KR20090091068A - Ｈｐｖ 지노타이핑용 칩 - Google Patents

Ｈｐｖ 지노타이핑용 칩 Download PDF

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KR20090091068A
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정광회
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김태선
송금수
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엄운용
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Abstract

본 발명은 캘릭스아렌 유도체가 표면 코팅된 고체기질; 및 (b) 상기 고체기질 상에 고정화 되어 있는 HPV(human papilloma virus) 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는(hybridizable) 프로브로서, 상기 프로브는 (i) HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 혼성화 부위 및 (ⅱ) 최소 2개 이상의 구아닌을 포함하는 고정화 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩에 관한 것이다. 본 발명의 HPV 지노타이핑용 DNA 칩은 스트립 형태로 구축될 수 있는 이점을 가지며, 이 경우, 분석하고자 하는 시료의 적용 및 분석 결과의 분석이 매우 용이하게 되는 이점이 있다. 또한, 본 발명에 따르면, HPV의 유전자형 결정 이외에 시료 내 HPV를 정량 분석할 수 있다.
HPV, 유전자형 분석, DNA 칩, 유리섬유, 아미노캘릭스아렌 유도체, 이민캘릭스아렌 유도체, 자기조립단분자층

Description

ＨＰＶ 지노타이핑용 칩{Chips for Genotyping ＨＰＶ}
본 발명은 HPV의 검출 또는 유전자형 결정을 하기 위한 DNA 칩에 관한 것이다.
유전자칩은 미국의 Affymetrix사가 photomask를 이용한 표면광합성기술을 이용한 고체기질 상에서 직접 염기를 선택적으로 결합하는 방법으로 유전자칩 제조기술을 발표한 뒤 알데히드 칩 등의 다양한 고체기질 상에 탐침 유전자를 화학결합으로 고정화 하여 유전자칩을 제조하는 일반화된 방식들이 개발되었다. 대한민국의 바이오메트릭스 테크놀로지㈜ (이하 BMT라 명명함) 사가 개발한 연속된 구아닌 염기를 가진 유전자 올리고머를 고체기질 상에 자발적으로 고정화 되게 고체기질의 표면을 초분자 단분자층으로 변성하는 기술을 이용하는 등의 다양한 유전자칩 제조기술이 발표되었다.
한편, 국내외에서 HPV(인유두종 바이러스) 유전자형 분석을 위한 유전자칩, 결핵균 유전자형 판별을 위한 유전자칩 등 다양한 유전자 칩이 개발되고 있다.
이러한 유전형 분석용 유전자 칩의 사용을 제한하는 문제는 다음과 같은 두 가지로 크게 구분된다.
첫째는 유전형 분석 (genotyping)을 위한 유전자칩은 신호검출을 위한 물질이 부착된 특히 형광물질이 부착된 프라이머 등을 이용하여 진행한 PCR 결과물을 유전자 칩 상에 도포하여 칩상에 고정화된 프로브(탐침) 중 최적의 유전형 일치를 보이는 프로브유전자(탐침)와 결합(혼성화반응)하여 형광이 나타나는 민감도를 이용하여 바이러스 등의 유전형을 분석한다. 문제는 이때 최적의 유전형 일치가 아니라도 유전자가 다른 유전형 분석용 프로브에 부착되는 비특이적 결합에 의해 정확하지 않은 곳에 형광감도가 나타나게 되며 이를 제거하기 위하여 혼성화반응(hybridization) 후에 진행하는 세척과정에서 이러한 비특이적 결합을 제거하는 과정으로 이용하고 있다. 이러한 세척과정은 사람에 의해 진행되어 숙련도에 따라 비특이 결합된 유전자를 제거하는 양에 차이가 나타나 최근에 개발된 많은 HPV 유전자 칩에서 false result(잘못된 결과)를 얻게 되는 경우를 피할 수 없다. 결과의 재현성을 확보하기 위하여 유체역학적으로 동일한 용매가 투입되면 동일하게 전해진 공간을 용매가 일정한 속도로 전개되어 동일한 세척과정을 진행하게 설계된 스트립을 이용한 유전형 분석기술이 필수적으로 요구되고 있다.
두 번째는 현재 형광이 부착된 핵산증폭산물로 혼성화반응을 진행한 뒤 인유두종 바이러스 유전형 분석은 수천만원대의 고가의 형광분석기를 이용하고 있다. 이러한 고가의 분석기를 최종 사용자가 구매하여 사용하는 것이 어려워 수백만원대의 저가의 분석기를 이용하여 결과를 확인할 수 있는 단순한 구조를 가진 판독기가 사용되어야 하며 이러한 판독기에 최적으로 사용될 유전형 분석용 유전자 칩 형태가 스트립 타입에 선형으로 유전형 분석을 위한 프로브 유전자가 도포되어 고정화되고 혼성화반응 용액을 흘려주어 고정화된 선형에서 선택적으로 혼성화반응이 진행된 후 선형판독기를 이용하여 결과를 판독할 수 있게 하는 스트립 타입의 인유두종바이러스 유전형 분석용 스트립이 필수적으로 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 간편한 방법, 특히 스트립 타입의 고체 기질을 이용하는 래피드 키트(rapid kit) 방식으로 HPV를 검출 및 유전자형 결정(genotyping)을 할 수 있는 방법을 개발하고 노력하였다. 그 결과, 특정 화학구조의 캘릭스아렌 유도체를 고체기질에 코팅하고 여기에 프로브 올리고뉴클레오타이드를 고정화 하는 경우에는 간편하면서도 정확하게 HPV의 검출 및 유전자형 결정을 할 수 있음을 확인함으로서, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 캘릭스아렌 유도체가 표면 코팅된 고체기질; 및 (b) 상기 고체기질 상에 고정화 되어 있는 HPV(human papilloma virus) 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는(hybridizable) 프로브로서, 상기 프로브는 (i) HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 혼성화 부위 및 (ⅱ) 최소 2개 이상의 구아닌을 포함하는 고정화 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또 는 타이핑용 DNA 칩을 제공한다.
본 발명자들은 보다 간편한 방법, 특히 스트립 타입의 고체 기질을 이용하는 래피드 키트(rapid kit) 방식으로 HPV를 검출 및 유전자형 결정(genotyping)을 할 수 있는 방법을 개발하고 노력하였다. 그 결과, 특정 화학구조의 캘릭스아렌 유도체를 고체기질에 코팅하고 여기에 프로브 올리고뉴클레오타이드를 고정화 하는 경우에는 간편하면서도 정확하게 HPV의 검출 및 유전자형 결정을 할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 캘릭스아렌 유도체가 표면 코팅된 고체기질이 이용된다:
화학식 1
Figure 112009010756473-PAT00001
상기 화학식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH 또는 -COOR이며; 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 이고; 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 또는 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z이며; Z는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 이고; -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기를 나타내고; n은 2-15의 정수, m은 1-10의 정수, c는 0-10의 정수이다;
화학식 2
Figure 112009010756473-PAT00002
상기 화학식에서, R1, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH 또는 -COOR이며; 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 이고; 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 또는 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z이며; Z는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 이고; -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기를 나타내고; n은 2-15의 정수, m은 1-10의 정수, c는 0-10의 정수이고;
화학식 3
Figure 112009010756473-PAT00003
상기 화학식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH 또는 -COOR이며; 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 이고; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8 모두 동시에 -H인 경우는 제외되며; 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 또는 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z이며; Z는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 이고; -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기를 나타내고; n은 2-15의 정수, m은 1-10의 정수, c는 0-10의 정수이다.
본 발명의 특징 중 하나는, 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 캘릭스아렌(calixarene) 유도체가 표면 코팅된 고체기질을 이용하는 것이다. 캘릭스아렌 유도체는 본 발명자들에 의해 개발된 것으로서, 대한민국 특허 제698763호 및 제748082호에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 두 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 화학식 1 및 3은 아민캘릭스아렌 유도체이고, 화학식 2는 이민캘릭스아렌 유도체이다.
화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3의 캘릭스아렌 유도체를 고체기질에 코팅하면 상기 유도체는 자기조립단일막(self-assembled monolayer: SAM)을 형성한다.
본 발명의 또 다른 특징 중 하나는, 본 발명에 이용되는 프로브가 (i) HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 혼성화 부위(hybridizing portion) 및 (ⅱ) 최소 2개 이상의 구아닌을 포함하는 고정화 부위(immobilizing portion)로 이루어져 있는 것이다.
본 명세서에서, 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
본 발명의 프로브에서 두 부위를 포함하며, 이 중에서 “혼성화 부위”는 HPV 타겟 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 부위로서 HPV 타겟 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. “고정화 부위”는 고체기질에 코팅되어 있는 캘릭스아렌 단일막에 고정화 되는 부위로서, 최소 2개 이상의 구아닌을 포함한다. 이 고정화 부위의 구아닌 염기는 캘릭스아렌 유도체의 4 개의 질소 원자를 통한 다 중 분자인식에 의하여 프로브를 캘릭스아렌 단일막에 고정화시킨다.
최소 2개 이상의 구아닌은 연속적으로 위치하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프로브의 고정화 부위에서 최소 2개 이상의 구아닌은 프로브의 5’-말단 또는 3’-말단에 위치하며, 보다 바람직하게는 5’-말단에 위치한다.
프로브를 언급하면서 사용되는 용어 “구아닌”은 구아닌 염기가 있는 뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 프로브는 그의 5’-말단 또는 3’-말단에 7-15개의 구아닌을 포함하며, 보다 바람직하게는 7-10의 구아닌을 포함한다.
본 발명의 칩을 구성할 수 있는 고체기질은 특별하게 제한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 고체기질도 포함한다. 바람직하게는, 고체기질은 유리, 유리섬유, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미눔), 금속 옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 또는 콜로이드이다.
본 발명은 특히, 스트립 타입의 고체 기질을 이용하는 래피드 키트(rapid kit) 방식으로 HPV 검출 및 유전자형 결정을 하기 위하여 개발된 것이다. 따라서, 본 발명의 키트를 래피드 키트로 구축한다면, 유리섬유 고체기질을 이용하는 것이 가장 바람직하다. 래피드 키트는 일반적으로 고체기질 내에서 액상 상태의 시료가 유동 또는 이동하여 작동된다. 통상적으로 래피드 키트는 크로마토그래피 분석 방식으로 불린다. 본 발명의 키트는 이러하는 래피드 키트 방식으로 구축하는 데 매우 유리하다. 유리섬유는 일반섬유나 멤버레인(membrane)처럼 한쪽에 적용된 용액(예컨대, PCR 증폭된 유전자 시료)이 중력이나 모세관 현상 등의 물리적 성질에 따라 용액이 전개되는 특성을 갖는다. 본 발명에서는 상술한 유리섬유의 특성을 이용하여 표지물질(예컨대, 형광물질)이 결합된 PCR 증폭산물이 흘러가며 고정화된 HPV 유전자형 분석용 프로브와 혼성화반응을 진행하여 유전자형 분석이 가능하게 된다.
본 발명의 키트는 HPV의 검출뿐만 아니라, HPV의 유전자형을 결정하는 데에도 매우 유용하다. HPV 유전자형을 결정하는 경우, 본 발명의 DNA 칩은 HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 HPV 타입의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 프로브가 고체 기질에 고정화 된다.
HPV의 타입은 그 종류가 많으며, 현재까지 약 100 종의 HPV 타입이 알려져 있다. 이 중에서, HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68은 고위험 타입(high risk types)으로 알려져 있다. 한편, HPV 타입 6, 11, 42, 43 및 44는 저위험 타입(low risk types)으로 알려져 있다.
본 발명에서 이용되는 HPV 지노타이핑용 프로브의 구체적인 예는 서열목록 제1서열 내지 제4서열에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 칩은 인간 세포의 하우스킵핑(housekeeping) 유전자에 혼성화되는 프로브를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에서 용어 “하우스킵핑 유전자”는 세포 기능을 유지하기 위하여 계속적으로 발현되는 유전자를 의미한다(Watson et al. Molecular Biology of the Gene , Vol . 1, 1965).
하우스킵핑 유전자에 혼성화되는 프로브는 본 발명의 칩에 의해 최종적으로 나오는 시그널을 정규화(normalization)하게 하며, 이를 통하여 HPV 유전자를 정량화할 수 있다. 실시예 5에서 입증한 바와 같이, 고농도와 저농도의 하우스킵핑 유전자(베타글로빈 유전자)와 HPV 유전형 등이 보여주는 혼성화 시그널(예컨대, 형광세기)의 비를 분석하여 HPV 유전형의 농도를 정량화할 수 있다.
본 발명의 칩에 사용되는 하우스킵핑 유전자에 대한 프로브는, 바람직하게는 GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) 유전자, β-액틴 유전자, PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 유전자, β-글로빈 유전자 또는 28S RNA 유전자에 혼성화될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로브이다.
본 발명의 칩은, 특히 스트립 타입의 고체 기질을 이용하는 래피드 키트 방식으로 구축되는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 칩은 멤브레인 스트립 형태를 가지며 HPV 타입에 특이적으로 결합하는 최소 2종의 프로브가 상기 멤브레인 스트립을 따라 개별 위치에 고정화 되어 있고, 분석하고자 하는 DNA 시료는 상기 멤브레인 스트립의 한쪽 말단에 적용되어 멤브레인 스트립을 따라 이동한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 DNA 칩은 (i) 고체기질로서 유리섬유로 이루어진 멤브레인 스트립, (ii) 상기 유리섬유 멤브레인 스트립 상에 HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 HPV 타입의 뉴클레오타이드 서열에 각각 특이적으로 혼성화되는 최소 2종의 프로브, 상기 프로브는 상기 멤브레인 스트립을 따라 개별 위치에 고정화 되어 있고, 및 (iii) 인간 세포의 하우스킵핑(housekeeping) 유전자에 혼성화되는 프로브를 포함한다.
본 발명은, 현재 사용되고 있는 HPV 유전자형 분석용 DNA 칩(HPV genotyping DNA Chip)에서 나타나는 문제점들을 해결한다. 본 발명에 따르면, HPV 유전자에 혼성화되는 프로브를 유리섬유 등의 스트립 상에 도 4와 같은 형태의 선형으로 고정화하고, DNA 시료(예컨대, PCR 증폭산물)가 스트립 상을 이동하며 특정 유전자형의 프로브와 혼성화되어 유전자형을 판독할 수 있도록 하는 스트립형 HPV 유전자형 분석용 스트립 칩을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고체기질에 고정화되는 프로브 또는 분석하고자 하는 DNA 시료에는 검출가능한(detectable) 신호를 발생시키는 표지(label)가 결합되어 있다. 예를 들어, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 방사능 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지(예컨대, 플루오리신, 피코에리트린, 로다민, 리사민, TAMRA, Cy5, Cy3, HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 중금속 표지(예컨대, 금)이다. 표지 물질에 의한 레이블링 방법은 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.
본 발명의 DNA 칩에 분석하고자 하는 DNA 시료를 적용하여 프로브와 혼성화 되도록 하며, 이어 혼성화 반응 발생 여부를 결정함으로써 시료 내의 HPV의 존재여부 또는 양을 결정한다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다.
예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으 로 세척하는 것을 의미한다. 저엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 칩은 분석 대상의 시료 내의 HPV 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 사용된 프라이머에 혼성화 되는 혼성화 대조군용 프로브를 추가적으로 포함한다.
일반적으로, DNA 칩에 적용되는 DNA는 분석 대상의 시료에서 분리되고 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭된다. 즉, 분석 대상의 시료에서 분리된 DNA의 PCR 증폭물이 DNA 칩에 적용된다. 본 발명의 DNA 칩은 분석 대상의 시료(예컨대, 자궁경부로부터 얻은 세포) 내의 HPV 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 사용된 프라이머에 혼성화 되는 혼성화 대조군용 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다. 즉, PCR 증폭물에는 반응하지 않은 프로브가 잔존하게 되는 데, 이 프로브에 혼성화 대조군용 프로브가 혼성화 하게 된다. 혼성화 대조군용 프로브에 의해 나오는 시그널은 본 발명의 DNA 칩에서 나오는 시그널의 오류 가능성을 크게 줄일 수 있다. 즉, 혼성화 대조군용 프로브에서 혼성화 시그널이 나오고 HPV 특이적 프로브에서 혼성화 시그널이 나오지 않은 경우에는 시료 내에 HPV가 없는 것으로 판정되지만, 혼성화 대조군용 프로브에서도 시그널이 나오지 않고 HPV 특이적 프로브에서 시그널이 나오지 않은 경우에는 오류 음성(false negative) 결과로 판정될 수 있다.
바람직하게는, 혼성화 대조군용 프로브는 HPV 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 사용된 역방향 프라이머와 혼성화되는 프로브이고, 보다 바람직하게는 HPV 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 사용된 형광물질로 표지된 역방향 프라이머와 혼성화되는 프로브이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 혼성화 대조군용 프로브의 구체적인 예는 표 2에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 칩은 HPV 타입 비특이적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 양성 대조군 프로브를 추가적으로 포함한다. 양성 대조군 프로브의 구체적인 예는 표 2에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 칩은 HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되지 않는 음성 대조군 프로브를 추가적으로 포함한다. 음성 대조군 프로브의 구체적인 예는 표 2에 기재되어 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 HPV 지노타이핑용 DNA 칩은 HPV의 검출 및 유전자형 결정에 매우 유용하다.
(ⅱ) 본 발명의 HPV 지노타이핑용 DNA 칩은, 스트립 형태로 구축될 수 있는 이점을 갖는다.
(ⅲ) 본 발명의 DNA 칩이 스트립 형태로 구축되는 경우, 분석하고자 하는 시료의 적용 및 분석 결과의 분석이 매우 용이하게 되는 이점이 있다.
(ⅳ) 본 발명에 따르면, HPV의 유전자형 결정 이외에 시료 내 HPV를 정량 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 5,11,17,23- 테트라디벤질아미노캘릭스[4]아렌 -1,3- 헥산알데하이드 ( TDBACAHA )에 의한 아민-변형된 유리섬유 표면의 변형
CHCl3 유기용매에 화학식 1의 유도체 중에서 5,11,17,23-테트라디벤질아미노캘릭스[4]아렌-1,3-헥산알데하이드(TDBACAHA, 참조: 대한민국 특허 제698763호)를 0.1-5.0 mM 농도로 용해하여 용액을 제조하였다. 이어, 도 1a와 같이 알려진 방법(Langmuir, 12:5338-5342(1996))에 따라 유리섬유 표면을 아민으로 변성하고 이 유리섬유를 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 도 1a와 같이 유전자 고정화용 스트립으로 사용할 아미노캘릭스아렌 단분자층으로 변형된 유리섬유를 제조하였다.
실시예 2: 5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4] 아렌다이헥사알데하이 드 ( TBICAHA )에 의한 아민-변형된 유리섬유 표면의 변형
CHCl3 유기용매에 화학식 2의 유도체 중에서 5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4]아렌(TBICAHA, 참조: 대한민국 특허 제748082호)를 0.1-5.0 mM 농도로 용해하여 용액을 제조하였다. 도 1b와 같이 알려진 방법(Langmuir, 12:5338-5342(1996))에 따라 유리섬유 표면을 아민으로 변성하고 이 유리섬유를 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 도 1b와 같이 유전자 고정화용 스트립으로 사용할 이민캘릭스아렌 단분자층으로 변형된 유리섬유를 제조하였다.
실시예 3: 변형 유리섬유 기질 상에서 프로브와 HPV PCR 산물의 혼성화 반응에 의한 HPV 유전자형 결정
(a) PCR 증폭을 이용한 HPV DNA 시료의 준비
본 실시예에서 사용된 서로 다른 유형의 HPV 플라스미드DNA 를 포함하는 E. coli 균주는 다음과 같다: HPV-16 (ATCC 45113), HPV-18 (ATCC 45152), HPV-6b (ATCC 45150), HPV-11 (ATCC 45151),
각 주형의 HPV 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 E. coli 균주는 37oC LB 액체 배지에서 16시간동안 진탕 배양한 다음 "Accuprep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit (Cat. No. K-3111, ㈜바이오니아 사)"로 분리 정제하여 10ng/ul로 농도조정하였으며, 이를 표준 주형 DNA 용액으로 활용하였다.
상기에서 정제된 HPV 유형의 DNA를 주형으로 하고 표 1의 프라이머를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 ㈜바이오니아 사에 합성 의뢰하여 구입하였다. PCR 실험은 ㈜바이오니아 사로부터 구입한 PCR 완충액 10 ㎕, 1.5 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 30 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), Taq 중합효소 (1 unit) 와 프라이머 1 ㎕ (10 pmol/㎕), 증류수 7 ㎕ 및 주형 DNA 1 ㎕로 구성된 반응액을 이용하여 실시하였다. PCR 온도 사이클은, 94℃에서 5분간 1회, 94℃ 1분, 45℃ 45초 및 72℃ 1분의 35회 반복, 72℃에서 5분간 1회이다. 최종 반응액 5 ㎕를 DNA 스탠더드 마커(size standard maker)와 함께 2% 아가로스 겔에 부과하여 전기영동하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 UV 를 이용하여 확인하였다.
프라이머명 염기서열 (5'→ 3')
정방향 GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTT
Cy5*-역방향 CY5-CCTAGTGGCTCTATGGTAACCTCTGACGC
*Cy-5는 미국의 텔레켐 사에서 구입함.
(b) 유리섬유에 프로브의 고정화
프로브 유전자 고정화에는 바이오닷 (Biodot) 분주기 장치 (모델명 XYZ 3050, 미국)를 사용하였다(도 3). 표 2에 기재되어 있는 HPV-16, -18, -6, -11, 양성 대조군 1(PC-1), 양성 대조군 2(PC-2), 음성대조군(NC) 및 혼성화 대조군(HC)을 포함하여 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 프로브 올리고머를 7-30 pmol/㎕ 로 BMT 분주용액(㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)에 용해하여 고정화 용액(100 mM 암모늄 이온용액)을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 분주노즐을 이용하여 20 mm/sec(0.7 ㎕/Cm)의 속도로 분주하였으며, ㈜바이오메트릭스 테크놀로지사에서 제조한 변형된 유리 섬유에 도포하여, 프로브를 두께 0.2-3.0 mm인 선형 밴드로 도포하여 자발적으로 고정화시켰다. 상온에서 1-24 시간동안 고정화한 후 올리고 DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹하기 위하여, 세척된 유리섬유를 250 mL 의 BMT 블록킹 용액(4xSSC, 1% 카제인 및 0.5% 폴리에틸렌글리콜 포함)에 넣고 10-30분 동안 처리하여 40-50℃ 인큐베이터에서 30분-4시간 동안 건조하여 도 5에서 보여지는 스트립을 제조하였다.
프로브 염기서열 ( 5'→ 3') HPV 유형
HPV-1 ggg ggg ggg t tca aat tat ttt cct aca HPV-16
HPV-2 ggg ggg ggg gt gtg tat tct ccc tct HPV-18
HPV-3 ggg ggg ggg agt ata tat gtt aac acc HPV-6
HPV-4 ggg ggg ggg tct gta gct act agt att tat gta cat aca HPV-11
PC-1* ggg ggg ggg tat ttt cct aca cct agt gg ggg ggg ggg tat tct ccc tct cct agt gg 양성 대조군
PC-2** ggg ggg ggg tat gtt aac acc cct agt gg ggg ggg ggg tat gta cat aca cct agt gg 양성 대조군
NC ggg ggg ggg aaa gct gct gct cgt cgt cgt cgt 음성 대조군
HC ggg ggg ggg ttt aca cct agt ggc tct atg gtg tcc tct 혼성화 대조군
*두 종의 프로브를 혼합하여 도포(HPV -16, -18 에 대한 양성 대조군)
**두 종의 프로브를 혼합하여 도포(HPV -6, -11 에 대한 양성 대조군)
(c) 형광부착된 핵산중합반응 결과물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 프로브와 혼성화시켜 형광을 이용한 물질분석방법
실시예 1에서 제조된 표면변형 유리섬유 기질에 실시예 3의 (b)와 같은 방법으로 프로브를 고정화된 유리섬유를 도 3과 같은 형태의 케이스에 조립하여 핵산증폭산물을 전개시켜 특정 유전자의 존재 유무를 확인하였다. 전개용액의 제조를 위하여 1.5 mL튜브에 실시예 3의 (a)에서 제조된 핵산중합반응 결과물 5 ㎕와 BMT hyb-mix A(6xSSC , 20% 포름아마이드 및 0.05% Triton X-100 포함) 75 ㎕ 비율로 혼합용액을 제조하였다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 80 ㎕의 혼합용액을 조립된 스트립의 시료주입구에 주입하였다. 주입후 스트립을 상온에서 3-120분 동안 방치하여 용액이 전개되어 혼성화 반응이 진행되게 한 뒤 BMT Wa-B-2 (4xSSC, (㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)용액을 100 ㎕ 투입하고 5분 후 스트립을 분리하여 반응이 끝난 유리섬유(스트립)를 슬라이드에 부착하여 마이크로어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 분석한 결과는 도 5a 및 5b의 위쪽 부분에 스트립 형태로 나타나 있다. 도 5a 및 5b의 그래프는 스트립 분석용으로 사용되는 BMT HPV strip reader type-1(㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)을 이용하여 분석한 결과이다. HC, PC-1 및 PC-2의 형광감도와 HPV 타입이 나타나는 부분의 형광감도의 비는 두 가지의 결과에서 상당한 상관관계가 보여준다. PC-1 및 PC-2 는 HPV 바이러스의 존재유무를 확인하기 위하여 사용된 양성대조군이다.
도 5a-5b에서 분명히 알 수 있듯이, 각각의 HPV 유형을 함유하고 있는 샘플에 대해서 해당 HPV 유형 특이적-프로브가 고정화된 밴드(선)에서 특이적인 혼성화 반응이 나타나고, 동시에 PC 영역에서도 혼성화 반응이 진행되어 바이러스 존재 유무를 확인시켜주고 있으며 다른 프로브 위치에서는 아무런 혼성화 반응이 일어나지 않는다. 따라서, 본 발명에 의해 개발된 스트립형 유전자 칩은 높은 선택성과 낮은 비특이적 결합도로 HPV 유전자형 분석을 가능하게 한다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: HPV 및 베타글로빈의 동시 검출
(a) 베타글로빈 유전자의 PCR 결과물을 이용한 유전자 진단을 위한 올리고 프로브의 고정화
유리섬유를 이용한 스트립에 프로브를 고정화 하기 위하여 바이오닷 (Biodot) 분주기 장치(모델명 XYZ 3050, 미국)를 사용하였다. 표 3에 기재된 HPV type 16, type 18 및 베타글로빈의 핵산증폭산물(PCR 결과물)과 결합하는 프로브 및 혼성화 대조군(HC)용 프로브 등의 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고유전자를 7-30 pmol/㎕ 의 농도로 BMT 분주용액(㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)과 혼합하여 고정화 용액을 준비하였다. 상기 고정화 용액을 분주노즐을 통하여 20 mm/sec(0.7 ㎕/Cm)의 속도로 분주하였으며, 실시예 1 또는 2에 따라 제조된 변성된 유리 섬유(스트립)에 0.1-3.0 mm인 선형으로 도포하였다. 상온에서 1-24 시간동안 고정화한 후 프로브가 고정화된 부분을 제외한 나머지 부분을 블록킹 하기 위하여, 프로브가 고정화된 유리섬유를 250 mL의 BMT 블록킹 용액(4xSSC, 1% 카제인 및 0.5% 폴리에틸렌글리콜 포함)에 넣고 10-30분 동안 처리하고 40-50℃인큐베이터에서 30분-4시간동안 건조하여 제조하였다.
프로브 염기서열 ( 5'→ 3') HPV 유형
HPV-1 ggg ggg ggg t tca aat tat ttt cct aca HPV-16
HPV-2 ggg ggg ggg gt gtg tat tct ccc tct HPV-18
Beta-G ggg ggg ggg c tgc cct gtg ggg caa g 베타글로빈
HC gggggg ggg ttt aca cct agt ggc tct atg gtg tcc tct 혼성화 대조군
(b) 타겟 서열의 PCR 증폭
자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5ml PBS 보존액이 담겨 있는 15ml 튜브에 넣고 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 한다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거한다. 세포는 "Accuprep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Cat. No. K-3111, ㈜바이오니아 사)"로 분리 정제하여 10ng/ul로 농도조정하였으며, 이를 주형DNA 용액으로 활용하였다.
상기에서 정제된 HPV 유형의 DNA를 주형으로 하고 표 4의 프라이머를 사용하여 다음과 같이 핵산중합반응(PCR)을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 ㈜바이오니아 사에 합성 의뢰하여 구입하였다. PCR 실험은 ㈜바이오니아 사로부터 구입한 PCR 완충액 10 ㎕, 1.5 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 30 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), Taq 중합효소 (1 unit)와 프라이머 1 ㎕(10 pmol/㎕), 증류수 7 ㎕ 및 주형 DNA 1 ㎕로 구성된 반응액을 이용하여 실시하였다. PCR 온도 조건은, 94℃에서 5분간 1회, 94℃ 1분/45℃ 45초/72℃ 1분을 반복하는 사이클을 35회 반복 후 72℃에서 5분간 1회의 조건이다. 최종 반응액 5 ㎕를 DNA 스탠더드 마커(size standard maker)와 함께 2% 아가로스 겔에 부과하여 전기영동 하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 UV 를 이용하여 확인하였다.
프라이머명 염기서열 (5' 3')
정방향 caa ctt cat cca cgt tca cc
Cy5-역방향 CY5-gg tga acg tgg atg aag ttg
(c) 형광부착된 핵산중합반응 결과물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 베타글로빈 프로브와 혼성화시켜 형광을 이용한 판독방법
상기에서 제조된 프로브 고정화된 유리섬유 기질을 도 3과 같은 형태의 스트립으로 조립하여 유리섬유 상에서 유전자를 포함한 용액의 흐름을 이용한 용액상 유전자와 고정화된 프로브 사이의 결합에 의해 용액상의 특정 유전자 및 베타글로빈(β-globin)의 존재를 확인하였다. 형광부착된 핵산증폭산물과 프로브의 혼성화 반응을 위하여, 1.5 mL 튜브에 상기 실시예 3-(a)의 방법으로 제조된 HPV 바이러스 핵산중합반응 결과물과 실시예 4-(b)에서 제조된 베타글로빈 핵산중합반응결과물을 각각 5 ㎕ 그리고 BMT hyb-mixA(6xSSC , 20% 포름아마이드 및 0.05% Triton X-100 포함) 75 ㎕를 혼합하여 85 ㎕의 혼성화 반응용액을 만들었다. 이 용액을 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 85 ㎕의 혼합용액을 조립된 스트립의 시료주입구에 주입하였다. 스트립을 상온에서 3-120분 동안 방치하여 혼성화 반응용액이 전개되며 혼성화 반응을 진행한 후 BMT Wa-B-2(4xSSC, ㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국) 용액을 100 ㎕ 투입하여 세척용액을 전개시키고 BMT에서 스트립 분석용으로 사용되는 BMT HPV strip reader type-1(㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)을 이용하여 분석하였다(도 6a 및 6b). 반응이 끝난 유리섬유(스트립)를 케이스에서 분리하여 유리 슬라이드에 부착하고, 마이크로어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 두 가지의 판독기에서 얻어진 결과를 종합하면, HC 그리고 베타글로빈과 HPV 유전형 등이 보여주는 형광감도의 비는 스캐너와 BMT reader에서 독립적으로 얻어진 결과와 상당한 상관관계가 있을 나타낸다.
실시예 5: 베타글로빈 유전자와 혼성화 대조군(HC)을 이용한 HPV의 정량
(a) 베타글로빈 유전자의 PCR 결과물을 이용한 유전자 진단을 위한 올리고 프로브의 고정화
유리섬유를 이용한 스트립에 프로브를 고정화 하기 위하여 바이오닷(Biodot) 분주기 장치(모델명 XYZ 3050, 미국)를 사용하였다. 표 3에 기재된 HPV type 16과 베타글로빈의 핵산증폭산물(PCR 결과물)과 결합하는 프로브를 1배 및 1/10배의 농도로 고정화가 될 수 있도록 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고프로브를 7-30 pmol/㎕ 의 농도로 BMT 분주용액(㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)과 혼합하여 고정화 용액을 준비하였다. 상기 고정화 용액을 분주노즐을 통하여 20 mm/sec(0.7 ㎕/Cm)의 속도로 분주하였으며, 실시예 1 또는 2에 따라 제조된 변성된 유리 섬유(스트립)에 0.1-3.0 mm인 선형으로 도포하였다. 상온에서 1-24 시간동안 고정화한 후 프로브가 고정화된 부분을 제외한 나머지 부분을 블록킹하기 위하여, 프로브가 고정화된 유리섬유를 250 mL의 BMT 블록킹 용액(4xSSC, 1%카제인 및 0.5% 폴리에틸렌글리콜 포함)에 넣고 10-30분 동안 처리하고 40-50℃인큐베이터에서 30분-4시간동안 건조하여 제조하였다.
프로브 염기서열 ( 5'→ 3') HPV 유형
HPV-1 ggg ggg ggg t tca aat tat ttt cct aca HPV-16
Beta-G ggg ggg ggg c tgc cct gtg ggg caa g 베타글로빈
(b) 타겟 서열의 PCR 증폭
자궁경부세포 채취 솔을 이용하여 자궁경부로부터 세포를 채취하여 5ml PBS 보존액이 담겨 있는 15 ml 튜브에 넣고 2분 동안 강력하게 교반하여 솔에 붙어 있는 세포가 보존액으로 떨어져 나오도록 한다. 원심분리기에서 3,000g로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거한다. 세포는 "Accuprep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Cat. No. K-3111, ㈜바이오니아 사)"로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정하였으며, 이를 다시 2.5x104 및 2.5x103 copies 의 농도로 제조하여 이를 주형 DNA 용액으로 활용하였다.
상기에서 정제된 DNA를 주형으로 하고 표 6의 프라이머를 사용하여 HPV 16형과 베타글로빈 유전자에 대해 다음과 같이 핵산중합반응(PCR)을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 ㈜바이오니아 사에 합성 의뢰하여 구입하였다. PCR 실험은 ㈜바이오니아 사로부터 구입한 PCR 완충액 10 ㎕, 1.5 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 30 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), Taq 중합효소 (1 unit)와 프라이머 1 ㎕(10 pmol/㎕), 증류수 7 ㎕ 및 주형 DNA 1 ㎕로 구성된 반응액을 이용하여 실시하였다. PCR 온도 조건은, 94℃에서 5분간 1회, 94℃ 1분/45℃ 45초/72℃ 1분을 반복하는 사이클을 35회 반복 후 72℃에서 5분간 1회의 조건이다. 최종 반응액 5 ㎕를 DNA 스탠더드 마커(size standard maker)와 함께 2% 아가로스 겔에 부과하여 전기영동 하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 UV 를 이용하여 확인하였다.
프라이머명 염기서열 (5' 3')
HPV(정방향) gatggtgatatggtagatacaggattt
HPV(역방향) CY5-cctagtggctctatggtaacctctgacgc
Beta-G(정방향) caa ctt cat cca cgt tca cc
Beta-G(역방향) CY5-gg tga acg tgg atg aag ttg
(c) 형광부착된 핵산중합반응 결과물을 도포하여 유리섬유에 고정화된 베타글로빈 프로브와 혼성화시켜 형광을 이용한 판독방법
상기에서 제조된 프로브 고정화된 유리섬유 기질을 도 3과 같은 형태의 스트립으로 조립하여 유리섬유 상에서 유전자를 포함한 용액의 흐름을 이용한 용액 상 유전자와 고정화된 프로브 사이의 결합에 의해 0, 2.5x103, 및 2.5x104 copies의 각기 다른 농도의 주형유전자로 PCR한 결과물을 스트립 상에 도포하여 특정 농도에서 발현되는 HPV 유전자의 농도를 혼성화 대조군(HC)(표 2의 HC 프로브 이용) 및 베타글로빈(β-globin)의 형광감도를 이용하여 정량화하였다. 형광부착된 핵산증폭산물과 프로브의 혼성화 반응을 위하여, 1.5 mL 튜브에 상기 실시예 5-(b)의 방법으로 제조된 HPV 바이러스 핵산중합반응 결과물과 베타글로빈 핵산중합반응결과물을 각각 5 ㎕ 그리고 BMT hyb-mixA(6xSSC , 20% 포름아마이드 및 0.05% Triton X-100 포함) 75 ㎕를 혼합하여 85 ㎕의 혼성화 반응용액을 만들었다. 이 용액을 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 85㎕의 혼합용액을 조립된 스트립의 시료주입구에 주입하였다. 스트립을 상온에서 3-120분 동안 방치하여 혼성화 반응용액이 전개되며 혼성화 반응을 진행한 후 BMT Wa-B-2(4xSSC, ㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국) 용액을 100 ㎕ 투입하여 세척용액을 전개시키고 BMT에서 스트립 분석용으로 사용되는 BMT HPV strip reader type-1(㈜바이오메트릭스 테크놀로지, 대한민국)을 이용하여 분석하였다(도 7a, 7b 및 7c). 반응이 끝난 유리섬유(스트립)를 BMT reader로 판독하여 고농도와 저농도의 베타글로빈과 HPV 유전형 등이 보여주는 형광감도의 비를 분석하여 보면 베타글로빈의 형감감도를 이용하여 HPV 유전형의 농도를 정량화할 수 있다는 결과를 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1a는 아민-변형된 표면을 갖는 유리섬유에 화학식 1의 유도체를 결합시켜 단분자층을 제조하는 모식도이다.
도 1b는 아민-변형된 표면을 갖는 유리섬유에 화학식 2의 유도체를 결합시켜 단분자층을 제조하는 모식도이다.
도 2는 실시예에서 사용된 유리섬유 사진, 확대사진 및 모식도이다. 사용된 유리섬유는 유리재질을 수십 nm 에서 수백 ㎛에 이르는 직경을 갖는 가는 유리선으로 뽑은 뒤 멤버레인 형태로 직조된 것이다. 직조된 유리섬유는 Millipore사 및 Waters 사 등이 판매하고 있는데 그중 순수한 유리재질로만 제조된 것을 구매하여 유리슬라이드와 동일하게 표면을 화학식 1-3의 캘릭스아렌 유도체로 표면변형하여 프로브가 고정화 될 수 있는 유리섬유를 제조한다.
도 3은 초분자 단분자층으로 변형된 유리섬유에 연속된 구아닌 염기를 가진 HPV 유전자형 분석용 프로브인 올리고뉴클레오타이드가 용해된 용매를 변형된 유리섬유 상의 각각 다른 위치에 분주기 등을 이용하여 선형으로 분주하여 프로브 유전자가 자발적으로 고정화된 유리섬유를 포함하는 스트립형 DNA 칩의 제조과정을 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 스트립형 DNA 칩에 형광이 부착된 핵산중합반응(PCR)의 결과물을 포함한 용액을 적용하여 용액이 자발적으로 전개되어 고정화된 프로브와 일치하는 유전자형을 갖는 유전자가 결합하는 모식도이다.
도 5a-5b는 다수의 HPV 유전자형 분석용 프로브가 선형으로 분주되어 고정화 된 유리섬유에 형광물질이 부착된 HPV 증폭산물 시료(도 5a: HPV 타입 18, 도 5b: HPV 타입 16)를 적용한 결과를 보여준다. HPV 증폭산물을 용액을 유리섬유의 한쪽 말단에 적용하면 용액이 자발적으로 전개되어 고정화된 프로브와 일치하는 유전자형을 갖는 유전자가 선형으로 고정화된 위치에 결합한다. 고정화된 프로브의 염기서열이 도포된 증폭산물의 염기서열과 일치하는 곳에서는 형광이 강하게 발현하고 그렇지 않은 곳에는 형광발현이 전혀 나타나지 않아, 본 발명의 스트립형 DNA 칩은 HPV의 검출 및 유전자형 결정을 할 수 있음을 알 수 있다. 그래프에서, y 축은 형광세기(arbitrary unit: AU)이고, x 축은 데이터 포인트(즉, 스트립 상에서 1차원 위치를 나타낸다).
도 6a-6b는 시료 내 HPV 및 β-글로빈 유전자의 검출 결과를 보여준다. 인간 세포에만 존재하는 하우스킵핑 유전자인 β-글로빈 유전자로부터 나오는 형광세기를 이용하여 실험 결과의 형광세기를 정규화(normalization) 하였다. 그래프에서, y 축은 형광세기(arbitrary unit: AU)이고, x 축은 데이터 포인트(즉, 스트립 상에서 1차원 위치를 나타낸다).
도 7a-7c는 시료 내 HPV 타입 16의 정량적 분석에 대한 실험 결과이다. 인간 세포에만 존재하는 하우스킵핑 유전자인 β-글로빈 유전자로부터 나오는 형광세기를 이용하여 실험 결과의 형광세기를 정규화(normalization) 하였다. 도 7a-7c는 각각 2.5x104 copies, 2.5x103 copies 및 0 copy의 주형 DNA 시료로 PCR한 결과물에 대한 분석결과이다. 위쪽 그래프에서, y 축은 형광세기(arbitrary unit: AU)이고, x 축은 데이터 포인트(즉, 스트립 상에서 1차원 위치를 나타낸다). 아래쪽 그래프에서 y 축은 형광세기(arbitrary unit: AU)이고, x 축은 PCR 시 사용된 DNA 주형의 카피수를 나타낸다.
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Claims (13)

  1. (a) 캘릭스아렌 유도체가 표면 코팅된 고체기질; 및 (b) 상기 고체기질 상에 고정화 되어 있는 HPV(human papilloma virus) 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는(hybridizable) 프로브로서, 상기 프로브는 (i) HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 혼성화 부위 및 (ⅱ) 최소 2개 이상의 구아닌을 포함하는 고정화 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩:
    화학식 1
    Figure 112009010756473-PAT00004
    상기 화학식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH 또는 -COOR이며; 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 이고; 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 또는 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z이며; Z는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 이고; -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기를 나타내고; n은 2-15의 정수, m은 1-10의 정수, c는 0-10의 정수이다;
    화학식 2
    Figure 112009010756473-PAT00005
    상기 화학식에서, R1, R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH 또는 -COOR이며; 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 이고; 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 또는 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z이며; Z는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 이고; -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기를 나타내고; n은 2- 15의 정수, m은 1-10의 정수, c는 0-10의 정수이고;
    화학식 3
    Figure 112009010756473-PAT00006
    상기 화학식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH 또는 -COOR이며; 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 이고; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 및 R'8 모두 동시에 -H인 경우는 제외되며; 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 또는 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z이며; Z는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 이고; -C6H4- 및 C6H5 는 페닐기를 나타내고; n은 2-15의 정수, m은 1-10의 정수, c는 0-10의 정수이다.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 프로브는 그의 5’-말단 또는 3’-말단에 7-15개의 구아닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 고체기질은 유리, 유리섬유, 금속, 금속 옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머, 세파로스, 아가로스 및 콜로이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 고체기질은 유리섬유인 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 HPV 타입의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 인간 세포의 하우스킵핑(housekeeping) 유전자에 혼성화되는 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 하우스킵핑 유전자는 GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) 유전자, β-액틴 유전자, PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 유전자, β-글로빈 유전자 또는 28S RNA 유전자인 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 멤브레인 스트립 형태를 가지며 HPV 타입에 특이적으로 결합하는 최소 2종의 프로브가 상기 멤브레인 스트립을 따라 개별 위치에 고정화 되어 있고, 분석하고자 하는 DNA 시료는 상기 멤브레인 스트립의 한쪽 말단에 적용되어 멤브레인 스트립을 따라 이동하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 분석 대상의 시료 내의 HPV 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 사용된 프라이머에 혼성화 되는 혼성화 대조군용 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 HPV 타입 비특이적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 양성 대조군 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 HPV 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되지 않는 음성 대조군 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또 는 타이핑용 DNA 칩.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 (i) 고체기질로서 유리섬유로 이루어진 멤브레인 스트립, (ii) 상기 유리섬유 멤브레인 스트립 상에 HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 HPV 타입의 뉴클레오타이드 서열에 각각 특이적으로 혼성화되는 최소 2종의 프로브, 상기 프로브는 상기 멤브레인 스트립을 따라 개별 위치에 고정화 되어 있고, 및 (iii) 인간 세포의 하우스킵핑(housekeeping) 유전자에 혼성화되는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 검출 또는 타이핑용 DNA 칩.
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