CZ20031582A3 - Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu - Google Patents
Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031582A3 CZ20031582A3 CZ20031582A CZ20031582A CZ20031582A3 CZ 20031582 A3 CZ20031582 A3 CZ 20031582A3 CZ 20031582 A CZ20031582 A CZ 20031582A CZ 20031582 A CZ20031582 A CZ 20031582A CZ 20031582 A3 CZ20031582 A3 CZ 20031582A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- dna
- primers
- amplification
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 276
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 249
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 249
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 150
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 152
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 99
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 94
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 91
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 50
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 49
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 34
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 28
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims description 12
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 11
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 5
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 12
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 7
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 6
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 235000019788 craving Nutrition 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000004836 empirical method Methods 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid group Chemical group C(\C=C/C(=O)O)(=O)O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid group Chemical group C(CCC(=O)O)(=O)O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Description
Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu oblast techniky
Vynález spadá do oblasti amplifikace nukleových kyselin.
Popisuje se způsob izotermické amplifikace nukleových kyselin aložený na použití pevného povrchu. Dále se popisuje přístroj sady, které je možné použít při aplikacích, kde je nutný yysoký výkon, zvláště při sekvenování nukleových kyselin.
Dosavadní stav techniky
Analýza sekvencí nukleových kyselin je základ při řadě aktivit oblasti bilogie, biotechnologie a medicíny. Schopnost stanovit sekvence nukleových kyselin se stává stále důležitější a využívá se při sekvenování velkých genomů lidí a jiných vyšších organizmů a také například umožňuje stanovení polymorfizmu jediného nukleotidu (SNP) a testování a sledování exprese genů. Genetická informace získaná sekvenováním 'nukleových kyselin má řadu aplikací, například při zkoumání a potvrzení cílových míst v případě léků, při stanovení diagnózy onemocnění, při hodnoceníohrožení a při identifikaci a charakterizaci organizmu.
Na základě rostoucí poptávky po spolehlivých genetických informacích spojených s organizmem, s onemocněním nebo s jedinci v populaci, je stále důležitější zlepšit výkonnost sekvenačních metod. Základním úkolem takových aplikaci je stanovení sekvence čtyř baží adenin (A) , cytosin (C) , guanin (G) a tymin (T) nebo uráčil (U) , která je obsažena v nukleových kyselinách a náleží určitému typu buněk, organizmu nebo populaci jedinců. Většina metod sekvenování nukleových kyselin (popisuje se v publikaci Yan H., et al. , Science 2000, 289 (5486):1890-2) umožňuje stanovit sekvenci • ·
nukleové kyseliny buď přímo (extenzí nukleotidů použitím primerů nebo hybridizací) nebo nepřímé (elektroforetickou analýzou a/nebo analýzou na základě štěpení). Vědecká nebo ekonomická hodnota libovolné aplikace udělené sekvenační analýze nukleových kyselin vysoce závisí na skutečném výkonnu letody.
Úsilí nutné pro získání izolovaných nukleových kyselin v množství a kvalitě, která je. přijatelná 'pro získání spolehlivých výsledků, tvoří jeden z hlavních problémů, které je nutné zvažovat při hodnocení výkonnosti sekvenační metody. Původní vzorek obsahující nukleovou kyselinu, která se má sekvenovat, často neposkytuje dostatek materiálu, aby se mohla provést uvedená analýza. Je nutné použít velké množství počátečního materiálu a/nebo výrazný zásah člověka. To je zvláště důležité v případě . soudní analýzy DNA a při archivování vzorků DNA nebo mRNA získaných z určitých typů buněk, kdy se provádějí sekvenační metody vyžadující stovky nanogramů izolované sekvence DNA, přičemž se zažíná. z jednoho ňanogramu nebo z menšího množství celkové genomové.DNA.
Aby se tento problém vyřešil, je možné amplifikovat sekvenci DNA, přičemž vzniká několik kopií pouze fragmentu nukleové kyseliny, který je ve středu zájmu. V obecném případě amplifikace nukleové kyseliny vyžaduje opakování série akcí:
a) Získání první nukleové kyseliny (templát) obsahující sekvenci, která nás zajímá.
b) Získání druhé nukleové kyseliny (primer), která obsahuje, alespoň na svém 3'konci, sekvenci komplementární se sekvencí obsaženou v první nukleové kyselině a sekvenci přilehlou nebo vnitřní, vztaženo k 3'-konci, která je středem zájmu.
• ···
3·
c)
d)
e)
f)
Vytvoření podmínek, které umožňují přechod templátu a primeru na jednořetězcové molekuly, alespoň v komplementární oblasti dvou nukleových kyselin.
Vytvoření podmínek, které umožňují hybridizaci mezi komplementárními sekvencemi lokalizovanými na templátu a v primeru.
Použití polymerázy nukleových kyselin schopné syntetizovat komplementární řetězec oblasti templátu začínající na 3'konci hybridizovaného primeru podle pravidel párování baží podle Watsona a Cricka (A-T nebo A-U a C-G) .
Vyvolání oddělení výsledné dvouřetězcové nukleové kyseliny (jeden řetězec patří původnímu templátu, druhý obsahující primer fúzovaný se sekvencí komplementární s oblastí templátu, kde je možná extenze nukleotidů) tak, že každý řetězec se může stát templátem pro další hybridizaci a polymerizaci.
Do amplifikační reakce se také přidá druhý primer, aby začala polymerizace jeho hybridizaci s částí nově syntetizovaného řetězce, která sousedí se sekvencí, jenž je Ltředem zájmu nebo je její součástí. Jestliže se použijí dva orimery, kdy každý je specifický pro jeden komplementární řetězec, opakování každého z těchto cyklů umožňuje syntetizovat více kopií obou řetězců templátové sekvence obsažené mezi sekvencemi používanými k hybridizaci primerů. V jiném případě, jestliže se použije pouze jeden primer, vzniká více kopií jednoho řetězce.
Klíčovým bodem je kontinuální zajištění podmínek, které umožňují dehybridizaci původních a nově syntetizovaných řetězců a jejich hybridizaci s volnými molekulami primerů, přičemž dochází k opětné polymerizaci a rychle se tvoří požadované množství specifické sekvence nukleové kyseliny. Molekuly primerů jsou v obecném případě přítomny v koncentraci
Ί,.
• · podstatně vyšší než templátové molekuly, což podporuje exponencionální kinetiku procesu amplifikace.
V běžném případě přechod mezi jednořetězcovou a dvouřetězcovou formou nukleových kyselin vzniká na základě zvyšující se a snižující· se teploty v systému, při které dochází k amplifikaci. V tomto rozsahu elementy nezbytné pro amplifikaci (templát, primery, polymeráza nukleových kyselin, nukleotidy a sole) se podrobují sérii fází zahřívání a chlazení, které vytváří externí zařízení.
Takový přístup, který se‘obvykle nazývá teplotní cyklus, se aplikuje při postupu dobře známém v oboru, který se nazývá oolymerázová řetězcová reakce (PÓR) (popisuje se v publikaci Taylor G.R., „Polymerase chain reaction: Basic prínciples and automation in PCR: a Practical approach, edit.ed by Mcpherson M.J. et al., Oxford Univ. Press -1991), kdy následující kroky se provádějí v přesném pořadí a v předem definovaném časovém úseku:
a) Denaturace (provádí se při teplotě 90 až 95 °C po dobu .30 až 60 sekund). Vnější zařízení poskytuje energii (ve formě tepla) nezbytnou ke zvýšení pohybu molekul nukleových kyselin na úroveň, která je dostatečná pro porušení nekovalentních interakcí, které stabilizují dvouřetězcovou konfiguraci. Tento krok je možné v prvním cyklu vypustit, v případě, že templáty a primery jsou už v jednořetězcové formě, ale je absolutně nezbytný v následujících cyklech.
b) Hybridizace (probíhá při teplotě 35 až 80 °C po dobu 30 až 90 sekund). Komplementární sekvence získaná v molekulách primerů a templátů může hybridizovat v okamžiku snížení teploty. Tato teplota, kterou je nutné pozorné kontrolovat, aby se zabránilo hybridizaci molekul, které vykazují pouze omezenou homologii, se ’ ’ ·« ·· ···· * · · ♦ · · · • · ·· · · · • ·· ··· · φ • · · · · ·· · vypočítá případ od případu, protože je funkcí délky a obsahu baží G/C v sekvenci nukleové kyseliny primeru a komplementární oblasti templátu.
c) Elongace (probíhá při teplotě 60 až 85 °C po dobu 60 až 180 sekund). To je jediný krok, ve kterém vznikají nové molekuly nukleových· kyselin. Teplota, při které dochází k elongaci, je funkcí vybrané polymerázy a až na několik výjimek neodpovídá teplotě hybridizace. Elongace nově syntetizovaného řetězce se obvykle provádí za použití polymeráz během jedné nebo několika minut, v závislosti na délce amplifikované nukleové kyseliny. Nové navázání primerů nemůže proběhnout až do okamžiku, kdy se prodloužený řetězec alespoň částečně neuvolní jako jednořetězcová molekula z dvouřetězcové molekuly vzniklé elongaci..
Za účelem získání množství nukleové kyseliny, které je dostatečné pro další analýzu, se tyto kroky opakují v 15-ti až 40-ti cyklech. Po uplynutí této doby PCR obvykle nepokračuje, protože dochází k vyčerpání polymerázy.
Vyvinula se řada různých technologií, strategií a reakčních podmínek, které odpovídají základnímu schématu, ale PCR má stále vážná omezení způsobená řadou specifických požadavků.
a) zařízení pro zahřívaní a chlazení,
b) polymeráza, která zůstává vysoce progresivní a přesná dokonce po řadě cyklů při vysokých teplotách nutných při denaturaci nukleových kyselin,
c) dělení amplifikačního postupu ha řadu cyklů tak, že polymerizace není kontinuální, ale je synchronizovaná s teplotními cykly. Polymerizační reakce nukleové kyseliny nelze dosáhnout kontinuálním způsobem, protože je pravidelně přerušována opětným vytvořením podmínek, • · · . . . . , ! ?··. · · ·. · , * · * · · »· »·· , . .. · · · . . , ’ ·· ·· ·· ..
které jsou nezbytné pro hybridizaci mezi . volným primerem a templátem, což zpomaluje celý postup.
V předchozím stavu techniky se popisují různá řešení, jak obejít taková omezení klasické PCR. Zvláště se popisují alternativní přístupy, které umožňují oddělení řetězců a lJybridizace při izotermických 'podmínkách, ' aniž dochází Jeplotním cyklům.
Amplifikace s nahrazením řetězce (SDA) je izotermická amplifikační a detekční metoda nukleových kyselin, při kterých se používá polymeráza ve spojení s endonukleázou, která štěpí pouze polymerízovaný řetězec tak, že polymeráza nahradí takový řetězec zatímco vytváří nově polymerizovaný řetězec (popisuje se v patentovém dokumentu EP 497272, a v publikaci Walker.
G.T., PCR Methods Appl. 1993, 3 (1): 1-6). Tato· metoda.
založená na opakované tvorbě zlomů jediného řetězce, na kroku prodlužování a nahrazování, se různě přizpůsobovala (popisuje se v patentovém dokumentu WO 96/23 904 a v publikaci Westin L.
et al.., Nat. Biotechnol. 2000, 18(2):199-204), ale uvedený přístup vykazuje omezenou použitelnost. Endonukleáza se musí přidávat spolu s polymerázou a proto rozmezí povolených teplot, při kterých se uskutečni celý proces, je omezeno na teploty při kterých jsou oba enzymy aktivní. V případě endonukleáz je takové rozmezí (obvykle 25 až 50 °C) obvykle příliš malé, aby se předešlo nespecifické hybridizaci primerů s templátem vedoucí k tomu, že část reakcí je neproduktuvní >1>
nebo se tvoří nežádoucí produkty. Nukleové kyseliny působící jako primery a/nebo templáty se. musí dále upravovat, protože je nutné, aby templátová oblast, aby se mohlo amplifikovat, neobsahovala místo rozeznávané . endonukleázou, zatímco toto místo musí být vždy přítomné v primerové sekvenci.
• · I • · « • 4 ··
7*
Amplifikace po otáčivé kružnici (RCA) je metoda využívající DNA polymerázu prodlužující kruhové oligonukleotidové sondy za izotermických podmínek. Tato metoda vykazuje buď lineární nebo geometrickou kinetiku a tvoří tandemově spojené kopie molekuly DNA pro amplifikaci v důsledku komplexního paternu nahrazení řetězce (popisuje se v publikaci Walter N.G. and Strunk G., Proč. Nati. Acad. Sci USA 1994, 91 (17): 7937-41 a v patentovém dokumentu WO 94/03624). Také v tomto případě, dokonce i jestliže se technologie už dříve upravila (popisuje se v patentovém dokumentu WO 97/19193 a v publikaci Isaksson A and Landergren U, Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10(1):11-5), vykazuje uvedený přístup řadu omezení. Jako například, použití kruhových molekul a příprava amplífíkovaných molekul není možné ve formě jedné entity, ale jako série molekul obsahující různý počet kopií původních . sekvencí, které jsou vzájemně tandemově spojeny.
Vyvinuly se další metody, které řeší problém prostřednictvím dočasného hybridu DNA-RNA v izotermické multir enzymatické reakci obsahující RNA polymerázu, ribonukleázu a reverzní transkriptázu (popisuje se v patentových dokumentech WO 91/04340, WO 92/08800, WO 97/04126 a v publikaci Gebinoga M. and Oehlenschlager F., Eur. J. Biochem. 1996, 235 (12):256-61). Při použití uvedené metody se musí počítat s řadou problémů spojených s rychlou degradací RNA a s nalezením komplexních podmínek, při kterých budou v jednom okamžiku správně pracovat všechny složky obsažené v reakci, přičemž je nutné udržet specifitu a rychlost amplifikačního procesu.
Dokonce v případě, že amplifikační metody jsou nápomocné při analýze sekvencí velmi malého množství nukleové kyseliny, výkonnost metod sekvenace nukleových kyselin není spojena pouze s dostupností izolovaných nukleových kyselina v množství •8.
• · • ··· • · « • · « • · ·· ···· dostatečném pro zpracování a pro získání spolehlivých informací, ale také s možností zpracovat velké množství vzorků rychle a s minimálními zásahy člověka. Většina genetických informací se dnes stále získává použitím technologií, jako je gelová elektroforéza, která je těžkopádná, pracná, obtížně se automatizuje a vyžaduje -relativně velké přístroje. Takové metody však v obecném případě umožňují pouze individuální zpracování každé entity nukleové kyseliny, která se bude sekvenovat. Proto se vyvinula řada technologií, které poskytují specifická řešení' umožňující paralelní analýzu několika různých nukleových kyselin.
405 (6788): 827-36).
obsahující více jak
V předchozím stavu techniky běžným způsobem . zvýšení výkonnosti je zpracování řady vzorků při paralelním použití pevného povrchu, které se často definuje jako mikroerej DNA nebo DNA čipy, na kterých se DNA zachytí a pak se analyzuje za použití různých přístupů, které zahrnují buď značené jednotlivé nukleotidy, nebo značené nukleové kyseliny (popisuje v publikaci Southern E. et al., Nat. Gent. 1999, 21 (1
Suppl.): 5-9, Lockhart D.J., and Winzeler E.A., Nátuře 2000, Velké molekuly (například molekuly 500 nukleotidů) stejně jako menší molekuly, jako jsou oligonukleotidové primery se mohou účinně spojovat s pevným povrchem kovalentním způsobem fyzikálně nebo chemicky a to buď nespecificky nebo použitím specifické chemické skupiny na jednom konci nukleové kyseliny (popisuje se v publikaci Adessi C., et al., Nucleic Acids Res. 2000, 28(20): E87, Okamoto T. et al., Nat. Biotechnol. 2000,
18(4):438-41). Kombinace vhodných robotů, systémů založených na mikromechanice a mikroskopické metody umožňují technicky provést uložení a analýzu až miliónů nukleových kyselin na jeden centimetr čtvereční podkladu.
• · • · φ • · • · · ·· ··
Za použití stejných přístupů je možné provést reakci extenze primerů nebo templátových molekul . (popisuje se v patentovém dokumentu WO 91/13075, WO 00/47767). V jiném případě se mohou primery zachytit na povrchu a ve spojení s volnými primery v roztoku umožňují amplifikaci a zachycení produktu PCR na povrchu -podkladu (popisuje se v publikaci Andreadis, J. D. and Chrisey L.A., Nucleic Acids Res. 2000, 28 (2) : e5) . Primery se mohou také imobilizovat na matrici a templátové molekuly jsou obsaženy v kapalné fázi při teplotě (58 až 74 °C) , což umožňuje velmi náhodné a neřízené ustanovení rovnováhy mezi jednořetězcovou a dvouřetězcovou formou, stejně jako extenzi o jedinou bázi (popisuje se v publikaci Dubiley, S., et al., Nucleic Acids Res. 1999, 27(18)el9).
Hlavní nevýhodou těchto technologií je, že v případě každé amplifikace je nutné nejdříve navrhnout a vyrobit čip. Postup výroby je stále docela zdlouhavý, komplexní a nákladný a proto se provádí pouze, když je potřeba1 velké množství čipů. Čipy se mohou často používat pouze. při hybridizaci a/nebo elongaci postupující po jedné bázi, není možné je použít opakovaně a v případě jednoho čipu je možné v jednom čase zpracovat pouze jeden vzorek nukleových kyselin (popisuje se v publikaci Cheung, V. G. et al., Nat. Genet. 1999, 21 (1 Suppl) : 25-32).
Jiné technologie se vyvinuly za účelem alespoň částečně vyřešit problémy spojené s výkonností amplifikace a sekvenování tím, že se zvýší účinnost spojením dvou postupů.
Patentový dokument WO 96/04404 (Mosaic technologies lne.) popisuje metody detekce cílové nukleové kyseliny potencionálně obsažené ve vzorku. Způsob zahrnuje vyvolání amplifikace cílové nukleové kyseliny založené na PCR pouze v případě, jeli cílová nukleová kyselina v testovaném vzorku přítomna.
φφ • ·
• φ • ΦΦ φ
• ·
Λ * » φ • · · Φ • · ΦΦ • ♦ · · Φ • » · Φ ·· ·Φ • · « · <» φ
Φ
Φ
Φ • Φ
Specifické primery jsou zachyceny na pevném podkladu, což umožňuje amplifikovaným sekvencím cílové nukleové kyseliny být také zachyceny na uvedeném povrchu. Dva primery specifické pro řetězec stejně, jako 'v případě běžné PCR, se specificky navrhují tak, že hybridizuji se sekvencemi, které lemují nebo jsou uvnitř cílové sekvence, která se bude amplifikovat a probíhá standardní proces teplotních cyklů.
Prvním krokem uvedeného postupu amplifikace založeného na PCR je hybridizace cílové nukleové kyseliny s prvním specifickým primerem zachyceným na podkladu (primer 1) . První elongační produkt komplementární s cílovou nukleovou kyselinou se pak tvoří extenzí sekvence primeru 1. Když se podklad vystaví působení vysokých teplot nezbytných pro dehybridizaci, cílová nukleová kyselina se uvolní a může se pak účastnit dalších hybridizačních reakcí s jinými sekvencemi primeru 1, které mohou být zachyceny na podkladu. První zachycený produkt elongace může pak hybridizovat s druhým specifickým primerem (primer .2.) zachyceným také na. uvedeném podkladu, a. může. se tak tvořit druhý elongační produkt komplementární s prvním extenzí sekvence primeru 2 a je také zachycen na podkladu. Cílová nukleová kyselina, první a druhý produkt elongace jsou pak templátové molekuly schopné se účastnit vysokého počtu hybridizaci a extenzí. Tento postup limituje pouze přítomnost cílové nukleové kyseliny na začátku postupu a počet sekvencí primer 1 a 2 na počátku postupu. Konečný výsledek je množství kopií cílové sekvence zachycené na povrchu.
Amplifikační postup popsaný v tomto dokumentu se v obecném případě nazývá „můstková amplifíkace protože po prvním cyklu, kdy templát je v roztoku, molekuly templátu a primeru jsou zachyceny na podkladu jejich 5'-koncem, čímž tvoří typickou strukturu podobnou můstkům.
«· ·· • · · • 9 999 • ♦ · · • « · ·
Λ 9 9 9
Vzhledem k tomu, že tento amplifikační postup umožňuje imobilizaci pouze cílové nukleové kyseliny, sledování podkladu umožňuje genericky kvalitativní hodnocení přítomnosti nebo absence specifické cílové sekvence předem definované při návrhu primerů. Můstková amplifikace se může použít jako metoda pro analýzu sekvence s vysokou účinností, .jestliže v různých oblastech pevného povrchu jsou uspořádány různé sady prvního a druhého primeru a jestliže není nutné provést postupnou analýzu cílové sekvence postupující po jediné bázi. Taková technologie poskytuje podstatné zlepšení v postupné analýze různých sekvencí a/nebo vzorků pouze v případě, že jsou známy primery specifické pro každou . odlišnou cílovou sekvenci a mohou amplifikovat cílovou sekvenci v podobných amplifikačních podmínkách.
Jiné technologie zkouší využít účinněji mechanizmus můstkové amplifikace. Patentový dokument WO 98/44151 (Glaxo) popisuje jak, použitím všech analyzovaných templátů nukleové kyseliny přidáním, při obou extrémech, sekvence linkeru komplementární s imobilizovanými primery, každá templátová molekula v roztoku může být náhodně uspořádána a amplifikována bez ohledu na jejich skutečnou sekvenci. Tímto způsobem jsou shodné produkty amplifikace PCR imobilizovány s vysokou hustotou v diskrétní oblasti pevného podkladu, která se nazývá „DNA kolonie. Název vznikl na základě podobnosti s bakteriálními koloniemi na kultivační plotně. Každá DNA kolonie se může zviditelnit a analyzovat jednotlivě, například hybridizací se značenými referenčními sekvencemi nebo použitím přístupu založeném na elongaci primeru. V patentovém dokumentu WO 00/18957 (Appl. Res. Syst.) se popisuje zvýšení účinnosti technologie můstkové amplifikace současnou imobilizaci molekul primeru a templátů na pevném podkladu dříve, než skutečně začne amplifikace.
.·» ···» : :: : *: :: : ·:
·· ·« «· « technologií založených na můstkové nezávisle na zvolené specifiťě nebo nebylo popsáno, jak uskutečnit postup
Podstatné omezení amplifikaci je to, že imobilizační strategii, při izotermických podmínkách (to znamená, aniž je nutné použít teplotních cyklů). Tyto metody proto stále vykazují stejná omezení spojená s PCR. Dokonce, jestliže je možné aplikovat omezený počet cyklů, dochází, na základě citlivosti analýzy a systému vizualizace, k dalším komplikacím, protože teplota dehybridizace může ovlivnit jednotnost pevného povrchu, stejně jako stabilitu navázání nukleových kyselina na povrch. Žádný z izotermických amplifikačních systémů popsaných v předchozím stavu techniky nedosahuje, ve stejném okamžiku, . hustoty různých templátových molekul, které se mohou amplifikovat a analyzovat současně, a samo-dostatečnosti, které charakterizující technologii můstkové amplifikace.
Proto je stále výhodné navrhnout způsob, kde hybridizace primeru, elongace řetězce a oddělení řetězce probíhá kontinuálním způsobem při konstantní teplotě, přičemž se aplikují principy můstkové amplifikace. Dokonce důležitějším bodem je dosažení separace řetězce, poněvadž pouze teplota nebo použití komplexní a specifické techniky, jak se popisuje v předchozím stavu techniky, řeší tento problém. V patentovém dokumentu WO 97/47767 (Sarnoff Corp.) se navrhuje použití chemických a elektrostatických denaturačních postupů amplikovaných při amplifikačních postupech. Takové postupy však vyžadují vysoce specifické materiály, jako. je přístroj generující elektrické pole nebo chemikálie, jako hydroxid sodný, a jsou málo kompatibilní s běžnými postupy amplifikace a vyžaduje specifické další kroky (to je modifikující primery, vymývání chemikálií před začátkem elongace).
Technologie můstkové amplifikace nese další výhody.
Jestliže je možné provést oddělení řetězce v izotermických « · • · • ·· t « » · · · · • · ··· · · ·· · · · podmínkách, pak oddělení řetězce bude možné pouze po úplné elongaci nebo v případě, že elongace1 není dokončena, pak nedochází k přerušení elongace prováděné polymerázou nukleových kyselin.
Podstata.vynálezu
Zjistilo se, že oddělení řetězce dvouřetězcové nukleové kyseliny imobilizované 5'-koncem obou řetězců na stejném pevném podkladu může jednoduše proběhnout v izotermických podmínkách, .jestliže délka nukleové kyseliny omezuje možnost tvořit ohyb. Tento biofyzikální rys se úspěšně využil . při tvorbě DNA kolonií za použití můstkové amplifikace při izotermických podmínkách.
Flexibilita makromolekuly je tradičně vyjádřena jako stabilní délka, což znamená, jakou minimální velikost makromolekuly musí mít, aby se vytvořil ohyb, aniž se podstatně upraví jejich lokální struktura. V případě koncentrací solí kompatibilní s aktivitou polymeráz nukleových kyselin uvedená délka koresponduje přibližně s 5 nanometry (nebo z 15 bázemi) jednořetězcové DNA a přibližně, s 50 nanometry (nebo ze 150 páry baží) v případě dvouřetězcové DNA (Tinland B et al., Macromolecules 1997, 30 (19): 5763-5765,
Williams LD and Mhaler L.J., Annu Rev. Biophys. Biomol. Sťurct. 2000, 29, 497-521). Jinými slovy dvouřetězcové DNA je daleko pevnější ve srovnání s jednořetězcovou DNA, což je způsobeno velkým množstvím nekovalentních interakcí, které stabilizují její strukturu. Podobné pozorování je možné udělat také v případě RNA, dokonce přes to, že stabilní délka dvouřetězcové RNA se podle literatury kolísá v případě dvouřetězcové RNA od 35 do 72 nanometrů (popisuje se v publikaci Zachyrias M., Biopolymers 2000, 54(7): 547-60,
Kebbekus P. et al., Biochemistry 1995. 4, 43(13): 4354-7).
V případě, že externí podmínky vytváří ohyb, dvouřetězcová molekula podstoupí daleko vyšší mechanický stres ve srovnání s jednořetězcovou molekulou.
Řada biofyzíkálních studií zkoušela kvantifikovat a předpovědět destabilizační účinky energie, která vzniká z mechanického stresu na nekovalentní interakce přítomné ve dvouřetězcové DNA, který může následovat po transkripci, po vytvoření dvoušroubovice nebo po mechanické separaci přiléhajících extrémů 5'/3'konce (popisuje se v publikaci Strick T.R., et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000, 29, 523-43). Takové přechody mezí jednořetězcovou· a dvouřetězcovou nukleovou kyselinou jsou ukázány jako přirozený a neřízený jev, ke kterému dochází, když dvouřetězcová molekula se vystaví působení teplot, které se přibližují denaturačním teplotám (popisuje se v publikaci Dubiley S. ét al., Nucleic Acids Res. 1999, 27 (18)·: e!9) . Nikdy se neprokázalo, že takový jev je možné vyvolat a využít, jestliže oba 5'-konce (částečně nebo zcela) molekul dvouřetězcové DNA se současně im.obilizuj.í na· pevném podkladu. Žádný z uvedených dokumnetů stejně jako žádný dokument popisující technologii příbuznou s můstkovou amplifikací nenaznačuje, že taková energie může být vyvolána, aby se předešlo teplotním cyklům v případě provedení můstkové amplifikace.
Na obrázku č. 1 jsou zobrazeny molekulární mechanizmy probíhající podle vynálezu.
V případě, že komplementární sekvence patřící jednořetězcovým primerům (a' a a'') a templáty ’ (b) imobilizované 5'koncem na pevný povrch (c) jsou dostatečně blízko hybridizaci (1) . Každý produkt hybridizace primeru a templátu je více či méně zakřiven v závislosti na vzdálenosti mezi imobilizovanými 5z-konci (zobrazeno na obrázku č. 1A).
• · • ·
4 4 4
V přítomnosti amplifikačního roztoku (d) molekula polymerázy nukleové kyseliny (e) může začínat extenzi nového řetězce, která je kopií imobilizovaného templátu od 3' konce hybridizovaného primeru (2). Dvouřetězcová oblast se následně prodlužuje z počáteční hybridizační oblasti a komplex obsahuje progresivně rostoucí množství uměle zakřivené dvouřetězcové nukleové kyseliny.(zobrazeno na obrázku č IB) .
Během extenze dvouřetězcového segmentu polymeráza se může denaturovat spontánně, jako účinek mechanického stresu vyvolaného kontrastem mezi pevností dvouřetězcového uspořádání a ohybností vyvolanou fixovanou polohou 5'-konce obou řetězců (3). Nekovalentní interakce stabilizující dvouřetězcovou nukleovou kyselinu mohou tvořit konzistentní mechanický stres, jestliže templát není dostatečně dlouhý, aby se taková pevná struktura přizpůsobila zakřivené konfiguraci. Dvouřetězcová část molekuly může méně a méně přijímat vyvolané zakřivení s rostoucím počtem nekovalentních interakcí přítomných v molekule a mechanický stres se může eliminovat pouze redukcí části templátu na dvouřetězcové uspořádání. V tento okamžik část, která je slaběji vázána a proto jednodušeji absorbuje takový stres, je 3'-konec templátové molekuly, který leží distálně k pokračující polymeráze nukleových kyselin a který se může stát jednořetězcový. Stres, který vyvolává zakřivení se následně redukuje a činnost polymerázy dále pokračuje do okamžiku, kdy se stres stane opět příliš silný, aby byl absorbován. Zatímco postup probíhá molekuly dvouřetězcové nukleové kyseliny se oddělí, přičemž ponechají 3'-konec dostupný pro hybridizaci s jiným primerem (4) a druhá molekula polymerázy DNA může iniciovat druhou kopii templátu (5) . Tento postup může probíhat dokonce jako postup postupující po jednotlivých bázích. Mechanický stres aktivovaný otevřením řetězce přes 1 až 2 báze na 3'-konci templátu může být • · · · • · · ···· · · · • · · · · · · · · · · · xš....: =..::..: :..:-..= průvodní jev začlenění 1 až 2 bází polymerázou na 3'-konec neo-syntetizovaného řetězce (zobrazeno na obrázku č. 1C) .
Když se ukončí první kopie templátu nebo je ukončována, DNA polymeráza syntetizující druhou kopii je schopna vyvolat mechanický stres na sdíleném řetězci, který je možné progresivně separovat a nahradit prvním syntetizovaným řetězcem (6) (zobrazeno na obrázku č. ID).
Reakce pak pokračuje až do ukončení, to znamená, že dva řetězce templátu jsou imobilizovány a pravděpodobně iniciují amplifikaci, jak se popisuje dříve v textu. Po té, co druhá kopie templátu je dokončena nebo se dokončuje, může se uvolnit 5'-konec tvořený jediným řetězcem templátu (7) a hybridizuje s jiným imobilizovaným primerem v sousedstvím (8), zatímco jiná molekula polymerázy nukleové kyseliny může opětovně nastartovat syntézu (9). Ve stejný čas první jednořetězcová kopie může hybriďizovat s jiným primerem (10) a může iniciovat nové vytváření kopií (11). Tento postup, zobrazený na obrázku č. 1E, umožňuje, aby se neo-syntetizované kopie přetvářely na jednořetězcové nukleové kyseliny pomocí separace a nahrazení řízené mechanickým stresem, který může být reprodukován libovolnou imobilizovanou templátovou molekulou, která hybridizuje s imobilizovaným primerem, aniž působí externě vytvořená cyklická aktivita.
Vynález zobrazuje, že flexibilita nukleových kyselin, která se podstatně liší, jestliže nukleová kyselina, je buď jednořetězcová nebo dvouřetězcová, umožňuje částečné uvolnění templátů ve formě jednořetězcové molekuly, zatímco, stále probíhá polymerizace. Vynález překvapivě také ukazuje, že tento jev neovlivňuje aktivitu polymerázy, ale může se použít k řízení izotermické amplifikace molekuly templátu za vzniku ·· · · · · · · ·· ····
nově syntetizované molekuly, kdy všechny jsou imobilizovány v určité oblasti pevného povrchu.
Zdokonalení metody zde popsané můstkové amplifikace umožňuje exponencionální produkci komplementárních sekvencí, které mají smíchanou jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou konfiguraci v diskrétní oblasti pevného povrchu (v případě kolonií DNA se popisuje v patentových dokumentech WO 98/44151 a WO 00/18957), ale izotermickým a kontinuálním způsobem. V případě, že se uvažuje, že množství shodných amplifikovaných molekul je dostatečné, sekvenování a jiné popsané analytické metody se mohou stejně aplikovat v případě kolonií DNA vytvořených izotermicky buď na samotném podkladu nebo na molekulách uvolněných z kolonií DNA do roztoku metodami, které se popisují v předchozím stavu techniky.
Kontinuita amplifikačního postupu podle vynálezu spojená s izotermickými podmínkami poskytuje zřejmé výhody ve srovnání s metodami popsanými v předchozím stavu techniky, co se týká uspořeného času a úsilí při získání molekul nukleové kyseliny ve formě a v množství umožňující aplikovatelnost výkonných sekvenčních metod. 'Je nutné poznamenat, že vynález popisuje použití pevného, podkladu ne pouze jako nástroje, který umožňuje paralelní analýzu amplifikovaných molekul (které jsou dobře známy v předchozím stavu techniky), ale také jako komponent podstatný při provedení amplifikace nukleových kyselin, jako kontinuální postup při izotermických podmínkách.
Dokonce ačkoli stabilní délka pro dvouřetězcovou DNA koresponduje s 150 páry baží, metody podle vynálezu ukázaly, že je možné použít templátu DNA nebo RNA v širokém rozsahu délek v řádu několik stovek nukleotidů. Je možné odvodit, že takové rozmezí je možné dále rozšířit na templáty obsahující až 1 000 nukleotidů za použití podmínek identifikovaných ··· · pomocí stejných empirických metod popsaných v příkladech v případě molekul DNA, které obsahují 68 až 605 nukleotidů.
Hlavní předmětnou věcí vynálezu jé způsob izotermické amplifikace alespoň jednoho segmentu nukleové kyseliny obsahující až 1 000 nukleotidů zahrnující:
a) vytvoření aléspoň jednoho templátu nukleové kyseliny obsahující nukleovou kyselinu(y), který se mají amplifikovat, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje na 5' konci oligonukleotidovou sekvenci Y a na 3'konci oligonukleotidovou sekvenci Z a navíc nukleové kyseliny nesou na 5'-konci prostředek pro imobilizaci na pevný podklad,
b) vytvoření jednoho nebo více primerů kolonií X, které mohou hybridizovat buď s oligonukleotidovou sekvencí Z nebo s oligonukleotidovpu sekvencí Y a nesou na 5' konci prostředek imobilizůjící uvedené primery kolonií, na pevný podklad,
c) smíchání uvedeného templátu(ů) nukleových kyselin a primerů kolonií spolu s roztokem, který umožňuje jejich imobilizaci 5'-.koncem na pevný podklad v přítomnosti uvedeného pevného podkladu tak, že 5' konce templátu.(ů) nukleových kyselin a primerů' kolinií se váží na uvedený pevný podklad,
d) aplikace amplifikačního roztoku, který obsahuje alespoň polymerázu. nukleové kyseliny a nukleotidové prekurzory, na uvedený pevný podklad za účelem izotermicky vytvořit a ímobilízovat nukleové kyseliny, které vykazují sekvenci shodnou nebo komplementární se sekvencí imobilizovaného templátu(ů) nukleové kyseliny.
• · , · · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 • ,· 999 9999
19: :: : ·: ::.....
·· ·· 99 99 99 99
Způsob podle vynálezu se s úspěchem provedl při izotermické amplifikaci na pevném povrchu molekul jednořetezcové DNA, které obsahují 68 až 605 baží.
Množství imobilizovaných nukleových kyselin, jak se uvádí v odstavci c) udává průměrný počet kolonií DNA na jednotce povrchu, která se může vytvořit způsobem podle vynálezu. Rozmezí výhodných, koncentrací molekul DNA, které se mají imobilizovat, se stanoví v příkladech a pohybuje se mezi 1 nM a 0,01 nM v případě templátových molekul a mezi 50 a 1 000 nM v případě primerů kolonií. Takové koncentrace nukleových kyselin umožňuji vytvoření kolonií DNA s hustotou 1 000 až 100 000 na mm2.
Konstantní teplota při amplifikaci podle vynálezu je teplota, při které vybraná polymeráza nukleové kyseliny vykazuje optimální aktivitu. Příklady ukazují, že polymerázy nukleových kyselin, které se běžně používají v systémech amplifikace nukleových kyselin známých v předchozím stavu techniky, . je možné také použít k provedení metod podle vynálezu při teplotě mezi 70 až 85°C nebo výhodněji mezi 77 a 81 °C. Toto rozmezí teplot je také funkční v případě hybridizace, protože při těchto teplotách se v obecném případě snižuje nespecifická hybridizace mezi primerem a templátem.
Termín „izotermický je ekvivalentní termínu v podstatě stejná teplota, což znamená, že libovolná odchylka od teploty, která se na začátku vybrala, aby se provedl způsob se specifickou polymerázou nukleových kyselin je v rozmezí odchylek, který vykazuje běžně dostupný termostat.
Termín „pevný podklad znamená libovolný pevný povrch, na který se mohou zachytit nukleové kyseliny. Mohou to být latexové částice, dextranové částice, polystyrénové povrchy, • · • · • · · 9 » · · · 4 9 • · · · · · ··· 9 · · polypropylenové povrchy, polyakrylamidový gel, povrchy tvořené zlatém, skleněné povrchy a silikonové destičky. S výhodou se používá pevný podklad, jako je sklo nebo polystyren.
Termín „templát nukleové kyseliny znamená entitu obsahující nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA), která se bude amplifikovat a je přítomna v reakci jako- jednodořetězcová, dvouřetězcová nebo jednořetězcová a dvouřetězcová. nukleová kyselina. Nukleotidy, které tvoří templáty nukleových kyselin, se mohou přirozeně vyskytovat nebo to mohou být syntetické nukleotidy.
Termín „primer. kolonií znamená entitu, která obsahuje oligonukleotidový primer, který je možné mobilizovat na pevném povrchu za použití jeho 5'-konce a je schopen hybridizovat s komplementární sekvencí za použití jeho 3'-konce pro iniciaci specifické polymerázové reakce.
Termín degenerované sekvence primerů znamená krátkou oligonukleot.idovou sekvenci, která je schopna hybridizovat s libovolným fragmentem nukleové kyseliny nezávisle na sekvenci uvedeného fragmentu nukleové kyseliny.
Termín „prostředek pro imobi-lizaci nukleových kyselina na pevném podkladu znamená libovolné chemické zachycení nebo zachycení, které neprobíhá chemickým způsobem, zahrnující použití funkční skupiny, které je možné upravit chemickým způsobem. Termín „zachycení se vztahuje k imob.ilizaci nukleové kyseliny na pevném podkladu kovalentní vazbou nebo' nekovalentní interakcí.
Termín „chemicky upravitelná , funkční skupina znamená skupinu, jako je například fosfátová skupina, karboxylová skupina nebo aldehydová skupina, thiol nebo aminoskupina.
»· ·· ···· • · · · • · ··· ·
2Í··**··’ ’
Termín „kolonie nukleové kyseliny znamená diskrétní oblast obsahující více kopií dvou komplementárních řetězců nukleové kyseliny.
Termín „derivatizovaný povrch znamená povrch, který je možné upravit chemicky reaktivními skupinami, jako je například aminoskupina, thiolnebo akrylátová skupina.
Termín „funkcionalizovaný povrch znamená derivatizovaný povrch, který se upravil se specifickými funkčními skupinami, jako jsou například funkční části kyseliny maleinové nebo jantarové.
molekul nukleových neznámou sekvenci.
Nukleové kyseliny, které se mohou amplifikovat způsobem podle vynálezu zahrnují DNA, jako je například genomová DNA, komplementární DNA, ’ rekombinanntí DNA nebo libovolná forma syntetické nebo upravené DNA. Jejich délka může kolísat mezi molekulami templátů současně imobilizovanými na stejném pevném povrchu a mohou to být fragmenty nebo menší části . větších kyselin, které vykazují známou nebo Nukleové kyseliny, které se mají amplifikovat, se mohou získat z libovolného zdroje /například fragmenty genomové DNA získané z částečného štěpení restrikčními enzymy). Uvedené nukleové kyseliny se musí dříve než se použijí metody podle vynález dále zpracovávat za použití standardních technik genetických manipulací, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 00/18 957. Zvláště je.nutné přidat sekvenci Y a Z, které jsou nezbytné při hybridizaci primerů kolonií. V případě mRNA ,se může izolovaná mRNA dříve než se upraví pro metody podle vynálezu transformovat na cDNA použitím reverzní transkriptázy a případně na dvouřetězcovou
DNA.
·· · · • · · · · · · · * ‘ · • · tu · · · · * · · • · · ··* · · · · · · · • · · · · · · · · · · · __»· ·· ·· ·· ·· ··
V jiném případě, když je templář přirozená, syntetická nebo upravená molekula RNA, může se přímo amplifikovat způsobem podle vynálezu za použití specifického enzymu, o kterém je známo, že _může vytvořit z jednořetězcové RNA dvouřetězcovou RNA.
Templáty nukleové kyseliny podle vynálezu obsahují nejen nukleovou kyselinu, která se bude amplifikovat, ale také oligonukleotidy v sekvenci Y a Z, které, mají známé sekvence a mohou mít různou délku. Oligonukleotidové sekvence Y . a Z vhodné pro použití v uvedených metodách podle vynálezu s výhodou obsahují alespoň pět nukleotidů, výhodněji 5 a 100 nukleotidů a ještě výhodněji přibližně 20 nukleotidů.
Oligonukleotidové sekvence Y a Z podle vynálezu se mohou připravit použitím metod, které jsou v oboru standardní nebo běžné nebo se mohou získat z komerčních zdrojů. Jestliže se má amplifikovat velké množství sekvencí nukleových kyselin, pak zachycení oligonukleotidů Y a Z se může provést stejnou nebo odlišnou reakcí.
Oligonukleotidové sekvence Y a Z obsažené na 5'-konci respektive 3'-konci templářů nukleové kyseliny se nemusí nacházet na samých koncích templářů. Ačkoliv se oligonukleotidové sekvence Y a Z nacházejí s výhodou na 5' nebo 3'konci templářů nukleových kyselin nebo v jejich blízkosti (například v oblasti 0 až 100 nukleotidů 5' konce a 3'konce), mohou se také nacházet dále (například více jak 100 nukleotidů ) od 5'nebo 3'konce templářů nukleové kyseliny, což umožňuje, že sekvence Y a Z lemují amplifikovanou sekvenci nukleové kyseliny, která není delší než 1 000 baží.
Po té, co se připraví templář nukleové kyseliny, může se před použitím v metodách podle vynálezu amplifikovat. Taková ·« «4 ♦· ·· 44 ·44· • 4 4 · 4 · · 4 4 4 • 4 ··· 4 · 4 4 4 4 4 • 44 ··· ·· · · 4 · · . Κ 44 4 4 . · 4 4 4 44 4
23·· · · ·· ·· ·· ·♦ amplifikace se může provést za použití metod, které jsou dobře známy a popsány v oboru, jako je například začlenění templátu nukleové kyseliny do expresívního vektoru a její amplifikace ve vhodném biologickém hostiteli nebo amplifikace pomocí PCR. Tento amplifikační krok není podstatný, ale jako způsob podle vynálezu umožňuje přípravu velkého množství kopií, templátu nukleové kyseliny ve vytvořených kolonií nukleových kyselin vzniklých z jediné kopie templátu nukleové kyseliny. To je možné provést zavedením 5'chemicky upravené imobilizační skupiny, jak je zobrazeno v příkladech.
Templát nukleové kyseliny se může imobilizovat na pevném povrchu jako dvouřetězcová molekula, ale může se připravit jako jednořetězcová forma za použití metod, které jsou dobře známy v oboru a jsou dobře zdokumentovány. Je to například zahřívání na přibližnou teplotu 94 °C a rychlé ochlazení na ledu na teplotu 0 °C nebo promytím 0,1 až 0,5 M NaOH.
Sekvence obsažená v primeru kolonií a komplementární s oligonukleotidovými sekvencemi obsaženými v templátu.(ech) se vybraly tak, že vykazují maximální hybridizační aktivitu vůči své komplementární sekvenci a velmi nízkou nespecifickou hybridizační aktivitu vůči libovolné jiné sekvenci. Primer kolonií může obsahovat 5 až 100 baží, ale s výhodou 15 až 25 baží. V primeru se mohou také vyskytovat přirozeně se vyskytující nebo syntetické nukleotidy.
Za účelem vytvoření kolonií nukleových kyseliny způsoby podle vynálezu se mohou použít jeden nebo dva různé primery kolonií. V základním provedení vynálezu se smíchají dva různé primery kolonií X'a X'' s templáty nukleové kyseliny, jak se popisuje v odstavci c) a sekvence primeru kolonií X'a X' ' jsou takové, že oligonukleotidová sekvence Z může hybridizovat s jedním z primeru kolonií X' a oligonukleotidová sekvence Y «9 ·« ·· ··
4 9 4 · · · ··· 4 4 ·· • 4 4 4 > 4 4 · • 4 Λ · 4 4 4 • 9 4 ·· 4·
2Φ •9 4444
4
4 9*4
4 4 4 je stejná jako jeden z primerů kolonií X''. V jiném případě oligonukleotidová sekvence Z je komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y a sekvence primeru kolonií X je stejná jako oligonukleotidová sekvence Y.
Když se připravují templáty nukleových kyselin a primery podle vynálezu mohou se dále do nich zavést požadované sekvence způsoby, které jsou dobře známy v oboru a jsou dobře dokumentovány. Takové další sekvence zahrnují například místa rozeznávaná restrikčními enzymy, upravené nukleotidy nebo jiné značky nukleových kyselin, ' které umožňují identifikaci a izolaci produktů amplifikace, které obsahují sekvenci. daného templátu nukleové kyseliny. Další požadované sekvence zahrnují sekvence vlásenkové struktury DNA (které tvoří ' vlásenkovou strukturu nebo jiné sekundární struktury, když jsou jednořetězcové), řídící sekvence DNA, které řídí interakce protein-DNA, jako je promotor, zesilovač, začátek replikace nebo sekvence operátoru DNA, které rozeznávají specifické proteiny vázající se na DNA.
Primery kolonií podle vynálezu mohou také zahrnovat sekvence degenerovaných' primerů. Takové degenerované primery tak nevyžadují přítomnost oligonukleotidových sekvencí Y nebo Z v templátu(ech), aby došlo k hybridizaci s templátem, ačkoli použití degenerovaných primerů při hybridizaci s templátem, který obsahuje oligonukleotidové sekvence X nebo Y, není vyloučeno. Při použití při amplifikačních metodách podle vynálezu degenerované primery musí hybridizovat . se. sekvencemi nukleových kyselin templátu v místech lokalizovaných na obou stranách sekvence nukleové kyseliny, která se amplifikuje, nebo v místech, která uvedenou sekvenci lemují.
5'-konec templátu nukleové kyseliny a primery připravené způsobem popsaným shora v textu se upravuje tak, aby nesl ··
Λ.
• ··· • · · !· · ·· ···· • · · • · · • · · · ·· ·· prostředek pro imobilizaci 5'konců templátu nukleové kyseliny a primerů kolonií. Imobilizace nukleových kyselin za použití 5'konce nechává 3'-konec volný tak, že oblast 3'-konce templátů a primerů mohou hybridizovat a řídit syntézu nového řetězce.
Protokol imobilizace by měl zabránit uvolnění templátu a primerů z pevného povrchu během izotermické amplifikace. Proto prostředky pro imobilizaci jsou s výhodou chemicky upravené funkční skupiny, které umožňují tvorbu kovalentní vazby mezi uvedenými molekulami a pevným povrchem, který má derivační povrch a následně se upravuje řetězením bifunkčních skupin za vzniku funkčního povrchu. V jiném případě je možné dosáhnout imobilizace nevratnou pasivní adsorpcí nebo využitím afinity mezi specifickými molekulami (například imobilizace na povrchu potaženém avidinem pomocí molekul značených biotinem).
Příklady chemicky upravených funkčních skupin, které se přidávají na 5'-konec nukleových kyselin za účelem imobilizace jsou thiol, hydroxyl, dimetoxyltrityl (DMT), aminoskupina nebo fosfátová skupina, stejně jako karboxylová skupina ' a aldehydová skupina. Příklady řetězících činidel, použitelné při úpravě pevného povrchu jsou hydrochlorid l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC), anhydrid kyseliny jantarové, fenyldiizothiokyanát nebo anhydrid kyseliny maleinové nebo hetero-bifunkční řetězící činidlo, jako je například ester m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidu (MBS), N-sukcinimidyl[4-jodoacetyl]aminobenzoát (SIAB), sukcinimidyl4-[N-maleimidometyl] cyklohexan-l-karboxylát (SMCC) , ester N-ymaleimidobutyryloxysukcinimidu (GMBS), sukcinimidyl-4-[pmaleimidofenyl]butyrát (SMPB) a odpovídající sloučeniny obsahující sulfoskupinu (rozpustné ve vodě). Nejvýhodnější je, když jsou templáty nukleových kyselin a primery upravené na 5'-konci thiolem, fosfátovou skupinou nebo aminoskupinou a ··
·· ···· • · « • · · • · · · ·· ·· imobilizují se za použití imobilizačního roztoku, který obsahuje hydrochlorid l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu.
Ačkoli pevným podkladem může být libovolný pevný povrch, na který je možné imobilizovat nukleové kyseliny, jako jsou například latexové nebo dextranové částice, polystyrénové povrchy, polypropylenové povrchy, polyakrylamidový gel, povrch tvořený zlatém, skleněné povrchy a silikonové destičky.· Je výhodné, aby pevný povrch byl dostatečně odolný,, aby nebyl ovlivněn silou vyvinutou během elongace a umožnil kovalentní navázání nukleové kyseliny za použití monofunkčních nebo bifunkčních řetězících činidel, jak se popisuje dříve v textu a v patentovém dokumentu WO 00/18957. Po syntéze templátů nukleové kyseliny a primerů kolonií nebo izolaci ze vzorku a po úpravě, jak se popisuje dříve v textu, může dojít k jejich smíchání ve vypočtených koncentracích, kdy se berou v úvahu data udávaná v tomto dokumentu stejně jako hustota kolonií DNA. Koncentrace templátů je s výhodou nižší než nM a primery kolonií jsou v koncentraci 50 krát až 100 000 krát vyšší.
Po imobilizaci primerů kolonií a templátů nukleové kyseliny na pevný povrch se .mohou vytvořit izoteřmickou amplifikační reakcí kolonie DNA podle vynálezu, jak je znázorněno na obrázku č. 1 tak, že každá kolonie obsahuje více kopií původního imobilizovaného templátů nukleové kyseliny a jejich komplementární sekvenci. Hranice vytvořené kolonie nukleové kyseliny je omezena relativně malou oblast, na které se mobilizuje počáteční templář nukleové kyseliny. Je zřejmé, že jednou tolik kopií, molekuly templátů se syntetizuje provedením amplifikační metody podle ,vynálezu, pak vytvořená hranice kolonie nukleové kyseliny je schopná se posunout dále, ačkoliv hranice vytvořené kolonie jé stále omezena na malou '44 44 44 4· 44 ····
4 4 4 4 « 4 4 4 4
4 444 4 4 44 4 4 4
2!7 « · · * · · · ϊ * ί ·» · ·· *· ·· »· ·· ·· část pevného povrchu, na kterém jsou imobilizované nukleové kyseliny.
Velikost a počet kolonii DNA se může řídit úpravou času, během kterého se pevný povrch vystaví izotermické amplifikací. Tak počet kolonií nukleových kyselin vytvořených na povrchu pevného podkladu závisí na počtu templátů nukleové kyseliny, které se na začátku imobilizují na podklad za vzniku dostatečného počtu imobilizovaných' primerů kolonií ve vzdálenosti, která umožňuje hybridizací s molekulami templátů. Řízením počáteční hustoty templátů nukleové kyseliny a primerů je možné dosáhnout optimální situace, kdy se může izotermicky na pevném povrchu připravit vysoká hustota jednotlivých nukleových kyselin o velikosti, která je dostatečná, aby mohla proběhnout jejich analýza, a dále kolonie DNA obsahují dostatečný počet amplifikovaných sekvencí.
Izotermická amplifikace podle vynálezu se může provést za použití' DNA polymerázy závislé na DNA nebo RNA a za. podpory molekul nukleosidtrifosfátů nebo libovolných jiných nukleotidových prekurzorů, jako jsou například upravené nukleosidtrifosfátové molekuly.
Příklady polymeráz nukleových kyselin, které se mohou použít podle vynálezu, jsou DNA polymeráza (Klenow fragment, T4 DNA polymeráza), teplotně stabilní DNA polymerázy (popisuje se v publikaci Perler F. B. et al., Adv. Protein Chem. 1996, 48: 377-435) identifikované v různých teplotně stabilních bakteriích nebo se mohou do těchto bakterií klonovat (jsou to DNA polymeráza Taq, VENT, Pfu, Tfl) stejně jako jejich geneticky upravené deriváty (TaqGold, VENTexo, Pfuexo). Polymeráza nukleové kyseliny s výhodou používaná v případě extenze primerů kolonií je stabilní za teploty, při které • Φ φφ *· »· φφ' φφφφ • · · · ·Φ\ φ φ * · • φ φφφ ΦΦΦ· φ φ · • φφ φφ* φφ φφφ φ · φφφφ φφφφ φφφ φ
28** ·* ........
hybridizace primeru a templátu je dostatečně specifická, aby se zabránilo neúplné nebo nežádoucí ampiifikaci templátu.
skupinou. diverzitu
Amplifikační roztok obsahuje s výhodou nukleotidové prekurzory, deoxyribonukleotidtrifosfáty, jako. je například dATP, dTTP, dCTP, dGTP, které se přirozeně nebo nepřirozeně vyskytují například upravené fluorescenční nebo radioaktivní Za účelem zvýšit detekovatelnost a/nebo funkční nukleových kyselin se vyvinulo velké množství synteticky upravených nukleových kyselin pro chemické a biologické metody. Tyto funkční/upravené molekuly mohou být zcela kompatibilní s přirozenými polymerizačními enzymy, které udržují parametry párování baží a replikace přirozených doplňků (popisuje se v publikaci Thum 0. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40 (21): 3990-3993).
Jestliže templátem je buď molekula RNA nebo DNA a je nutné získat amplifikační produkty ve formě dvouřetězcové RNA, pak polymerázou nukleové kyseliny může být RNA polymeráza.. závislá.
| na RNA | a DNA, | jako je | například | virová replikáza | RNA | nebo |
| ribozym | (popisuje se v | publikaci | Johnston, W. K. | et | al., | |
| Science | 2001, | 292 (5520) | : 1319-25, | Tayon, R. Jr. | et | al., |
Nucleic Acids Res. 2001, 29(17):3576-82). Amplifikační roztok bude následně obsahovat nukleotidové . prekurzory, ribonukleotidtrifosfáty.
Po volbě polymerázy nukleových kyselin do amplifikačního roztoku přidají další složky a v podstatě , odpovídají sloučeninám známým v oboru a účinně podporují aktivitu každé polymerázy. V oboru je známo, že koncentrace sloučenin, jako je dimetylsulfoxid (DMSO), bovinní sérový albumin (BSA), Triton X-100 nebo MgCl2, jsou důležité, aby došlo k optimální ampiifikaci a proto odborník může jednoduše upravit takové
4« ·· ·» ·· «444 • 4 « 4 4··»« « : ·.
• · · · 4 · · · 4 4 « 4 * · 44 44 44 4 4 koncentrace vhodné pro určité metody podlé vynálezu na základě zde popsaných příkladů.
Velké množství kopií řetězců nukleových kyselin tvořící kolonie jsou v obecném případě imobilizované. na pevném povrchu a mohou být v jednořetězcovém, dvouřetězcovém uspořádání nebo ve smíchaném uspořádání. Všechny formy jsou reprezentovány v populaci amplifikovaných molekul patřících do jediné kolonie DNA. Jestliže je pro metodu nezbytné, aby všechny molekuly nukleové kyseliny, které se budou analyzovat a/nebo sekvenovat, byly ve specifickém uspořádání, mohou se provést další úprava izotermicky amplifikovaných produktů, aby se všechny dostaly do požadovaného stádia (nebo alespoň většina z nich). Denaturace řízená elektrický nábojem, chemickou cestou nebo teplotou se může použít k transformaci všech amplifikačních produktů na jednořetězcovou DNA. Takové molekuly mohou nyní hybridizovat účinněji s primerem'přidaným do kapalné fáze nebo zachyceným na podkladu, který vykazuje sekvenční komplementaritu s vnitřní sekvencí jednoho amplifikačního řetězce. V závislosti na sekvenační metodě tento pomocný oligonukleotid umožňuje detekci sekvence různými způsoby. Oligonukleotid může být značen nebo může vyvolat elongaci použitím značeného/upraveného nukleotidu. V jiném případě je možné použít endonukleolytických enzymů, které rozeznávají specifickou sekvenci nebo strukturu vytvořenou po hybridizaci a po elongaci.
Kolonie nukleových kyselin podle vynálezu se mohou tvořit v různých velikostech a v hustotách v závislosti na používaných podmínkách. Velikost kolonií se s výhodou pohybuje v intervalu 0,2 mikrometrů do 6 mikrometrů. Hustota kolonií nukleových kyselin vhodných pro použití při metodě podle vynálezu je v typickém případě 1 000 až 100 000 na jeden milimetr čtvereční. Vyšší hustoty například 100 000 až 10 000
A AAAA
A A A
A · · J * ·
AAA AA AAA A AAAA A
A · A ·
A A A ζλΑΑ »·
3(7
000 na jeden milimetr -čtvereční je možné dosáhnout způsoby podle vynálezu. Limitujícím prvkem pro· analýzu zobrazení je v současné době pouze technologie zobrazení -(mikroskopy,, kamery CCD, software). Toto omezení se pravděpodobně odstraní v budoucnosti a bude možné získat jasné rozlišení jednotlivých kolonií při uvedené hustotě.
Po té, co se izotermicky vytvořily kolonie nukleových kyselin, mohou se pro současnou vizualizaci a/nebo charakterizaci jedné nebo více kolonií DNA použít různé technologie sloužící například pro ověření, že se dosáhlo předpokládané hustoty a rozměru izotermicky vytvořených kolonií DNA. V závislosti na specifickém postupu výstup analytické metody je možné získat monitorováním buď pevného povrchu, na kterém izotermická amplifikacé probíhá, nebo materiálu uvolněného z takového podkladu do kapalné fáze. Molekuly nukleových kyselin odlišné od molekul používaných při izotermické amplifikaci se mohou použít při specifických analytických metodách a hybridizují s produkty amplif.ikace v kapalné fázi podle optimálních hybridizačních podmínek, které je možné jednoduše stanovit empiricky pro každou sekvenci nukleové kyseliny za použití metod, které jsou dobře známy v oboru.
Metody pro vizualizaci kolonií a stanovení sekvencí, které je možné použít, v souvislosti s koloniemi . DNA se popisují v dokumentu WO 00/18957. Neúplný seznam takových metod zahrnuje hybridizaci. se značenými oligonukleotidy, začlenění značených nukleotidů, opětná amplifikacé použitím specifických sond, použití barviv, která se váží na DNA, štěpení endonukleázami, které . jsou specifické pro sekvenci nebo strukturu a použití, jiných enzymů, které upravují DNA (jako jsou ligázy, metylázy, exonukleázy) a jiné proteiny ·vázající se na DNA.
·«
4 4
4 444 • 4 4 4
4 4 4
31*· “
44 • •44 4 4 ·
4 4 4 4 4 ·
44 4 44 4 4
44 4 4 44 4
44 44 44
Dříve než se provede sekvenační analýza je možné vypočítat hustotu a rozměry izotermicky vytvořených kolonií nukleových kyselin použitím metod detekce fluorescence, které jsou dobře známy v oboru. Za účelem obarvení izotermicky amplifikovaných dvouřetězcových molekul imobilizováných na povrchu se může například použít interkalační barvivo, jako je etidiumbromid nebo PicoGreen(tm) (Molecular Probes, Eugene, OR) nebo jiná chemická metoda pro barvení DNA jako je sada Ulisys(tm) (Molecular Probes) a výsledek barvení je možné pozorovat epifluorescenčním mikroskopem, jak zobrazuje obrázek č. 3. Pro stanovení sekvence je možné použít libovolný přístroj umožňující detekci a kvantifikaci vhodného značení, jako je například fluorescence nebo radioaktivita, jak se popisuje v dokumentu WO 00/18957. Mimo mikroskopu je možné použít například jiné přístroje dobře známé v oboru, jako je například skenovací zařízení.
Celá nebo část sekvence jedné nebo více nukleových kyselin se může stanovit stanovením celé nebo částečné sekvence amplifikovaných templátů nukleové kyseliny přítomné ; ve více jak jedné kolonii DNA. Tyto další kroky se mohou provést s amplifikovanými nukleovými kyselinami buď na pevném povrchu samotné nebo po uvolnění jednoho nebo obou řetězců nukleových kyselin, které patří do jedné nebo více kolonií DNA. Výhodné je, když se, současně stanoví velké množství sekvencí.
Jakmile je nutné provést přímé značení amplifikovaného produktu nebo sekvenování amplifikovaného produktu, je možné do amplifikovačního roztoku zavést značený nukleotid, pak je možné po ukončení reakce detekovat izolované kolonie DNA. Značící skupina může být radioaktivní nebo fluorescenční, jako je červeň Texas, - a může se přidat 'do amplif ikačního roztoku spolu s primerem odlišným od primerů používaných při «· ·<ι ·· ·· ···· ··· · » · · 9 · · • · ··· · · ·> · · · • 9 · ··· ·· 9 9 9 9 9
9 9 · 9 9 9 9 9 99 9
32· ·· ·· *· ·· ·· amplifikací templátových molekul ve vhodné koncentraci (v typickém případě desetkrát až tisíc krát vyšší koncentrace neznačeného dATP). Vysoké koncentrace značených nukleotidů mohou inhibovat amplifikační proces, což je jev dobře známý v oboru v případě jiných amplifikačních metod, jako je kapalná fáze PCR.
Metody podle vynálezu proto obsahují další krok postupu nebo více izotermicky Stanovení sekvence může stanovení sekvence, amplifikovaných kolonií následovat po začlenění j edné DNA.
značených nukleotidů, přičemž se využívají primery kolonií nebo jiné primery imobilizované na pevném povrchu nebo v kapalné fázi. V jiném případě stanovení sekvence může následovat po hybridizaci se značeným oligonukleotidem nebo po .uvolnění jednoho nebo obou řetězců nukleových kyselin patřící do jedné nebo více kolonií nukleových kyselin.
Vynález dále popisuje způsob obsahující další krok uvolnění jednoho nebo obou řetězců nukleové kyseliny patřící do jedné nebo více kolonií DNA vytvořených izotermicky tak, že se mohou získat v roztoku pro další použití. Uvolnění takové nukleové kyseliny je možné dosáhnout chemickou, optickou, fyzikální nebo enzymatickou cestou, přičemž dochází ke štěpení vazby mezi primerem a povrchem, nebo specifickou sekvencí, strukturou nebo nukleotidem obsaženým v amplifikovaných nukleových kyselinách. Například v patentovém dokumentu WO 00/58329 (Goldsbo.rough.. A) popisuje způsob oddělení molekuly nukleové kyseliny z pevného povrchu selektivním štěpením nukleotidu, který není běžný. V jiném případě sekvence obsažená v imobilizovaných koloniích DNA se mohou znovu amplifikovat v kapalné fázi, ve které jsou kolonie ponořeny, za použití libovolné z amplifikačních metod, jako je například
PCR.
• · ··
Za účelem stanovení počtu nebo · podstaty nukleotidů začleněných v každé kolonii je možné použít libovolný detekční systém kolonií DNA v kombinaci s analytickým systémem. Například po každém kroku prodloužení primeru nebo později za použití zaznamenaných dat .je možné stanovit sekvenci templátu nukleové kyseliny v dané kolonii.
Za účelem vytvoření kolonií· nukleových kyselin při izotermických podmínkách je možné použít metody podle vynálezu. Kolonie nukleových kyselin podle vynálezu se mohou vytvořit z jediného imobilizovaného templátu nukleové kyseliny podle vynálezu. Způsob podle vynálezu umožňuje současnou produkci řady takových kolonií nukleových kyselin, každá z nich potencionálně obsahuje různé imobilizované sekvence.
V tomto dokumentu se popisuje alternativní řešení problému urychlení amplifikace nukleové kyseliny a sekvenování podstatným zjednodušením postupů nezbytných pro . izotermickou amplifikaci nukleových kyselin na pevném podkladu. Vynález může uspokojit řadu rostoucích požadavků vysoko výkonnostních metod, dokonce i v případě, že je možné použití, v případě sekvencí nukleových kyselin omezených délek (až 1 000 baží).
V oblasti studií genomu a v příbuzných studiích (účinky farmakologických činidel na organizaci genomu, zkoumání léků, charakterizace potravin, genotypování, diagnostice, sledování exprese genů, zkoumání profilů genetické diverzit.y, sekvenování celého genomu a zkoumání polymorfizmů) jsou stanovované a porovnávané sekvence nukleových kyselin příbuzné několika stovkám různých fragmentům DNA genomu, rekombinantním fragmentům DNA a retrotranskribovaným fragmentům DNA, kdy každý z nich není delší než 1 000 bází. Metody podle vynálezu je možné zvláště použít při idetnifikaci sekvencí DNA • ♦ ·· ··· · v situacích, kdy velké množství genů nebo mRNA (například 500) z velkého množství jedinců (například 500) se musí sekvenovat současně nebo je nutné současně vyhódnotit velké množství (například milion) polymorfizmů nebo je nutné současně sledovat expresi velkého množství genů (například 100 000).
Různé metody analýzy exprese genu umožňují charakterizaci exprese genů typické v subpopulaci buněk nebo v mikroanatomických strukturách. Tyto vysoce citlivé metody mohou často použít komplementární DNA, která je rozdělena na fragmenty obsahující 10 až 20 párů baží (značky), a řadu baží, které jsou dostatečné pro identifikaci jednořetězcové mRNA tak, že je možné přibližně vypočítat množství mRNA kódující protein nebo porovnat množství v jednotlivých vzorcích tím, že se určí počet značek přítomných vé vzorku, které jsou spojeny s uvedenou mRNA. Tyto segmenty se obvykle tandemově ligují, aby se mohly sekvenovat, jako například v případě SAGE (postupná analýza exprese genů) (popisuje
Velculascu V. E., et al., Trends.. Gent. 2000.
nebo je možné použít jiné systémy, které jsou také založeny na vytvoření značek použitím restrikčních nukleáz typu lis (popisuje se v dokumentu WO 00/53806). Způsoby podle vynálezu umožňují identifikaci a stanovení počtu značek. Po ligaci sekvencí vhodných linkerů do každé značky, aby se umožnila imobilizace a izotermická amplifikace na pevném povrchu, je možné zviditelnit každou kolonii DNA odpovídající dané značce, je jí možné přímo nebo nepřímo sekvenovat a hodnotit za použití softwaru zobrazovací analýzy. Tímto způsobem je možné vypočítat frekvenci každé značky v populaci . cDNA, aniž je nutné ligovat všechny značky do doplňků, které se budou klonovat do plazmidu.
se v publikaci 16(10) : 423-5)
Podobný přístup je možné aplikovat v případě EST nebo genomové DNA za účelem identifikovat haplotypy nebo specifické »4 4444 • · ··
SNP, spojené s onemocněním nebo s jinými fenotypy, protože také v tomto případě, existuje základní požadavek rychle identifikovat sekvenci obsahující tisíce malých segmentů jediné nukleové kyseliny.
Vynález dále popisuje použití metody izotermické amplifikace nukleových kyselin na pevném podkladu pro přípravu molekul nukleových kyselin, které se použijí pro sekvenování nukleových organizace organizaci kyselin genomů, genomů, a při opětném . sekvenování v oblasti účinků farmakologických činidel na zkoumání léků, charakterizace potravin, genotypování, diagnostiky, monitorování exprese genů, profilů genetické diverzity, sekvenování celého genomů a zkoumání polymorfizmu nebo libovolné jiné aplikace amplifikaci nukleových kyselin.
zahrnuj ící
Dále vynález popisuje sadu pro izotermickou amplifikaci nukleových kyselin na pevném podkladu za vzniku molekul nukleových kyselin, který se používají pro sekvenování nukleových kyselin a opětném sekvenování v oblasti- organizace genomů, účinků farmakologických činidel na organizaci genomů, zkoumání léků, charakterizace potravin, genotypování, diagnostiky, monitorování exprese genů, profilů genetické diverzity, sekvenování celého genomů a zkoumání polymorfizmu nebo libovolné jiné aplikace zahrnující amplifikaci nukleových kyselin.
Příklad postupu pro identifikaci a charakterizaci amplifikačních produktů získaných způsoby podle vynálezu a založených na značených nukleotidech by mohly být:
la) vytvoření a zviditelnění amplifikovaných nukleových kyselin na pevném povrchu za použití metod popsaných dříve v textu tohoto patentového dokumentu .a zaznamenávání výsledků,
lb) ošetření amplifikováných nukleových kyselin tak, že se odstraní interkalační barvivo používané pro zviditelnění, lc) transformace, alespoň částečná, amplifikovaných nukleových kyselin na jednořetězcové molekuly, ld) příprava oligonukleotidů v kapalné nebo pevné fázi, kde fáze a/nebo oligonukleotidy' mohou by ty samé, jako se používají při izotermické amplifikaci nebo mohou být odlišné a oligonukleotidy by měly obsahovat sekvenci 3'-konce schopnou hybridizovat se sekvencí přítomnou alespoň v jednom amplifikovaném produktu, le) vytvoření podmínek. pro hybridizaci mezi oligonukleotidy a amplifikovanou .molekulou, lf) získání polymerázy nukleové kyseliny a alespoň jednoho typu značeného nukleotidu ' v kapalné fázi spolu s vhodným pufrem za podmínek, které umožňují elongaci primeru, lg) , detekce amplifikovaných nukleových kyselin, ve kterých jsou začleněné značené nukleotidy, prostřednictvím značení nebo interakce tohoto značení s amplifikovaným produktem a zaznamenání výsledku, lh) odstranění kapalné fáze a opakování kroku lf) a lg) za použití nukleotidu, které mají značení odlišné od značení používaného při předchozí elongaci a zaznamenávání výsledků,.
li) opakování kroku lc) až lf) za použití oligonukleotidů a/nebo značených nukleotidů odlišných od těch používaných při předchozí elongaci a zaznamenávání výsledku.
Shora v textu popsaný způsob je zvláště možné použít pro sekvenování amplifikovaného produktu podle vynálezu postupujícího po jednotlivých bazích, kdy relativní variace výsledků se převádějí na signál a porovnávají se, aby se získal důkaz o začlenění značeného nukleotidu, jak se popisuje v dokumentu WO 00/18957.
Příklad postupu pro identifikaci a charakterizaci produktů amplifikace získaných metodami podle vynálezu a založených na značených oligonukleotidech by mohl být:
2a) vytvoření a zviditelnění amplifikovaných nukleových kyselin na pevném povrchu za použití metod popsaných dříve v textu tohoto patentového dokumentu a zaznamenávání výsledků,
2b) ošetření amplifikovaných nukleových kyselin tak, že se odstraní interkalační barvivo používané pro zviditelnění,
2c) transformace, alespoň částečná, amplifikovaných nukleových kyselin na jednořetězcové molekuly,
2d) příprava oligonukleotidů v kapalné fázi nebo na pevné fázi, kde fáze a/nebo oligonukleotidy mohou by ty samé, jako se používají při izotermické 'amplifikaci nebo mohou být odlišné, a oligonukleotidy by měly obsahovat sekvenci 3'-konce schopnou hybridizovat se sekvencí přítomnou alespoň v jednom amplifikováném produktu,
2e) vytvoření podmínek pro hybridizaci mezi
Ί1 oligonukleotidy a amplifikovanými molekulami,
2f) detekce amplifikovaných nukleových kyselin hybridizaci se značeným oligonukleotidem prostřednictvím uvedeného značení nebo interakce tohoto značení s amplifikovaným produktem a zaznamenání výsledku,
2g) možnost opakování kroků 2c) až 2f) nebo 2e) až 2f) za použití oligonukleotidů obsahujících rozdílnou sekvenci a/nebo odlišné značení a zaznamenávání výsledku.
Příklad postupu identifikace a charakterizace produktů amplifikace získaných metodami podle vynálezu a založeném na restrikčních enzymech by mohl být:
3a) vytvoření a zviditelnění amplifikovaných nukleových kyselin na pevném povrchu za použití metod popsaných dříve v textu tohoto patentového dokumentu a zaznamenávání výsledků,
3b) ošetření amplifikovaných nukleových kyselin tak, že se odstraní interkalační barvivo používané pro zviditelnění,
3c) ošetření amplifikovaných nukleových kyselin roztokem obsahujícím alespoň, jednu restrikční endonukleázu, která potencionálně štěpí molekulu dvouřetězcové nukleové kyseliny přítomné alespoň v jednom produktu amplifikace podle vynálezu a/nebo získané po kroku popsaném v odstavci b) , spolu s vhodným pufrem a za podmínek umožňující takovou enzymatickou aktivitu,
3d) získání uvolněných nukleových kyselin,
3e) opakování kroku 3aj a zaznamenávání výsledku;
porovnání výsledků vizualizace před a po štěpení,
3f) možnost opakování kroků 3b) až 3e) s různými restrikčními endonukleázami a zaznamenávání výsledků.
Přehled obrázků na výkrese
Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma mechanizmu probíhající izotermické amplifikace na pevném povrchu. Písmena a číslice zobrazují působení a složky definované v popisu vynálezu.
Obrázek č. 2 zobrazuje sekvenci plasmidového insertu templátu: TI. Podtrženy jsou sekvence užívané k hybridizaci různých primerů a k amplifikaci specifických templátů testovaných v příkladech. Název primerů a směr extenze je označen v horním řádku.
Obrázek č. 3 zobrazuje kopie digitálně invertovaných zobrazení fluorescenčně barvených izotermicky amplifikovaných nukleových kyselin na pevném podkladu pozorované epif luor.escenčním mikroskopem vybaveným CCD kamerou. Měřítko zobrazení je uvedeno na horní levé straně obrázku.
Obrázek č. 4 zobrazuje graf hustoty DNA kolonií pozorovaných na dně prohlubní po obarvení systémem PicoGreenŤM po izotermické amplifikaci, když se imobilizovaly různé
4« 4« ·· 44*4>
4 4 4 4 4 · • 4 ·· 4 4 4 • ·· 4 4 4 · 4 • · · 4' · 4 · 4
44 44 44 koncentrace templátů. Hodnoty jsou vyneseny v logaritmech. Každý bod znázorňuje průměrnou hodnotu tří pozorování. Směrnice přímky je 1.
Obrázek č. 5 zobrazuje rozptyl celkové fluorescence získaný v případě, že templáty různé délky se amplifikují izotermicky. Stejná jednotka se používá v případě všech křivek.
Obrázek č. 6 zobrazuje porovnání celkové fluorescence získané, když templát T386 se imobilizuje v buňkách nebo v roztoku nebo templát T386 není přítomen v amplifikačním postupu.
Obrázek č. 7 ukazuje digitalizované zobrazení 2% agarózového gelu, do kterého se nanesly amplifikační produkty získané PCR nebo kapalnou izotermickou amplifikaci, přičemž elektroforéza probíhala po dobu 30 minut v elektrickém poli 10 V/cm. Dráha 1, 5, 9, 13 obsahuje 2,5 mikrolitrů markéru molekulových hmotností (Superladder low, žebříček po 100 párech baží, Gensura), přičemž relevantní počet baží je označen na levé straně. Dráha 2, 3 a 4 obsahují 6 mikrolitrů amplifikovaného a izolovaného templátů T90 vytvořeného po PCR s teplotními cykly (dráha 2) nebo při izotermických podmínkách pří teplotě 72 °C (dráha 3) a 78 °C (dráha 4) . Dráha 6, 7 a 8 obsahuje 2,5 mikrolitrů amplifikovaného a čištěného templátů T386 vytvořeného PCR s teplotními cykly (dráha 6) nebo v izotermických podmínkách při teplotě 72 °C (dráha 7) a 78 °C (dráha 8). Dráha 10, 11 a 12 obsahuje 2,5 mikrolitrů amplifikované a izolované negativní kontroly (pouze primery) vytvořené po PCR s teplotními cykly (dráha 10) nebo v izotermických podmínkách při teplotě 72 °C (dráha 11) a 78°C (dráha 12). Gel se barvil systémem SybrGreen™ (Molecular Probes, Eugene OR).
• · · • ·· > · · « » · · « ·· ·· » · · « ·· ··
Na obrázku č. 8 jsou znázorněny průměrné hodnoty' 2 experimentů vykazující množství začleněného 32P-dCTP za použití izotermické amplifikace použitím různých enzymů: přípravek Dynazyme (Dyn), polymeráza Pfu (Pfu), polymeráza Taq (Taq), Vent™ (Vent).
Na obrázku č. 9 je zobrazen výkyv množství fluorescence získané provedením izotermické amplifikace za použití různých teplot (A) nebo procent DMSO (B) za- použití templátů různé délky. Každá křivka se normalizovala ve vztahu k.její nejvyšší hodnotě. ;
Obrázek č. 10 ukazuje .digitalizované zobrazení agarózového gelu, kdy elektroforéza probíhala po dobu 30 minut v elektrickém poli lOV/cm. Do agarózového gelu se nanesly produkty PCR získané použitím různých počátečních materiálů. Dráha 1 a 8 obsahuje žebříček DNA po 100 pb (Superladder low, Gensura) s relevantními počty baží, které jsou uvedeny na levé straně. Počáteční materiál PCR byl 0,1 nanogram T386 (dráha 2) . Do dráhy 3 se nanesl materiál, který není počátečním materiálem. Alikvót prohlubní, kde T386 byl imobilizován, se nanesl do dráhy 4 a 6 nebo nebyl immobilizován se nanesl do dráhy 5 a 7 s předchozí izotermickou amplifikaci (dráha 4 a 5) nebo bez předchozí izotermické amplifikace (dráha 6 a 7). Gel se obarvil použitím . systému SybrGreen™ (Molecular Probes, Eugene OR) . Slabé pruhy na spodní části gelu jsou primery pro amplifikaci PCR.
Příklady provedení vynálezu
Izotermické amplifikace templátové imobilizované na pevném povrchu
DNA
1:
Příklad <«9 • 9 9
9 9 99 • 9 9 9 • · · · • 9 9 9
Metody:
sekvence DNA
Primer Pl (24-mér, SEQ ID NO: 1),. P2 (24-mér, SEQ ID NO: 2) a P3 (40-mér, SEQ ID NO: 3) jsou syntetické oligonukleotidy, které nesou na samém 5-konci skupinu tvořenou šesti atomy uhlíku s aminovou vazbou. Tato chemická skupina se používá k imobilizaci primerů a, templátů na pevném povrchu za účelem aplikovat metody podle vynálezu .
Templáty T3 (SEQ ID NO: 9) a T4 (SEQ ID NO: 10), které jsou 68-méry, mají sekvenci odpovídající primeru Pl na 5'konci a sekvenci komplementární s primerem P2 na 3'-konci, a T90 (90-mér, který má sekvenci odpovídající primeru Pl na 5'konci a sekvenci komplementární s primerem P2 na 3'-konci, SEQ ID NO: 11) jsou syntetické oligonukleotidy' nesoucí skupinu tvořenou šesti atomy uhlíku a aminovou vazbou (T9Ó) nebo 5'fosfátovou skupinu (T3 a T4).
Templáty T155 (155-mér, SEQ ID NO: 12), T203 (203-mér, SEQ ID NO: 13), T386 (386-mér, SEQ ID NO:4) a T605 (605-mér, SEQ ID NO: 15) mají na 5'-konci sekvence odpovídající primeru P3 a na 3'-konci sekvence komplementární s P2. Templáty se zkonstruovaly amplifíkací fragmentů Tl (SEQ I.D NO: 8) a sekvence obsahující 823 párů baží obsažené v plazmidu pBSk (Stratagene), jak je zobrazeno na obrázku č. 2). Přímý primer P3 (40-mér, který vykazuje na svém 5'-konci sekvenci odpovídající primeru Pl a na 3'-konci sekvenci komplementární se sekvencí Tl obsahující 16 nukleotidů, SEQ. ID NO: 3) nese na 5'-konci skupinu s aminovou vazbou. Reverzní primery P155r (SEQ ID NO: 4), P203r (SEQ ID NO: 5), P386r (SEQ ID NO: 6) a P605r (SEQ ID NO: 7) jsou 44-mérní syntetické oligonukleotidy, které na svém 5'-konci mají sekvenci’ odpovídající primeru P2 a sekvenci komplementární s různými sekvencemi Tl obsahující 16
4* ··
4 4 4
4 44 ···· • 4 4 1
44 nukleotidů. Tyto templáty se amplifikovaly za použití 100 mikrolitrů roztoku, který obsahuje 5 jednotek polymerázy Taq (Perkin-Elmer), lx Taq pufr (Perkin-Elmer), dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, od firmy Pharmacia) v koncentraci 200 μΜ, a 5 nanogramů v jednom mikrolitrů plazmidu pBSK, primer P3 v koncentraci 1 mikromol a odpovídající reverzní primer v koncentraci 1 mikromol. Provedlo se dvacet cyklů PCR (probíhají při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund, při teplotě 62 °C po dobu 30 sekund a při teplotě 72 °C po dobu 60 sekund) a výsledný produkt se čistil za použití sady QiaQuick (od firmy Qiagen) podle instrukcí výrobce. Roztok používaný k získání izolovaných nukleových kyselin borát sodný v koncentraci 10 mM (hodnota pH je 7,5).
Všechny syntetické oligonukleotidy se získaly od firmy Microsynth (Švýcarsko).
Protokol pro imobilizaci primeru ra templátové nukleové kyseliny na pevném povrchu
Pevný povrch používaný k demonstraci vhodnosti metod podle vynálezu byl reprezentován vnitřním prostorem rovného dna prohlubní připraveného z funkcionalizovaného syntetického materiálu, který se nazývá Nucleolink<tm) (Nunc, Dánsko) . Prohlubně jsou sestaveny na destičky, které svým uspořádáním vyhovují zařízení PCR probíhající na destičkách obsahující 96 prohlubní. Jestliže se prohlubně naplní imobilizačním a amplifikačním roztokem' používaným v příkladech (15 až 20 mikrolitrů), plocha povrchu vystavená působení uvedených roztoků odpovídá přibližně 30 mm2.
Primery a templáty jsou zachycené na destičkách Nucleolink(tm), které se udržovaly na ledu, zatímco nukleové kyseliny se ředily v imobilizačním roztoku, který obsahuje «4 «4 44 44 44 4444 4 4 4 4 4 4 4 44 4
4 444 4 4 44 4 4 4 • 44 444 44 44 4 4 4
44 4 4 4 4 4 4 4 4 4
44 44 44 44 44 imidazol v koncentraci 10 nM a hypochlorid l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) v koncentraci 10 nM, a pak se přidaly do prohlubni. Po té, co se všechny prohlubně naplnily, destičky se inkubovaly po'dobu.10 minut při teplotě 50 °C. Prohlubně se pak dvakrát promyly při teplotě místnosti roztokem, který obsahuje 0., 4 M NaOH a 0,1 % Tween 20 a nakonec třikrát s TNT, což je roztok, který obsahuje 100 mM Tris-HCl (hodnota pH je 7,5), 150 mM NaCl a 0,1 % Tween-20 a pak se provedla izotermická amplifikace.
Protokol pro vizualizaci amplifikovaných nukleových kyselin
Po izotermické amplifikaci se prohlubně třikrát promyly 20 mM Tris-HCl s hodnotou pH 7,5 a pak se kolonie DNA vizualizovaly inkubací prohlubní s PicoGreen(tm) (od firmy Molecular Probes), což je molekula, která vakyzuje fluorescenčníaktivitu v případě, že je navázaná na dvouřetězcovou DNA. V běžném případě se ředí 2 000 krát 20 mM roztokem Tris-HCl (hodnota pH je 7,5). Každá prohlubeň se inkubovala s 50 mikrolitry ředěného PicoGreen(tm) po dobu 10 minut při teplotě místnosti.
Kolonie DNA imobilizované na dně prohlubní se pozorovaly za použití epifluorescenčního mikroskopu (Axiovert 100TV, Zeiss, Německo) vybaveného chlazenou CCD kamerou /Micomax 512x768, Princeton Instruments, Treton, NJ) , která ‘je řízena softwarem Winview. Zobrazení se získalo po expozici po dobu 2 minut a analyzovala se za použití softwaru analySIS (Soft Imaging Systém GmBH, Německo) nebo jiného ekvivalentního softwaru.
Výsledky
Primery PÍ a P2 a templátové nukleové kyseliny T90 a T386 se zachytily na dně prohlubní Nucleolink(tm), jak se popisuje
44 4 4 4
4 ·
4 4 dříve v textu. Aby se stanovilo první rozmezí délky templátu, při kterém je možné aplikovat metody podle vynálezu, templáty, obsahují počet nukleotidů, který je přibližně 0,6 až 2,5 větší než je perzistentní délka.
Prohlubně se naplnily . 20. mikrolitry imobilizačního roztoku, který obsahuje primery Pl a P2 (každý v koncentraci 250 nM) a typ templátu, přičemž koncentrace se liší v případě každé prohlubně, jak je uvedeno v tabulce č. 1:
Tabulka č. 1:
| číslo prohlubně | název templátu | koncentrace templátu (nM) |
| Al | T90 | 3,1 |
| B1 | T90 | 1 |
| Cl | T90 | 0,3 |
| Dl | T90 | 0,1 |
| El | T90 | 0,03 |
| F1 | T90 | 0,01 |
| G1 · | T90 | 0,003 ' |
| H1 | - | 0 |
| A2 | T38.6 | 3,1 |
| B2 | T386 | 1 |
| C2 | T386 | 0,3. |
| D2 | T386 | 0,1 |
| E2 | T386 | 0,03 |
| F2 | T386 | 0,01 |
| G2 | T386 | 0,003 1 |
| H2 | - | 0 |
Izotermická amplifikace se provedla inkubací prohlubní po dobu 1 hodiny při teplotě 78 °C s 15 mikrolitry amplifikačního roztoku, který obsahuje 1 jednotku polymerázy Pfu (od firmy Stratagene), 10 % dimetylsulfoxidu (DMSO), 10 mM dNTP (dATP, • · ·· • « · » · · · · • · · · • · · · *· ·« • V w • · · · • · »· ·· t··· • · · • · · · · ' · ·· ·· dGTP, dCTP, dTTP, od firmy Pharmacia), 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X-100 a 0,1 mg/ml BSA. Izotermické irikuísace se uskutečnila za použití standardního přístroje pro PCR s 96 prohlubněmi (MJResearch PTC-200) při konstantní teplotě 78 °C za použití výhřevného příklopu.
Výsledná zobrazení jsou uvedena na obrázku č. 3. Na základě používaného postupu barvení DNA signál způsobuje přítomnost (alespoň částečně) dvouřetězcové DNA amplifikované a imobilizované do kolonií na dně prohlubní Nucleolinkítm). Zobrazení se vytisklo inverzně. Signál slabší nebo roven hodnotě 130 AU (libovolné jednotky, k výpočtu se použil software řídící CCD kameru) se jeví jako bílá barva a signál silnější nebo roven 350 AU se jeví jako černá barva.
Na obrázku č. 3 je zobrazeno, že pokud jsou primery pouze zachyceny (Hl a H2), zobrazení je.úplně bílé, což ukazuje, že nedochází ke spontánní amplifikaci. Zatímco při nej vyšších koncentracích templátu (Al/2, Bl/2) produkty amplifikace pokrývají celý povrch saturující zobrazení. V případě koncentrací obou templátu nižších než nanomoly se. získaly kolonie. DNA v prohlubních Cl/2, Dl/2 a El/2. Počet takových bodů (každý zabírá plochu 1 až 5 čtverečních mikrometrů) roste přibližně lineárně s koncentrací templátu používaného během kroku zachycení. Amplifikace se provedla s templáty, které mají dvě různé · délky a za použití templát/primer během postupu imobilizace.
různých poměrů
Další data získaná kvantitativní analýzou účinnosti izotermické amplifikace, co se týká počtu kolonií DNA, jsou zobrazena na obrázku č. 4. V testovaných experimentálních podmínkách (roztok pro imobilizaci nukleových kyselin imidazol/EDC, prohlubně Nucleolink(tHl), doba inkubace 10 minut při teplotě 50 °C a každý primer v koncentraci 250 mM) se • 4 4*44 • 4 4 · · « 4 · · · • β 444 4 4 44 4 · ·
44 4 4 4 44 44 4 4 ·
6 4«4* 4444 4444
4. 44 4444 ·444 templáty obsahující rozmezí nukleotidů 90 až 386 přidané do imobilizačního roztoku v koncentracích nižších než nM amplifikovaly izotermicky jako kolonie DNA na pevném povrchu, přičemž se získalo několik desítek tisíc kolonií DNA na jeden čtvereční milimetr.
Postup izotermické amplifikace se také aplikoval za použití jiných délek templářů a různých koncentrací primerů. Série osmi prohlubní Nucleolink<tm) se naplnily 20 mikrolitry imobilizačního roztoku, který obsahuje konstantní koncentraci jednoho templátu nižší než je nM v případě sérií A (T155, 0,14 nM), Β (T203, 0,2 nM), C (T386, 0, 08 nM) a D (T606, 0, 04 nM) .
Koncentrace se definovaly na základe křivek získaných v případě každého templátu, jak je zobrazeno na obrázku č. 4 v případě dvou z nich.
Osm prohlubní obsahovalo primery PÍ a P2 .v koncentracích zobrazených v tabulce č. II.
Tabulka č. II
| číslo prohlubně | PÍ (nM) | P2 (nM) |
| 1 | 250 | 250 |
| 2 | 75 | 75 |
| 3 | 55 | 55 |
| 4 | 37,5 | 37,5 |
| 5 | 22,5 | 22,5 |
| 6 | 00 | 6, 8 |
| 7 | 2,0 | 2,0 |
| 8 | 0,6 | 0, 6 |
Po provedení izotermické amplifikace, jak se popisuje dříve v textu, účinnost způsobů podle vynálezu se měřila fluorescenčním signálem normalizovaným pro délku templátu při různých koncentracích primeru (zobrazeno na obrázku č. 5) ·« ·· «· ·β ·» ···· ··· ······ · • · ··· · · ·· · · · • >· ·»· ·· ··· · · >··· ···· ···· ·« ·· ·· »· ·♦ ··
Normalizace je nezbytná vzhledem k tomu, že delší templáty začleňují více sloučenin barvících DNA, tak, že surový fluorescenční signál po odečtení pozadí se dělil délkou templátu (vyjádřené v kilobazích).
Tyto experimenty ukazují, že množství primerů PÍ a P2, které je nezbytné pro získání detekovatelné síly amplifikacé za použití metod podle vynálezu za imobilizačních a amplifikačních podmínek uvedených dříve v textu, částečně závisí na délce templátu. Zatímco signál je dostatečně silný v případě, že celková koncentrace primerů je nižší než 100 nM v případě menších templátu, které vykazují délku přibližně odpovídající stabilní délce (T90 a T155, respektive 0,6 a 1 násobek perzistentní délky), v případě delších templátu (T386 a T605, respektive 2,5 a 4 násobek perzistentní délky) stále dochází k amplifikaci, ale celková koncentrace primerů je vyšší než 100 nM. Tyto výsledky naznačují, že menší mechanický stres se vyvolá za použití delších imobilizovaných nukleových kyselin, které mohou pravděpodobně vytvořit, alternativní třírozměrné uspořádání absorbující frakci mechanický stres nezbytný při řízení izotermického oddělení řetězce a nahrazení.
Za účelem ověřit, že se amplifikované produkty opravdu získaly vhodnou imobilizací primerů a templátů na pevném povrchu, se provedly následující kontrolní experimenty.
V prvním experimentu se provedla izotermická amplifikacé a vizualizace podle dříve v textu popsaného protokolu, přičemž se imobilizovaly primery (PÍ a P2, koncentrace každého byla 250 mM) nebo se neimobilizovaly primery, a s templátem (T386 v koncentraci 0,08 nM) , který je buď imobilizovaný nebo je volný v roztoku. Jak je zobrazeno 'na obrázku č. 6, celková fluorescence je velmi slabá, v případě, že templát je buď
v roztoku nebo není přítomen nebo dokonce, jestliže se imobilizuje velké množství primeru. Takový signál je pravděpodobně způsoben mezni samoamplifikací. Je zřejmé, že pouze imobilizace obou primerů a templátu umožňuje izotermickou amplifikaci dvouřetězcové DNA ve formě kolonií DNA.
Ve druhém kontrolním experimentu se použily stejné nukleové kyseliny jako v předešlých experimentech v kapalné fázi za použití podmínek PCR nebo se aplikovaly stejné izotermické podmínky na pevném povrchu.
Amplifikační roztok používaný pro amplifikační experimenty obsahoval 0,05 jednotek na jeden mikrolitr polymerázy Pfu (Stratagene) , 80 μΜ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, od firmy
Pharmacia), 200 mM Tris-HCl (hodnota pH je 8,8), 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2SO4 , 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 1 μΜ primer Pl a 1 μΜ primer P2 s templátem nebo bez templátu (0,13 nM T386, 0,33 nM T90) . Amplif ikační roztok se rozdělil do tří alikvotů, . každý se podrobil různým amplifikačním podmínkám: 20 cyklů při PCR s teplotními cykly (teplota 94 °C, po dobu 30 sekund, teplota 60 °C pó dobu 40 sekund, teplota 72 °C po dobu 60 sekund), 1 hodina .při teplotě 72 °C nebo 1 hodina při teplotě 78 °C. Produkty amplifikace se čistily na kolonách Qiaquick (od firmy Qiagen) a nanesly se na 2% agarózový gel.
Jak je zobrazeno na obrázku, - č. 7, při izotermických podmínkách se nezískal žádný produkt amplifikace, dokonce i když primery mohli amplifikovat stejný templát v roztoku za podmínek teplotních cyklů.
Měřením začlenění radioaktivního nukleotidu se testovala účinnost různých běžných polymeráz DNA při použití v metodách
45:
podle vynálezu. Izotermická amplifikace se provedla za použití primerů PÍ a P2 (každý v koncentraci 250 nM) v případě, že se velmi krátké templáty (68-mér) T3 a T4 přidaly ve velkém nadbytku a nebo se vůbec nepřidaly (koncentrace každého templátů je 5 nM). Izotermická amplifikace se provedla při teplotě 80 °C po dobu 90 minut za použití 20 μΐ amplifikačního roztoku, který obsahuje 0,5 jednotek polymerázy DNA, 5 % DMSO, 80 μΜ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP od firmy Pharmacia), 200 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA a 0,128 μΜ a32P-dCTP. Používanou
DNA polymerázou je Dynazyrne(tm) (od firmy Finzyme, Finsko) , polymeráza Pfu (od firmy Promega), Taq polymráza (od firmy Perkin Elmer) a polymeráza Vent(tm) (New England Biolabs) .
Po izotermické amplifikaci se pětkrát promyly 20 mM Tris-HCl (pH scintilačního roztoku (Ultima gold, začleněných značených nukleotidů se Beckmanově scintilačním počítači.
prohlubně Nucleolink<tm) 7,5) a umístily se do
Packard), a množství stanovil počítáním na
Jak je zobrazeno na obrázku č. 8, všechny testované polymerázy umožňují izoteřmickou amplifikaci způsoby podle vynálezu, ale s odlišnými výtěžky a s různou hodnotou amplif ikačního pozadí. Polymerázy Pfu a Vent(tm) mají nejvýhodnější poměr specifického a nespecifického signálu.
Testovaly se další podmínky pro izoteřmickou amplfikaci podle vynálezu s ohledem na teplotu a koncentraci DMSO, přičemž se porovnávaly výsledky získané použitím templátů různé délky.
Každý templát (T155 v koncentraci 0,14 nM , T203 v koncentraci 0,2 nM, -T386 v koncentraci 0,08 nM a T606 v koncentraci 0,04 nM) se imobilizoval v odlišných sériích ·· ·· .... . · • · · ... · · ·
5$··:: ::./-./ prohlubní Nucleolink(tm> spolu s primery. PÍ a P2, kdy každý je v koncentraci 250 nM. Izotermická amplifikace se provedla buď použitím 10 % DMSO, ale za použití přístroje PCR, který tvoří v sérii prohlubní teplotní gradient, nebo při teplotě 78 °C v přítomnosti různých množství DMSO.
Po izotermické amplifikaci, promytí a vizualizaci se měřila celková fluorescence kolonií DNA pomocí softwaru pro zobrazovací analýzu, který kvantifikuje intenzitu bodů přítomných na zobrazení. Jak je, zobrazeno na obrázcích 9A a 9B, množství amplifikovaného produktu může vysoce záviset na aplikovaných podmínkách amplifikace. Izotermická amplfikace je částečně účinná v případě všech teplot, mezi 77 a 81 °C a v rozsahu koncentrací DMSO 8 až 14 %.
Příklad 2: Analýza amplifikované nukleové kyseliny
Po té, co se izotermický získaly kolonie DNA, provedly se některé experimenty, které hodnotí některé rysy amplifikovaných nukleových kyselin.
Průměrné, množství řetězců nukleových kyselin přítomné v každém bodě se. odhadlo na základě použití barvené DNA a radioaktivně značených nukleotidů, za použití polymerázy Pfu a podmínek imobilizace, amplifikace, vizualizace a počítání impulzů užívané v experimentu reprezentovaném na obrázku č. 8.
Templát T386 se přidal do sérií prohlubní v různých koncentracích (1 nM, 0,31 nM) : nebo nebyl přítomen. Počet signálů se přenesl na počet molekul v' kolonii DNA, přičemž se uvažuje povrch prohlubně pokrytý objemem amplifikačního roztoku (přibližně 27; 56 mm2, když se použije objem 15 mikrolitrů a prohlubeň má průměr '4 mm), velikost každého analyzovaného zobrazení (přibližně 0,8 mm2), stejně jako • 4 4
specifická aktivita značení. Výsledky’ jsou uvedeny v tabulce č. III.
Tabulka č. III
| prohlubně obsahující T386 (lnM) | Prohlubně obsahující T386 (1 nM) | č. T386 | |||||||||||
| počet | 8304 | 8536 | 6754 | 8615 | 6427 . | 4867 | 3687 . | 4787 | 4988 | 2902 | 3693 | 4072 | 843 |
| počet kolon | 3846 | 3831 . | 3149. | 3788 | 2844 | 2349 | 1808 | 2087 | 2408 | 1218 | 1638 | 1935 | 0 |
| prům. počet řetě. v kol onii | 3007 | 3103 | 2987 | 3167 | 3147 | 2885 | 2840 | 3194 | 2885 | 3318 | 3140 | 2931 | bez |
| 3 049 ± 109 | 3 051 ± 193 |
Tento experiment ukazuje, že metody podle vynálezu umožňují izotermickou amplifikací jediné molekuly templátů za vzniku až několik tisíc řetězců imobilizovaných v diskrétní oblasti. Zatímco počet kolonií jasně závisí na koncentraci templátů, účinnost metody podle vynálezu měřená jako počet amplifikovaných řetězců v kolonii DNA závisí na koncentraci templátů (to znamená na rozmezí uvedené v nM).
Bylo také možné získat produkty izotermické amplifikace z povrchu. Imobilizační protokol popsaný shora v textu se aplikoval v případě čtyř prohlubní, kdy ve všech prohlubních se použily primery PÍ a P2 a ve dvou z nich templát T386. Pouze dvě prohlubně, kdy jedna obsahuje imobilizovaný templát T386 a jedna neobsahuje templát, se podrobily izotermické amplifikací podle·protokolu, který se aplikuje shora v textu. Všechny prohlubně se pak naplnily 60 mikrolitry roztoku PCR za použití 5 jednotek polymerázy Pfu (Stratagene), 10 % DMSO, 100 μΜ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP od firmy Pharmaci-a)..., 200 mM. Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KC1 , 10 mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0,1 % Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA a primery P3 a P386 (každý má koncentraci 1 μΜ) . V prohlubních se provedl jeden cyklus PCR (při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund, při teplotě 60 °C po ···· dobu 30 sekund, při teplotě- 72 °C po' dobu 60 sekund) a pak se 30 mikrolitrů PCR roztoku přeneslo do zkumavky PCR. Jako kontrola slouží zkumavky PCR naplněné 30 mikrolitry stejného roztoku PCR, do kterého se přidalo 0,1 ng templářů Ť386. Pak se uskutečnilo 10 cyklů PCR (teplota 94 °C po dobu 30 sekund, teplota 60 °C po dobu 30 sekund, teplota 72 °C po dobu 60 sekund) a na 2% agarózový gel se nanesly 4 μΐ každého vzorku. Výsledky jsou uvedeny na obrázku, č. 10.- Izotermícky amplifikovaný produkt poskytuje produkt PCR srovnatelný s produktem PCR získaným za podmínek, když je v roztoku přítomen templát T386, zatímco produkt je sotva viditelný, v případě, že je DNA zachycena vé zkumavce, ve které neprobíhá izotermická amplifikace. Kontroly ukazují, že během izotermické,amplifikace ani během amplifikace PCR nedochází ke vzniku diméru primerů ani jiným artefaktům.
···· • ·· · ::.. ·
3». : ·:
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (A) (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
zGaccaaccca; aaccaaccca aacc ......24
| Informace o | SEQ ID NO: 2: |
| (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 24 párů baží |
| (B) | TYP: nukleová kyselina |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetě |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární |
| (ii) DRUH | MOLEKULY: DNA |
(ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
.aaggaaaggg aaggdáaagg aagg
V-.V 24 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
·· ···· « · • · • · • · · ·· ·· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY:.DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
caccaaccca aaccaaccca' aaccggctca cgcctataat (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 44 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: DNA |
(ix) ZNAKY:
| (D) | Jiné informace: /poznámka=syntetická konstrukce | |
| (xi) | Popis sekvence: SEQ ID NO: 4: | |
| gagga 44 | aaggg a | .agggaaagg aaggatccgc ctcccaggta |
| Informace o | SEQ ID NO: 5: | |
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 44 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: DNA |
3?*”** » τ?γ
9 · • 9 999 : 55: :
·· (ix) ZNAKY:
(D). Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
gaggaaaggg aagggaaagg aaggatccgc ctcctgggtt caag . 44 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
| (iii) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 44 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořet | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (iii) | DRUH | MOLEKULY: DNA |
(ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
gagaaaaggg s«J99aaagg· aaggatccga tctgcctggt tctg (2) Informace o SEQ ID. NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetěžcová (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
gaggaaagag aagggaaagg aaggatccgt gagcgcaacg caat 44 ·· ···· : ? ···.
...... :
•ř.9·./ ·. »· (2) Informace o SEQ. ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 823 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (II) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:.8:
gggccccccc tcgagaagcc gtgctgtcag catcagcatc. atcggtgaga 60 agccctacag accctgggac tagggtgcag gscagcacag gctctaattt 120 tctggcctta tccctaacag ccaccccacc tctccctcca tgcacccaca 180 ccctacccca cccaaattct gccaagagag cagccaagcc tctcccttct 240 cctctcccca cctgccccat cccaagcctc tccctctgag aacactccat agtcgagcat aacccaggag acaaaagtga ctaaataacc agaaccaggc gttcccttta tgtgaaattg aagcctgggg ctaaaaaaag gaacagacgg ctgggcgcgg tggctcacgc ctgtaatccc 300 gcatctggtg atgcgagctc gactctgggg aaaacactgg gttttcccag 360 tctacctggg aggccagcta cttgagággc tgaggcagga gaattgcťtg 420 gcatagattg tgatgagcca agatcgcaccattgcatgcc agcctcggca 480 aactccatct caaaaaaaaa agaaagggaa agactccact ggggctccca 540 ctctctcaac ccgaagtctt cctttctgac: tggatccaac tttgtcttcc 600 agatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc tccagctttt 660 gtgagggtta attccgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 720 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 780 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tca 823 (2) Informace o SEQ ID ŇÓ: 9:
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 68 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: DNA |
(ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
caccaaccca aaccaaccca aaccatgccg atgacctgca gaagccttcc tttcccttcc 60 ctttcctc '
(2) Informace o SEQ ID NO: 10:
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA:. 68 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetě | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: DNA |
(ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ‘ID NO: 10:
caccaaccca aaccaaccca aac.cgtáctg caccaggcgg ccgcccttcc tttcccttcc . · 60 ctttcctc (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 90 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ.ID NO: 11:
caccaaccca aaccaaccca aacccctggg gaggčatgcc gatgacctgc agaagccatg 60 ggatggcctt cctttccctt ccctttcctc 90 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 155 párů baží | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: DNA |
| ix) | ZNAKY: |
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
caccaaccca aaccaaccca aaccggctca cgcctgtaat cccaacactc. catgcatctg60 gtgatgcgag ctcgactctg gggaaaacac tgggttttcc cagagtcgag cattctacct 120 · gggaggcgga tccttccttt cccttccctt. tcctc 155 · ·.
:ss: : ·: · ·· · ·· ··
13:
SEKVENCE:
Dárů baží (2) Informace o SEQ ID NO:
(i) CHARAKTERISTIKA (A) DÉLKA: 203 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
| caccaaccca 60 | aaccaaccca | aaccggctca | cgcctgtaat | cccaacactc | catacgtctg |
| gtgatgcgag 120· | ctcgactctg | gggaaaacac | tgggttttcc | cagagtcgag | cattctacct |
| gggaggccag 180 | ctacttgaga | ggctgaggca | ggagaattgc | ttgaacccag | gaggcggatc |
| cttcctttcc | cttccctttc | ctc |
203 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 386 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
·· ·· '60
| caccaaccca 60 | aaccaaccca | aaccggctca | cgcctgtaat | cccaacactc | catgcatctg ) i 1 |
| gtgatgcgag 120 | ctcgactctg | gggaaaacac | tgggttttcc | cagagtcgag | cattctacct ! |
| gggaggccag 180 | ctacttgaga | ggctgaggca | ggagaattgc | ttgaacccag | gaggcataga 1 |
| ttgtgatgag 240 | ccaagatcgc | accattgcat | gccagcctcg | gcaacaaaag | tgaaactcca |
| tctcaaaaaa 300 | aaaagaaagg | gaaagactcc | actggggctc | ccactaaata | accctctctc |
| aacccgaagt 360 | cttcctttct | gactggatcc | aactttgtct | tccagaacca | ggcagatcgg |
| atccttcctt | tcccttccct | ttcctc |
386 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |
| (A) | DÉLKA: 605 párů)bázi | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární •í | |
| (ii) | DRUH | MOLEKULY: DN |
(ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka=syntetická konstrukce (xi) Popis sekvence: SEQ “ID NO: 15:
.·%.·* .··..··· •.rt*··· ···’ ·· ·· ···· * * • · !
« 9 · »· ** caccaaccca aaccaaccca aaccggctca cgcctgtaat cccaacactc catacgtctg 60 gtgatgcgag ctcgactctg gggaaaacac tgggttttcc cagagtcgag cattctacct 120 gggaggccag ctacttgaga ggctgaggca ggagaattgc ttgaacccag gaggcataga
180 ttgtgatgag ccaagatcgc accattgcat gccagcctcg gcaacaaaag tgaaactcca 240 tctcaaaaaa aaaagaaagg gaaagactcc actggggctc ccactaaata accctctctc 300 aacccgaagt cttcctttct gactggatcc aactttgtct tccagaacca ggcagatcca 360 ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agčtccagct tttgttccct ttagtgaggg 420 ttaattccga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttč ctgtgtgaaa ttgttatccg '480 ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 540 tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcacgga tccttccttt cccttccctt 600 tcctc
605 • · ' • ··· • · « • · · ·“>
·<· ·'« «· ·· ♦e·· « · • · • · • · · ·· ··
Claims (2)
1. Způsob pro izotermickou amplifikaci alespoň jednoho segmentu nukleové kyseliny obsahující až 1 000 nukleotidů, vyznačující se tím, že zahrnuje: .
a) vytvoření alespoň jednoho templátu nukleové kyseliny obsahující nukleovou kyselinu(y), která se bude amplifikovat, přičemž uvedená nukleová kyselina(y) obsahuje na 5'konci oligonukleotidovou sekvenci Y a na 3'konci oligonukleotidovou' sekvenci Z a navíc nukleová kyselina(y). : nese na 5'-konci prostředek pro její imobilizaci na pevný podklad,
b) vytvoření jednoho nebo více primerů kolonií X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na 5'-konci prostředek imobilizující . uvedené primery kolonií ha pevný podklad,
c) smíchání - uvedeného templátu(ů) nukleové kyseliny a primerů kolonií spolu s roztokem, který umožňuje jejich imobilizaci 5'-koncem na pevný podklad v přítomnosti uvedeného pevného podkladu tak, že 5'-konce templátu(ů) nukleových kyselin a primerů kolinií jsou vázány na uvedený pevný podklad,
d) aplikace amplífikačního roztoku, který obsahuje alespoň polymerázu nukleové kyseliny a nukleotidové prekurzory, na uvedený pevný podklad za účelem vytvořit a imobilizovat izotermicky nukleové kyseliny, které vykazují sekvenci shodnou nebo komplementární se sekvencí imobilizovaného.'templátu (ů) nukleové kyseliny.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e dva různé primery kolonií X' ‘a X'' se smíchají s templátem(y) nukleové kyseliny a kolonií X' a X' ' jsou takové, že sekvence Z může hybridizovat s jedním X'a oligonukleotidové sekvence Y je z primerů kolonií X' ' .
sekvence primerů oligonukleotidové z primerů kolonií stejná jako jeden
Způsob podle nároku 1, vyznač ž e oligonukleotidové sekvence s oligonukleotídovou sekvencí Y vykazuje stejnou sekvenci jako sekvence Y.
ující se tím, Z je komplementární a primer kolonií X je oligonukleotidové
Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e jeden' nebo více primerů· kolonií X může obsahovat degenerovanou sekvenci primeru a templát(y) nukleových kyselin obsahuje nukleovou(é) kyselinu(y), které se budou amplifikovat, a neobsahuje na 5'-konci a 3'-konci oligonukleotidové sekvence Y respektive Z.
Způsob podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že uvedeným templátem nukleové kyseliny je genomová DNA, komplementární DNA, rekombinantní DNA nebo libovolná forma syntetické nebo upravené DNA, RNA, mRNA nebo libovolná forma syntetické nebo .upravené RNA.
Způsob, podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e templát nukleové kyseliny obsahuje 68 až 605 bází.
Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e templát(y) nukleové kyseliny v imobilizačním roztoku se vyskytuje v koncentraci 1 až 0,01 nM.
Způsob podle libovolného ’ z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že primery kolonií • · • · v imobilizačním roztoku se vyskytuje v koncentraci 1 000 až 50 nM.
9. Způsob podle libovolného z nároků 1' až 8, vyznačující se tím, že uvedená polymeráza nukleové kyseliny je DNA polymeráza závislá na DNA nebo DNA polymeráza závislá na RNA.
10. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c i se tím, ž e uvedená polymeráza „nukleové kyseliny je DNA polymeráza, která je aktivní v teplotním rozmezí 70 až 85°C.
11. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e amplifikacé se uskutečnila při teplotě 77 až 81 °C.
Způsob podle vyznačuj nukleotidů jsou libovolného z nároků 1 ící setím, že deoxyribonukleotidtrifosfáty.
až 11, prekurzory
13. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že prostředky imobiliz.ující 5.-konce templátu (ů) nukleových kyselin a primery kolonií jsou chemicky upravitelné funkční skupiny, které umožňují tvorbu kovalentní vazby mezi uvedenými molekulami a pevným podkladem.
14. Způsob podle, nároku 13, vyznačující se tím, ž e templáty nukleové kyseliny a primery jsou upraveny na 5-konci thiolem,. fosfátovou skupinou nebo aminoskupinou a jsou imobilizovány použitím imobilizačního roztoku, který obsahuje hydrochlorid ' l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC).
00 ····
15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e pevný podklad umožňuje kovaiéntní navázání nukleové kyseliny prostřednictvím funkcionalizace za použití monofunkčních nebo bifunkčních činidel tvořících příčné vazby.
16. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že prostředky imobilizující 5'-konce templátu(ů) nukleových kyselin a primerů kolonií jsou chemické skupiny vázající se na molekuly imobilizované na pevném podkladu na základě afinity.
izotermickou přípravu kolonií DNA na pevném podkladu.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e hustota vytvořených kolonií nukleových kyselin je 1 000 až 100 000 na každém čtverečním milimetru.
20. Způsob podle libovolného z nároků 18 nebo 19, vyznačující se tím, že obsahuje další krok, který zviditelňuje amplifikované nukleové kyseliny.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, ž e se používá interkalační činidlo pro dvouřetězcovou DNA, značený nukleotid(y) nebo značený oligonukleotid(y).
22. Způsob podle libovolného z nároků 18 až 21, vyznačující se t í ní; že zahrnuje další krok uvolnění jednoho nebo více imobilizovaných řetězců nukleových kyselin patřících do jedné nebo více kolonií nukleových kyselin chemickým, optickým, fyzikálním nebo enzymatickým způsobem.
23. Způsob podle libovolného z nároků 18 až 22, vyznačující se tím, že zahrnuje další krok provedení alespoň jednoho kroku determinace sekvence jedné nebo více kolonií nukleových kyselin.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e determinace sekvencí se' provedla začleněním značeného nukleotidu(ů).
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, ž e značený nukleotid(y) jsou začleněny využitím primerů kolonií.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, ž e značený nukleotid(y) je začleněn využitím primerů jiných než jsou primery' kolonií, které hybridizuj! s jednou nebo více amplifikovaných nukleových kyselin.
27. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e determinace, sekvence následuje po hybridizaci se značeným oligonukleotidem(y) jednoho nebo obou řetězců nukleových kyselin, které patří do jedné nebo více kolonií nukleových. kyselin.
28. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 27, vyznačující se tím, radioaktivní nebo fluorescenční skupina.
ž e značkou je
29. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e determinace sekvence následuje po uvolnění jednoho nebo obou řetězců nukleových kyselin podle nároku 22.
30. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se stanovily celé nebo částečné sekvence amplifikovaných templátů nukleových kyselin přítomných v koloniích, které obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu.
31. Způsob podle libovolného z nároků 19 až 29, vyznačující se tím, že další krok(y) se provádějí současně s jednou nebo více kolonií nukleových kyselin.
32. Použití způsobu podle libovolného z nároků 1 až 31 při přípravě molekul nukleových kyselin, které se budou používat při sekvenování nukleových kyselin a resekvenování v oblasti organizace molekul genomové DNA a fyzikálního mapování, vliv farmaceutických prostředků na organizaci - molekul genomové DNA, objevení léků, charakterizaci potravin, genotypování, diagnostiky, sledování exprese genů, analýzy genové diverzity, sekvenování celého genomu a zkoumání polymorfizmů nebo při libovolných jiných aplikacích, které zahrnují amplifikaci nukleových kyselin.
33. Sada, vyznačující se tím, že se používá při izotermické amplifikaci nukleových kyselin a zahrnuje způsob podle, libovolného z nároků 1 až 31 pro přípravu molekul nukleových kyselin, které se budou používat pro sekvenování nukleových kyselin' a re-sekvenování v oblasti organizace molekul genomové DNA a fyzikální mapování, eJX·-·; A- y- -J
9 9 . *· 9 9 . 9 · 9 9 9 999 • · · · · 9' >' 9 9 9 .· •9999,9999 99 9
9 99 9 9 9 99 999 9 9
9 99 9 9 99 9 9 99 9 vlivu farmaceutických prostředků na organizace molekul genomové DNA, objevení léků, čhárakterizace potravin, genotypování, diagnostiky, sledování exprese genů, analýzy genové diverzity, sekvenování celého genomu a zkoumání polymorfizmů nebo při libovolných jiných aplikacích, které zahrnují amplifikací nukleových kyselin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00127011 | 2000-12-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031582A3 true CZ20031582A3 (cs) | 2003-10-15 |
Family
ID=8170618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20031582A CZ20031582A3 (cs) | 2000-12-08 | 2001-12-07 | Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7790418B2 (cs) |
| EP (1) | EP1339877A1 (cs) |
| JP (1) | JP2004524012A (cs) |
| KR (1) | KR20030055343A (cs) |
| CN (1) | CN1489632A (cs) |
| AR (1) | AR031640A1 (cs) |
| AU (1) | AU2002219161A1 (cs) |
| BG (1) | BG107861A (cs) |
| BR (1) | BR0116033A (cs) |
| CA (1) | CA2430369A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20031582A3 (cs) |
| EA (1) | EA200300647A1 (cs) |
| EE (1) | EE200300256A (cs) |
| HU (1) | HUP0302803A2 (cs) |
| IL (1) | IL156311A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03005078A (cs) |
| NO (1) | NO20032455L (cs) |
| PL (1) | PL363742A1 (cs) |
| SK (1) | SK6952003A3 (cs) |
| WO (1) | WO2002046456A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200304102B (cs) |
Families Citing this family (372)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2327797B1 (en) | 1997-04-01 | 2015-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Method of nucleic acid sequencing |
| US7846733B2 (en) * | 2000-06-26 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
| JP2004513617A (ja) * | 2000-06-26 | 2004-05-13 | ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 転写に基づく核酸増幅のための方法および組成物 |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| AU2002228974A1 (en) | 2000-12-13 | 2002-06-24 | Nugen Technologies, Inc | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
| US6946251B2 (en) | 2001-03-09 | 2005-09-20 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for amplification of RNA sequences using RNA-DNA composite primers |
| ATE397095T1 (de) | 2001-04-20 | 2008-06-15 | Penn State Res Found | Verfahren zur manipulation von nukleinsäuren |
| WO2004092418A2 (en) * | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Nugen Technologies, Inc. | Global amplification using a randomly primed composite primer |
| US7220549B2 (en) * | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
| JP2006234712A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Ｄｎａの固定化方法 |
| JP2006230335A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 遺伝子の検出方法 |
| JP2008538496A (ja) * | 2005-04-12 | 2008-10-30 | ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション | ウルトラディープ配列決定を用いて配列変異体を決定するための方法 |
| US20060228721A1 (en) | 2005-04-12 | 2006-10-12 | Leamon John H | Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing |
| EP3257949A1 (en) | 2005-06-15 | 2017-12-20 | Complete Genomics Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| EP1929046B1 (en) * | 2005-09-07 | 2012-07-11 | Nugen Technologies, Inc. | Improved nucleic acid amplification procedure |
| GB0524069D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| US8192930B2 (en) | 2006-02-08 | 2012-06-05 | Illumina Cambridge Limited | Method for sequencing a polynucleotide template |
| EP2021503A1 (en) * | 2006-03-17 | 2009-02-11 | Solexa Ltd. | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| CA2648149A1 (en) | 2006-03-31 | 2007-11-01 | Solexa, Inc. | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
| WO2008002502A2 (en) | 2006-06-23 | 2008-01-03 | Illumina, Inc. | Devices and systems for creation of dna cluster arrays |
| US7501254B2 (en) | 2006-07-20 | 2009-03-10 | Ghc Technologies, Inc. | Methods and compositions for amplification and capture of nucleic acid sequences |
| ATE538216T1 (de) * | 2006-07-31 | 2012-01-15 | Wanli Bi | Nukleinsäureverstärkung mithilfe eines reversibel modifizierten oligonukleotids |
| US20080081330A1 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Helicos Biosciences Corporation | Method and devices for analyzing small RNA molecules |
| US7754429B2 (en) * | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| JP2010521156A (ja) | 2007-03-16 | 2010-06-24 | ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション | Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 |
| WO2008157640A2 (en) | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Illumina, Inc. | Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates |
| US9689031B2 (en) | 2007-07-14 | 2017-06-27 | Ionian Technologies, Inc. | Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids |
| JP5020734B2 (ja) * | 2007-07-31 | 2012-09-05 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸解析方法及び装置 |
| EP2191011B1 (en) * | 2007-08-29 | 2017-03-29 | Illumina Cambridge Limited | Method for sequencing a polynucleotide template |
| ITBO20070627A1 (it) * | 2007-09-14 | 2009-03-15 | Twof Inc | Metodo per la preparazione di dna microarray con sonde ad alta densita' lineare |
| JP2009178159A (ja) | 2007-11-05 | 2009-08-13 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板 |
| US20090203531A1 (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-13 | Nurith Kurn | Method for Archiving and Clonal Expansion |
| EP2247727A4 (en) * | 2008-02-12 | 2011-08-03 | Nugen Technologies Inc | PROCESS FOR ARCHIVING AND CLONING EXPANSION |
| US12060554B2 (en) | 2008-03-10 | 2024-08-13 | Illumina, Inc. | Method for selecting and amplifying polynucleotides |
| WO2011025477A1 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | Illumina, Inc. | Methods for selecting and amplifying polynucleotides |
| WO2009117698A2 (en) * | 2008-03-21 | 2009-09-24 | Nugen Technologies, Inc. | Methods of rna amplification in the presence of dna |
| US20100036110A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Xiaoliang Sunney Xie | Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
| US20100227327A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-09-09 | Xiaoliang Sunney Xie | Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| US8728764B2 (en) | 2008-10-02 | 2014-05-20 | Illumina Cambridge Limited | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| US8486865B2 (en) | 2008-11-03 | 2013-07-16 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting modification resistant nucleic acids |
| EP2379748A4 (en) | 2008-12-23 | 2012-08-29 | Illumina Inc | MULTIBASE RELEASE FOR LONG READINGS IN SEQUENCING BY SYNTHESIS PROTOCOLS |
| US20120156728A1 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Life Technologies Corporation | Clonal amplification of nucleic acid on solid surface with template walking |
| US9309566B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification |
| US9334531B2 (en) | 2010-12-17 | 2016-05-10 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| US9309557B2 (en) * | 2010-12-17 | 2016-04-12 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
| US8182994B2 (en) | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| WO2011038241A1 (en) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
| WO2011053845A2 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Illumina, Inc. | Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same |
| CN202281746U (zh) | 2010-03-06 | 2012-06-20 | 伊鲁米那股份有限公司 | 检测来自样品光信号的测定设备及其光学组件和光学系统 |
| DK2556171T3 (en) | 2010-04-05 | 2015-12-14 | Prognosys Biosciences Inc | Spatially CODED BIOLOGICAL ASSAYS |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US12152275B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-11-26 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US12545960B2 (en) | 2010-05-18 | 2026-02-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10179937B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-01-15 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US12221653B2 (en) | 2010-05-18 | 2025-02-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| AU2011255641A1 (en) | 2010-05-18 | 2012-12-06 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| WO2011159942A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
| US9029103B2 (en) | 2010-08-27 | 2015-05-12 | Illumina Cambridge Limited | Methods for sequencing polynucleotides |
| EP2632593B1 (en) | 2010-10-27 | 2021-09-29 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
| EP3388532B1 (en) | 2010-11-01 | 2021-03-10 | Gen-Probe Incorporated | Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing |
| US8575071B2 (en) | 2010-11-03 | 2013-11-05 | Illumina, Inc. | Reducing adapter dimer formation |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| EP2643484A4 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-16 | Univ California | METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN |
| CA2821906C (en) | 2010-12-22 | 2020-08-25 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
| JP6017458B2 (ja) | 2011-02-02 | 2016-11-02 | ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション | 大量並列連続性マッピング |
| CA2824387C (en) | 2011-02-09 | 2019-09-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| US8778848B2 (en) | 2011-06-09 | 2014-07-15 | Illumina, Inc. | Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis |
| AU2012281152B2 (en) | 2011-07-13 | 2017-09-07 | The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. | Methods for data collection and distribution |
| CA3104322C (en) | 2011-09-23 | 2023-06-13 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| WO2013049135A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Gen-Probe Incorporated | Algorithms for sequence determinations |
| CN102559864B (zh) * | 2011-09-29 | 2014-04-16 | 东南大学 | 可进行单分子核酸扩增的颗粒、其制备方法及应用 |
| EP3305400A3 (en) | 2011-10-28 | 2018-06-06 | Illumina, Inc. | Microarray fabrication system and method |
| WO2013096460A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Pseudogenes and uses thereof |
| WO2013117595A2 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
| WO2013124738A2 (en) | 2012-02-21 | 2013-08-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| US20150111758A1 (en) | 2012-03-06 | 2015-04-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer |
| NO2694769T3 (cs) | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
| US20130261984A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities |
| CN204832037U (zh) | 2012-04-03 | 2015-12-02 | 伊鲁米那股份有限公司 | 检测设备 |
| US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
| US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
| US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| EP2870264A4 (en) | 2012-07-03 | 2016-03-02 | Sloan Kettering Inst Cancer | QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THE RECOVERY OF HUMAN T-CELL REPERTOIR AFTER TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC BLOOD-GENERATING STEM CELLS |
| US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
| NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
| CA3040684C (en) | 2012-08-20 | 2023-02-07 | Hod Finkelstein | Method and system for fluorescence lifetime based sequencing |
| WO2014060483A1 (en) | 2012-10-17 | 2014-04-24 | Spatial Transcriptomics Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
| DK3553175T3 (da) | 2013-03-13 | 2021-08-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek |
| WO2014142841A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication |
| EP2971171A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-02 | Abbott Molecular Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR MULTIPLEX AMPLIFICATION SPECIFIC TO METHYLATION |
| EP2971175B1 (en) | 2013-03-14 | 2019-04-17 | Abbott Molecular Inc. | Minimizing errors using uracil-dna-n-glycosylase |
| CA2905410A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Abbott Molecular Inc. | Systems and methods for detection of genomic copy number changes |
| US9255265B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-09 | Illumina, Inc. | Methods for producing stranded cDNA libraries |
| ES2716094T3 (es) | 2013-03-15 | 2019-06-10 | Ibis Biosciences Inc | Métodos para analizar la contaminación en la secuenciación del ADN |
| EP2971071B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-02-28 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
| US9868979B2 (en) | 2013-06-25 | 2018-01-16 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays using a microfluidic device |
| MX363806B (es) | 2013-07-01 | 2019-04-03 | Illumina Inc | Funcionalización de superficies sin catalizador e injerto de polímeros.. |
| EP3241913B1 (en) | 2013-07-03 | 2019-02-20 | Illumina, Inc. | System for sequencing by orthogonal synthesis |
| KR102043320B1 (ko) | 2013-08-08 | 2019-11-11 | 일루미나, 인코포레이티드 | 플로우 셀로의 시약 전달을 위한 유체 시스템 |
| US20160199832A1 (en) | 2013-08-30 | 2016-07-14 | Advanced Liquid Logic France Sas | Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces |
| US10415083B2 (en) | 2013-10-28 | 2019-09-17 | The Translational Genomics Research Institute | Long insert-based whole genome sequencing |
| CA2931533C (en) | 2013-12-09 | 2023-08-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| NZ720871A (en) | 2013-12-10 | 2020-03-27 | Illumina Inc | Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same |
| US10353633B2 (en) * | 2013-12-19 | 2019-07-16 | Sony Interactive Entertainment LLC | Mass storage virtualization for cloud computing |
| EP3084523B1 (en) | 2013-12-19 | 2019-07-03 | Illumina, Inc. | Substrates comprising nano-patterning surfaces and methods of preparing thereof |
| CN106414765A (zh) | 2013-12-20 | 2017-02-15 | Illumina公司 | 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息 |
| WO2015103225A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Illumina, Inc. | Addressable flow cell using patterned electrodes |
| AU2015209103B2 (en) | 2014-01-27 | 2021-07-01 | Archerdx, Llc | Isothermal methods and related compositions for preparing nucleic acids |
| US12492429B2 (en) | 2014-04-21 | 2025-12-09 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| EP3143161B1 (en) | 2014-05-16 | 2021-04-21 | Illumina, Inc. | Nucleic acid synthesis techniques |
| AU2015267189B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-12-05 | Illumina, Inc. | Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge |
| EP3669985B1 (en) | 2014-06-05 | 2022-02-02 | Illumina, Inc. | Systems including a rotary valve for at least one of sample preparation or sample analysis |
| US20180173846A1 (en) | 2014-06-05 | 2018-06-21 | Natera, Inc. | Systems and Methods for Detection of Aneuploidy |
| CN106715693A (zh) | 2014-06-13 | 2017-05-24 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 用于制备序列文库的方法和组合物 |
| ES2713153T3 (es) | 2014-06-30 | 2019-05-20 | Illumina Inc | Métodos y composiciones que utilizan la transposición unilateral |
| WO2016026924A1 (en) | 2014-08-21 | 2016-02-25 | Illumina Cambridge Limited | Reversible surface functionalization |
| WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
| AU2015318017B2 (en) | 2014-09-18 | 2022-02-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data |
| BR112017005038B1 (pt) | 2014-10-09 | 2022-01-25 | Illumina, Inc | Método e dispositivo para separar líquidos imiscíveis para isolar efetivamente pelo menos um dos líquidos |
| AU2015331739B2 (en) | 2014-10-17 | 2021-12-02 | Illumina Cambridge Limited | Contiguity preserving transposition |
| CN107074904B (zh) | 2014-10-23 | 2022-12-23 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 信号约束测序(scs)和用于信号约束测序的核苷酸类似物 |
| SI3212684T1 (sl) | 2014-10-31 | 2020-04-30 | Illumina Cambridge Limited | Polimeri in DNK kopolimer premazi |
| EP3218482A4 (en) | 2014-11-11 | 2018-05-09 | Abbott Molecular Inc. | Hybridization probes and methods |
| CN107810404B (zh) | 2015-03-24 | 2020-11-10 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于对样品成像用于生物或化学分析的方法、载体组件和系统 |
| EP4282977B1 (en) | 2015-04-10 | 2024-06-05 | 10x Genomics Sweden AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11220705B2 (en) | 2015-04-24 | 2022-01-11 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support |
| WO2016170182A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Qiagen Gmbh | Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support |
| DK3294906T3 (en) | 2015-05-11 | 2024-08-05 | Natera Inc | Methods for determining ploidy |
| EP4190912A1 (en) | 2015-05-11 | 2023-06-07 | Illumina, Inc. | Platform for discovery and analysis of therapeutic agents |
| EP3302804B1 (en) | 2015-05-29 | 2022-07-13 | Illumina, Inc. | Sample carrier and assay system for conducting designated reactions |
| CN107849600A (zh) | 2015-06-09 | 2018-03-27 | 生命技术公司 | 用于分子标记的方法、系统、组合物、试剂盒、装置和计算机可读媒体 |
| WO2017007753A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-12 | Illumina, Inc. | Selective surface patterning via nanoimrinting |
| US20180207920A1 (en) | 2015-07-17 | 2018-07-26 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
| WO2017019278A1 (en) | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Illumina, Inc. | Orthogonal deblocking of nucleotides |
| US10976334B2 (en) | 2015-08-24 | 2021-04-13 | Illumina, Inc. | In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays |
| US10906044B2 (en) | 2015-09-02 | 2021-02-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods of improving droplet operations in fluidic systems with a filler fluid including a surface regenerative silane |
| EP3359669B1 (en) | 2015-10-06 | 2020-05-13 | Pierce Biotechnology, Inc. | Devices and methods for producing proteins |
| WO2017087724A1 (en) | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| WO2017123533A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Illumina, Inc. | Detection apparatus having a microfluorometer, a fluidic system, and a flow cell latch clamp module |
| EP3377226B1 (en) | 2016-03-28 | 2021-02-17 | Illumina, Inc. | Multi-plane microarrays |
| WO2017181202A2 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Natera, Inc. | Methods for lung cancer detection |
| PT109359A (pt) | 2016-05-03 | 2017-11-03 | Univ Aveiro | Dispositivo portátil, método para leitura de etiquetas de autenticação e seus usos. |
| SG11201809376WA (en) | 2016-05-18 | 2018-12-28 | Illumina Inc | Self assembled patterning using patterned hydrophobic surfaces |
| ES2873723T3 (es) | 2016-07-22 | 2021-11-03 | Univ Oregon Health & Science | Colecciones de genoma completo de células individuales y métodos de indexación combinatoria para prepararlas |
| WO2018053362A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation |
| WO2018053365A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free dna |
| WO2018064116A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems for data compression |
| WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| MY194951A (en) | 2016-10-14 | 2022-12-28 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| GB201618485D0 (en) | 2016-11-02 | 2016-12-14 | Ucl Business Plc | Method of detecting tumour recurrence |
| CN116606726A (zh) | 2016-11-03 | 2023-08-18 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 用于生物或化学分析的生物传感器及其制造方法 |
| AU2017360993A1 (en) | 2016-11-16 | 2019-06-13 | Illumina, Inc. | Validation methods and systems for sequence variant calls |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| AU2018210944B2 (en) | 2017-01-20 | 2021-07-22 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow |
| CA3063364A1 (en) | 2017-01-26 | 2018-08-02 | Qiagen Gmbh | Method for enriching template nucleic acids |
| WO2018152162A1 (en) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | Omniome, Inc. | Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation |
| KR102657576B1 (ko) | 2017-03-20 | 2024-04-12 | 엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디. | 생물학적 또는 화학적 분석을 위한 바이오센서 및 그 제조 방법 |
| US10737267B2 (en) | 2017-04-04 | 2020-08-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
| US10934584B2 (en) | 2017-04-23 | 2021-03-02 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| SG11201909918XA (en) | 2017-04-23 | 2019-11-28 | Illumina Cambridge Ltd | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| CN110785492B (zh) | 2017-04-23 | 2024-04-30 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法 |
| US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| WO2018213803A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Neon Therapeutics, Inc. | Immunogenic neoantigen identification |
| DK3981884T3 (da) | 2017-06-07 | 2023-09-04 | Univ Oregon Health & Science | Enkeltcelle-helgenombiblioteker til methyleringssekventering |
| EP3662482A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-06-10 | Illumina Inc. | Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation |
| WO2019035897A1 (en) | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Omniome, Inc. | SCANNING APPARATUS AND METHODS USEFUL FOR DETECTION OF CHEMICAL OR BIOLOGICAL ANALYTES |
| EP3476938B1 (en) * | 2017-09-14 | 2020-05-13 | Zhongke Xinray (Suzhou) Biological Science Technologies Co., Ltd. | Method and kit for synthesizing nucleic acid under constant temperature conditions |
| CN118045644A (zh) | 2017-09-19 | 2024-05-17 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 晶片级测序流通池制造 |
| CA3066775A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Illumina, Inc. | Deep learning-based techniques for training deep convolutional neural networks |
| US11488009B2 (en) | 2017-10-16 | 2022-11-01 | Illumina, Inc. | Deep learning-based splice site classification |
| AU2018353136B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-05-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
| CA3036161C (en) | 2017-11-13 | 2023-03-28 | The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. | Integrated, molecular, omics, immunotherapy, metabolic, epigenetic, and clinical database |
| CA3085933A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Tai Diagnostics, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
| CN110832305A (zh) | 2018-01-08 | 2020-02-21 | 因美纳有限公司 | 利用基于半导体的检测的高通量测序系统和设备 |
| US11378544B2 (en) | 2018-01-08 | 2022-07-05 | Illumina, Inc. | High-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| WO2019140402A1 (en) | 2018-01-15 | 2019-07-18 | Illumina, Inc. | Deep learning-based variant classifier |
| KR20200024167A (ko) | 2018-03-22 | 2020-03-06 | 일루미나, 인코포레이티드 | Rna 및 dna로부터의 핵산 라이브러리의 제조 |
| AU2019248635B2 (en) | 2018-04-02 | 2022-01-27 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing |
| CA3095292A1 (en) | 2018-04-02 | 2019-10-10 | Progenity, Inc. | Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules |
| NL2020861B1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-22 | Illumina Inc | Variant classifier based on deep neural networks |
| WO2019200338A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Illumina, Inc. | Variant classifier based on deep neural networks |
| EP3781714B1 (en) | 2018-04-14 | 2026-01-07 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna |
| AU2019255987A1 (en) | 2018-04-19 | 2020-12-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods |
| WO2019209426A1 (en) | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes |
| CN119955902A (zh) | 2018-05-17 | 2025-05-09 | 伊鲁米纳公司 | 具有减少的扩增偏倚的高通量单细胞测序 |
| WO2019231568A1 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Omniome, Inc. | Increased signal to noise in nucleic acid sequencing |
| SG11202000905PA (en) | 2018-06-04 | 2020-02-27 | Illumina Inc | High-throughput single-cell transcriptome libraries and methods of making and of using |
| KR102088262B1 (ko) | 2018-06-21 | 2020-03-12 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | 금 나노쉘 상에 형성되는 헤어핀을 이용한 유전자 돌연변이의 단일 단계 등온 검출방법 |
| US12234509B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-02-25 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| US12073922B2 (en) | 2018-07-11 | 2024-08-27 | Illumina, Inc. | Deep learning-based framework for identifying sequence patterns that cause sequence-specific errors (SSEs) |
| WO2020018824A1 (en) | 2018-07-19 | 2020-01-23 | Ultima Genomics, Inc. | Nucleic acid clonal amplification and sequencing methods, systems, and kits |
| WO2020023362A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Omniome, Inc. | Serial formation of ternary complex species |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| CN113767175B (zh) | 2018-08-28 | 2025-07-25 | 10X基因组学股份有限公司 | 增加空间阵列分辨率 |
| NZ759665A (en) | 2018-10-15 | 2022-07-01 | Illumina Inc | Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks |
| US20240011086A1 (en) | 2018-11-15 | 2024-01-11 | Omniome, Inc. | Electronic detection of nucleic acid structure |
| TWI853851B (zh) | 2018-11-15 | 2024-09-01 | 中國商深圳華大智造科技有限公司 | 微流體裝置與其製備方法 |
| CN118853850A (zh) | 2018-12-01 | 2024-10-29 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 改善生物传感器光收集效率的方法和结构 |
| WO2020117653A1 (en) | 2018-12-04 | 2020-06-11 | Omniome, Inc. | Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays |
| SG11202012762WA (en) | 2018-12-05 | 2021-01-28 | Illumina Cambridge Ltd | Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification |
| WO2020123311A2 (en) | 2018-12-10 | 2020-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Resolving spatial arrays using deconvolution |
| CN112639126A (zh) | 2018-12-14 | 2021-04-09 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 降低测序期间用未标记的核苷酸的定相 |
| CN112654714B (zh) | 2018-12-17 | 2024-10-11 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 用于测序的引物寡核苷酸 |
| ES3032918T3 (en) | 2018-12-17 | 2025-07-28 | Illumina Cambridge Ltd | Method of polynucleotide sequencing |
| KR102872035B1 (ko) | 2018-12-18 | 2025-10-16 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 단일 표면 프라이머를 사용하는 페어드 엔드 서열분석을 위한 방법 및 조성물 |
| WO2020132103A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Illumina, Inc. | Methods for improving polynucleotide cluster clonality priority |
| CN113227348B (zh) | 2018-12-20 | 2025-05-27 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于分析核酸和其他分析物的温度控制 |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| WO2020167574A1 (en) | 2019-02-14 | 2020-08-20 | Omniome, Inc. | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes |
| US11680950B2 (en) | 2019-02-20 | 2023-06-20 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes |
| WO2020180778A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina, Inc. | High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using |
| WO2020191387A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based base calling |
| NL2023316B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based sequencing |
| US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| US11347965B2 (en) | 2019-03-21 | 2022-05-31 | Illumina, Inc. | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| EP3947718A4 (en) | 2019-04-02 | 2022-12-21 | Enumera Molecular, Inc. | METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR COUNTING NUCLEIC ACID MOLECULES |
| GB201905303D0 (en) | 2019-04-15 | 2019-05-29 | Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh | Multiplex assembly of nucleic acid molecules |
| US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| CA3104851A1 (en) | 2019-05-16 | 2020-11-19 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| US11423306B2 (en) | 2019-05-16 | 2022-08-23 | Illumina, Inc. | Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing |
| WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| US12305235B2 (en) | 2019-06-06 | 2025-05-20 | Natera, Inc. | Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system |
| WO2020252186A1 (en) | 2019-06-11 | 2020-12-17 | Omniome, Inc. | Calibrated focus sensing |
| US11377655B2 (en) | 2019-07-16 | 2022-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Synthetic nucleic acids having non-natural structures |
| US10656368B1 (en) | 2019-07-24 | 2020-05-19 | Omniome, Inc. | Method and system for biological imaging using a wide field objective lens |
| US11180520B2 (en) | 2019-09-10 | 2021-11-23 | Omniome, Inc. | Reversible modifications of nucleotides |
| MX2021015885A (es) * | 2019-09-20 | 2022-03-22 | Illumina Inc | Métodos y composiciones para identificar ligandos en arreglos usando índices y códigos de barra. |
| CN118186063A (zh) | 2019-10-18 | 2024-06-14 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于对核酸加帽的方法和组合物 |
| EP4025711A2 (en) | 2019-11-08 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| EP4055185A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
| EP3927824A2 (en) | 2019-12-19 | 2021-12-29 | Illumina, Inc. | High-throughput single-cell libraries and methods of making and of using |
| US11747262B2 (en) | 2019-12-23 | 2023-09-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell carrier and methods of use |
| CN115135984B (zh) | 2019-12-23 | 2025-12-23 | 10X基因组学有限公司 | 可逆固定试剂及其使用方法 |
| DK3891300T3 (da) | 2019-12-23 | 2023-05-22 | 10X Genomics Inc | Fremgangsmåder til rumlig analyse ved anvendelse af rna-template-ligering |
| US11498078B2 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell receiver and methods of use |
| US12241890B2 (en) | 2019-12-23 | 2025-03-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods for generating barcoded nucleic acid molecules using fixed cells |
| US11155858B2 (en) | 2019-12-31 | 2021-10-26 | Singular Genomics Systems, Inc. | Polynucleotide barcodes for long read sequencing |
| US12365942B2 (en) | 2020-01-13 | 2025-07-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods of decreasing background on a spatial array |
| US12405264B2 (en) | 2020-01-17 | 2025-09-02 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic system and method for analyte capture |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US20210230681A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using proximity ligation |
| US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| CN115243792A (zh) | 2020-02-04 | 2022-10-25 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 流通池及其制造和使用方法 |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US12129516B2 (en) | 2020-02-07 | 2024-10-29 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
| US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
| US12399123B1 (en) | 2020-02-14 | 2025-08-26 | 10X Genomics, Inc. | Spatial targeting of analytes |
| US12281357B1 (en) | 2020-02-14 | 2025-04-22 | 10X Genomics, Inc. | In situ spatial barcoding |
| US12354008B2 (en) | 2020-02-20 | 2025-07-08 | Illumina, Inc. | Knowledge distillation and gradient pruning-based compression of artificial intelligence-based base caller |
| US20210265016A1 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Data Compression for Artificial Intelligence-Based Base Calling |
| BR112022016415A2 (pt) | 2020-02-20 | 2022-10-11 | Illumina Inc | Múltiplas chamadas de base à base de inteligência artificial |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
| US11768175B1 (en) | 2020-03-04 | 2023-09-26 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic methods for spatial analysis |
| EP4118656A1 (en) | 2020-03-11 | 2023-01-18 | Illumina, Inc. | Incremental secondary analysis of nucleic acid sequences |
| ES3014967T3 (en) | 2020-04-22 | 2025-04-28 | 10X Genomics Inc | Methods for spatial analysis using targeted rna depletion |
| US20230183798A1 (en) | 2020-05-05 | 2023-06-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes |
| US11188778B1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-30 | Illumina, Inc. | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator |
| EP4150065A2 (en) | 2020-05-12 | 2023-03-22 | Illumina Inc | Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase |
| US12416603B2 (en) | 2020-05-19 | 2025-09-16 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoresis cassettes and instrumentation |
| EP4153776B1 (en) | 2020-05-22 | 2025-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| EP4414459B1 (en) | 2020-05-22 | 2025-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| US12265079B1 (en) | 2020-06-02 | 2025-04-01 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for detecting analytes from captured single biological particles |
| EP4158054B1 (en) | 2020-06-02 | 2025-04-16 | 10X Genomics, Inc. | Spatial transcriptomics for antigen-receptors |
| EP4025692A2 (en) | 2020-06-02 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| EP4421186B1 (en) | 2020-06-08 | 2025-08-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| WO2021252617A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Illumina, Inc. | Methods for increasing yield of sequencing libraries |
| US12435363B1 (en) | 2020-06-10 | 2025-10-07 | 10X Genomics, Inc. | Materials and methods for spatial transcriptomics |
| WO2021252591A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| WO2021252747A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 1Ox Genomics, Inc. | Fluid delivery methods |
| EP4450639B1 (en) | 2020-06-25 | 2025-10-15 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of dna methylation |
| JP2023532231A (ja) | 2020-06-30 | 2023-07-27 | イルミナ インコーポレイテッド | 傷なしｄｎａを生成するための触媒的に制御された合成による配列決定 |
| CN115843315A (zh) | 2020-07-02 | 2023-03-24 | 伊鲁米纳公司 | 用于校准流通池中核酸文库接种效率的方法 |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US12209280B1 (en) | 2020-07-06 | 2025-01-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| EP4153606A4 (en) | 2020-07-13 | 2024-10-02 | Singular Genomics Systems, Inc. | METHODS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES |
| US12553898B1 (en) | 2020-08-10 | 2026-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Fluorescent hybridization of antibody-oligonucleotide for multiplexing and signal amplification |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| EP4214678B1 (en) | 2020-09-18 | 2024-11-06 | 10X Genomics, Inc. | Sample handling apparatus and image registration methods |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| WO2022087485A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid circularization and amplification on a surface |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| WO2022140028A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| US12576400B2 (en) | 2021-01-08 | 2026-03-17 | Cellanome, Inc. | Methods for incubating and analyzing a cell in a compartment of a fluidic device |
| MX2023007842A (es) | 2021-01-08 | 2023-09-19 | Cellanome Inc | Dispositivos y metodos para analizar muestras biologicas. |
| JP2024505508A (ja) | 2021-01-29 | 2024-02-06 | イルミナ インコーポレイテッド | ポリヌクレオチドによるフローセルの播種効率を改善するための方法、組成物、及びキット |
| WO2022170212A1 (en) | 2021-02-08 | 2022-08-11 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides |
| WO2022178267A2 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Modular assay support devices |
| US12525320B2 (en) | 2021-03-16 | 2026-01-13 | Illumina, Inc. | Neural network parameter quantization for base calling |
| WO2022197754A1 (en) | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Illumina Software, Inc. | Neural network parameter quantization for base calling |
| WO2022198068A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-22 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
| US20220333178A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-10-20 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
| EP4305196B1 (en) | 2021-04-14 | 2025-04-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods of measuring mislocalization of an analyte |
| US20220336057A1 (en) | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Illumina, Inc. | Efficient voxelization for deep learning |
| US12217829B2 (en) | 2021-04-15 | 2025-02-04 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based analysis of protein three-dimensional (3D) structures |
| WO2022236054A1 (en) | 2021-05-06 | 2022-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods for increasing resolution of spatial analysis |
| EP4582555A3 (en) | 2021-06-03 | 2025-10-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| WO2022265994A1 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Illumina, Inc. | Hydrogel-free surface functionalization for sequencing |
| KR20240027608A (ko) | 2021-06-29 | 2024-03-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | 유기체 서열을 사용하여 훈련된 자체-학습 염기 호출자 |
| WO2023278184A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| US12530882B2 (en) | 2021-07-01 | 2026-01-20 | Illumina, Inc. | Efficient artificial intelligence-based base calling of index sequences |
| US12423815B2 (en) | 2021-07-13 | 2025-09-23 | Illumina, Inc. | Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| JP2024532004A (ja) | 2021-07-19 | 2024-09-04 | イルミナ インコーポレイテッド | ベースコールのための補間及び適合による強度抽出 |
| US11455487B1 (en) | 2021-10-26 | 2022-09-27 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling |
| GB202110485D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| WO2023002203A1 (en) | 2021-07-21 | 2023-01-26 | Dnae Diagnostics Limited | Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides |
| GB202110479D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
| WO2023009758A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Illumina, Inc. | Quality score calibration of basecalling systems |
| US12553805B2 (en) | 2021-08-02 | 2026-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Methods of preserving a biological sample |
| KR20240035413A (ko) | 2021-08-03 | 2024-03-15 | 일루미나, 인코포레이티드 | 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출 |
| EP4196605B1 (en) | 2021-09-01 | 2024-12-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods for blocking a capture probe on a spatial array |
| US12480157B2 (en) | 2021-09-30 | 2025-11-25 | Illumina, Inc. | Polynucleotide sequencing |
| US20250236865A1 (en) | 2021-10-20 | 2025-07-24 | Illumina, Inc. | Methods for capturing library dna for sequencing |
| WO2023081485A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Stepwise sequencing of a polynucleotide with a homogenous reaction mixture |
| WO2023086880A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample |
| WO2023102118A2 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis |
| EP4441711A1 (en) | 2021-12-20 | 2024-10-09 | 10X Genomics, Inc. | Self-test for pathology/histology slide imaging device |
| EP4457364A1 (en) | 2021-12-29 | 2024-11-06 | Illumina, Inc. | Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers |
| US20240294967A1 (en) | 2022-01-20 | 2024-09-05 | Illumina, Inc. | Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing |
| CN114438186A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-06 | 赛纳生物科技(北京)有限公司 | 一种芯片上恒温扩增测序的方法 |
| JP2025512975A (ja) | 2022-04-07 | 2025-04-22 | イルミナ インコーポレイテッド | 改変シチジンデアミナーゼ及び使用方法 |
| CN119677869A (zh) | 2022-09-16 | 2025-03-21 | 伊路米纳有限公司 | 具有多核苷酸结合位点的纳米颗粒及其制备方法 |
| WO2024069581A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use |
| WO2024073047A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides |
| WO2024073043A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides |
| GB202215624D0 (en) | 2022-10-21 | 2022-12-07 | Dnae Diagnostics Ltd | Clonal amplification |
| EP4482979B1 (en) | 2022-11-09 | 2025-10-01 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of multiple analytes in a biological sample |
| WO2024129969A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Illumina, Inc. | Systems and methods for capture and enrichment of clustered beads on flow cell substrates |
| WO2024249200A1 (en) | 2023-05-26 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Methods for preserving methylation status during clustering |
| US20240401129A1 (en) | 2023-05-31 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Methods for double-stranded sequencing by synthesis |
| WO2024249061A1 (en) | 2023-05-31 | 2024-12-05 | Illumina, Inc. | Detecting a methylated nucleotide using a quencher |
| WO2025072783A1 (en) | 2023-09-28 | 2025-04-03 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2025081064A2 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Illumina, Inc. | Thermophilic deaminase and methods for identifying modified cytosine |
| WO2025137222A1 (en) | 2023-12-19 | 2025-06-26 | Illumina, Inc. | Methylation detection assay |
| US20250215491A1 (en) | 2023-12-28 | 2025-07-03 | Illumina, Inc. | Sequencing with single-stranded binding proteins |
| WO2025207535A1 (en) | 2024-03-26 | 2025-10-02 | Illumina, Inc. | Photo-switchable surfaces |
| WO2025240905A1 (en) | 2024-05-17 | 2025-11-20 | The Broad Institute, Inc. | Imaging-free high-resolution spatial macromolecule abundance reconstruction |
| WO2025264831A1 (en) | 2024-06-18 | 2025-12-26 | Illumina, Inc. | Methods for increasing sequencing quality of gc-rich regions |
| WO2025264836A1 (en) | 2024-06-18 | 2025-12-26 | Illumina, Inc. | Methods for increasing sequencing quality of gc-rich regions |
| WO2026006774A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2026006314A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Illumina, Inc. | Tagging target regions prior to nucleotide sequencing |
Family Cites Families (90)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4957858A (en) | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| US4719179A (en) * | 1984-11-30 | 1988-01-12 | Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. | Six base oligonucleotide linkers and methods for their use |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| EP0224126A3 (en) | 1985-11-25 | 1989-02-01 | The University of Calgary | Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| IE72468B1 (en) | 1987-07-31 | 1997-04-09 | Univ Leland Stanford Junior | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| US5093245A (en) * | 1988-01-26 | 1992-03-03 | Applied Biosystems | Labeling by simultaneous ligation and restriction |
| SE8801070D0 (sv) | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| US6107023A (en) | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
| AU632760B2 (en) * | 1988-07-26 | 1993-01-14 | Genelabs Technologies, Inc. | Rna and dna amplification techniques |
| GB8818020D0 (en) | 1988-07-28 | 1988-09-01 | Ici Plc | Method for amplification of nucleotide sequences |
| WO1990002205A1 (en) | 1988-08-25 | 1990-03-08 | Angenics, Inc. | Detection of nucleic acid sequences using particle agglutination |
| GB8827160D0 (en) | 1988-11-21 | 1988-12-29 | Apothekernes Lab | Detection & quantitative determination of rna & dna |
| IE66572B1 (en) | 1989-02-13 | 1996-01-24 | Geneco Pty Ltd | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| KR920700360A (ko) | 1989-03-22 | 1992-02-19 | 하리크 프리드리히 | 미끄럼 베어링 |
| US5629158A (en) | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| GB2233654A (en) | 1989-07-07 | 1991-01-16 | Nat Res Dev | Immobilised polynucleotides |
| US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
| EP0450060A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-10-09 | Sri International | Dna sequencing |
| CA2036946C (en) * | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
| US5326692B1 (en) * | 1992-05-13 | 1996-04-30 | Molecular Probes Inc | Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| GB9019512D0 (en) | 1990-09-06 | 1990-10-24 | Ici Plc | Assay method |
| CA2055755A1 (en) | 1990-11-22 | 1992-05-23 | Toshihiko Kishimoto | Method of immobilizing single-stranded dna on carrier at terminal |
| US5455166A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| WO1993003151A1 (en) | 1991-08-10 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Treatment of cell populations |
| WO1993004199A2 (en) | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Scientific Generics Limited | Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids |
| CA2077135A1 (en) | 1991-08-30 | 1993-03-01 | Joh-E Ikeda | A method of dna amplification |
| US5474796A (en) | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| GB9119735D0 (en) * | 1991-09-16 | 1991-10-30 | Secr Defence | Gene probe biosensor method |
| CA2119557C (en) * | 1991-09-24 | 2004-02-24 | Marc Zabeau | Selective restriction fragment amplification: a general method for dna fingerprinting |
| WO1993009245A1 (en) | 1991-10-31 | 1993-05-13 | University Of Pittsburgh | Reverse dot blot hybridization using tandem head-to-tail monomers containing probes synthesized by staggered complementary primers |
| WO1993009250A1 (en) | 1991-11-01 | 1993-05-13 | Adelaide Children's Hospital | Solid phase amplification process |
| DE4141178A1 (de) | 1991-12-13 | 1993-06-17 | Europ Lab Molekularbiolog | Verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren |
| EP0675966B1 (en) | 1992-02-19 | 2004-10-06 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids |
| GB9208733D0 (en) | 1992-04-22 | 1992-06-10 | Medical Res Council | Dna sequencing method |
| US5849544A (en) | 1992-07-24 | 1998-12-15 | University Of Australia | Amplification and detection process |
| WO1994003624A1 (en) | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Auerbach Jeffrey I | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
| US5639423A (en) | 1992-08-31 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of Calfornia | Microfabricated reactor |
| RU2048522C1 (ru) * | 1992-10-14 | 1995-11-20 | Институт белка РАН | Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления |
| US5795714A (en) | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
| US6277606B1 (en) * | 1993-11-09 | 2001-08-21 | Cold Spring Harbor Laboratory | Representational approach to DNA analysis |
| ATE217347T1 (de) * | 1992-12-04 | 2002-05-15 | Univ Yale | Diagnose mittels signalverstärkung durch ein ribozym |
| US5462854A (en) | 1993-04-19 | 1995-10-31 | Beckman Instruments, Inc. | Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5645801A (en) | 1993-10-21 | 1997-07-08 | Abbott Laboratories | Device and method for amplifying and detecting target nucleic acids |
| HUT74275A (en) | 1993-11-02 | 1996-11-28 | Neurobiological Technologies | Process for treatment of rheumatoid arthritis |
| JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1995-08-08 | Hamamatsu Photonics Kk | 核酸塩基配列決定方法 |
| EP0763135B1 (en) | 1994-05-28 | 2002-07-10 | Tepnel Medical Limited | Producing copies of nucleic acids |
| US5942391A (en) * | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US5641658A (en) * | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
| US6090592A (en) * | 1994-08-03 | 2000-07-18 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| US6468751B1 (en) * | 1994-08-03 | 2002-10-22 | Mosaic Technologies, Inc. | Method and apparatus for performing amplification of nucleic acid on supports |
| US6060288A (en) * | 1994-08-03 | 2000-05-09 | Mosaic Technologies | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| JP3612092B2 (ja) | 1994-09-07 | 2005-01-19 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａの分離・分取法及びその解析法 |
| US5843660A (en) * | 1994-09-30 | 1998-12-01 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
| WO1996024688A1 (en) | 1995-02-07 | 1996-08-15 | Mosaic Technologies | Diagnostics based on dna duplex repair |
| AU5171696A (en) | 1995-02-27 | 1996-09-18 | Ely Michael Rabani | Device, compounds, algorithms, and methods of molecular characterization and manipulation with molecular parallelism |
| CA2218188A1 (en) | 1995-04-11 | 1996-10-17 | Trustees Of Boston University | Solid phase sequencing of biopolymers |
| DE19515552A1 (de) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Europ Lab Molekularbiolog | Simultane Sequenzierung von Nukleinsäuren |
| AU5797696A (en) | 1995-05-19 | 1996-11-29 | Ely Michael Rabani | Parallel multiplex polynucleotide sequencing |
| US5753439A (en) * | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
| US5690894A (en) | 1995-05-23 | 1997-11-25 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
| AT402203B (de) * | 1995-06-13 | 1997-03-25 | Himmler Gottfried Dipl Ing Dr | Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren |
| FR2737223B1 (fr) | 1995-07-24 | 1997-09-12 | Bio Merieux | Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres |
| WO1997019193A2 (en) | 1995-11-21 | 1997-05-29 | Yale University | Unimolecular segment amplification and detection |
| US5955268A (en) | 1996-04-26 | 1999-09-21 | Abbott Laboratories | Method and reagent for detecting multiple nucleic acid sequences in a test sample |
| US6203978B1 (en) | 1996-05-31 | 2001-03-20 | Du Vergier Ltd. | Capture of single stranded nucleic acids |
| US5939291A (en) | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Sarnoff Corporation | Microfluidic method for nucleic acid amplification |
| US5837466A (en) * | 1996-12-16 | 1998-11-17 | Vysis, Inc. | Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples |
| EP2327797B1 (en) | 1997-04-01 | 2015-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Method of nucleic acid sequencing |
| EP1498494A3 (en) | 1997-04-01 | 2007-06-20 | Solexa Ltd. | Method of nucleic acid sequencing |
| WO1998045474A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Innogenetics N.V. | Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions |
| US6235471B1 (en) * | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
| ES2283936T3 (es) | 1997-07-07 | 2007-11-01 | Medical Research Council | Procedimiento de clasificacion in vitro. |
| US6326489B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| US6124120A (en) | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
| US6511803B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| EP1032705B1 (en) * | 1997-10-30 | 2011-12-14 | Cold Spring Harbor Laboratory | Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing dna |
| US6054276A (en) * | 1998-02-23 | 2000-04-25 | Macevicz; Stephen C. | DNA restriction site mapping |
| US6248558B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity |
| WO2000004193A1 (en) | 1998-07-20 | 2000-01-27 | Yale University | Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers |
| AR021833A1 (es) * | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| CA2345441A1 (en) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Affymetrix, Inc. | Complexity management and analysis of genomic dna |
| AU2410500A (en) | 1999-01-11 | 2000-08-01 | President And Fellows Of Harvard College | Isothermal amplification of dna |
| GB9902970D0 (en) * | 1999-02-11 | 1999-03-31 | Zeneca Ltd | Novel matrix |
| US6300070B1 (en) * | 1999-06-04 | 2001-10-09 | Mosaic Technologies, Inc. | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
-
2001
- 2001-12-06 AR ARP010105678A patent/AR031640A1/es unknown
- 2001-12-07 CZ CZ20031582A patent/CZ20031582A3/cs unknown
- 2001-12-07 EE EEP200300256A patent/EE200300256A/xx unknown
- 2001-12-07 MX MXPA03005078A patent/MXPA03005078A/es unknown
- 2001-12-07 IL IL15631101A patent/IL156311A0/xx unknown
- 2001-12-07 US US10/433,965 patent/US7790418B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 CN CNA018225373A patent/CN1489632A/zh active Pending
- 2001-12-07 EP EP01999663A patent/EP1339877A1/en not_active Withdrawn
- 2001-12-07 ZA ZA200304102A patent/ZA200304102B/en unknown
- 2001-12-07 CA CA002430369A patent/CA2430369A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-07 AU AU2002219161A patent/AU2002219161A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-07 KR KR10-2003-7007646A patent/KR20030055343A/ko not_active Withdrawn
- 2001-12-07 EA EA200300647A patent/EA200300647A1/ru unknown
- 2001-12-07 WO PCT/EP2001/014369 patent/WO2002046456A1/en not_active Ceased
- 2001-12-07 JP JP2002548173A patent/JP2004524012A/ja active Pending
- 2001-12-07 SK SK695-2003A patent/SK6952003A3/sk unknown
- 2001-12-07 BR BR0116033-8A patent/BR0116033A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-12-07 PL PL01363742A patent/PL363742A1/xx unknown
- 2001-12-07 HU HU0302803A patent/HUP0302803A2/hu unknown
-
2003
- 2003-05-28 NO NO20032455A patent/NO20032455L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-05-30 BG BG107861A patent/BG107861A/xx unknown
-
2010
- 2010-05-05 US US12/774,126 patent/US7972820B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EE200300256A (et) | 2003-08-15 |
| IL156311A0 (en) | 2004-01-04 |
| US7790418B2 (en) | 2010-09-07 |
| AR031640A1 (es) | 2003-09-24 |
| WO2002046456A1 (en) | 2002-06-13 |
| BR0116033A (pt) | 2003-10-07 |
| AU2002219161A1 (en) | 2002-06-18 |
| ZA200304102B (en) | 2004-06-23 |
| US7972820B2 (en) | 2011-07-05 |
| SK6952003A3 (en) | 2003-09-11 |
| CN1489632A (zh) | 2004-04-14 |
| JP2004524012A (ja) | 2004-08-12 |
| HUP0302803A2 (hu) | 2003-11-28 |
| BG107861A (en) | 2004-07-30 |
| NO20032455D0 (no) | 2003-05-28 |
| NO20032455L (no) | 2003-08-05 |
| CA2430369A1 (en) | 2002-06-13 |
| US20040096853A1 (en) | 2004-05-20 |
| PL363742A1 (en) | 2004-11-29 |
| MXPA03005078A (es) | 2003-09-05 |
| EA200300647A1 (ru) | 2003-10-30 |
| US20110008781A1 (en) | 2011-01-13 |
| KR20030055343A (ko) | 2003-07-02 |
| EP1339877A1 (en) | 2003-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20031582A3 (cs) | Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu | |
| JP5806213B2 (ja) | 核酸の特異的解析のためのプローブ | |
| AU771073B2 (en) | Methods of nucleic acid amplification and sequencing | |
| US20080274904A1 (en) | Method of target enrichment | |
| US20070141604A1 (en) | Method of target enrichment | |
| US20100222232A1 (en) | Enrichment and sequence analysis of genomic regions | |
| KR20140024378A (ko) | 조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출을 위한 방법 및 그 방법의 생성물 | |
| US20230175047A1 (en) | Array and method for detecting spatial information of nucleic acids | |
| JP2013535986A (ja) | 核酸の捕捉法および配列決定法 | |
| JP2006508677A (ja) | 遺伝子発現のオリゴヌクレオチド誘導分析 | |
| JP4731081B2 (ja) | 核酸を選択的に単離するための方法 | |
| HK1184831A (en) | Methods for nucleic acid capture and sequencing | |
| JP2003061656A (ja) | 標的核酸の検出法及びキット |