JPH11510709A - 最適蛍光オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 最適蛍光オリゴヌクレオチドの製造方法。蛍光色素−結合ヌクレオチドトリホスフェートが、オリゴヌクレオチドの最適特異蛍光を許容することができる所定の反復態様で核酸シーケンスに組み込まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、蛍光が著しい核酸プローブが所望される場合に特に、種々の核酸シーケンスの検定において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 最適蛍光オリゴヌクレオチド発明の分野 本発明は、標識オリゴヌクレオチドの製造と使用に関する。より詳細には、本 発明は、蛍光標識オリゴヌクレオチドを製造しかつ使用する方法に関する。発明の背景 核酸を検出するのに、数多くの種々の蛍光化合物が使用されている。一般に、 核酸の蛍光標識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ）は２つの綱、即ち、（ １）蛍光成分との共有結合により核酸を修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）するものと、 （２）蛍光成分との非共有結合により、即ち、イオン相互作用、水素結合または インターカレーションにより修飾を行うものとに分けることができる。一般には 、核酸の非共有結合蛍光プローブは、核酸に対する結合により著しく増大した蛍 光を呈するので、所定のサンプルに存在する全核酸を測定するように構成された 検定において著しく有用となっている。更に、非共有結合の蛍光分子は、標識ス トランドから非標識ストランドへ移行することができる。これに対して、共有結 合蛍光分子は、標識オリゴヌクレオチドから非標識オリゴヌクレオチドへ移行す ることができない。従って、共有結合された蛍光成分は、蛍光標識核酸プローブ として使用するのが好ましい。 核酸シーケンスに共有結合により取着された蛍光化合物には、例えば、ヌクレ オチドトリホスフェートまたはホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄ ｉｔｅ）と蛍光成分との複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および直接反応性の色素 （ｄｙｅ）が含まれる。ヌクレオチドトリホスフェートは、核酸ポリメラーゼに より核酸内に組み込まれる。商業的に入手することができるヌクレオチドトリホ スフェート−色素複合体には、ＤｕＰｏｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ ｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍおよびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆ ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手することができるｄＣＴＰ−Ｃｙ３、ｄＣＴＰ− Ｃｙ５、ｄＵＴＰ−ＦｌｕｏｒＸなどが含まれる。これらの色素複合体は、ヌク レオチドに共有結合されるシアニンまたはフルオレセイン誘導体を含んでおり、 各複合体は色素成分の吸収マキシマに対して異なっている。直接反応性色素は、 存在する核酸シーケンスに共有結合する。種々のプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ ）並びにエチジウムモノ−およびジ−アジドをはじめとする幾つかの反応性色素 を入手することができる。 ホスホルアミダイトと蛍光分子との複合体に関する化学は最近著しい進歩を遂 げ、商業的に入手することができる核酸合成物質を用いることにより、蛍光標識 オリゴヌクレオチド（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｏｒｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を完全に合成することができるようになっている。蛍 光標識オリゴヌクレオチドはまた、修飾されたホスホルアミダイトと反応性色素 との組み合わせにより合成されており、多くの場合、合成の際に第１アミンがオ リゴヌクレオチドに組み込まれ、次いで、アミン基が反応性色素に共有結合され る。 蛍光化合物をオリゴヌクレオチドに共有結合させる３つの方法のうち、ヌクレ オチドトリホスフェート−色素複合体が、最も融通性があるとともに、最高の達 成可能な特異蛍光を呈している。合成核酸（非酵素的に得られる分子）は一般に 、１００未満の塩基に制限され、可変色素結合化学の影響を受ける。エチジウム モノアジドのような直接反応性色素は、非特異的に反応し、標識オリゴヌクレオ チドに大きな損傷を与える。これに対して、ポリメラーゼ駆動標識処理は、数十 乃至数千の塩基から分子を形成することができるとともに、ニックトランスレー ションおよびプライマエクステンション反応のような標準的な標識処理方法を利 用することができ、色素の組み込みの程度は、標識ＮＴＰ対未標識ＮＴＰの比を 変えることにより大まかに制御することができる。 核酸のポリメラーゼ駆動蛍光標識処理の主たる制約として、特定のシーケンス に組み込まれる蛍光化合物の量を絶対的に制御することができないということが 挙げられる。例えば、ＤＮＡをｄＣＴＰ−Ｃｙ３で標識処理することが所望され るとともに、特定のシーケンスが限定された数の「Ｃ」部位だけを有する場合に は、得られる蛍光標識オリゴヌクレオチドは比較的少ないＣｙ３分子を有し、従 って、特異蛍光は低いものとなる。本発明は、このシーケンスに特有の制限を克 服するとともに、ポリメラーゼによる蛍光成分の組み込みを最適にするものであ る。発明の概要 本発明によれば、（ａ）プライマを得る工程と、（ｂ）プライマと相補するヌ クレオチドシーケンスを含むとともに相補領域の下流側にヌクレオチド反復領域 を含むテンプレートオリゴヌクレオチドを得る工程と、（ｃ）ポリメラーゼ、ヌ クレオチドトリホスフェートおよび蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェート を含む適宜の反応媒体においてテンプレートおよびプライマをアニーリングする 工程と、（ｄ）テンプレートにおける相補ストランドの合成を開始する工程と、 （ｅ）相補ストランドに隣接してターゲットシーケンスを含むオリゴヌクレオチ ドを取着する工程と、（ｆ）適宜の方法により最適蛍光オリゴヌクレオチドを精 製する工程とを備える最適蛍光オリゴヌクレオチドの製造および精製方法が提供 されている。 本発明によればまた、プライマと相補するヌクレオチドシーケンスと該相補シ ーケンスの下流側にヌクレオチド反復領域とを有し、ヌクレオチド反復領域は蛍 光色素結合ヌクレオチドトリホスフェートと塩基対を形成することができるヌク レオチドであるＮ^tを含むとともに、蛍光色素結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヌ クレオチドトリホスフェートとは塩基対を形成することができない複数のヌクレ オチドであるＮを任意に含むように構成されたオリゴヌクレオチドが提供されて いる。 本発明によれば更に、放射性標識（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ）核酸シーケン スとヌクレオチド反復領域とを備え、ヌクレオチド反復領域は蛍光色素に結合さ れるヌクレオチドＮ^tを有するとともに、最適には蛍光色素には結合されない複 数のＮを有する最適蛍光オリゴヌクレオチドが提供されている。 これらのおよび他の実施例は、開示されている以下の詳細な説明から明らかに なるものである。発明の詳細な説明 本発明を一層明確に理解することができるように、幾つかの語を下記の通り定 義する。 第１のヌクレオチドシーケンスの「補体」（”ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ”）とは 、第１のシーケンスとワトソン−クリック雑種形成により対を形成する塩基を有 す る第２のシーケンスであることは周知の通りである。かくして、デオキシリボ核 酸（ＤＮＡ）シーケンス５’−ＡＴＧＣ３’の補体は、周知の通り５’−ＧＣＡ Ｔ３’である。複体（ｄｕｐｌｅｘ）即ち二重ストランド即ち二重鎖ＤＮＡの場 合には、２つのストランドはそれぞれ他方に対して相補である即ち相補対である として説明される。補体および抗補体なる語も使用することができる。ＲＮＡへ の転写を進行させる複体ＤＮＡのストランドの識別については、転写ストランド は一般にプラス（「＋」）として説明され、その補体はマイナス（「−」）とし て説明される。あるいは、転写ストランドは感作ストランド（ｓｅｎｓｅ ｓｔ ｒａｎｄ）として説明され、その補体は抗感作（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）として説 明することができる。相補をなす全ての塩基対を有し、それぞれが他方に対して 雑種形成される２つのストランドは、互いに対して１００％相補である。５％の 非相補塩基を有し、それぞれが他方に対して雑種形成される２つのストランドは 、９５％相補である（即ち、２つのストランドは９５％の相補性を有する）。 「プローブ」（”ｐｒｏｂｅ”）とは、問題のターゲット核酸シーケンスと相 補であるシーケンスを有し、かつ、プローブ−ターゲット複体の測定を可能にす るある別の特徴を有する一重または二重鎖核酸である。当業者であれば理解する ことができるように、プローブおよび／またはターゲットが二重鎖である場合に は、二重鎖核酸は雑種形成が行われる前にストランド分離を受けなければならな い。 プローブは取着される標識により取り外し自在にされる。プローブに結合され る標識（ｔａｇ，ｌａｂｅｌ）には、原則として、蛍光または発光標識、アイソ トープ標識、色素標識、酵素標識、抗体において検出可能な抗原、あるいはスト レプトアビジンで被覆したビードのような更に別の成分によりプローブを特異的 に取着することができるビオチンのごとき結合成分が含まれる。標識プローブ− ターゲット複体が形成されると、この複体は標識の特性により検出することがで きる。この標識成分を有するプローブは、雑種形成および複体形成によりターゲ ットにアニーリングする。 「プライマ」（”ｐｒｉｍｅｒ”）とは、問題のシーケンスの部分と相補する オリゴヌクレオチドの比較的短いセグメントである（問題のシーケンスはより大 きい核酸シーケンス内のサブフラグメントとすることができる）。プライマは、 得られるエクステンション生成物（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）の５ ’末端を表す。テンプレートストランドの問題のシーケンスと相補するプライマ には、３’末端がポリメラーゼにより作用することができる。プライマはまた、 結合成分または取り外し自在の標識により５’末端を修飾することができる。 「雑種形成」（”ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”）とは、相補一重鎖核酸から の二重鎖即ち複体核酸の形成を意味する。雑種形成は、十分な相補性を有する一 重鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ間で行われて、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮ ＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡを形成することができる。 ＤＮＡの生体外増幅には、ＤＮＡポリメラーゼが触媒作用を行う。本技術分野 においては、数多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが知られている。これらは一般 に、プライマがアニーリングされる一重鎖テンプレートを利用する二重鎖ＤＮＡ シーケンスの合成を触媒するという共通の特性を共有している。ほとんどの有機 体から抽出されるＤＮＡポリメラーゼは、核酸の熱変性に必要な温度では不活性 にある。かくして、かかる熱感受性酵素が利用される場合には、各熱サイクルの 開始時の酵素の置換が必要となり、あるいは熱不活性を防止することができる因 子の付加が必要となる。本発明に関してだけでなく生体外ＰＣＲに関して好まし いＤＮＡポリメラーゼは、高温で成長し、かくして耐熱性があり、即ち、複体Ｄ ＮＡを変性する温度で十分な触媒活性を保持する有機体から誘導される。 ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される反応は本技術分野において公知であり、 本明細書においては「ＤＮＡポリメラーゼ反応」と呼ぶ。この反応には、好まし くはモル過剰の４つのデオキシリボ核酸トリホスフェートおよびプライマの幾つ かまたは全てと、サイクリックストランド分離の手段とが必要となる。ストラン ド分離は、アニーリング温度と変性温度との間での熱サイクルにより行うのが好 ましい。リバーストランスクリプターゼは、ＲＮＡとＲＮＡ複写の双方を仲介す るとともに、ＤＮＡ−ＤＮＡ複写を仲介することが知られている。従って、現時 点で公知の多数の任意の数の酵素が重合反応の触媒作用を行う。 「最適間隔」（”ｏｐｔｉｍａｌ ｓｐａｃｉｎｇ”）とは、オリゴヌクレオ チドの最大の蛍光をもたらす、蛍光標識ヌクレオチド間の距離を云う。 「特異蛍光」（”ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”）とは、標 識核酸の単位質量当たりの量子効率即ち標識核酸の単位質量につき組み込まれる 蛍光標識の量を云う。 「最適蛍光」（”ｏｐｔｉｍａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”）とは、所定 の反応媒体において得ることができる最大特異蛍光を云い、これはオリゴヌクレ オチドの蛍光成分の最適間隔および特定の蛍光標識ヌクレオチドに対して選択さ れるポリメラーゼに基づく。 「プライマエクステンション」（”ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ”）と は、ヌクレオチドトリホスフェートによりテンプレートに対形成される塩基であ るプライマオリゴヌクレオチドを延長させることにより、最終生成物を（完全な あるいは部分的な）複体ＤＮＡストランドとする、テンプレートにより制御され ポリメラーゼにより駆動される方法を云う。 「ターゲットシーケンス」（”ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ”）とは、（ 共有結合によりまたは非共有結合により）標識が付され、最適蛍光成分に結合ま たは連結されるべきオリゴヌクレオチドシーケンスを云う。 「ニックトランスレーション」（”ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”）法 は、ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用を受けるものであり、新たなＤＮＡの重合と 成長部位の前方におけるＤＮＡの分解とが同時に起こることに特徴がある。 「ＤＮＡマトリックス」（”ＤＮＡ ｍａｔｒｉｘ”）とは、二重鎖の腰部を 有するとともに分子端に一重鎖の自由腕部を有し、腕部の隣接する分子の腕部に 対する雑種形成により形成される特異構造のポリヌクレオチドの連続層を云う。 かかるマトリックスは、米国特許第５，１７５，２７０号および第５，４８７， ９７３号に説明されており、本明細書においてはこれらの米国特許を引用してそ の説明に代える。 「特異活性」（”ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ”）とは、標識化合物 の単位質量当たりに存在する放射性標識（”ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ”）を云い、 ミリモル（ｍｍｏｌ）当たりのキューリ（Ｃｉ）のユニットで通常表される。 「サザン法」（”Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ”）として知られる方法は、核 酸の特異シーケンスを標識プローブにより検出することを可能にする方法である 。 標識が放射性である場合には、結果はオートラジオグラフィにより視認化される 。制限を受けたＤＮＡフラグメントはゲルにおいて変性され、元のパターンを保 護する態様で毛管作用または電気泳動移送により膜状ニトロセルロースまたはナ イロンのシートにブロットされる。一重鎖ＤＮＡが膜に恒久的に結合した後は、 シートは標識プローブ（即ち、相補ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む溶液において培 養される。アニーリングに必要な時間を相同シーケンスにかけると、膜は洗浄さ れて未雑種形成のプローブがなくなる。放射性プローブに関して得られるオート ラジオグラフは、どの制限フラグメントがプローブのヌクレオチドシーケンスに 対して相同性を持つかを示す。 同様に、「ノーザン法」（”Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ”）は、ＲＮＡの特 異シーケンスを標識プローブにより検出する相似法である。ＲＮＡは膜にブロッ トされ、シートは標識プローブを含む溶液において培養される。相補シーケンス がアニーリングしてから、未雑種形成のプローブがなくなるように媒体を洗浄す る。この結果から、どのＲＮＡフラグメントがプローブのヌクレオチドシーケン スに対して相同性を持つかが示される。 核酸「ドットブロット」（”ｄｏｔ ｂｌｏｔ”）は、溶液を膜に点滴する（ ｓｐｏｔ）して溶液の核酸を検出したときに得られ、サザンまたはノーザン法と 同様に検出される。ドットブロットは、抽出物の核酸の量を定量するのに使用さ れる。 「ランダムプライミング」（”ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｉｎｇ”）とは、二重 鎖ＤＮＡがランダムプライマの存在下で変性される方法を云うものであり、未標 識ヌクレオチドトリホスフェート、³²Ｐ−標識ヌクレオチドトリホスフェートお よびポリメラーゼがプライマの延長を開始するために添加され、その後変性され て標識プローブを解放する。 「ミクロ力価プレート検定」（”ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅ ａｓｓ ａｙ”）とは、未知濃度の抗原、蛋白質またはＤＮＡ／ＲＮＡの溶液間における 抗原−抗体、色素−基体またはプローブ−ターゲットの相互作用の検出を云う。 未知の溶液は、小さい容積（通常は２００μｌ未満）の個々の溜めからなるミク ロ力価プレート内に置かれ、抗体溶液、色素またはプローブとの反応に供される 。 反応体と未知溶液との相互作用の程度が、未知溶液に存在する溶質の濃度を示す 。相互作用の評価は、蛍光、紫外線吸収または第２の抗体溶液との反応により行 うことができる。 本発明の方法は、シーケンスの既知の数と間隔の蛍光成分を有する標識オリゴ ヌクレオチドを発生させる。本発明のオリゴヌクレオチドは、式 Ｎ^t（Ｎ^t）_nＮ^t により表すことができ、該式においてｎは２０乃至１０００の整数であり、シー ケンスにおける全てのヌクレオチドは最適蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフ ェートと塩基対を形成することができる。従って、対応する最適蛍光オリゴヌク レオチドは、式 Ｎ^f（Ｎ^f）_nＮ^f により表すことができ、ｎは２０乃至１０００の整数であり、Ｎ^fはシーケンス における最適蛍光ヌクレオチドを表す。 更に、本発明のオリゴヌクレオチドは、式 Ｎ^t（Ｎ_mＮ^t）_nＮ_m により表すことができ、ｎは２０乃至１０００の整数であり、ｍは１乃至１１の 整数であり、ヌクレオチドＮ^tは最適蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェー トと塩基対を形成することができ、ヌクレオチドＮはかかる塩基対を形成するこ とができない。 従って、対応する最適の蛍光オリゴヌクレオチドは、式 Ｎ^f（Ｎ_mＮ^f）_nＮ_m により表され、ｎは２０乃至１０００の整数であり、ｍは１乃至１１の整数であ り、ヌクレオチドＮ^fはシーケンスの蛍光標識ヌクレオチドを示し、ヌクレオチ ドＮは蛍光標識処理がされていない。 蛍光成分によるターゲットシーケンスの標識処理は、ターゲットシーケンスを オリゴヌクレオチドに組み込む前または組み込む際に行うことができる。蛍光標 識オリゴヌクレオチドがターゲットシーケンスの組み込み前に発生する場合には 、ターゲットシーケンスはプライマエクステンションまたは連結により蛍光標識 オリゴヌクレオチドに取着することができる。あるいは、蛍光成分は、ターゲッ ト と適宜のテンプレートとの間の重合反応の際にターゲットシーケンスとともに組 み込むことができ、同時に色素結合ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰｓ） 更には未標識ＮＴＰｓがクローニングまたはランダマ（ｒａｎｄｏｍｅｒ）エク ステンションにより添加される。 この方法は、各色素−ＮＴＰ複合体ごとに最適間隔および好ましいポリメラー ゼを定めることにより開始する。一般には、プライマシーケンス（好ましくは６ −４０の塩基長さ）と複数のテンプレートシーケンスとが必要となる。テンプレ ートシーケンス（２０−１００塩基）は、プライマ結合領域と、このプライマ結 合領域から下流側に、塩基（第１のテンプレートシーケンスのポリホモヌクレオ チド）ごとに、第２のテンプレートシーケンスにおける塩基１つおきに、塩基２ つおきに、塩基３つおきに、塩基４つおきに、塩基５つおきに、塩基６つおきに 、塩基７つおきに、塩基８つおきに、塩基９つおきに、または塩基１０おきに離 隔配置された適宜のヌクレオチド（「Ｃ」結合色素に関しては「Ｇ」、「Ｕ」結 合色素に関しては「Ａ」など）とを有する。この態様でのヌクレオチドの反復は 、本明細書においては、ヌクレオチド反復領域と云われ、下記の式 Ｎ_(0-11)Ｎ^t により表され、Ｎは色素−結合ヌクレオチドに対して塩基対を形成することがで きないヌクレオチドを表し、Ｎ^tは色素結合ヌクレオチドに対して塩基対を形成 することができるヌクレオチド、即ち、蛍光色素に対して直接結合することがで きるヌクレオチドを示す。ヌクレオチド反復領域内での色素結合ヌクレオチドの 間隔は、個々の成分の蛍光信号を消光することなく可能な限り接近させるべきで ある。介在するシーケンスは、３つの（色素−ＮＴＰに対する）非塩基対形成塩 基から選ばれる反復シーケンス、半反復またはランダムシーケンスとすることが できる。介在シーケンスに対する主たる制約は、テンプレート間またはテンプレ ート内に自己相似がなく、非特異プライミング事象が最小になることである。色 素−ＮＴＰ複合体の最適の間隔を定めるには、１組のプライマで十分である。 プライマは、好ましくは³²Ｐを用いて高い特異活性に放射性標識が付されるべ きであり、実際の特異活性は、放射性標識プライマのアリコートを計数しかつ２ ６０ｎｍの光学密度を測定することにより定めるべきである。特異活性の実際の 測定は、最適間隔が実験から所望される唯一の情報である場合には省略すること ができるが、特異活性を測定することにより特異蛍光をその後に速やかに測定す ることができる。（各テンプレートシーケンスごとの別の反応における）５’−³² Ｐの標識が付されたプライマとテンプレートは、略化学量論比で混合され、ア ニーリングに供される。アニーリング処理は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ８．０と、２００ｍＭのＮａＣｌと、１ｍＭのＥＤＴＡとのような、核酸ハイ ブリッドを形成することができる緩衝液において行うことができる。アニーリン グ後は、サンプルをエタノールで沈降させ、水に再懸濁させることができ、ある いは重合検定に直接使用することができる。 次に、アニーリングされたプライマーテンプレートのアリコート約１μｇが、 Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手することができるＳＥ ＱＵＥＮＡＳＥ（商標）、ＤＮＡ ＰｏｌｌのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔａ ｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ、Ｐｙｒｏｓｔａｓｅその他の商業的に入手するこ とができるポリメラーゼのような多種ポリメラーゼを使用する一連の反応に加え られるべきである。反応は、（製造者が定めるように）各特定のポリメラーゼご とに最適にされた緩衝液において行われるべきである。反応はまた、色素−ＮＴ Ｐとともに、未標識ＮＴＰを２０μＭ乃至２ｍＭ（色素−ＮＴＰ複合体の一部と して既に加えられたＮＴＰを除く）の濃度で含むべきである。各ポリメラーゼは 、色素−ＮＴＰを認識することができるとともにこれを重合反応に異なる程度ま で組み込むことができ、酵素の選択は標識プローブの特異蛍光の有意の影響を及 ぼす。 重合反応の後は、標識オリゴヌクレオチドを精製し、組み込まれなかったヌク レオチドトリホスフェートから分離すべきである。精製は、エタノール沈降、サ イズ排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動その他の方法により行うことができる 。精製された標識オリゴヌクレオチドは、シンチレーションカウンタにより定量 すべきであり、あるいは十分に多量に得られたときには２６０ｎｍおよび色素成 分の最大吸収波長における光学密度を測定することにより定量すべきである。 次に、精製された標識オリゴヌクレオチドの特異蛍光を測定する。標識オリゴ ヌクレオチドの既知のアリコートを試薬等級の水に希釈し、蛍光の量を蛍光計、 好ましくは、可変スリット分光蛍光計を用いて測定する。特定の色素−ＮＴＰ複 合体の最適の標識処理方法として、最大の特異蛍光を示す反応混合物を選択する 。 あるいは、本発明の方法は、リボヌクレオチドシーケンスに標識処理を行うの に使用することができ、この場合には、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識リボヌク レオチドを、最適標識オリゴヌクレオチドの合成に使用することができる。ターゲットシーケンスの標識処理 特定の色素−ＮＴＰ複合体に必要な最適間隔とポリメラーゼを上記したように 選定する。次に、ターゲットシーケンスを蛍光標識ヌクレオチドに連結し、最適 間隔シーケンスに隣接するターゲットシーケンスをクローニングしあるいは「ラ ンダマ」（”ｒａｎｄｏｍｅｒ”）エクステンション反応を利用し、最適標識オ リゴヌクレオチドによってターゲットシーケンスに標識を付すことができる。連結によるター ゲットシーケンスの標識処理 連結による標識処理は、先づ、最適標識核酸（２０塩基乃至２０００塩基）を 合成しかつ精製することにより行われる。蛍光標識オリゴヌクレオチドによる標 識処理のターゲットシーケンスは、化学分解によりまたはＤＮＡｓｅ Ｉまたは 制限酵素のようなヌクレアーゼで処理することにより、平均で３０−７０塩基の 小さな片にニック処理する。略等重量の蛍光標識オリゴヌクレオチド（一般的に は５０−１００μｌにおいて５０ｎｇ乃至５μｇ）とターゲットシーケンスとを 、リガーゼ酵素製造者が推奨するようにして連結反応緩衝液における反応に供す る。比較的上首尾の連結反応工程は、ゲル電気泳動により評価を行うことができ る。連結反応を受けた物質は、雑種形成検定において直接使用することができ、 あるいは、所望の場合には、沈降、サイズ分別、ゲル電気泳動、抗原−特異結合 その他の方法により精製することができる。ランダマエクステンションによるターゲットシーケンスの標識処理 この標識処理技術の基本は、最適標識オリゴヌクレオチドの３’端部に短い（ ６−１２塩基）ランダムシーケンスを使用することにある。テンプレートと蛍光 化合物との初期標識処理反応は、テンプレート分子が６−２００塩基の３’オー バーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）とともに５’オーバーハング（色素−ＮＴＰ組 み込みのエクステンション領域）を有し、ほとんどの３’シーケンスが典型的 には６−１２塩基のランダムシーケンスとなる態様で構成されるように修飾され る。精製された標識オリゴヌクレオチドは、プライマエクステンション反応にお いて直接使用することができ、あるいは好ましくはターゲット標識反応において 使用する前にトリメチルプソラレンと架橋させることができる。 ターゲット標識反応は、所望のターゲットシーケンスを変性する工程と、適宜 の緩衝液においてポリメラーゼ、過剰の標識プライマ分子および所望のポリメラ ーゼに適したＮＴＰ（即ち、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼとともに使用するｄＡＴ Ｐ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を添加する工程とからなる。蛍光標識ランダ マの３’端部の幾つかは、ターゲット分子のプライマとして作用することにより 、重合処理の際に延長されるとともに、ターゲット分子に相補する３’端部と最 適標識５’端部とを有する分子を形成する。クローニングを伴うターゲットシーケンスの標識処理 ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモータ部位の下流側で最適化テンプレートシーケ ンスをクローニングし、次いでプロモータシーケンスの更に下流側のターゲット シーケンスをクローニングすることにより、次のポリメラーゼ標識処理によって 、最適標識シーケンスとターゲットシーケンスを有するポリヌクレオチドが同時 に発生する。ポリメラーゼは、リボヌクレオチドトリホスフェートとともに使用 されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼとすることができる 。ポリメラーゼはまたＤＮＡポリメラーゼとすることができ、標識処理はプライ マエクステンションまたはランダムプライミング法により行うことができる。 標識核酸は、高い蛍光の核酸プローブが、例えば、ドットブロット、サザン法 またはノーザン法などのような公知の核酸検定法において所望される場合に特定 のシーケンスのプローブとして使用することができる。更に、蛍光標識オリゴヌ クレオチドは、現場雑種形成技術に使用することができ、この場合には、問題の シーケンスは大きな混合集団内の少数の細胞だけに存在する。かかるシーケンス は、周囲の組織からの干渉シーケンスの存在により組織抽出物において検出不能 となる場合がある。 現場雑種形成は、（１）遺伝子発現の部位の識別、（２）転写の組織分布の分 析、（３）ウイルス感染の識別と位置、（４）特異ｍＲＮＡの変化の追従および （５）染色体地図形成に使用することができる。本発明は、高い特異蛍光を提供 することができ、従って、現場での雑種形成に関して従来の方法と比較して高い 感度を提供することができる。 本発明は更に、米国特許第５，１７５，２７０号および第５，４８７，９７３ 号に開示されているＤＮＡマトリックスと組み合わせて核酸シーケンスの検出を 高めるのに使用することができる。本明細書においては、これらの米国特許を引 用してその説明に代える。米国特許第５，１７５，２７０号および第５，４８７ ，９７３号に開示されているＤＮＡマトリックスは、一重鎖および二重鎖領域の 双方を有するポリヌクレオチドの連続層からなる。本発明のオリゴヌクレオチド プローブは、ＤＮＡマトリックスの非アニーリングの、遊離した一重鎖腕部に対 して雑種形成することができ、得られる蛍光標識ＤＮＡマトリックスは、病原性 バクテリアおよびウイルスに関連する核酸シーケンスを含む種々の核酸シーケン スの検定に有用である。 更にまた、本発明は、蛍光に基づくマイクロ力価プレート検定系において使用 することができ、最適蛍光オリゴヌクレオチドプローブにより提供される高い特 異蛍光により検定における蛍光成分の検出を確実かつ容易に行うことができる。 実施例１ ｄＣＴＰＣｙ３の組み込みの蛍光最適化 この実施例においては、ｄＣＴＰ−Ｃｙ３に関してポリメラーゼと最適間隔と が定められた。更に、蛍光標識ストランドは、プライマシーケンスがテンプレー トストランドに対して５’オーバーハングを有するように、テンプレートストラ ンドよりも長いことが望ましかった。従って、テンプレートは、ｄＧＴＰを反応 緩衝液からなくすことにより「バック」（”ｂａｃｋ”）反応（プライマのテン プレートシーケンスのエクステンション）を阻止することができるように、３つ の塩基「Ｇ」、「Ａ」および「Ｔ」だけを利用した。プライマストランドの５’ オーバーハングを許容するように反応を構成することにより、その後のストラン ド分離は、後反応においてはエクステンション生成物はテンプレートシーケンス よりも長いので、変性ゲル電気泳動により容易に行うことができた。 テンプレートは、ａ（＋）−２Ｃ、ａ（＋）−３Ｃおよびａ（＋）−４Ｃで示 される４１マー（４１ｍｅｒｓ）であり、これらはそれぞれｄＣＴＰ−Ｃｙ３色 素を１つおき、２つおき、または３つおきの塩基ごとにそれぞれ組み込むように 構成されているものであった。プライマシーケンスは、１４塩基に亘ってテンプ レートストランドと雑種形成を行うように構成された３１マー（３１ｍｅｒｓ） であった。 含量の領域 合成オリゴヌクレオチドをテキサス州、ミッドランドに所在するＴｈｅ Ｍｉ ｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．から購入し、（３０ μｇ／ｍｌ＝１Ａ２６０Ｕを基準に）２００ｎｇ／μｌの濃度で試薬等級の水に 溶解した。プライマシーケンスは、γ³²Ｐ−ＡＴＰ（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌｓカタログ＃３５０２０）１００ｕＣｉ／反応および１０Ｕのポリヌ クレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ）により製造者の供給反応緩衝液において推奨された時間をかけて³² Ｐで５’標識を行った。プライマは、サイズ排除クロマトグラフィ（セレクト −Ｄ−Ｇ２５、カラム５’−３’（登録商標）、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）により 製造者の推奨通りにして、未組み込みヌクレオチドが実質上ないように精製した 。これは、３１，１８０ｃｐｍ／ｎｇの特異活性を有していた。プライマをアリ コートにして保管したが、各アリコートは、２００ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥ ＤＴＡを含むｐＨ８．０の１００ｍＭトリス−ＨＣｌにおける濃度が（試薬等級 の水１ｍｌにおける５８．３μｌのＯＤ₂₆₀により測定した状態で）６２．２ｎ ｇ／μｌであった。 アニーリング反応を、５ＭのＮａＣｌを２．０μｌ含む試薬等級の水２４μｌ （ＮａＣｌの最終濃度１００ｍＭ）においてテンプレートオリゴヌクレオチド （５マイクログラム、０ｃｐｍ）２５μｌと³²Ｐ標識プライマ（３．０μｇ、３ ９，５４０，０００ｃｐｍ）４９μｌとを反応させることにより行った。反応系 を１１のビーカにおいて１５分かけて９５℃から室温に冷却した。 次いで、ポリメラーゼエクステンション反応を、上記アニーリング処理したオ リゴヌクレオチド反応混合物１０．０μｌと、（ポリメラーゼの製造者により提 供された）５Ｘ反応緩衝液１０μｌと、ｄＡＴＰ１μｌと、ｄＴＴＰ（各１０ｍ Ｍ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ提供）１μｌと、ｄＣＴＰ−Ｃｙ ３（１ｍＭ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ提供 ）５．０μｌと、試薬等級の水２２μｌと、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（商標）（ＵＳ Ｂ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１０単位）または ＤＮＡ ＰｏｌｌのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ提供、１０単位）１μｌとを組み合わせることにより行った。反応は 、室温で１時間後に完了した。 各反応系の一部を９％変性ポリアクリルアミドゲルに充填した。電気泳動に続 いて、ゲルを３ＭＫ紙で乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露してオートラジオグラフィ に供した。次に、各反応系からの別のアリコートを分取９％変性アクリルアミド ゲルに充填し、電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色を行った。標識（変動間 隔で５’³²Ｐおよび３’Ｃｙ３−ＣＴＰ）５８マー（５８ｍｅｒｓ）をゲルから 切り取り、１ｍｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ８．０の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ２０ ０μｌで粉砕し、サンプルを１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブにおいて３ ７℃で一晩振とうを行った。サンプルの遠心分離を簡単に行い、上澄みを新しい マイクロ遠心分離チューブに移した。各上澄みのアリコートのカウントをＢｅｃ ｋｍａｎのＬＳ８１００シンチレーションカウンタにおいて行った。等しいカウ ント（１０，０００ｃｐｍ＝３０マーａ（−）としてのＤＮＡの８５４ｐｇ）を 試薬等級の水２ｍｌに加え、ＳＰＥＸ装置のＦｌｕｏｒｏｍａｘ分光蛍光計を用 いて蛍光の走査を行った。 励起は、５３５ｎｍに最大の信号対ノイズ比を有することがわかった。発光は 、５６０ｎｍ乃至６２０ｎｍの範囲に亘って測定された。発光マキシマは５６５ ｎｍ付近に中心があり、各反応系の発光最大を測定することにより特異蛍光の算 出 を行った。結果は表１に示す通りであった。 ｃｐｓ＝秒当たりのカウント、 ｐｇ＝ピコグラム 上記分析から、酵素の選定は得られる特異蛍光に有意の影響を及ぼすことがで きるとともに、色素の組み込みの間隔は特異蛍光を最大にするのに重要であるこ とがわかる。色素−ヌクレオチド複合体であるｄＣＴＰ−Ｃｙ３の場合には、最 適酵素はＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（商標）であり、最適間隔は分子２つおきである。 実施例２ ＤＮＡマトリックスに対する最適蛍光オリゴヌクレオチドの組み込み ３Ｃ最適蛍光オリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡマトリックスのポリヌク レオチドの外層の標識処理を、そのアニーリング処理されていない自由な一重鎖 腕部を介して行うことができる。蛍光標識ＤＮＡマトリックスを使用して、より 小さいビードに結合されたシーケンスの多種ＤＮＡ腕部を認識するとともに、容 易に測定される質量を検定系に供給することができる。 先づ、ＤＮＡビードマトリックスを、米国特許第５，４８７，９７３号に記載 のようにして組み立てる。マトリックスモノマを連続的に添加することによりｋ 層（ｋ−Ｍマー（ｋ−Ｍｍｅｒ））を有するＤＮＡマトリックスを形成する。（ ５’一重鎖オーバーハングを有する）二重鎖の未精製３Ｃ最適蛍光オリゴヌクレ オチドをｋ−Ｍマーへの最終添加物として添加して、最適蛍光一重鎖腕部を有す るＤＮＡビードマトリックスを得る。アニーリング反応を２Ｘ・ＳＳＰＥ（２０ Ｘ＝３．６ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍの燐酸ナトリム、ｐＨ７．０および０．０２ ＭのＥＤＴＡ）において行う。 本発明の好ましい実施例をある程度詳細に説明したが、上記実施例については 本発明の精神と範囲とから逸脱することなく数多くの変更を行うことができるの で、請求の範囲に記載の本発明は上記した特定の実施例によって限定されるもの ではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，Ｂ Ｇ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．最適蛍光オリゴヌクレオチドの製造方法であって、 （ａ）プライマを得る工程と、 （ｂ）プライマと相補するヌクレオチドシーケンスを含むとともに相補領域の 下流側にヌクレオチド反復領域を含むテンプレートオリゴヌクレオチドを得る工 程と、 （ｃ）ポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートおよび蛍光色素結合ヌク レオチドトリホスフェートを含む適宜の反応媒体においてテンプレートおよびプ ライマをアニーリングする工程と、 （ｄ）テンプレートにおける相補ストランドの合成を開始する工程と、 （ｅ）前記相補ストランドに隣接してターゲットシーケンスを含む前記オリゴ ヌクレオチドを取着する工程と、 （ｆ）適宜の方法により前記最適蛍光オリゴヌクレオチドを精製する工程とを 備える製造。 ２．前記プライマは³²Ｐで標識処理されることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の方法。 ３．前記ヌクレオチド反復領域は式 Ｎ^t（Ｎ^t）_nＮ^t を有し、Ｎ^tは蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェートと塩基対を形成する ことができるヌクレオチドであり、ｎは２０乃至１０００の整数であることを特 徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．前記ヌクレオチド反復領域は式 Ｎ^t（Ｎ_mＮ^t）_nＮ_m を有し、Ｎは蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェートと塩基対を形成するこ とができないヌクレオチドであり、Ｎ^tは蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフ ェートと塩基対を形成することができるヌクレオチドであり、ｎは２０乃至１０ ００の整数であり、ｍは１乃至１１の整数であることを特徴とする請求の範囲第 １項に記載の方法。 ５．前記取着工程は連結反応からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載 の方法。 ６．前記取着工程はランダマエクステンションからなることを特徴とする請求の 範囲第１項に記載の方法。 ７．前記取着工程はクローニングからなることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の方法。 ８．前記精製工程は沈降、サイズ分別、ゲル電気泳動および抗原特異結合よりな る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．最適蛍光オリゴヌクレオチドの製造方法であって、 （ａ）プライマ結合領域と、蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェートのそ の後の組み込みのための５’エクステンション領域と、６−２００ヌクレオチド の３’オーバーハング領域とを備えたテンプレートをつくる工程と、 （ｂ）オリゴヌクレオチドターゲットシーケンスを変性し、適宜の反応媒体に おいて過剰のテンプレートと、適宜のヌクレオチドトリホスフェートと、ポリメ ラーゼとを添加することによりターゲットシーケンスを標識処理する工程とを備 えることを特徴とする方法。 １０．ほとんどの３’シーケンスは６乃至１２ヌクレオチドのランダムシーケン スであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．前記テンプレートはプロモータ部位から下流側にあり、ターゲットシーケ ンスはクローニング用の適宜のベクタにおいてプロモータ部位から更に下流側に あることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の方法。 １２．前記プロモータ部位はＴ３プロモータであることを特徴とする請求の範囲 第１１項に記載の方法。 １３．前記プロモータ部位はＴ７プロモータであることを特徴とする請求の範囲 第１１項に記載の方法。 １４．前記プロモータ部位はＳＰ６プロモータであることを特徴とする請求の範 囲第１１項に記載の方法。 １５．前記方法は最適標識シーケンスとターゲットシーケンスに対して相補性を 有するオリゴヌクレオチドを同時発生することを特徴とする請求の範囲第７項に 記載の方法。 １６．前記標識処理工程はプライマエクステンションからなることを特徴とする 請求の範囲第７項に記載の方法。 １７．前記標識処理工程はランダムプライミング方法からなることを特徴とする 請求の範囲第７項に記載の方法。 １８．プライマと相補するヌクレオチドシーケンスと、前記相補領域から下流側 のヌクレオチド反復領域とを備え、前記ヌクレオチド反復領域はＮ^tからなり、 Ｎ^tは蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェートと塩基対を形成することがで きるヌクレオチドであり、前記反復領域は式 Ｎ^t（Ｎ^t）_nＮ^t を有し、ｎは２０乃至１０００の整数であることを特徴とするオリゴヌクレオチ ド。 １９．前記ヌクレオチド反復領域は蛍光色素結合ヌクレオチドトリホスフェート と塩基対を形成することができないヌクレオチドＮと、蛍光色素結合ヌクレオチ ドトリホスフェートと塩基対を形成することができるＮ^tとからなり、前記反復 領域は式 Ｎ^t（Ｎ_mＮ^t）_nＮ_m を有し、ｎは２０乃至１０００の整数であり、ｍは１乃至１１の整数であること を特徴とする請求の範囲第１８項に記載のオリゴヌクレオチド。 ２０．放射性標識核酸シーケンスとヌクレオチド反復領域とを備え、請求の範囲 第１項の方法により得られることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 ２１．前記放射性標識は³²Ｐであることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載 のオリゴヌクレオチド。 ２２．前記ヌクレオチド反復領域は式 Ｎ^f（Ｎ^f）_nＮ^f を有し、Ｎ^fは蛍光色素に結合されたヌクレオチドであり、ｎは２０乃至１００ ０の整数であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２３．前記ヌクレオチド反復領域は式 Ｎ^f（Ｎ_mＮ^f）_nＮ_m を有し、Ｎは蛍光色素に結合されないヌクレオチドであり、Ｎ^fは蛍光色素に結 合 されるヌクレオチドであり、ｎは２０乃至１０００の整数であり、ｍは１乃至１ １の整数であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２４．前記オリゴヌクレオチドは一重鎖であることを特徴とする請求の範囲第２ ０項に記載のオリゴヌクレオチド。 ２５．前記オリゴヌクレオチドは二重鎖であることを特徴とする請求の範囲第２ ０項に記載のオリゴヌクレオチド。