JP5194459B2 - 一本鎖ｄｎａ増幅方法 - Google Patents

Description

本発明は、目的の核酸鎖断片を増幅する技術に関する。より詳細には、長い核酸鎖（ＲＮＡ）中の特定の核酸断片に相補的な一本鎖ＤＮＡを増幅する技術に関する。

基板上に、所定形状に形成された反応領域において進行させたハイブリダイゼーションの結果から遺伝子の網羅的解析を行うことを特徴としたＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）技術が知られている。

一般のＤＮＡチップ技術は、基板表面に、場合によりプローブとも称されるオリゴヌクレオチド（通常ｃＤＮＡ、通常２５ｍｅｒ〜８０ｍｅｒ程度）を固定しておき、そして、このプローブとターゲット核酸鎖との間のハイブリダイゼーションを進行させて、これを蛍光検出技術等により測定し、ターゲット核酸鎖が係わる遺伝子の発現情報プロファイルを得るという技術である。

遺伝子の発現頻度解析のためにＤＮＡチップを用いる場合は、通常、細胞、組織等からｍＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光物質を組み込みながら増幅を行い、蛍光ラベルされたターゲット核酸鎖と前記プローブとの間のハイブリダイゼーションを進行させるという手法が採用される。

前記ハイブリダイゼーションにおいては、プローブ核酸鎖に対してターゲット核酸鎖の分子数（塩基数）が多すぎてしまうと、ターゲット核酸鎖が嵩高になってしまうので、立体障害等によってハイブリダイゼーションの効率が悪くなってしまう。このため、ターゲット核酸鎖は、抽出された全長のｍＲＮＡやそのｃＤＮＡそれ自体を用いるのではなく、８０ｍｅｒ程度にランダムに分断したＲＮＡ断片やそのｃＤＮＡ断片が用いられている。

ｍＲＮＡを分断する際は、プローブとのハイブリダイゼーション効率の観点、プローブに対応する塩基配列部分の途中位置での分断が起こり難いという観点などからその分断位置が概ね決定されているが、このような手法により分断されたｍＲＮＡ断片の長さは一律に揃っているわけはないという問題や、プローブと相補的な塩基配列領域の途中でｍＲＮＡを分断してしまうことがあるという問題を抱えている。後者の問題では、ターゲット核酸鎖はプローブの塩基配列の一部分としかハイブリダイゼーションしない。

ここで、先行する核酸鎖の増幅技術を挙げる。特許文献１には、一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成し、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成することを特徴とする核酸配列の増幅方法、および前記増幅法により生成した核酸増幅産物に、標識オリゴヌクレオチドを加え、ハイブリダイゼーションを行い、標的核酸を検出する方法が開示されている。この技術では、一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを経由してＲＮＡが合成されている。

特許文献２には、リボ核酸の増幅をもたらすプロセス技術、具体的には、（ａ）一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、ＲＮＡの逆転写を介して一本鎖ＤＮＡを合成する工程、（ｂ）該ＲＮＡを除去する工程、（ｃ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、二本鎖ＤＮＡを合成する工程、（ｄ）該二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する工程、（ｅ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、（ｄ）において得られた一本鎖ＤＮＡを基にして二本鎖ＤＮＡを合成する工程、ならびに（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドモノマーを使用して、複数の一本鎖ＲＮＡを合成する工程からなるプロセス技術が開示されている。この技術では、ＲＮＡの逆転写工程が必須であり、また、二本鎖ＤＮＡの合成、解離等を経由して一本鎖ＲＮＡが合成される。
特開平６−３２７５００号公報。 特表２００５−５０３７９４号公報。

本発明では、リボ核酸鎖（ＲＮＡ）を最初の鋳型に用いて、簡易で、かつ正確な一本鎖ＤＮＡの増幅技術を提供すること、より具体的には、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成やＰＣＲ増幅（核酸の二本鎖増幅）などの工程を全く行うことなく、目的のプローブ核酸鎖に対して相補的で、かつ、長さ（塩基数）の揃った一本鎖核酸（ＤＮＡ）を増幅する技術を提供することを主な目的とする。

本発明は、一本鎖ＤＮＡを連続的に多数増幅する方法である。本方法では、まず始めに、リボ核酸鎖（ＲＮＡ）中に含まれる所定の塩基配列領域に対して、該塩基配列領域に相補的な塩基配列部分と３′末端側に連結されたプライマー配列部分とを備える一本鎖プローブＤＮＡを相補結合させる工程（便宜上第１工程と称する。）を行う。続いて、前記一本鎖プローブＤＮＡを鋳型として、該一本鎖プローブＤＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡを、前記プライマー配列を起点として増幅する過程を繰り返す工程（便宜上、第２工程と称する。）を行う。
このようにして増幅された各一本鎖ＤＮＡは、プライマー配列を含む一本鎖プローブＤＮＡと相補的な塩基配列を有する。したがって、増幅された各一本鎖ＤＮＡは、プライマー配列部分と相補的な塩基配列部分（以下、「プライマー相補配列」と称する。）を除けば、前記一本鎖プローブＤＮＡと同数の塩基配列を備えるものとなる。なお、「リボ核酸」は、特に限定されないが、遺伝子解析等の目的とする場合、トータルＲＮＡ（totalＲＮＡ）やメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ、特に成熟ｍＲＮＡ）が有用である。
本発明では、前記リボ核酸鎖の３′末端又は５′末端のいずれかを固相表面に固定した状態で行うようにするとよい。このように工夫すると、該リボ核酸が反応場に遊離せずに固定されているため、該リボ核酸に対して非特異的にハイブリダイズした一本鎖プローブＤＮＡだけを温度操作によって選択的に解離させ、これを反応場から洗浄除去するという操作を実施することが可能となる。即ち、リボ核酸に対して特異的に相補結合した一本鎖プローブＤＮＡだけを選択的に反応場に残すことができる（即ち、精製できる）。
本発明で用いる一本鎖プローブＤＮＡ（リボ核酸に相補結合させる一本鎖ＤＮＡ）の前記塩基配列部分は、遺伝子特異的塩基配列（例えば、何らかの疾病の発症に特異的に係わる遺伝子塩基配列）であってもよい。例えば、公知の遺伝子特異的なｃＤＮＡライブラリーから選択されたプローブＤＮＡや市販のプローブＤＮＡであってよい。
さらに本発明では、上記方法によって増幅された一本鎖ＤＮＡを、前記一本鎖プローブＤＮＡが固定されている反応場へ供給し、該一本鎖プローブＤＮＡに係わる遺伝子発現解析を行うことを特徴とする遺伝子解析方法を提供する。
この方法では、反応場に固定された一本鎖プローブＤＮＡと増幅されたターゲット一本鎖ＤＮＡの塩基数は、プライマー相補配列部分を除くと完全に一致しているため、両ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率は良く、また、Ｔｍ値の他の操作条件の選定が行い易くなる。
なお、本方法におけるハイブリダイゼーションの検出の具体的方法は、特に限定されない。例えば、相補鎖に結合して蛍光を発する性質のインターカレーターを用いて、該インターカレーターからの蛍光強度を測定する方法や、増幅された一本鎖ＤＮＡ（ターゲット一本鎖ＤＮＡ）を蛍光物質で標識して、該蛍光物質からの蛍光強度を測定する方法などを採用することができる。

本発明に係る一本鎖ＤＮＡ増幅方法によれば、例えば、ｍＲＮＡの遺伝子特異的な塩基配列領域だけを一本鎖ＤＮＡ断片として多数増幅することができる。また、本方法では、逆転写反応によるｃＤＮＡ作成過程を必要としないので、逆転写反応時の不安定性（塩基配列の読み間違い等）を排除でき、また、目的の遺伝子断片を１本鎖増幅の形式で増幅するので、二本鎖増幅方法(例えば、ＰＣＲ法等)を行った場合に比べて、一本鎖の精製の際に生じる数的損失を抑えることができ、さらには、増幅に要する時間の短縮が可能となる。

次に、本発明に係る遺伝子解析方法では、基板に固定されたプローブ核酸鎖に対して、長さがほぼ等しく短いターゲット核酸鎖をハイブリダイズさせることができるので、基板上でのハイブリダイズを効率良く進行させることができる。さらに、各遺伝子においてターゲット核酸鎖の長さ、ハイブリダイズする位置が均一であるため、各遺伝子、各プローブでのハイブリダイズ率が一定に保たれ、定量性を向上させることができる。

以下、本発明に係る方法の好適な一実施形態例ついて、添付した図１を参照にしながら説明する。

測定対象のサンプル(細胞、組織など)から抽出したtotalＲＮＡもしくはｍＲＮＡをビオチン（biotin）で標識する（図１の符号１で示す工程）。なお、ｍＲＮＡを、その末端に位置するポリＡ配列を用いて精製する場合には、このような標識工程を省略することが可能である。

次に、ビオチンで標識されたＲＮＡに対して、該ＲＮＡ中の所定の塩基配列領域と相補的なプローブＤＮＡをハイブリダイゼーション（ＲＮＡ／ＤＮＡ）させる（図１の符号２で示す工程）。このプローブＤＮＡ（図１中の符号Ｘ）は、特定の疾病発症に関与するような遺伝子特異的な塩基配列を有するものを例示できる。

プローブＤＮＡの３′側末端には、プライマー（例えば、ポリＡのようなユニバーサルプライマー）などを連結しておく。なお、このプライマーに予め蛍光標識を行っておくと、増幅された一本鎖プローブＤＮＡのすべてが蛍光標識された状態になるので、増幅された一本鎖プローブＤＮＡに対する蛍光標識工程を省略することができる。

前記ＲＮＡを、標識物質を介して、基板やビーズなどの固相表面Ｓに固定する。例えば、前記標識物質が本実施形態にようにビオチンであれば、アビジンによって処理された固相表面にビオチン-アビジン結合により固定する（図１の符号３で示す工程）。なお、固相表面は、特に限定されないが、基板やビーズなどの表面を例示することができる。

このように固相表面Ｓに固定されたＲＮＡには、前記プローブＤＮＡがハイブリダイゼーションされているため、該プローブＤＮＡは、前記ＲＮＡを介して固相表面Ｓ上に固定された状態となる。なお、ＲＮＡ固定の別法の例としては、ＲＮＡ末端のポリＡ配列を、前記固相表面Ｓに結合させておいたポリＴ（オリゴｄＴ）と相補結合させる方法を挙げることができる（図示せず）。

次に、適切に選定された塩濃度のバッファー溶液を加温することよって、ＲＮＡに対して非特異的にハイブリダイズしたプローブＤＮＡを解離させてこれを洗浄除去し、特異的にハイブリダイズしたプローブＤＮＡのみを精製した後、プローブＤＮＡを鋳型とし、プライマーを起点として一本鎖ＤＮＡ増幅、若しくはインビトロ転写を行うことによって、プローブＤＮＡ（遺伝子特異的配列を持った核酸鎖）の増幅を行う（図１中の符号５に示す工程）。

なお、一本鎖ＤＮＡ増幅やインビトロ転写は、プローブＤＮＡのみを鋳型にして反応が起こるため、目的外のＲＮＡの増幅は起こらず、プローブＤＮＡと相補的な塩基配列を持った一本鎖核酸鎖Ｙ（一本鎖ＤＮＡ）の増幅のみが起こる。

次に、増幅した遺伝子特異的配列を備えるＤＮＡ一本鎖Ｙをターゲット核酸鎖として用い、その相補的塩基配列からなるプローブＸが固定されているＤＮＡチップ１０上でハイブリダイゼーションを進行させる。

図２は、同ハイブリダイゼーションの様子を模式的に示す図である。この図２に示すように、符号Ｙで示すターゲットＤＮＡは、上記したように、これと相補的なプローブＸを鋳型として増幅されたものであるから、該ターゲットＤＮＡは、プライマーとの相補塩基部分（図２のＴＴＴ参照）を除く塩基配列部分が、プローブＸと全く同じ塩基数である。

ここで、一本鎖ＤＮＡの増幅プロセス段階においては、ＳＰＩＡ法を応用してもよい。このＳＰＩＡ法（例えば、米国特許６２５１６３９号参照）の応用例では、鋳型となるＤＮＡに相補的な（本発明においてはプローブＤＮＡの３′末端側に連結されたプライマー配列に相補的な）ＤＮＡ/ＲＮＡキメラプライマーＤＮＡと、二本鎖を形成したＲＮＡを特異的に分解するRNaseH、Strand displacement(鎖引き剥がし)活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行う。

以下、進行過程を順に説明すると、まず、（１）ＤＮＡ/ＲＮＡキメラプライマーが鋳型であるプローブＤＮＡにハイブリダイズし、続いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こる。次に、（２）RNaseHが前記キメラプライマーのＲＮＡ部分を分解する。そして、（３）ＲＮＡが分解されて一本鎖となった前記プローブＤＮＡ部分に、新たにＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーがハイブリダイズする。続いて、（４）ＤＮＡポリメラーゼが、新たにハイブリダイズした前記キメラプライマーを起点として、直前に伸長されたＤＮＡ鎖を引き剥がしながら、伸長反応を引き起こす。以上の（２）〜（４）のサイクルを繰り返すことで、一本鎖ＤＮＡ（引き剥がされたストランド）が増幅される。

また、ＳＰＩＡ法以外に非対称ＰＣＲ法（ただしこの手法の場合、プローブの両末端にプライマー配列が必要となる。）も応用してもよい。ＰＣＲ反応を行う際に、両側のプライマーの一方を、もう一方のプライマーに比べ過剰に加えるように工夫することで、過剰に加えたプライマーから伸長反応が進み、一本鎖ＤＮＡを増幅することができる。

本発明に係る一本鎖ＤＮＡ増幅法に基づいて、実際に増幅を行った例（実施例）について説明する。

まず、培養細胞からtotalＲＮＡを抽出した。具体的には、Ｕ２ＯＳ細胞からRNeasy Midi ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて所定の方法で抽出した。次に、この抽出したtotalＲＮＡ １μｇをビオチンで標識した。ビオチン標識は、Label IT μAray biotin Labeling kit（Mirus社製）を使用して行った。

具体的には、totalＲＮＡ 1μｇ、10ｘLabeling Buffer10μL、Label IT μAray Reagent 4μLを混合し（Total 100μL）、37℃の条件で一時間インキュベーションした。その後、ミリポア社製マイクロコンYM-30（限外濾過）を用いて、ラベルされなかったフリーのビオチンを除去した。

次に、ビオチン標識したtotalＲＮＡ 50ｎｇと最終濃度0.1μＭのプローブＤＮＡ(β-アクチン特異的配列[25mer：配列番号１]とポリＡ配列[30mer：配列番号２]とからなる計55merのオリゴＤＮＡ)を、３０μLのＰＢＳ中５０℃で1時間インキュベートし、このプローブＤＮＡをtotalＲＮＡ中に含まれるβ-アクチン遺伝子にハイブリダイズさせた。

反応液にストレプトアビジンを結合した磁気ビーズを加えた。磁気ビーズはDynabeads M-280 Streptavidin(Dynal Biotech社)を使用した。プローブＤＮＡがハイブリダイズした状態のビオチン化ＲＮＡをビオチン-アビジン結合によって前記磁気ビーズに固定した。

磁気ビーズを500μLのＰＢＳを用いて55℃の温度条件で5分間、3回洗浄し、ＲＮＡに非特異的にハイブリダイズしたプローブＤＮＡを洗浄除去し、特異的にハイブリダイズしたプローブＤＮＡのみを精製した。

このように精製されたプローブＤＮＡに存在するポリＡ配列を用いて、ＳＰＩＡ法を応用して、プローブＤＮＡのβ-アクチン特異的配列部分の相補鎖を増幅した。この際、増幅された核酸鎖のみが蛍光標識できるようにしておいた。

この増幅には、Ovation Aminoallyl System（NuGEN社）を使用した。なお、SPIA法の伸長反応に用いる核酸の一部にアミノアリル基が導入されており、増幅されたＤＮＡ鎖にアミノ基が導入される。

SPIA Buffer Mix 18μL、SPIA Primer Mix 1μL、SPIA Enzyme Mix 1μL(Total 40μL)に上記ＲＮＡとプローブＤＮＡが結合した磁気ビーズ、もしくは0.3fmolのプローブＤＮＡを加え、50℃で一時間インキュベートした。

蛍光標識には、Cy3 Mono-Reactive Dye Pack（Amersham Bioscience社）をを使用した。ＳＰＩＡ法に基づく増幅サンプル（磁気ビーズ除去）を、ミリポア社マイクロコンYM-30（限外濾過）を用いて濃縮、溶液の交換を行い、リン酸バッファーpH8.0に溶解した。リン酸バッファーに溶解したサンプルを、Cy3 Mono-Reactive Dye Packに加えて室温で１時間インキュベートした。この際にCy3 Mono-Reactive Dye（蛍光色素）が、増幅されたDNA鎖のアミノ基に共有結合する。最後に、ミリポア社マイクロコンYM-30（限外濾過）を用いて、DNA鎖に導入されなかったCy3 Mono-Reactive Dyeの除去を行った。

上記方法によって目的の一本鎖ＤＮＡが増幅されたことを図３（図面代用写真）に示す。

プローブＤＮＡを直接加えてＳＰＩＡ法により増幅、または上記手法に従い、totalＲＮＡ中に含まれるβ-アクチン遺伝子にハイブリダイズしたプローブＤＮＡを前記ＳＰＩＡ法によって増幅し、蛍光標識を行ったサンプルを、アクリルアミドゲル電気泳動を行うことでサイズによる分離を行い、標識した蛍光色素Cy3により検出した。このCy3の検出により、除去しきれなかったフリーのCy3 Mono-Reactive Dyeと、30bp程度のＤＮＡ鎖が検出された。

レーン１は、プローブＤＮＡを直接加えてＳＰＩＡ法により増幅されたＤＮＡ断片を示しており、レーン２は上記手法に従い、totalＲＮＡ中に含まれるβ-アクチン遺伝子にハイブリダイズしたプローブＤＮＡを前記ＳＰＩＡ法によって増幅したものである。どちらのレーンにおいても、プローブＤＮＡのβ-アクチン特異的配列２５merとほぼ同じ長さの一本鎖ＤＮＡが増幅されたことが確認された。

本発明は、例えば、遺伝子発現頻度解析などの場合におけるターゲット核酸鎖の増幅技術、プローブ作製技術などとして利用できる。

本発明に係る一本鎖ＤＮＡ増幅方法の実施形態例の概念を説明するための図である。 同方法によって使用したプローブＤＮＡを基板に固定し、該プローブに対して同方法で増幅した一本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせる方法を説明するための図である。 実施例（アクリルアミドゲル電気泳動）の結果を示す図（図面代用写真）である。

Claims (2)

1. リボ核酸鎖中に含まれる所定の塩基配列領域に対して、該塩基配列領域に相補的な塩基配列部分と３’末端側に連結されたプライマー配列部分とを備える一本鎖プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第１工程と、
   リボ核酸鎖に対して特異的にハイブリダイズした一本鎖プローブＤＮＡのみを精製する第２工程と、
   前記リボ核酸鎖の３’末端または５’末端のいずれかを固相表面に固定した状態で、前記一本鎖プローブＤＮＡを鋳型として、該一本鎖プローブＤＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡを、前記プライマー配列を起点としてＳＰＩＡ法により増幅する過程を繰り返す第３工程と、
   を行う一本鎖ＤＮＡ増幅方法。
2. 前記一本鎖プローブＤＮＡの塩基配列部分は、遺伝子特異的塩基配列であることを特徴
   とする請求項１記載の一本鎖ＤＮＡ増幅方法。