres på et nukleinsyretemplat, dvs. i nærvær av fire forskjellige nukleotidtrifosfater og et polymeriseringsmiddel (dvs. en DNA-polymerase eller en revers transkriptase) i en egnet buffer og ved egnet temperatur. En primer er fortrinnsvis et enkelttrådet DNA-molekyl. En egnet primerlengde ligger typisk mellom 15 og 40 nukleotider. En primer må ikke nødvendigvis gjenspeile templatets nøyaktige sekvens, ved å endre bindingstemperaturen (reaksjonstemperaturen) kan følgelig en gruppe av målmolekyler som ligner hverandre fungere som templat for syntesen (konsensusamplikon). Kjemiske grupper med visse fordelaktige egenskaper kan anvendes for å merke primeroligonukleotidet slik at det kan bindes til en fast fase og for andre formål.

Begrepet "primer" viser i foreliggende oppfinnelse også til en gruppe av sekvensbeslektede oligonukleotider som kan prime (som beskrevet ovenfor) på en gitt gruppe av templatsekvenser. I tillegg kan medlemmer av gruppen bestå av oligonukleotider som kan danne feiltilpassede hybrider med noen eller alle medlemmer av et gitt sett av templatnukleinsyrer. Under egnede betingelser kan imidlertid disse primerne også delta i primingen. Begrepet "konsensusprimere" viser til en primer eller gruppe av primere som kan anvendes for priming av visse områder i beslektede templatnukleinsyrer. Egenskapene til disse områdene er at deres variabilitet er signifikant lavere enn variabiliteten av hele nukleinsyren, dvs. at de er konserverte, på disse sekvensene kan således utvalgte konsenusprimere utføre priming som omfatter hele gruppen av templat-nukleinsyresekvenser. Konsensusprimeren er ikke nødvendigvis en enkelt primer, den kan være en gruppe av primere.

Begrepet "varmestabilt polymeraseenzym" viser til et enzym som er relativt stabilt ved 95 °C og som katalyserer polymerisering av nukleosidtrifosfater slik at det dannes primerforlengelsesprodukter som er komplementære til én av nukleinsyretrådene i målsekvensen. Et renset, varmestabilt polymeraseenzym beskrives i US patentskrift nr. 4889818, som inkorporeres heri ved referanse, og er kommersielt tilgjengelig fra for eksempel Applera.

I foreliggende oppfinnelse utføres amplifisering av DNA ved polymerase-kjedereaksjonen (PCR), som beskrives i US patentskrifter nr. 4683195, 4683202 og 4965188.

I foreliggende oppfinnelse er det blitt utviklet optimaliserte PCR-betingelser for amplifisering av et stort antall forskjellige HPV-genotyper, med optimalisering av primerkonsentrasjoner, primersekvenser og PCR-syklusbetingelser. I den første del av amplifiseringen amplifiseres det med en konstant økende stringens, med det mål at amplifisering av genotypene som inneholder flere mistilpassede nukleotider relativt til primerne vil begynne å amplifiseres med samme effektivitet som de andre genotypene, mens den økende bindingstemperatur senere vil forskyve reaksjonen mot anvendelse av de primere som foreligger i høyere mengder. Med en optimalisert blanding av primere vil denne prosessen i teorien forskyve primerbindingssekvensene mot en konsensussekvens, noe som gir muligheten for amplifisering med balansert følsomhet av genotypene.

Selv om primerase-kjedereaksjonen er den foretrukne amplifiseringsfremgang-måte kan de nevnte genomiske områdene og oligonukleotidene anvendes i enhver kjent fremgangsmåte. For eksempel kan ligase-kjedereaksjonen (Wu og Wallace 1989, Genomics 4:560-569), TAS-amplifiseringssystemet (Kwoh et al,. 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:1173-1177) og selvunderstøttende sekvensreplikasjon (Guatelli et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:1874-1878) være egnede for korrekt amplifisering av målsekvensen. På tilsvarende måte kan sekvensspesifikke prober amplifiseres i Q-beta-replikasesystemet (Kramer og Lizardi, 1989, Nature 339:401-402).

I foreliggende oppfinnelse er primerne utvalgt slik at de utgjør en gruppe av mer eller mindre komplementære sekvenser som er egnede for amplifisering av HPV-konsensusamplikoner. Effektiv priming oppnås i nærvær av feiltilpasset nukleotid ved anvendelse av nøye utformede hybridiseringstemperaturer og relative konsentrasjoner av primerne.

I den foreliggende oppfinnelse anvendes primerne ifølge oppfinnelsen (SEQ. ID. NO: 1-40, 70-72) sammen med de kjente primerne (SEQ. ID. NO: 73-75) i form av egnede reagenser. Dette tillater påvisning av et utvidet sett av HPV-genotyper, minst 47 kjente genotyper. Det kan observeres i Eksempel 4 at amplifisering av HPV-35-genotypen ifølge oppfinnelsen kan utføres ved å la primeren ifølge SEQ. ID. NO: 37 inngå i reaksjonen. Uten denne primer, men med kun de kjente primere i reaksjonen, amplifiseres ikke HPV-35-genotypen. En annen utførelse av oppfinnelsen gjelder typespesifikke primere for HPV LI-genet, som omfatter én av nukleotidsekvensene som beskrives i SEQ. ID. NO: 1-36.

Oppfinnelsen angår en primerblanding som omfatter primerne L1C1, L1C2 og newLlC2 (SEQ. ID. NO: 73-75), SEQ. ID. NO: 37-40 og SEQ. ID. NO: 35, og om ønskelig én eller flere primere valgt fra gruppen som består av SEQ. ID. NO: 70-72, SEQ. ID. NO: 1-34 og SEQ. ID. NO: 36.1 tillegg angår oppfinnelsen bruk av en slik primerblandingen til amplifisering av genotypene 3,4, 6, 7, 9,10,11, 12,13,14,16,18, 20, 24,26,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39,40, 41, 42,44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 og 77 av humant papillomavirus.

Et essensielt element av foreliggende oppfinnelse er nærvær av generiske og typespesifikke genomiske segmenter i amplikonene. Disse genomiske segmentene tillater realisering av svært spesifikk hybridisering og påvisning. Følgelig gjelder foreliggende oppfinnelse også et genomisk segment i amplikonene som særpreges ved et genotype-spesifikt, variabelt genomisk segment som strekker seg fra amplikonets 3' ende (i 3-5' retning) fra -80 bp til -30 bp. Disse genomiske segmentene er tilnærmet 40 bp lange dobbelttrådede DNA-sekvenser som beskrives i SEQ. ID. NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103, 105,107, 109 og 111.

Den foreliggende oppfinnelsen beskriver et annet genomisk segment i amplikonene som strekker seg i 3'-5' retning fra amplikonets 3' ende fra -150 bp til -105 bp og som særpreges ved sekvenser med lav kompleksitet som er svært konserverte mellom genotypene og som viser generisk HPV-slektsspesifisitet. Disse genomiske segmentene er dobbelttrådet DNA som vanligvis inneholder 23 bp, og den øvre tråd har én av følgende sekvenser: SEQ. ID. NO: 76,78, 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94,96, 98, 100, 102, 104, 106,108 eller 110.

Under påvisning av amplikonene ved hybridisering anvendes generiske eller typespesifikke hybridiseringsprober som er utformet for de genomiske segmentene som nevnes ovenfor. De generiske oligonukleotidprobene kan generelt anvendes for påvisning av HPV-amplikonet, dvs. det amplifiserte HPV-DNA, mens de typespesifikke probene kan anvendes for videre typebestemmelse, dvs. for påvisning av de enkelte genotypene. Begge hybridiseringsprober kan være DNA, RNA eller PNA av natur.

De generiske probene som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har egenskaper som ligner på egenskapene til konsensusprimerne, med den forskjell at den 5' ende ikke foretrekkes når det gjelder posisjonen av feiltilpassede basepar. I foreliggende oppfinnelse anvendes de som prober, men disse generiske probene kan anvendes både som hybridiseringsprober og som primere.

De generiske (konsensus) hybridiseringsprobene eller -primerne ifølgelig oppfinnelsen omfatter én av sekvensene som beskrives i SEQ. ID. NO: 41-49.

I en foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen anvendes følgende prober som generiske prober: SEQ. ID. NO: 41-49.

Når det gjelder typespesifikke prober er probene 100 % komplementære til sekvensen av den tilsvarende genotype. Under utforming av probene er det viktig å utelukke muligheten for at andre genotyper viser høy grad av komplementaritet med proben eller en del av den. Siden det typespesifikke segment er tilnærmet 40 bp langt i amplikonene ifølge oppfinnelsen er det mulig å utvelge til og med overlappende probesekvenser, noe som er mest tilfredsstillende både teoretisk og eksperimentelt. Det vises i Eksempel 5 at adekvate prober med høy spesifisitet (sammenlignet med de undersøkte 70 genotypene) kan utformes og anvendes, og at de bevarer sin spesifisitet selv ved romtemperatur under de benyttede hybridiseringsbetingelser. Siden hybridiseringen av prober er tilstrekkelig spesifikk under identiske hybridiseringsbetingelser kan probeblandingen også anvendes. Fra et praktisk synspunkt kan følgelig mer enhetlige reaksjonsbetingelser anvendes. Oppfinnelsen gjelder derfor sekvensene for de typespesifikke probene som kan anvendes for amplifisering, deteksjon og genotyping av HPV og som omfatter én av sekvensene som er opplistet i SEQ. ID. NO: 50-67.

Selv om oppfinnelsen gjelder enhver utførelse av hybridiseringen foretrekkes i kommersiell sammenheng hybridisering i fast fase.

Ved såkalt fast fase (forlengs)-hybridisering bindes probene til immobiliserte målnukleinsyrer (amplikoner), mens ved revers hybridisering bindes målnukleinsyren (amplikonet) til immobiliserte prober. Ubundne reaksjonsprodukter fjernes med forskjellige vaskeløsninger i prosessen. I det første tilfelle må proben være merket på en måte som er egnet for senere fremkalling, mens amplikonet er merket i den reverse utgaven. Begge systemer kan realiseres i mikrotiterplater. Siden immobiliseringsevnen er begrenset foretrekkes i foreliggende oppfinnelse det forlengse hybridiseringssystem, grunnet det store antall enkeltprober som utgjør den benyttede probeblanding.

Fremgangsmåten som beskrives i US 6214979 kan på tilsvarende måte anvendes, i denne tilsettes probene til reaksjonen under amplifiseringen. I løpet av prosessen nedbryter 5'-3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq polymerase probene, og påvisning av de dannede nedbrytningsprodukter kan anvendes for å påvise nærvær av målnukleinsyren. Også andre, hovedsakelig hybridiseringsbaserte, såkalte sanntidsdeteksjonssystemer er kjente, men disse skiller seg kun ut når det gjelder implementering og påvisningsfrem-gangsmåte og utgjør ikke en teoretisk forskjellig realisering av sekvensspesiflkk probeamplikonbinding.

For immobiliseringen kan amplikonene være merkede. Av de forskjellige mulighetene ifølge foreliggende oppfinnelse foretrekkes biotinmerking av primerne og anvendelse av merket primer i amplifiseringsreaksjonene. I nærvær av avidin eller streptavidin absorbert til en fast fase fører biotin til immobilisering av amplikonet, grunnet den svært spesifikke og svært stabile binding mellom avidin og biotin. I en gitt reaksjon vil kun primere som hybridiseres til den ene eller den andre tråd være biotinylerte, slik at den andre tråden kan fjernes før hybridiseringen.

For påvisningsformål kan probene være merkede med en merket gruppe som kan påvises ved forskjellige fremgangsmåter, for eksempel ved påvisningsfremgangsmåter som bygger på fluorescens, radioaktivitet, kolorimetri, røntgendiffraksjon, absorpsjon, magnetisme, enzymaktivitet osv. Den egnede merkingen kan således omfatte, men er ikke begrenset til, fluorofores, kromoforer, isotoper, elektrontette forbindelser, enzymer eller ligander som kan inngå i spesifikk binding. Kombinasjoner av systemene som nevnes ovenfor kan også anvendes. I foreliggende oppfinnelse foretrekkes den spesifikke binding mellom fluorescein og antifluorescein-HRPO-antistoff, som påvises ved pepperrot-peroksidaseoksidasjonsreaksjonen i nærvær av HPPA-substrat og H202(se Eksempel 2). I foreliggende oppfinnelse anvendes biotinilerte forover-primere eller reverse primere. Både systemer for merking av probene og anti-fluorescein-HRPO er kommersielt tilgjengelige. Kjemikalier som er nødvendige for vask og de forskjellige løsningene er også generelt tilgjengelige. Systemer som benytter alkalisk fosfatase eller et annet enzym hvis aktivitet kan påvises kan også utformes eller anvendes. I tillegg til fluorescens-påvisning er luminometri og kolorimetri også aksepterbare deteksjonsfremgangsmåter for medisinsk diagnostisk anvendelse av systemet.

Å la en intern kontroll inngå ved diagnostisk anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir muligheter for identifisering av falske negative reaksjoner og foretrekkes fra et diagnostisk synspunkt. Forskjellige kunstige eller naturlige DNA-kilder kan anvendes for intern kontroll. Systemer som ikke gir en økning av antall primere som anvendes i reaksjonen foretrekkes, og mengden og de analytiske egenskapene til den interne kontrollmål-nukleinsyre standardiseres på egnet vis. I foreliggende oppfinnelse tilsettes en kunstig nukleinsyresekvens (SEQ. ID. NO: 68) til prøven i form av et rekombinant plasmid (Eksempel 6). I foreliggende oppfinnelse utføres påvisning av den interne kontroll parallelt med påvisning ved hybridisering av HPV-DNA, og kun fremkalling av substratene skjer separat. Proben er digitoksigeninmerket (SEQ. ID. NO: 69) og kan påvises med anti-digitoksigeninantistoff konjugert til alkalisk fosfatase. Andre påvisningsteknikker er imidlertid også egnede for påvisning av intern probe.

Påvisning av den interne kontroll kan imidlertid også utføres basert på mobilitetsforskj eller ved anvendelse av agarosegelelektroforese eller andre egnede teknikker.

For amplifisering og påvisning av HPV-DNA er fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse egnet for fremstilling av en harmonisert enhet av reagensene (et sett). I denne formen kan settet inneholde alle de påfølgende reagenser eller enhver kombinasjon av disse og andre reagenser: primere, primerblandinger, buffere, varmestabil polymerase, positivt kontroll-HPV-DNA, ikke-HPV-DNA, internt kontroll-DNA, prober eller probeblandinger og antistoff-enzymkonjugat.

Beskrivelsen av sekvenser av primere og prober ifølge oppfinnelsen er kun illustrerende. Mange varianter av både de generiske og de typespesifikke probene kan utformes av fagfolk ved anvendelse av det generiske eller det typespesifikke genomiske HPV-område, følgelig er disse variantene i den grad de er utvalgt fra det genomiske område ifølge oppfinnelsen dekket av foreliggende oppfinnelses område.

Oppfinnelsen presenteres i mer detalj i de påfølgende eksempler. Selv om fremgangsmåten som danner grunnlaget for oppfinnelsen kan anvendes for amplifisering av ethvert HPV-genom anvendes i de påfølgende eksempler kun de genitale HPV-genomer, som er av større medisinsk betydning. Det bør bemerkes at eksemplene kun er illustrerende og ikke skal oppfattes som begrensende for oppfinnelsens område.

Eksempel 1

Syntese av oligonukleotidprimere

Oligonukleotidprimerne som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble erholdt fra kommersielle kilder (IDT, USA). Primerne ble syntetisert med en 5' amino-gruppe. NHS-ester ble anvendt for merking med biotin, fluorescein og digitoksigenin. De merkede nukleotidene ble HPLC-renset.

Eksempel 2

Prosessering av prøver, fremstilling av DNA

Prøver ble uttatt av gynekologer ved anvendelse av "cytobrush", og prøvene ble overført til PBS (10 mM fosfatbufret saltvann pH = 7,4, sigma, 138 mM NaCl, 2,7 mM KC1). Forbehandlingen av prøvene ble utført i prøverørene: før lyseringen ble prøvene sentrifugert (2000 xg, 10 minutter), supernatantene ble fjernet og 1 ml PBS-løsning ble tilsatt, prøvene ble vorteksbehandlet og sentrifugert på ny, hvoretter supernatanten ble fjernet. Så ble 250 ul lyseringsløsning tilsatt til prøvene (0,5 mg/ml proteinase-K, 0,01 M TPJS-HCl pH = 8, 0,001 M EDTA pH = 8, i destillert vann), hvor denne løsning inneholder den interne kontroll for HPV-analysen (SEQ. ID. NO: 68), og prøvene ble vorteksbehandlet og inkubert i 30 minutter ved 56 °C. Fra dette punkt ble alle væskehåndteringsoppgaver utført i en TECAN RSP150 robot. 200 ul bindingsløsning (5,5 M GUSCN, 20 mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl pH = 6,5, 65 mM ditiotreitol, 40 g/l silika, SIGMA Kat. nr. 28,851-3, destillert vann) ble tilsatt, og kiselgelen ble separert fra de løselige bestanddelene ved vakuumfiltrering. Filtrering benyttes igjen for to gangers vask av kiselgelen med 200 ul bindingsløsning uten kiselgel (5,5 M GUSCN, 20 mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl pH = 6,5,65 mM ditiotreitol, destillert vann), og to gangers vask med 200 ul vaskeløsning (25 % isopropylalkohol, 25 % 96 % etanol, 50 % destillert vann, 0,1 M NaCl), og endelig vask med 200 ul 96 % etanol. Etter lufttørking av kiselgelen ble DNA eluert i 200 ul 10 mM TRIS-løsning pH 8,0. Eluert DNA lagres nedfrosset ved - 20 °C inntil videre anvendelse.

Eksempel 3

Generell beskrivelse av HPV- deteksionen

Amplifisering

Det totale reaksjons volum var 25 ul og omfattet følgende bestanddeler: 10 ul

DNA, 2,5 ul 10X polymerasebuffer (sluttkonsentrasjon: 10 mM TRIS-HCl (pH = 9,0), 50 mM KC1, 0,1 % Triton X-100 (Promegal)), 2 mM MgCl2,250 uM av hvert dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 4 uM av en primerblanding: SEQ. ID. NO: 35, 37-40, 73-75, og 1U Taq DNA-polymerase (Promega). Reaksjonen ble utført i en GeneAmp 9700 programmerbar varmeblokk med følgende parametre:

Syklus 1: 4 minutter ved 95 °C,

Syklus 2-40: 30 sekunder ved 94 °C, 1 minutt ved 48 °C og 45 sekunder ved 72 °C, Syklus 41: 3 minutter ved 72 °C.

Hybridisering og påvisning

Hybridiseringen ble utført i fast fase. 24 timer tidligere ble sorte 96-brønners polystyrenplater (Costar) belagt med streptavidin (0,02 mg/ml streptavidin i PBS-løsning). Platene ble inkubert ved romtemperatur, og 24 timer senere ble platene vasket to ganger med 250 ul vaskeløsning [25 mM TRIS pH = 7,5,125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3 % Tween-20]. 20 ul av produktet fra PCR-reaksjonen fortynnes med 140 ul destillert vann, og 5 ul av denne løsningen ble blandet med 45 ul bindingsbuffer [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM EDTA-Na2, 5X Denhardts løsning, 0,1 Tween-20] og overført til brønner i den streptavidinbelagte platen. Reaksjonen ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter under konstant omrysting. Så ble 50 ul elueringsbuffer [100 mM NaOH, 300 mM NaCl] tilsatt til blandingen, og platene ble inkubert i 3 minutter ved romtemperatur og vasket tre ganger med 250 ul vaskeløsning [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl2,3 % Tween-20]. Etter vask ble 50 ul hybridiseringsbuffer (5xSSC (0,3 M Na-sitrat pH = 7, 3 M NaCl), lxDenhardts løsning, 0,1 % SDS], som inneholdt fluoresceinmerkede prober (5 nM pr. probe) tilsatt til brønnene. Blandingen ble inkubert i 30 minutter ved 50 °C under konstant omry sting, og brønnene ble vasket 6 ganger med 250 ul vaskeløsning med høy stringens [0,05 x SSC, 0,3 % Tween-20]. Etter dette ble 50 ul konjugeringsbuffer [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,3 % Tween-20,1 % BSA], som inneholdt anti-fluorescens-POD-antistoff (Roche, 0,0015 E/reaksjon) tilsatt til reaksjonsblandingen. Platene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur under omrysting og vasket 6 ganger med 250 ul vaskeløsning med høy stringens [25 mM TRIS pH = 7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3 % Tween-20]. For fremkallingen ble 135 ul substratløsning (5 volumer [45 mM hydroksyfenylpropionsyre (HPPA), løst i 0,1 M TRIS-HCl pH = 9,0 buffer], + 1 volum [0,6 g/l H202i 20 mM sitrat-fosfatbuffer]) tilsatt. For å stoppe reaksjonen ble 65 ul stoppløsning [0,75 M glysin pH = 10,3] tilsatt til reaksjonsblandingen etter 20 minutter. Fluorescenssignalet ble målt i et SpektraMax-platefluorometer ved 324/410 nm. Prøvene ble ansett som positive dersom verdien var høyere enn tre ganger gjennomsnittsverdien for 3 negative kontrollprøver kjørt i parallell.

Eksempel 4

Sammenlignende undersøkelse av amplifiseringen

Prøvene ble tilsatt 10 ng/reaksjon av plasmider som inneholdt klonet HPV Ll-område fra forskjellige genotyper og anvendt for amplifisering og påvisning av HPV-DNA ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. PCR-reaksjonen og hybridiseringen ble utført ifølge beskrivelsen i Eksempel 3, bortsett fra at sammensetningen av primerne ble endret. Reaksjonen uten L1F2 (SEQ. ID. NO: 37) førte ikke til amplifisering av genotypen HPV 35, mens anvendelse av LlF2-primeren førte til effektiv påvisning av genotypen HPV 35.

Eksempel 5

Påvisning av flere HPV- genotvper

Prøvene ble tilsatt 10 ng/reaksjon av plasmider som inneholdt klonet HPV Ll-område fra forskjellige genotyper og anvendt for amplifisering og påvisning av HPV-DNA ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. PCR-reaksjonen og hybridiseringen ble utført ifølge beskrivelsen i Eksempel 3. Amplifisering og typebestemmelse av følgende HPV-genotyper ble forsøkt: 1-24,26-42, 45, 47-68, 72-74, 76-77, 86. Amplifisering av følgende genotyper ble påvist ved agarosegelelektroforese: 3, 6-7,10-11,13-14,16, 18, 20, 24, 26,29, 30-36, 39-40, 42,45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72. Ved anvendelse av blandingen av de slektsspesifikke hybridiseringsprobene ifølge SEQ. ID. NO: 41-49 (ved anvendelse av betingelsene som beskrives i Eksempel 3) kunne følgende genotyper påvises: 3-4, 6-7, 9-14, 16,18,20,24,26, 29, 30-37, 39-42,45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Resultatene viser at en gruppe av genotypene kun kan påvises ved hybridisering, noe som ikke er overraskende siden hybridisering er tilnærmet 10-100 ganger mer følsom enn agarosegelelektroforese. Det kan også ses fra resultatene at den slektsspesifikke hybridiseringen påviste alle agarosegelelektroforese-positive genotyper, noe som viser hybridiseringens sanne slektsspesifikke natur.

Eksempel 6

Påvisning av genotype HPV 35

Prøvene ble tilsatt 10 ng/reaksjon av plasmider som inneholdt klonet HPV Ll-område fra forskjellige genotyper og anvendt for amplifisering og påvisning av HPV-DNA ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. PCR-reaksjonen og hybridiseringen ble utført ifølge beskrivelsen i Eksempel 3. Hybridiseringsproben var oligonukleotidet som er utformet for genotype HPV 35 (SEQ. ID. NO: 58). Påvisning av amplikoner fra følgende genotyper ble forsøkt: 3-4, 6-7, 9-14, 16,18,20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Proben påviste kun det tilsvarende amplikon fra HPV genotype 35.

Eksempel 7

HPV- påvisning med intern kontroll

Deteksjon i prøvene fremstilt ifølge Eksempel 2 ble utført ifølge Eksempel 3, med den forskjell at proben for den interne kontroll som var merket med digitoksigenin (mengden var den samme som for de typespesifikke probene) ble anvendt med de typespesifikke probene og at antistoffene anti-fluorescein-POD og anti-alp-ALP [1:2000, Jackson Immuno Research] samtidig forelå i konjugasjonstrinnet. Etter fremkalling av POD-reaksjonen (se Eksempel 2) ble fremkalling av ALP utført ifølge følgende fremgangsmåte: substratløsningen var 6,25 mg/100 ml 4-metyl-umbelliferilfosfat i 100 mM TRIS pH = 9,0, 0,5 mM MgCl2-buffer. Etter fremkalling av HPPA ble mikrotiterplaten vasket én gang med [25 mM TRIS pH=7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3 % Tween-20], og 150 ul substratløsning ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutters inkubering ble fluorescenssignalet målt i et SpectraMax platefluorometer ved 355/460 nm. Prøvene ble ansett som positive dersom verdien var høyere enn tre ganger gjennomsnittsverdien fra 3 negative kontrollprøver analysert i parallell.

Typespesifikke prober påviste kun de adekvate genotypene. Påvisning av den interne kontroll var positiv i alle reaksjoner, bortsett fra i reaksjoner hvor det hadde skjedd en kraftig konkurranse mellom HPV-amplifisering og amplifisering av den interne kontroll. Det forelå ingen inhiberte reaksjoner (HPV-DNA eller internt kontroll-DNA ble amplifisert i alle prøver). Den interne kontroll utelukket på tilfredsstillende måte muligheten for falske negative resultater.

Claims (9)

1. Amplifiseringsprimerblanding, karakterisert vedat den består av primerne L1C1, L1C2 og newLlC2 (SEQ. ID. NO: 73-75), primerne som har SEQ. ID. NO: 37-40 og SEQ. ID. NO: 35, og om ønskelig én eller flere primere utvalgt fra gruppen som består av SEQ. ID. NO: 70-72, SEQ. ID. NO: 1-34 og SEQ. ID. NO: 36.

2. Anvendelse av primerblandingen ifølge krav 1 for amplifisering av genotypene 3,4, 6,7, 9,10,11,12, 13,14,16,18,20, 24,26,28,29, 30, 31, 32,33, 34, 35, 36, 37, 39, 40,41,42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 og 77 av humant papillomavirus.

3. Fremgangsmåte for påvisning av én eller flere HPV-genotyper i en biologisk prøve, karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: a) fremstilling av ett eller flere amplikoner som kan erholdes ved anvendelse av primerblandingen ifølge krav 1 fra nukleinsyremolekyler ekstrahert fra den biologiske prøven, og bl) hybridisering av amplikonet erholdt i (a) under stringente betingelser til en genotypespesifikk hybridiseirngsprobe; og eventuelt b2) hybridisering av amplikonet erholdt i (a) under stringente betingelser til en HPV- slektsspesifikk probe.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert vedat den HPV-slektsspesifikke probe er; i) en HPV konsensus-probe eller primer som hybridiserer til hvilke som helst av SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102,104, 106, 108 eller 110; ii) en probe komplementær til proben ifølge i); eller iii) hvilke som helst av SEQ ID NO: 41-49.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert vedat den genotypespesifikke hybridiseringsproben er; i) en HPV genotype-spesifikk probe som hybridiserer til hvilke som helst av SEQ. ID. NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103, 105, 107, 109 eller 111; ii) en probe komplementær til i); eller iii) hvilke som helst av SEQ ID NO: 50-57.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 3 til5, karakterisert vedat høyrisiko- og lavrisiko-HPV-genotypegrupper påvises.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 3 til 6, karakterisert vedat den videre omfatter påvisning av et syntetisk oligonukleotid som intern kontroll.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert vedat sekvensen ifølge SEQ. ID. NO: 68 anvendes som intern kontroll og at sekvensen ifølge SEQ. ID. NO: 69 anvendes som hybridiseringsprobe for påvisning av den interne kontroll.

9. Sett for påvisning og typebestemmelse av HPV, karakterisert vedat det omfatter: i) primerblandingen ifølge krav 1, ii) om ønskelig interne kontrollprimere, iii) hybridiseringsprober som omfatter eller hybridiserer til hvilke som helst av SEQ. ID. NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103, 105, 107, 109 eller 111, og eventuelt hvilke som helst av SEQ. ID. NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94,96, 98, 100, 102, 104,106,108 eller 110; og iv) om ønskelig hybridiseringsprober for påvisning av den interne kontroll.