CN115243792A - 流通池及其制造和使用方法 - Google Patents

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D·I·弗雷里希斯
J·S·阿尔贝尼
L·德尼茨
E·古铁雷斯
A·奥利芬特
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Abstract

一种流通池，其包括(a)插置在第一基板与第二基板之间的垫圈，其中所述垫圈、所述第一基板和所述第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的，其中所述垫圈在所述第一基板上具有界定用于容纳所述水性液体的通道的覆盖区；(b)位于所述垫圈中的通孔，所述通孔包含将所述第一基板粘结到所述第二基板的固化液体粘合剂，其中所述通孔中的所述固化液体粘合剂通过所述垫圈与所述通道分离；以及(c)将所述通道连接到所述流通池的外部的通道端口，其中所述通道端口对于所述水性液体是可渗透的。

Description

流通池及其制造和使用方法
本申请基于2020年2月4日提交的美国临时申请号62/969,845并要求该临时申请的权益，该临时申请以引用方式并入本文。
背景技术
本公开整体涉及分析化学和生物学，并且对用于诸如核酸序列分析的分析方法的流通池具有特定的适用性。
流通池是现代分析化学或生物学实验室中的多步反应的便利容器。流通池可包含固定在腔室内的目标分析物(例如，细胞、蛋白质或核酸)，其中不同的液体试剂可以流过腔室，并且其中腔室被构造成便于目标分析物的检测。使不同的试剂以有序的顺序流过流通池以接触固定的靶标可控制可能发生的生化反应的性质。
某些新一代核酸测序技术已被自动化以采用流通池，其中试剂穿过固定化核酸的表面附着阵列的流动允许以循环方式进行的方便且有效的试剂交换。例如，经由发光显微术技术观察流通池以检测指示其序列的固定化核酸特征的变化。流通池通常是一次性的，因为其与待检测的分析物直接接触，并且甚至来自先前程序的少量分析物残留也可能导致错误的结果。对于许多程序，核酸测序是示例性的，流通池被构造用于高精度检测。在流通池制造或设计中，即使相对小的偏差也会不利地影响分析结果的质量。
因此，需要这样的流通池及其制造方法，其足够精确以支持高精度检测，但足够有效以在支持一次性使用的水平上限制成本。本发明满足了这一需求并且还提供了相关的优点。
发明内容
本公开提供了一种流通池，该流通池任选地包括(a)插置在第一基板与第二基板之间的垫圈，其中垫圈、第一基板和第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的，其中垫圈在第一基板上具有界定用于容纳水性液体的通道的覆盖区；(b)位于垫圈中的通孔，该通孔包含将第一基板粘结到第二基板的固化液体粘合剂，其中通孔中的固化液体粘合剂通过垫圈与通道分离；以及(c)将通道连接到流通池外部的通道端口，其中通道端口对于水性液体是可渗透的。
本公开还提供了一种制造流通池的方法。该方法可包括以下步骤：(a)将垫圈插置在第一基板与第二基板之间以界定用于容纳水性液体的通道，其中垫圈、第一基板和第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的；(b)将液体粘合剂递送到垫圈中的通孔；以及(c)允许液体粘合剂将第一基板粘结到第二基板，其中液体粘合剂通过垫圈与通道分离。
在附图和以下描述中阐述了本文所述的主题的一个或多个变型的细节。根据说明书和附图以及权利要求书，该主题的其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A示出了组装的流通池100的透视图。
图1B示出了组装的流通池100的顶视图。
图2A示出了流通池200的分解图。
图2B示出了流通池300的分解图。
图3A示出了组装的流通池500的顶视图。
图3B示出了组装的流通池500的透视图。
图3C示出了流通池500的分解图。
图3D示出了组装的流通池500的剖面。
图4A示出了流通池600的透视图。
图4B示出了流通池600的分解图。
图5A示出了将粘附材料粘结到非粘附材料的粘合铆钉。
图5B示出了将两种非粘附材料粘结在一起的粘合铆钉。
图6示出了安装在光学检测系统上的流通池。
图7A示出了流体连接器的顶部透视图。
图7B示出了流体连接器的侧视图。
图7C示出了流体连接器在与流通池的容器接合之前的透视图。
图7D示出了与流通池的容器接合的流体连接器的剖面。
图7E示出了流体连接器和连接到流通池的端口的管的剖面。
图8A示出了附接到管的粘合铆钉。
图8B示出了流体连接器、管和粘合铆钉的分解图。
图8C示出了组装的流体连接器的透视图。
图9A示出了组装的流通池700的顶视图。
图9B示出了在组装的流通池中被泡沫置换的液体的照片。
图10示出了具有发光标记物的流通池的顶视图。
图11A示出了流通池中的发光掺杂介质的剖面。
图11B示出了由发光掺杂介质在一个层上染色的流通池的剖面。
图11C示出了由发光掺杂介质在多个层上染色的流通池的剖面。
图11D示出了具有发光掺杂垫圈的流通池的剖面。
图12A示出了具有热膨胀接头的流通池的顶视图。
图12A示出了流通池中的热膨胀接头的透视图。
图13A示出了流通池的双端口的顶部透视图。
图13B示出了流通池的双端口的底部透视图。
图14A和图14B示出了移液管适配器的透视图，该移液管适配器被构造成便于将核酸文库起始材料引入流通池中。
图15A和图15B示出了移液管适配器的另一个实施方案。
图16示出了具有管道包覆件的流体连接器的底部区域。
具体实施方式
本公开提供了可用于多种分析或制备方法中的任一种方法的流通池。流通池提供对分析物的高准确度检测和处理。高准确度检测由流通池的精确尺寸支持，诸如通过其检测流通池中的分析物的表面的均匀平坦度和厚度。由于稳健的机械特性，包括例如承受高内部流体压力的能力和方便且可靠地连接到将试剂递送到流通池的流体部件的能力，可以实现分析物的高准确度处理。
本公开还提供了用于制造流通池的方法。例如，提供了一种使用粘附到两个基板的液体粘合剂来粘结两个基板之间的垫圈的方法。使两个基板(例如，光学透明的玻璃或塑料)与插置的垫圈层(例如，压敏粘合剂或橡胶膜)接触。垫圈层界定用于分析物的通道，并且垫圈层还可包括穿过垫圈的一个或多个通孔。这些通孔可通过穿过一个或两个基板中的通孔端口注入或直接注入到垫圈材料中而填充有液体粘合剂。在一些构型中，由于通孔中的液体粘合剂和垫圈与基板的界面处的粘合剂的组合，垫圈粘结到基板。
流通池的液体粘合剂粘结提供了一种用于粘结两个基板的模块化方法，尤其是在形成微流体通道时。这种用于粘结的模块化方法提供了将流通池设计的几何特性与流通池的机械特性分开的优点。垫圈层可以限定通道几何形状(例如，通道长度、宽度和高度)，并且液体粘合剂可以提供机械强度。这种模块化允许快速成型和简单制造。
流通池的液体粘合剂粘结还允许多个层粘结在一起，从而包含不同的材料(例如，玻璃和塑料)。此外，可通过在垫圈中构造通孔以包含可检测的液体粘合剂或其他可检测的材料来形成基准点。例如，一个或多个通孔可包含发光粘合剂或其他发光材料。可使用有效的制造技术精确地控制通孔的形状和通孔相对于通道中待检测分析物的位点的位置。因此，通孔提供了可在分析程序期间依赖的基准点以记录通道中的分析物位点。使用用于检测流通池的检测通道中的发光分析物的相同检测硬件，可以方便地检测具有发光通孔的流通池基准点。例如，可使用相同的激发波长和相同的发射波长来实现通孔中的材料的发光和检测通道中的分析物的发光。更具体地，相同的激发源可用于基准点和分析物。另选地或除此之外，相同的发射检测器可用于基准点和分析物。
除非另外指明，否则本文所用的术语应被理解为具有其在相关领域中的普通含义。本文所用的若干术语及其含义如下所述。
如本文所用，术语“阵列”是指附接到一个或多个固体载体的分子群体，使得一个位点处的分子可与其他位点处的分子区分开。阵列可包含各自位于固体载体上的不同可寻址位点处的不同分子。另选地，阵列可包括单独的固体载体，所述固体载体各自用作携带不同分子的位点，其中可根据固体载体在固体载体所附接的表面上的位置或根据固体载体在液体诸如流体流中的位置来识别不同的分子。阵列的分子可以是例如蛋白质、核苷酸、核酸、核酸引物、核酸模板、引发模板核酸、或核酸酶如聚合酶、连接酶、核酸外切酶或它们的组合。
如本文所用，术语“附接”是指两个物件彼此接合、紧固、粘附、连接、粘结或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到固体载体上。类似地，两个核酸可通过共价(例如，磷酸二酯)键或非共价键(例如，两个核酸的碱基之间的氢键)彼此附接。共价键的特征在于原子之间电子对的共享。非共价键是不涉及电子对共享的化学键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文所用，术语“封闭部分”在相对于核苷酸使用时意指在核酸聚合反应期间抑制或阻止核苷酸的3'氧与下一个正确核苷酸形成共价键的核苷酸部分。示例性封闭部分是可逆终止子部分。“可逆终止子”核苷酸的封闭部分可以从核苷酸类似物中除去或以其他方式修饰，以允许核苷酸的3'-氧共价连接到下一个正确核苷酸。该过程被称为将核苷酸类似物“去封闭”。这种封闭部分在本文中称为“可逆终止子部分”。示例性可逆终止子部分在美国专利号7,427,673、7,414,116、7,057,026、7,544,794或8,034,923、或PCT公布WO 91/06678或WO 07/123744中有所阐述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。具有封闭部分或可逆终止子部分的核苷酸可位于核酸的3'端，诸如引物，或者可以是未共价附接到核酸的单体。
如本文所用，术语“粘结”在相对于粘合剂使用时意指将粘合剂附接到基板的过程或结果。附接可经由机械方式或化学方式进行。示例性机械附接方式包括但不限于粘合剂渗入基板的小孔。示例性化学方式包括在粘合剂与基板之间形成共价键，在粘合剂与基板之间形成静电力，在粘合剂与基板之间形成范德华力，以及在粘合剂与基板之间形成氢键。
如本文所用，术语“催化金属离子”是指通过聚合酶促进核酸(例如，引物)的3'-氧与引入的核苷酸的磷酸酯之间的磷酸二酯键形成的金属离子。“二价催化金属阳离子”是化合价为二的催化金属离子。催化金属离子可以稳定聚合酶、核苷酸和引发模板核酸之间的复合物形成的浓度存在，在不发生磷酸二酯键形成的范围内称为金属离子的非催化浓度。金属离子的催化浓度是指足以使聚合酶催化核酸(例如，引物)的3'-氧与引入的核苷酸的磷酸酯部分之间的反应的金属离子的量。示例性催化金属离子包括Mg2+和Mn2+。
如本文所用，术语“通道”意指基板中或基板上的引导流体流动的通道。通道可具有基板内的管的形式。另选地，通道可具有基板上的沟或凹槽的形式。
术语“包括”在本文中旨在是开放式的，不仅包括所列举的要素，而且还涵盖任何附加的要素。
如本文所用，术语“连续”在相对于将两个基板粘结在一起的粘合剂使用时意指在两个基板之间存在不间断的粘合剂路径。粘合剂将被认为在两个基板之间形成连续粘结，只要在基板之间存在至少一个不间断的粘合剂路径。
如本文所用，术语“每个”在相对于项目集合使用时旨在标识该集合中的单个项目，但不必指代该集合中的每一个项目。如果明确的公开内容或上下文清楚地另外指明，则可出现例外。
如本文所用，“平衡”是指由于反向力的相等作用而产生的平衡状态。例如，当三元复合物的形成速率与其解离速率平衡时，在引发模板核酸、聚合酶和同源核苷酸之间形成的三元复合物与未结合的聚合酶和未结合的核苷酸平衡。在这种条件下，可逆结合反应停止以改变其产物(例如，三元复合物)与反应物(例如，聚合酶、核苷酸和核酸)的净比率。如果正向反应(例如，三元复合物形成)的速率与反向反应(例如，三元复合物解离)的速率平衡，则产物与反应物的比率没有净变化。
如本文所用，术语“外源性”在相对于分子的部分使用时意指不存在于分子的天然类似物中的化学部分。例如，核苷酸的外源性标记是不存在于天然存在的核苷酸上的标记。类似地，存在于聚合酶上的外源性标记不存在于其天然环境中的聚合酶上。
如本文所用，术语“延伸”在相对于核酸使用时意指将至少一个核苷酸添加到核酸的3'端的过程。术语“聚合酶延伸”在相对于核酸使用时意指将至少一个核苷酸添加到核酸的3’端的聚合酶催化过程。据称通过延伸添加到核酸中的核苷酸或寡核苷酸被掺入核酸中。因此，术语“掺入”可用于指通过磷酸二酯键的形成将核苷酸或寡核苷酸连接到核酸的3'端的过程。
如本文所用，术语“可延伸的”在相对于核苷酸使用时意指核苷酸在3'位置处具有氧或羟基部分，并且如果掺入核酸中时能够与下一个正确核苷酸形成共价键。可延伸的核苷酸可位于引物的3’位置处，或者它可以是单体核苷酸。可延伸的核苷酸将缺少封闭部分，诸如可逆终止子部分。
如本文所用，术语“游离”或“未结合”在相对于能够在结合反应中形成复合物的组分使用时是指不处于结合状态的组分。例如，平衡结合反应可包括产物(例如，三元复合物)和未结合在产物中的反应物(例如，游离聚合酶、游离核酸或游离核苷酸)。
如本文所用，“流通池”是包括将流体引导至检测区或反应区的一个或多个通道的反应室。检测区可联接到检测器，使得可以观察到反应室中发生的反应。例如，流通池可含有束缚于固相载体的引发模板核酸分子，将核苷酸和辅助试剂反复施加到其上并洗去。流通池可包含透明材料，该透明材料允许样品在期望的反应发生后成像。例如，流通池可包括含有小流体通道的玻璃或塑料载玻片，聚合酶、dNTP和缓冲液可通过小流体通道泵送。通道内的玻璃或塑料可以用待测序的一种或多种引发模板核酸分子装饰。
如本文所用，术语“流体”是指能够流动并改变其形状以填充容器的液体或气体。在许多情况下，当流体受到趋向于改变其形状的力的作用时，该流体将以稳定的速率改变形状。
如本文所用，术语“抑制金属离子”是指当存在聚合酶时抑制将核苷酸化学掺入引物中所需的磷酸二酯键形成的金属离子。抑制金属离子可以与聚合酶相互作用，例如，经由与催化金属离子相比的竞争性结合。“二价抑制金属离子”是化合价为二的抑制金属离子。二价抑制金属离子的实例包括但不限于Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Sr2+。三价Eu3+和Tb3+离子是化合价为三的抑制金属离子。
如本文所用，术语“标记”是指提供可检测特征的分子或其部分。可检测特征可以是例如光信号，诸如辐射的吸收、发光或荧光发射、发光或荧光寿命、发光或荧光偏振等；瑞利和/或米氏散射；对配体或受体的结合亲和力；磁特性；电特性；电荷；质量；放射性等。示例性标记包括但不限于荧光团、发光体、发色团、纳米粒子(例如，金、银、碳纳米管)、重原子、放射性同位素、质量标记、电荷标记、自旋标记、受体、配体等。
如本文所用，术语“液体粘合剂”意指粘结到基板上的物质，该物质在施加到基板上时处于流体状态。该物质在被活化以粘附到基板上之后不需要保持流体状态。因此，液体粘合剂在反应以粘结到基板上之后可以处于非流体状态(例如，“硬化液体粘合剂”或“固化液体粘合剂”)。
如本文所用，术语“下一个正确核苷酸”是指将在引物的3'端结合和/或掺入以与模板链中与引物杂交的碱基互补的核苷酸类型。模板链中的碱基被称为“下一个碱基”并且紧接模板中与引物的3'端杂交的碱基的5'。下一个正确核苷酸可被称为下一个碱基的“同源物”，反之亦然。在三元复合物或双链核酸中彼此特异性相互作用的同源核苷酸被称为彼此“配对”。具有不与下一个模板碱基互补的碱基的核苷酸被称为“不正确”、“错配”或“非同源”核苷酸。
如本文所用，术语“核苷酸”可用于指天然核苷酸或其类似物。实例包括但不限于核苷三磷酸(NTP)诸如核糖核苷三磷酸(rNTP)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、外源性标记的核苷酸或其非天然类似物诸如双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)或可逆终止的核苷三磷酸(rtNTP)。
如本文所用，术语“聚合酶”可用于指核酸合成酶，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引物酶和转移酶。通常，聚合酶具有一个或多个可发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的活性位点。聚合酶可以催化核苷酸聚合到双链核酸分子的第一链的3'端。例如，聚合酶经由磷酸二酯键催化将下一个正确核苷酸添加到双链核酸分子的第一链的3'氧基团，从而将核苷酸共价掺入双链核酸分子的第一链。任选地，聚合酶不需要能够在本文所述方法中使用的一种或多种条件下进行核苷酸掺入。例如，突变聚合酶能够形成三元复合物，但不能催化核苷酸掺入。流体中聚合酶的量可以活性单位定量。例如，聚合酶单位可以等于在特定温度下在30分钟内催化10nmol dNTP掺入DNA中的酶的量。例如，热稳定聚合酶可以在75℃下测量，而热不稳定聚合酶可以在37℃下测量。
如本文所用，术语“引发模板核酸”是指具有双链区域的核酸杂交体，使得一条链具有可通过聚合酶延伸的3'端。两条链可以是连续核酸分子(例如，发夹结构)的一部分，或者两条链可以是彼此不共价连接的可分离分子。
如本文所用，术语“引物”是指具有在模板序列处或附近与核酸序列结合的序列的核酸。一般来讲，引物以允许模板复制的构型结合，例如，经由引物的聚合酶延伸。引物可以是与核酸分子的第二部分结合的核酸分子的第一部分，第一部分是引物序列，并且第二部分是引物结合序列(例如，发夹引物)。另选地，引物可以是与具有模板序列(例如，可解离引物)的第二核酸分子结合的第一核酸分子。引物可以由DNA、RNA或其类似物组成。引物可以在3'端封闭，或者它可以是可延伸的。
如本文所用，术语“位点”在相对于阵列使用时意指阵列中存在特定分子的位置。位点可以仅含有单个分子，或者它可含有相同种类的若干分子的群体(即，分子的系综)。另选地，位点可含有不同种类的分子的群体(例如，不同模板序列的群体)。阵列的位点通常是离散的。离散位点可以是连续的，或者它们彼此之间可具有间隔。
如本文所用，术语“基板”是指不溶于水性液体的固体载体。固体载体可以是无孔的或多孔的。固体载体可任选地能够吸收液体(例如，由于多孔性)，但通常将足够刚性，使得固体载体在吸收液体时基本上不溶胀，并且在通过干燥去除液体时基本上不收缩。无孔基板对于液体或气体通常是不可渗透的。示例性基板包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。
如本文所用，术语“表面”是指固体载体的与流体或另一固体载体接触的一部分。流体可以是气体或液体。表面可以是基本上平坦的或平面的。另选地，表面可以是圆形的或波状的。可包括在表面上的示例性轮廓是凹孔、凹陷部、柱、脊、通道等。
如本文所用，术语“三元复合物”是指聚合酶、双链核酸和核苷酸之间的分子间缔合。通常，聚合酶促进下一个正确核苷酸与引发核酸的模板链之间的相互作用。下一个正确核苷酸可经由沃森-克里克氢键与模板链相互作用。术语“稳定的三元复合物”意指具有促进的或延长的存在的三元复合物或其破坏被抑制的三元复合物。一般来讲，三元复合物的稳定化防止三元复合物的核苷酸组分共价掺入三元复合物的引发核酸组分中。
如本文所用，术语“类型”或“种类”用于标识共享相同化学结构的分子。例如，核苷酸的混合物可含有若干dCTP分子。dCTP分子应理解为彼此是相同类型(或种类)的核苷酸，但与dATP、dGTP、dTTP等相比是不同类型(或种类)的核苷酸。类似地，具有相同核苷酸序列的单个DNA分子是相同类型(或种类)的DNA，而具有不同序列的DNA分子是不同类型(或种类)的DNA。术语“类型”或“种类”也可标识共享相同化学结构的部分。例如，模板核酸中的胞嘧啶碱基应理解为具有彼此相同类型(或种类)的碱基，而与它们在模板序列中的位置无关。
如本文所用，术语“通孔”在相对于垫圈或其他基板使用时意指基板中或穿过基板的空隙。穿过基板的空隙可具有圆形、长方形、椭圆形、卵形、三角形、正方形、矩形或多边形(例如，其中边数大于4)的剖面。剖面可以是对称的(例如，旋转对称、反射对称或平移对称)、不对称的或细长的(例如，形成通道)。通孔可以提供从垫圈的一侧上的基板到垫圈的另一侧(例如，相对侧)上的基板的连续通道。
根据上述定义，可以理解下文阐述的和权利要求中列举的实施方案。
本公开提供了可用于多种分析或制备用途中的任一种用途的流通池。本文所述的流通池的特征可被修改以适合特定用途。流通池的若干特征将在本文中在特定用途的上下文中举例说明。然而，本领域的技术人员应当理解，示例的流通池、更具体地示例的特征可用于除明确举例说明的那些之外的目的。
流通池的一些有用特征通过图1A的透视图和图1B的顶视图所示的流通池进行了展示。流通池可包括检测通道，其中可以观察感兴趣的分析反应。图1A和图1B所示的流通池包括两个通道101和102。通道由夹在两个光学透明基板110和111之间的间隔件105中的空隙形成。因此，通道中的分析物可通过基板进行光学检测。流体可经由通道端口120和121进入和离开通道101，并且流体可经由通道端口123和124进入和离开通道102。通道端口120和124容纳在容器125中，并且通道端口121和123容纳在容器126中。容器125和126被构造成与适配器1000(参见图7)配合，该适配器将流通池通道连接到流体递送设备。容器125和126被进一步构造成与移液管适配器1105配合，该移液管适配器被构造成便于将核酸文库起始材料引入流通池中，如下文参考图14A至图14B进一步所述。
流通池还包括位于与通道101和102不同的z平面中的两个翼部130和131。所述翼部分别包括孔132和133，这些孔被构造成接合光学检测装置的滑动架上的柱(参见图10)。可沿着其长度(即，沿着x维度)扫描细长通道以获得通道的图像。在一些构型中，通过在y维度上步进流通池，然后沿x重复扫描以获取下一个条带，来对通道的多个条带成像。
本公开的流通池可具有用于将流体转移到通道中的一个或多个开口。在特定构型中，第一开口可用作流体的入口，并且第二开口可用作流体的出口。这通过通道端口120和121来举例说明，所述通道端口可用作通道101的入口端口或出口端口。另选地，流通池可具有既用作入口又用作出口的单个开口。流体可以是液体、气体或混合相流体(例如，泡沫、乳液或颗粒浆料)。可用于产生和操纵混合相流体的示例性设备和方法在美国专利申请序列号16/700,422中有所阐述，该专利申请以引用方式并入本文。
分析反应可以在本公开的流通池内的本体溶液中进行。例如，可以将两种溶液混合，并且可以在检测通道中观察混合物的产物。另选地，可以在检测通道内的固体载体上进行分析反应。例如，附着于感兴趣的分析物的固体载体可以存在于通道101或102中，试剂溶液可以流过固体载体，并且可以在固体载体上观察所得反应。流通池允许通过使溶液经过用作入口的通道端口进入检测通道并经由用作出口开口的通道端口离开内部来进行方便的流体操纵。检测通道还具有观察区域(例如，观察面积或观察体积)，例如，通过光学透明窗口(例如，光学透明基板110和111)可见。特别有用的流通池具有窗口，该窗口对于用于电磁光谱的UV、VIS或IR区域中的发光检测的激发辐射和发射辐射是透明的。
如在图1和本文的其他图中所示例，流通池可具有一个或多个检测通道。一个或多个检测通道可以对于大气(或其他周围环境，诸如直接围绕流通池的局部环境)是封闭的，例如在流通池结构内部形成管或隧道。流通池通道的形状可以来源于基板(例如，基板110和111)的形状和基板之间使用的间隔件(例如，间隔件105)中的空隙区域的形状。间隔件可以是用于形成流通池的另一基板的组成部分，如图2A所示的流通池200所示例。另选地，间隔件可以是可与其他基板分开的垫圈，如图2B中的流通池300所示例。
流通池200(图2A)包括具有波状表面的顶部基板210，该波状表面具有用于通道201和202的切口。表面上的轮廓用作界定通道的x和y维度的间隔件。顶部基板210可结合到底部基板211以形成具有封闭剖面的通道。可使用基板210和211的材料之间的粘合剂或直接化学粘结、熔化一种或两种材料以将它们熔合在一起等来实现结合。可通过通道端口220和221进入通道201，并且可通过通道端口223和224进入通道202。端口容纳在容器225和226中。流通池200包括翼部230和231，所述翼部分别包括用于与扫描架上的柱相互作用的孔232和233。
流通池300(图2B)包括通过将顶部基板310和底部基板311与垫圈305配合而形成的通道301和302。可通过通道端口320和321进入通道301，并且可通过通道端口323和324进入通道302。端口容纳在容器325和326中。流通池300包括翼部330和331，所述翼部分别包括用于与扫描架上的柱相互作用的孔332和333。
如图1和图2所示例，通道的深度(在z维度上)由间隔件中的切口的厚度确定，无论间隔件是基板(例如，基板210)还是可分离垫圈(例如，垫圈305)的特征部。垫圈或其他间隔件可具有特定用途所需的任何厚度，包括例如至少100μm、1mm、1cm、10cm或更大的厚度。另选地或除此之外，垫圈或其他间隔件可具有至多10cm、1cm、1mm或100μm的厚度。使用液体粘合剂制造的流通池的特别优点是能够承受高正压。高正压可用于使流体流过具有相对小的通道厚度的流通池。因此，垫圈或其他间隔件可具有至多100μm、80μm、50μm、30μm、10μm或更小的厚度。另选地或除此之外，垫圈或其他间隔件可具有至少10μm、30μm、50μm、80μm或100μm的厚度。
本公开的流通池中的检测通道的xy剖面面积可为至少约1μm2、10μm2、100μm2、1mm2、10mm2或100mm2或更大。另选地或除此之外，检测通道的xy剖面面积可为至多约100mm2、10mm2、1mm2、100μm2、10μm2、1μm2或更小。流通池中的检测通道的体积可为至少约1nL、10nL、100nL、1μL、10μL、100μL、1mL或更大。另选地或除此之外，流通池中的检测通道的体积可为至多约1mL、100μL、10μL、1μL、100nL、10nL、1nL或更小。流通池通道的长度可被选择为提供期望的体积、表面积等。例如，流通池通道的长度可为至少1mm、1cm、10cm或更长。另选地或除此之外，流通池通道的长度可为至多10cm、1cm或1mm。
由于形成通道的基板(在y上)和间隔件(在z上)的平坦表面，图1和图2中示例的检测通道具有矩形yz剖面形状。流通池通道可具有多种yz剖面形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、多面体或其他封闭形状。检测通道的yz剖面在x上的长度上可以是均匀的(即，相等的面积和形状)。例如，具有在通道长度上均匀的圆形剖面的检测通道将具有圆柱形形状，具有在通道长度上均匀的矩形剖面的检测通道将具有长方体形状，并且具有在通道长度上均匀的多面体剖面的检测通道将具有棱柱形状。检测通道的剖面不必在面积上是均匀的。例如，具有在通道长度上渐增或渐减的圆形剖面面积的检测通道将具有圆锥形状，并且具有在通道长度上渐增或渐减的正方形剖面面积的检测通道将具有角锥形状。
流通池通道还可包括在其中检测分析物的区域。流体可经由入口流入流通池，然后通过该区域，再流出出口以离开流通池。作为例示性实例，可通过流通池中的窗口来检查或检测该区域。例如，外部光学检测器可通过流通池的光学透明窗口(诸如由基板110、111、210、211、310或311形成的窗口)观察流通池的内部区域。可通过除光学技术之外的技术来检查或观察流通池通道的一个或多个区域，包括例如本文所述的检测技术。因此，流通池可具有将信号从流通池的区域传输到适当的检测器设备的传输表面。应当理解，流通池不需要被构造用于检测分析物。例如，流通池可以提供用于进行反应的腔室，并且反应的产物可以流出流通池以进行后续的使用或检测。因此，流通池不需要具有被构造用于传输分析信号的光学透明窗口或其他表面。
本公开提供了一种流通池，该流通池任选地包括(a)插置在第一基板与第二基板之间的垫圈，其中垫圈、第一基板和第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的，其中垫圈在第一基板上具有界定用于容纳水性液体的通道的覆盖区；(b)位于垫圈中的通孔，该通孔包含将第一基板粘结到第二基板的固化液体粘合剂，其中通孔中的固化液体粘合剂通过垫圈与通道分离；以及(c)将通道连接到流通池外部的通道端口，其中通道端口对于水性液体是可渗透的。
本公开还提供了一种制造流通池的方法。该方法可包括以下步骤：(a)将垫圈插置在第一基板与第二基板之间以界定用于容纳水性液体的通道，其中垫圈、第一基板和第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的；(b)将液体粘合剂递送到垫圈中的通孔；以及(c)允许液体粘合剂将第一基板粘结到第二基板，其中液体粘合剂通过垫圈与通道分离。
使用液体粘合剂制成的示例性流通池示于图3中。图3A示出了组装的流通池500的顶视图，而图3B示出了其透视图。流通池500的分解图示于图3C中，并且流通池500的剖面示于图3D中。流通池500包括主体，该主体包括插置在基板510与基板511之间的垫圈505。垫圈505包括界定通道501和502的两个切口区域。垫圈505可任选地在接触基板510和511的面上具有粘合剂。例如，垫圈505可包含压敏粘合剂(PSA)。垫圈505以及基板510和511对于水性液体是不可渗透的。一旦组装，通道501和502是流体密封的，除了在入口端口512至515处。基板510和511中的一者或两者可以是光学透明的，以提供对通道501和502的光学检测。在流通池500的实例中，垫圈的覆盖区在两个基板上是相同的，使得通道的两侧呈现相同形状的窗口。应当理解，两个基板上的覆盖区可以不同，使得通道的两侧呈现不同形状的窗口。垫圈505不需要是光学透明的，但是如果需要可以是光学透明的。
组装的流通池500包括通孔550，该通孔包含将基板510粘结到基板511上的固化液体粘合剂。如图3D的视图所示，通孔550中的固化液体粘合剂的厚度将等于垫圈505的厚度。液体粘合剂可通过通孔端口556或557递送到通孔550，所述通孔端口分别与通孔550中的弯管551和552接合。通孔550连续地环绕通道501并且也连续地环绕通道502。在xy平面中，通孔550具有形成围绕通道501和502中每一者的沟槽或通道的八字形外观。因此，固化液体粘合剂形成围绕通道501和502并增强其流体不渗透性的增强珠粒。通孔550通过垫圈505的带506与通道501隔开，并且通孔550通过垫圈505的带507与通道502隔开。带506和507防止液体粘合剂进入通道501和502，并且相反，防止通道中的流体接触液体粘合剂。这样，液体粘合剂不需要对于将在通道501和502中处理的流体或流体组分是惰性的。
翼部530和531附接到基板510的外表面(即，与基板510的内表面相对)。翼部530经由垫圈570和通孔571中的固化液体粘合剂附接到基板510。翼部531经由垫圈560和通孔561中的固化液体粘合剂附接到基板510。翼部530和531分别包括用于附接到扫描设备上的支架的孔532和533。翼部530包括容纳通道端口520和525的容器525。可通过包括端口520、垫圈570中的孔572和基板510中的孔515的路径进入通道501，并且也可通过包括端口521、垫圈560中的孔562和基板510中的孔512的路径进入通道501。可通过包括端口524、垫圈570中的孔573和基板510中的孔514的路径进入通道502，并且也可通过包括端口523、垫圈560中的孔563和基板510中的孔513的路径进入通道502。通孔571在垫圈570中形成围绕孔572和573的沟槽，以在翼部530与基板510之间形成流体密封。类似地，通孔561在垫圈560中形成围绕孔562和563的沟槽，以在翼部531与基板510之间形成流体密封。
如图4所示，翼部不是流通池的必需特征部。流通池600包括插入顶部基板610和底部基板611的垫圈605。垫圈605可以任选地粘附到顶部基板610和底部基板611中的一者或两者上。垫圈605中的切口限定通道601和602。通道601可通过端口612和615进入，而通道602可通过端口613和614进入。组装的流通池600包括通孔650，该通孔包含将基板610粘结到基板611上的固化液体粘合剂。通孔650中的固化液体粘合剂的厚度将等于垫圈605的厚度。液体粘合剂可通过通孔端口656或657递送到通孔650，所述通孔端口分别与通孔650中的弯管651和652接合。通孔650连续地环绕通道601并且也连续地环绕通道602。固化液体粘合剂形成围绕通道601和602并增强其流体不渗透性的增强珠粒。通孔650通过垫圈605的带606与通道601隔开，并且通孔650通过垫圈605的带607与通道602隔开。
多种基板中的任一种基板可用于流通池。例如，当流通池可能受到机械应力时，刚性材料可能特别有用。任选地，聚合物材料被成形为基本上刚性的构型。例如，材料可被成形为具有当用作流通池的平坦表面时抵抗挠曲的厚度。平坦基板是有用的，如本申请的附图所示例。然而，基板不必是平坦的，而是可具有由垫圈和/或其他一个或多个基板补全的其他形状以形成流通池通道。在特定构型中，基板由有助于例如在光谱的UV、VIS和/或IR区域中传输光信号的材料制成。材料也可根据其对将在流动池中使用的流体的惰性来进行选择。然而，在一些情况下，期望基板的表面的至少一部分对于特定的化学连接过程具有反应性。此类程序在本文中相对于将分析物或分析物阵列附接到基板上进行了举例说明。
可用于流通池基板的示例性材料包括但不限于玻璃、硼硅酸盐玻璃、硅烷化玻璃(例如，氨基硅烷、缩水甘油醚氧基硅烷或巯基硅烷)、硅、二氧化硅、金属、碳纤维、氮化硅、熔融二氧化硅、石英、陶瓷、丙烯酸、塑料或聚合物。特别有用的塑料或聚合物包括但不限于聚酰亚胺、聚丁烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)；苯乙烯-丁二烯共聚物(SBC)；聚丙烯、聚乙烯、环状烯烃共聚物(COC)；环烯烃聚合物(COP)；苯乙烯甲基丙烯酸甲酯(SMMA)；聚苯乙烯(PS)；聚碳酸酯(PC)；共聚酯；聚砜；尼龙；聚醚醚酮(PEEK)；丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)；Kapton和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。
对于使用两个基板的流通池，第一基板和第二基板可以由相同的材料制成。例如，两个基板都可以是玻璃，或者两个基板都可以是相同的塑料(例如，两个基板都可以是COP)。另选地，两个基板的材料可以彼此不同。例如，一个基板可以是玻璃，并且另一个基板可以是COP。一般来讲，优选的是选择具有相似热膨胀系数(CTE)的材料，以避免在粘结的流通池经历显著的温度变化时翘曲。然而，具有彼此不同的CTE的材料可通过使用如下文结合图12进一步详细阐述的热膨胀接头来适应。
用于流通池的垫圈或间隔件可以由多种材料中的任一种材料制成。有用的材料对于将在流通池中使用的流体可以是惰性的。用于垫圈的材料对于光信号可以是透明的，但对于流通池的某些用途不需要是透明的。对于许多用途，用于垫圈或间隔件的材料将是不可压缩的或非弹性的，由此当用作间隔件时，垫圈在两个基板之间保持固定的距离。用于垫圈的材料可有利地具有与用于流通池中的一个或多个其他基板的材料类似的CTE。这可以有利于在流通池经受显著的温度变化时避免翘曲或破裂。例如，垫圈或间隔件可包括粘附表面，以粘附到本文的流通池中使用的基板上。例如，垫圈可在与垫圈所粘结的一个或多个基板接合的表面上具有压敏粘合剂。
用于垫圈或间隔件的示例性材料包括但不限于上述用于基板的材料。特别有用的材料包括例如橡胶、聚四氟乙烯(例如，Teflon)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰亚胺、丙烯酸基粘合剂、硅基粘合剂、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、胶乳。弹性体可用作例如用相对刚性的材料形成紧密密封的垫圈。用于特定流通池的垫圈可以是与一个或两个基板相同的材料，或者另选地，垫圈可以是与基板不同的材料。
液体粘合剂可根据其与用作流通池中的基板的材料结合的能力来进行选择。对于其中液体粘合剂存在于连接两个基板的通孔中的流通池构型，粘合剂可粘结到两个基板以组装流通池。在这种构型中，粘合剂不需要粘结到垫圈上。然而，如果需要，液体粘合剂可根据其粘结到基板和垫圈的能力来进行选择。液体粘合剂可基于固化或凝固粘合剂的方法来进行选择。例如，当流通池的材料或内容物受到用于其他粘合剂的基于化学品或基于热的固化技术的不利影响时，UV固化粘合剂可以是有用的。低释气或甚至不存在释气可以是液体粘合剂的期望特征，例如，当使用真空将粘合剂吸入通孔中时，或者当通风不方便时。液体粘合剂也可以基于粘合剂的相容性、或载体溶剂的相容性、关于流通池或其内容物的结构或化学完整性来进行选择。在一些情况下，期望使用在固化后不膨胀或收缩的液体粘合剂。例如，经历小于10％或甚至小于1％膨胀或收缩的粘合剂可以是特别有用的。然而，在其他情况下，膨胀可能是期望的，例如，以帮助粘合剂侵入表面的轮廓。收缩可能是期望的，以在固化时后将基板拉在一起或避免由于液体粘合剂的体积而使基板翘曲。在一些构型中，低粘度对于液体粘合剂是期望的，因为这将通过允许粘合剂流入待粘附的基板的通孔或其他物理特征部中而促进粘合剂的递送。
有用的液体粘合剂包括但不限于环氧树脂、光固化粘合剂(例如，UV固化粘合剂)和热固化粘合剂。任选地，液体粘合剂可通过热处理(例如在烘箱中)、暴露于UV光或适于粘结粘合剂的其他处理来粘结。
如图3和图4的流通池所示，包含液体粘合剂的通孔可被构造为围绕包含流体的通道或其他空间的沟槽。这样，液体粘合剂在流通池中围绕感兴趣的特征部形成连续的珠粒。另选地，多个填充有液体粘合剂的通孔可定位在流通池的通道或其他特征部附近。这样，液体粘合剂可形成类似于粘合铆钉的一组离散的粘合剂紧固件。例如，多个填充有液体粘合剂的通孔可以围绕流通池通道，而不是图3所示的连续珠粒。
液体粘合铆钉不需要粘附到将彼此附着的所有材料上。相反，液体粘合剂可被固化以形成使用机械装置将两种或更多种材料保持在一起的固体材料。图5A示出了固化液体粘合铆钉11的剖面，该铆钉粘附到第一基板15上，但不一定粘附到第二基板10上。然而，液体粘合铆钉11通过粘附到基板15和提供与基板10的机械联接的组合将基板15连接到基板10。更具体地，液体粘合铆钉固化以具有粘附到基板15的表面17、相对无弹性的轴16以及接触基板10上的底座的头部18(在图5A的剖视图中示出为脊12和13)。铆钉11通过铆钉11与表面17的粘附、铆钉11的头部18在基板10的底座上的机械力以及固化液体粘合剂11抵抗拉伸或断裂的非弹性刚性的组合力将基板保持在一起。
图5B示出了固化液体粘合铆钉21的剖面，该铆钉不一定粘附到基板20或基板30上，但仍然经由机械力将两个基板附接在一起。更具体地，液体粘合铆钉固化以具有接触基板20上的底座的第一头部28(在图5B的剖视图中示出为脊22和23)、相对无弹性的轴26以及接触基板30上的底座的第二头部38(在图5B的剖视图中示出为脊32和33)。铆钉11通过铆钉21的头部28在基板20的底座上的机械力、固化液体粘合剂21抵抗拉伸或断裂的非弹性刚性以及铆钉21的头部38在基板30的底座上的机械力的组合力将基板保持在一起。
提供用于粘结两个部件的机械装置的粘合剂粘结的另一实例由图13A和图13B所示的双端口部件980提供。双端口部件980包括经由基座987彼此连接的两个端口983和993。端口983具有主要为圆柱形的主体，其在锥形区域981的窄端部处具有开口982。端口993具有类似的形状，主要为圆柱体的主体，其在锥形区域991的窄端部处具有开口992。每个端口的圆柱形外部被成形为与柔性管的内径互补，以在端口与管之间形成紧密配合。围绕每个端口的开口的圆锥形状提供了将端口插入管中的容易性。端口983和993由基座987将彼此保持在固定的取向和距离。基座987的下侧990以及端口983和993的下侧989和999分别具有可与流通池的顶部形成紧密密封的平坦形状。端口983的平坦下侧989围绕开口988，并且端口993的平坦下侧999围绕开口998。开口988和998可以与流通池中的孔对齐，并且平坦的围绕989和999可以与流通池的外表面形成紧密密封。这样，流体可以从管进入开口982，通过端口983的内部通道，离开开口988，并经由流通池的上基板中的孔进入流通池的通道。类似地，流体可以从管进入开口992，通过端口993的内部通道，离开开口998，并经由流通池的上基板中的孔进入流通池的通道。
通过形成于基板987中的凹孔986和997促进双端口部件980与流通池表面的粘附。凹孔986和997分别围绕端口983和993。凹孔986和997可以用粘结到流通池表面的粘合剂填充。粘合剂可以粘结到流通池表面和凹孔986和997的内表面，以便将双端口部件粘附到流通池表面。如图13A和图13B所示，凹孔986包含插入凹孔内的辐条984和985，使得用粘合剂填充凹孔将辐条包封在粘合剂内。凹孔996包含执行类似功能的辐条994和995。只要粘合剂粘结到流通池表面，辐条和凹孔就不需要化学粘结到粘合剂。相反，将辐条包封在粘合剂中将提供机械粘附手段。除辐条之外的其他特征部可以嵌入液体粘合剂中以提供这些机械力。
多种分析物中的任一种分析物可存在于本文所述的流通池中。示例性分析物包括但不限于本文所示例的或本文引用的参考文献中的分析物。特别有用的分析物参与核酸测序过程。因此，流通池可包含一种或多种核酸、聚合酶、聚合酶抑制剂、聚合酶辅因子(例如，催化金属离子)、三元复合物稳定剂(例如，抑制金属离子)、核苷酸、核酸结合蛋白、核苷酸去封闭剂等。
可存在于流通池中的其他分析物包括例如生物组织、生物细胞；细胞器；基于蛋白质的酶；基于蛋白质的受体，诸如抗体、凝集素或链霉亲和素；肽；RNA分子；衔接子等。可使用的示例性的基于蛋白质的酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、重组酶、激酶、磷酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、硫酸化酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或藻胆蛋白(例如，藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白或藻红蛋白)。
在一些构型中，流通池包含固定在流通池内的三元复合物(例如，稳定的三元复合物)，其中三元复合物(例如，稳定的三元复合物)包含聚合酶、引发模板核酸和模板的下一个正确核苷酸。
流通池可包含核酸、蛋白质或其他分析物的阵列。在特定构型中，三元复合物(例如，稳定的三元复合物)存在于阵列的一个或多个位点处。阵列提供分析物的多重处理的优点，由此多种不同类型的分析物被平行操纵或检测。阵列可包括至少2个、10个、100个、1x103个、1x104个、1x105个、1x106个、1x109个或更多个不同分析物位点。另选地或除此之外，阵列可包括至多1x109个、1x106个、1x105个、1x104个、1x103个、100个、10个、2个或更少个不同分析物位点。
可用于本文的阵列可具有例如间隔小于100微米、50微米、10微米、5微米、1微米或0.5微米的位点。另选地或除此之外，阵列可具有间隔大于0.5微米、1微米、5微米、10微米、50微米或100微米的位点。这些位点可以各自具有小于1平方毫米、500平方微米、100平方微米、25平方微米、1平方微米或更小的面积。阵列中位点的位点密度可为例如至少约10个位点/cm2、100个位点/cm2、1×103个位点/cm2、1×104个位点/cm2、1×105个位点/cm2、1×106个位点/cm2或更高。
阵列可附接到流通池壁的内表面或流通池内部的固体载体。流通池或固体载体可由用于分析生物化学的多种材料中的任一种材料制成。合适的材料可包括玻璃、聚合物材料、硅、石英(熔融二氧化硅)、Borofloat玻璃、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属、光纤或光纤束、蓝宝石或塑料材料。可基于特定用途所需的特性来选择材料。例如，对于期望波长的辐射透明的材料可用于将利用该波长的辐射的分析技术。相反，可能期望选择不通过特定波长的辐射的材料(例如，不透明的、吸收性的或反射性的)。可以利用的材料的其他特性是对于下游工艺中使用的某些试剂(诸如本文所述的那些)的惰性或反应性、或易于操纵、或制造成本低。
用于流通池或其他容器的特别有用的固体载体是颗粒，诸如珠粒或微球。珠粒群体可用于附着分析物群体，诸如稳定的三元复合物或能够形成复合物的组分(例如，聚合酶、模板、引物或核苷酸)。在一些构型中，每个珠粒具有单一类型的稳定三元复合物或能够形成复合物的单一类型的组分或单一类型的本文所述的或本文引用的参考文献中的一些其他分析物。例如，单个珠粒可以附着于单一类型的三元复合物、单一类型的模板等位基因、单一类型的模板基因座、单一类型的引物或单一类型的核苷酸。另选地，不同类型的组分不需要在珠粒的基础上分离。因此，单个珠粒可以携带多种不同类型的三元复合物、模板核酸、引物、引发模板核酸和/或核苷酸。珠粒的组成可以根据例如待使用的型式、化学性质和/或附接而变化。示例性珠粒组合物包括例如塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、可控孔度玻璃(CPG)、胶乳或交联葡聚糖如SepharoseTM、纤维素、尼龙、交联胶束和TeflonTM、以及来自BangsLaboratories,Fishers Ind.的“Microsphere Detection Guide”中所述的其他材料，该文献以引用方式并入本文。
珠粒可具有对称形状，诸如球形、多面体、圆柱形等。另选地，珠粒可具有不规则或非对称形状。本文所用珠粒的示例性尺寸可具有至少约10nm、100nm、1μm、5μm、10μm、100μm、1mm或更大的平均直径。另选地或除此之外，本文所用的珠粒可具有至多约1mm、100μm、10μm、5μm、1μm、100nm、10nm、1nm或更小的平均直径。这些尺寸范围内的珠粒可用作阵列特征部或用作流体浆料中的颗粒。
可用于制备珠粒阵列的示例性组合物和技术包括但不限于购自Illumina,Inc.(San Diego,CA)的用于BeadChipTM Arrays的那些，或美国专利号6,266,459、6,355,431、6,770,441、6,859,570或7,622,294或PCT公布号WO 00/63437中所述的那些，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。珠粒可以位于固体载体上的离散位置诸如凹孔处，由此每个位置容纳单个珠粒。另选地，珠粒所在的离散位置可各自包括多个珠粒，如例如美国专利申请公布号2004/0263923 A1、2004/0233485 A1、2004/0132205 A1或2004/0125424 A1中所述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。
其他有用的阵列包括用于核酸测序应用的那些。例如，用于固定基因组片段的扩增子(通常称为簇)的阵列可以是特别有用的。可用于本文的核酸测序阵列的实例包括Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)、PCT公布号WO 91/06678、WO 04/018497或WO 07/123744、美国专利号7,057,026、7,211,414、7,315,019、7,329,492或7,405,281、或美国专利申请公布号2008/0108082中所述的那些，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。
核酸或其他分析物可以提供单分子水平或系综水平的检测的方式附着于阵列。例如，多个不同的核酸可以在阵列中的一个核酸分子上形成的单个稳定的三元复合物可以与在阵列中形成的所有相邻的三元复合物区分开的方式附着于阵列。另选地，本公开的阵列可包括多个系综，系综是相同类型的分析物的群体，诸如具有共同模板序列的核酸群体。阵列可具有多个系综，每个系综使用本领域已知的方法形成，诸如桥式扩增、乳液PCR或本文所述的其他方法。
本公开的流通池(例如，使用固化液体粘合剂粘结的流通池)可提供承受高正压的优点。当使用正压驱动流体通过流通池时，这可能是有益的。正压对于驱动混合相流体(例如，泡沫、乳液或颗粒浆料)通过流通池特别有用。示例性混合相流体和在流通池中采用此类流体的方法在美国专利申请序列号16/700,422中有所阐述，该专利申请以引用方式并入本文。本公开的流通池可被构造成承受大于5PSI、10PSI、50PSI、90PSI或更高的压力。
本公开的流通池可被构造用于多种分析系统中的任一种分析系统。本公开的分析系统可以任选地包括光学检测系统，该光学检测系统被构造成检测流通池的内部，诸如流通池中的检测通道的内部。特别有用的光学检测系统包括存在于核酸测序系统的子系统或部件中的那些。若干此类检测设备被构造用于光学检测，例如发光信号的检测。因此，光学检测系统可包括被构造成照射流通池通道内部的激发系统。光学检测系统还可包括被构造成检测来自流通池通道内部的发光的发射系统。发光的检测可使用本领域已知的关于核酸阵列或核酸测序的方法进行。发光团可基于多种发光特性中的任一种发光特性进行检测，所述发光特性包括例如发射波长、激发波长、荧光共振能量转移(FRET)强度、猝灭、各向异性或寿命。
可与本公开的流通池一起使用的核酸测序系统及其部件的实例在例如美国专利申请公布号2010/0111768 A1或美国专利号7,329,860、8,951,781或9,193,996中有所描述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。其他核酸测序系统包括被商业化用于核酸测序的那些，诸如由IlluminaTM,Inc.(例如，HiSeqTM、MiSeqTM、NextSeqTM或NovaSeqTM系统)、Life TechnologiesTM(例如，ION TORRENTTM或SOLiDTM系统)、Pacific Biosciences(例如，使用SMRTTM Technology的系统，诸如SequelTM或RS IITM系统)或BGI(例如，DNBSEQTM系统)提供的那些。可与本公开的流通池一起使用的其他有用的检测器在美国专利号5,888,737、6,175,002、5,695,934、6,140,489或5,863,722、或美国专利公布号2007/007991 A1、2009/0247414 A1或2010/0111768或WO2007/123744中有所描述，所述文献中的每一篇全文以引用方式并入本文。
尽管本公开的系统和方法在本文的若干示例性实施方案中在光学检测的上下文中进行了说明，但是应当理解，可以作为补充或替代地使用其他检测形式。例如，检测器可以是用于检测质子或焦磷酸盐的电子检测器(参见例如美国专利申请公布号2009/0026082A1、2009/0127589 A1、2010/0137143 A1或2010/0282617 A1，所述文献中的每一篇全文以引用方式并入本文，或可从ThermoFisher,Waltham,MA商购获得的Ion TorrentTM系统)，或如在纳米孔的检测中使用的检测器，诸如由Oxford NanoporeTM,Oxford UK商业化的那些(例如，MinIONTM或PromethIONTM系统)或如美国专利号7,001,792、Soni&Meller,Clin.Chem.53,1996-2001(2007)、Healy,Nanomed.2,459-481(2007)或Cockroft等人，J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)中所述的那些，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。可使用FET检测器，诸如美国专利申请序列号62/767,712、美国专利申请公布号2017/0240962 A1、2018/0051316 A1、2018/0112265 A1、2018/0155773 A1或2018/0305727 A1、或美国专利号9,164,053、9,829,456、10,036,064或10,125,391中所述的那些中的一者或多者，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。
图6示出了安装在光学检测系统2000上的流通池500。分别穿过翼部530和531的孔532和533接合支架2030上的柱。孔533是圆形的并且与支架2030上的圆形柱相对紧密地接合，而孔532具有细长的形状，从而允许当将流通池500放置在支架2030上时的宽容度。当位于支架2030上时，流通池500可通过预负载2010的推力被推靠在背板2021上的参考表面上。可使用杠杆2011用手接合和脱离预负载。支架2030使流通池500沿x维度滑动以扫描流通池通道的条带，并且支架2030还被构造成使流通池500沿y方向步进，以使通道的其他条带能够沿x维度被扫描。通过相对于背板2021移动光学设备2001内的物镜部件来实现聚焦。用于图6中所示例的光学检测系统类型的部件和方法在美国专利号10,501,796和美国专利申请序列号16/700,422中有所阐述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。
如图6的实例以及美国专利号10,501,796和美国专利申请序列号16/700,422(所述文献中的每一篇以引用方式并入本文)中阐述的系统所展示，流通池可以是流体系统的可移除部件。例如，本公开的系统可包括被构造用于方便地放置和移除流通池的平台。因此，流通池可以是专用于第一分析测试的可消耗部件，然后将其移除以替换为用于第二分析测试的第二流通池。两个流通池可以彼此相似地构造，例如，包含相似的分析物、相似的样品或特定样品的一小部分。另选地，流通池可以是流体系统的固定部件，例如，需要专门的工具和/或专门的训练来移除。
图7A至图7E示出了适配器或流体连接器1000，该适配器或流体连接器被构造成与流通池上的容器(诸如容器125、126、225、226、325、326、525、526和1526)接合。通过在挤压杠杆臂1002和1003的同时将端部1006插入容器中，可以方便地用手进行接合。杠杆臂端部处的钩1005和1004将与闩锁1504和1505中的互补表面1025和1024接合，如图7D所示。流体管线1037插入流体连接器1000的孔1007中并穿过通道1017，使得流体管线1037与流通池的容器1526中的端口1521接合(参见图7E)。类似地，流体管线1038插入流体连接器1000的孔1008中并穿过通道1018，使得流体管线1038与流通池的容器1526中的端口1523接合(参见图7E)。流体管线1037和1038的另一端与流体系统接合，使得试剂和其他流体可被递送到流通池的通道。通过在从闩锁1505和1504拉动流体连接器1000的同时挤压杠杆臂1002和1003以脱离钩1005和1004，流体连接器1000可以方便地从容器1526中移除。当从容器中拉出流体连接器1000时，脊状表面1010和1011为手指或适当的工具提供摩擦。图7D所示的流通池的翼部1531具有两个孔1533和1534，所述孔被构造成接合滑动架上的两个柱。使用两个孔防止使用者将流通池以错误的取向放置在检测器上。
图8示出了用于组装流体连接器的粘合铆钉的应用。粘合铆钉1031粘附到柔性管1037上，如图8A所示。图8B示出了六个粘合铆钉1031-1036相对于流体连接器1000的分解图。铆钉分别穿过孔1091-1096，使得每个铆钉的头部接合孔中的沉头座，并且每个铆钉的尾部粘附到管1037或管1038上。图8C示出了流体连接器1000的组装图。
图14A至图14B示出了移液管适配器1105，该移液管适配器被构造成与流通池上的容器诸如容器125、126、225、226、325、326、525和526接合。可以用手方便地进行接合。图14A示出了定位在容器126内的移液管适配器1105，而图14B示出了定位在容器126上方的容器适配器1105的分解图。移液管适配器1105的尺寸和形状被设定成装配在容器126的盆内。就这一点而言，移液管适配器1105可具有与盆的形状互补的形状，使得移液管适配器1105以紧贴的方式装配在其中。
移液管适配器1105包括移液管流体入口1110和流体出口1115。当移液管适配器1105位于容器126内时，移液管流体入口1110与容器126的端口121(图1A)对齐，并且流体出口1115与容器126的端口123对齐。移液管适配器1105被放置在端口121和123上，以便于将文库注入流通池中。该步骤可以由用户手动执行。移液管流体入口1110的尺寸和形状被设定成在其中容纳移液管。如上所述，移液管适配器1105被构造成装配在容器125、126、225、226、325、326、525和526中的任一者内。
图15A和图15B示出了移液管适配器1205的另一个实施方案，其中移液管适配器1205由多个工件制成。图14A和图14B的移液管适配器1105可以任选地为一体的、单片的结构。移液管适配器1205被构造成与流通池上的容器诸如容器125、126、225、226、325、326、525和526接合。可以用手方便地进行接合。图15A示出了定位在容器126上方的移液管适配器1105。如在先前的实施方案中，移液管适配器1205的尺寸和形状被设定成装配在容器126的盆内。移液管适配器1105可具有与盆的形状互补的形状，使得移液管适配器1105以紧贴的方式装配在其中。
图15B示出了移液管适配器1105的分解图，该移液管适配器包括机械联接到上保持器1215的下基板1210。上保持器1215可以诸如通过装配在下基板上而与下基板1210配合。当配合时，保持器1215和基板1210限定其间的空间，芯1225、隔膜1230和至少一个包覆件1235定位在该空间中。保持器1215限定移液管流体入口1240和流体出口1245，它们与相应的包覆件1235对齐，如下文更全面地描述。当移液管适配器1205位于容器126内时，移液管流体入口1240与容器126的端口121(图1A)对齐，并且流体出口1245与容器126的端口123对齐。
当保持器1215联接到基板1210时，保持器在隔膜1230和芯1225上施加力以保持密封。保持器还可具有与翼部131的卡扣配合。隔膜1230用作插入移液管流体入口1240中的移液管的密封件，以便抑制或防止试剂泄漏。芯1225被构造成浸泡或以其他方式捕获使用者所分配的试剂。
包覆件1235还与定位在其中的任何管道形成密封。第一包覆件与移液管流体入口1240同轴对齐，并且第二包覆件与流体出口1245同轴对齐。包覆件可有助于将移液管插入移液管流体入口1240中时的正确对齐，并且还可牢固地保持或固定移液管在其中的定位。包覆件1235是管状的，各自具有内腔，该内腔的尺寸和形状被设定成容纳管或其他结构，诸如移液管。
一个或多个包覆件也可以与先前参考图7A至图7E描述的适配器或流体连接器1000结合使用。图16示出了在端口1523的区域中的流体连接器100的下部区域。管道包覆件1610定位在端口1523内。管道包覆件1610被构造用于已引入文库的流通池的下游化学操纵。这种化学操纵是自动化的，并且需要在流通池沿图像捕获表面平移时将管道牢固地保持在适当位置。包覆件1610具有扩大的下部锁定区域，当流通池沿图像捕获表面平移时，该锁定区域将包覆件1610和管道固定在适当位置。管道包覆件1610被构造成当流通池在各个测序循环期间机械地来回平移穿过图像捕获装置时将管道保持在适当位置。包覆件1610还可以与通过管道的高压流体流结合使用。包覆件1610抑制或防止流体从管道中泄漏，并且还抑制或防止管道与流通池之间的界面的断开。在非限制性实例中，高压流体流在40psi至80psi的范围内。
本公开的流通池可用于对核酸进行测序。特别有用的测序方法是采用试剂递送和流通池检测的重复循环的循环方法。每个循环可包括一个步骤或多个步骤。例如，每个循环可包括检测模板核酸中单个核苷酸位置所需的所有步骤。一些测序方法采用循环可逆终止子(CRT)化学，其中每个循环包括以下步骤：(i)添加单个可逆终止的核苷酸以将新生引物增加到待检测的核苷酸位置；(ii)在单个核苷酸位置处检测核苷酸，以及(iii)将新生引物去封闭以允许返回步骤(i)，从而开始后续的循环。
有用的CRT核酸测序方法的具体实例是Sequencing By BindingTM(SBBTM)反应，例如，如共同拥有的美国专利申请公布号2017/0022553 A1、2018/0044727 A1、2018/0187245A1或2018/0208983 A1中所述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。一般来讲，用于确定模板核酸分子序列的SBBTM方法可以基于在特定条件下形成稳定的三元复合物(在聚合酶、引发核酸和同源核苷酸之间)。该方法可包括检查阶段，随后是核苷酸掺入阶段。
SBBTM方法的检查阶段可以在流通池中进行，该流通池含有至少一种模板核酸分子，所述模板核酸分子通过将试剂递送到流通池以形成第一反应混合物而被引物引发。反应混合物可包含引发模板核酸、聚合酶和至少一种核苷酸类型。聚合酶和核苷酸与一个或多个引发模板核酸分子的相互作用可以在核苷酸未共价添加到一个或多个引物的条件下观察到；并且可以使用观察到的聚合酶和核苷酸与一个或多个引发模板核酸分子的相互作用来鉴定每个模板核酸中的下一个碱基。引发模板、聚合酶和核苷酸之间的相互作用可以在多种方案中检测。例如，核苷酸可含有可检测的标记。每个核苷酸可具有相对于其他核苷酸可区分的标记。另选地，不同核苷酸类型中的一些或全部可具有相同的标记，并且核苷酸类型可以基于不同核苷酸类型向流通池的单独递送来区分。在一些实施方案中，聚合酶可以被标记。与不同核苷酸类型相关联的聚合酶可具有独特的标记，该标记区分与它们相关联的核苷酸的类型。另选地，聚合酶可具有相似的标记，并且不同的核苷酸类型可以基于不同核苷酸类型向流通池的单独递送来区分。可通过使用本文所阐述的或本文引用的参考文献中的设备或方法扫描流通池来进行检测。
在SBBTM方法的检查阶段，可通过三元复合物稳定化来促进正确和不正确的核苷酸之间的区分。多种条件和试剂可以是有用的。例如，引物可含有防止核苷酸共价连接的可逆封闭部分；并且/或者延伸所需的辅因子(诸如二价金属离子)可以不存在；并且/或者抑制基于聚合酶的引物延伸的抑制二价阳离子可以存在；并且/或者存在于检查阶段的聚合酶可具有抑制引物延伸的化学修饰和/或突变；并且/或者核苷酸可具有抑制掺入的化学修饰，诸如去除或改变天然三磷酸部分的5'修饰。检查阶段可包括使用本文所述的设备和方法扫描流通池。
然后可通过在流通池中创造条件来进行延伸阶段，其中可以将核苷酸添加到每个模板核酸分子上的引物中。在一些实施方案中，这涉及去除在检查阶段中使用的试剂并且用促进延伸的试剂替换它们。例如，检查试剂可以用能够延伸的聚合酶和一个或多个核苷酸替代。另选地，可将一种或多种试剂添加到检查阶段反应中以创建延伸条件。例如，可将催化二价阳离子添加到阳离子不足的检查混合物中，并且/或者可去除或禁用聚合酶抑制剂，并且/或者可添加可延伸的核苷酸，并且/或者可添加去封闭剂以使一种或多种引物可延伸，并且/或者可添加可延伸的聚合酶。
另一种有用的CRT测序方法是边合成边测序(SBS)。SBS一般涉及通过针对引物所杂交的模板链反复添加核苷酸来进行新生引物的酶促延伸。简言之，SBS可通过使靶核酸(例如连接到流通池中的位点)与一种或多种标记核苷酸、DNA聚合酶等接触来引发。使用靶核酸作为模板延伸引物的那些位点将掺入可检测的标记核苷酸。检测可包括使用本文所述的设备或方法进行扫描。任选地，标记核苷酸还可包括可逆终止子，一旦核苷酸被添加到引物中，该可逆终止子阻止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物中，使得在递送去封闭剂以去除该部分之前不能进行后续的延伸。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可将去封闭试剂递送到容器(在进行检测之前或之后)。洗涤可以在各个递送步骤之间进行。循环可进行n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可容易地适用于本公开的方法、系统或设备的示例性SBS程序、试剂和检测组分例如在Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、WO 91/06678、WO 07/123744、美国专利号7,057,026、7,329,492、7,211,414、7,315,019或7,405,281和美国专利申请公布号2008/0108082 A1中有所描述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。同样有用的是可从Illumina,Inc.(San Diego,CA)商购获得的SBS方法。
一些SBS实施方案是循环的，但不需要采用可逆终止子核苷酸。特别有用的方法包括检测核苷酸掺入延伸产物后时释放的质子。例如，基于对释放的质子的检测的测序可以使用可从Thermo Fisher(Waltham,MA)商购获得的或在美国专利申请公布号2009/0026082A1、2009/0127589 A1、2010/0137143 A1或2010/0282617 A1中所述的试剂和电检测器，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。
可以使用其他循环测序方法，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测当核苷酸掺入与模板核酸链杂交的新生引物时无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi等人，AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等人，Science 281(5375),363(1998)；美国专利号6,210,891、6,258,568和6,274,320，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过由ATP硫酸化酶转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且所得ATP可经由荧光素酶产生的光子来检测。
连接测序反应也是有用的，包括例如Shendure等人Science 309:1728-1732(2005)；美国专利号5,599,675或美国专利号5,750,341中所述的那些，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。一些实施方案可包括如例如Bains等人，Journal of TheoreticalBiology 135(3),303-7(1988)；Drmanac等人，Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor等人，Science 251(4995),767-773(1995)；或WO 1989/10977中所述的杂交测序方法，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。在连接测序和杂交测序的方法中，通过寡核苷酸连接对与核酸模板杂交的引物进行重复的延伸循环。通常，寡核苷酸被发光标记，并且可被检测以确定模板的序列，例如，使用本文所述的系统或方法。
上述测序方法的步骤可以循环进行。例如，可以重复SBBTM方法的检查和延伸步骤，使得在每个循环中检查单个下一个正确核苷酸(即，下一个正确核苷酸是与模板核酸中的核苷酸正确结合的核苷酸，所述模板核酸直接位于与杂交引物的3'端杂交的模板中的碱基的5')，并且随后将单个下一个正确核苷酸添加到引物中。可以进行本文所述的测序方法的任何数目的循环，包括例如至少1个、2个、10个、100个、250个、500个或更多个循环。另选地或除此之外，进行不超过500个、250个、100个、10个、2个或1个循环。
一些实施方案可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可通过携带荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用，或者用零模式波导(ZMW)检测核苷酸掺入。可被修改以用于本文所述的设备或方法中的用于经由FRET和/或ZMW检测进行测序的技术和试剂在例如Levene等人，Science 299,682-686(2003)；Lundquist等人，Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)；或美国专利号7,315,019、8,252,911或8,530,164中有所描述，所述文献的公开内容以引用方式并入本文。
多种核酸扩增技术中的任一种可用于在流通池中复制核酸。可使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、桥式扩增、随机引物扩增(RPA)或分子生物学领域已知的其他技术。在特定构型中，用于扩增的一种或多种引物可以附着于流通池的表面。在此类实施方案中，一种或多种附着于表面的引物沿模板核酸的延伸将导致模板的拷贝附着于表面。这种扩增方法可用于分析目的，诸如实时PCR或定量PCR。另选地，扩增可用于制备用于下游应用诸如核酸测序的核酸。在固相载体上产生一个或多个位点的制备型扩增方法，其中每个位点附着于特定核酸模板的多个拷贝，被称为“聚类”方法。
在PCR技术中，用于扩增的一个或两个引物可以附着于表面。利用两种连接引物的型式通常被称为桥式扩增，因为双链扩增子在位于已被复制的模板序列侧翼部的两个连接引物之间形成桥样结构。可用于桥式扩增的示例性试剂和条件在例如美国专利号5,641,658或7,115,400；美国专利公布号2002/0055100 A1、2004/0096853 A1、2004/0002090 A1、2007/0128624 A1或2008/0009420 A1中有所描述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。PCR扩增也可以用附着于表面的扩增引物和溶液中的第二引物中的一种进行。使用一种固相附着的引物和一种液相引物的组合的示例性型式被称为引物步移，并且可以如美国专利号9,476,080中所述进行，该专利以引用方式并入本文。另一个实例是乳液PCR，其可以如例如Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)，WO 05/010145或美国专利公布号2005/0130173 A1或2005/0064460 A1中所述进行，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。
RCA技术可用于本文所述的方法中。可用于RCA反应的示例性试剂和RCA产生扩增子的原理例如在Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)或美国专利申请公布号2007/0099208 A1中有所描述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。用于RCA的引物可以在溶液中或附着于流通池的表面。
MDA技术也可用于本公开的方法中。用于MDA的一些试剂和有用条件例如在Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；Lage等人，Genome Research 13:294-307(2003)；Walker等人，Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；Walker等人，Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)；或美国专利号5,455,166、5,130,238或6,214,587中有所描述，所述文献中的每一篇以引用方式并入本文。用于MDA的引物可以在溶液中或附着于流通池的表面。
用于本文的方法或组合物中的核酸模板可以是DNA，诸如基因组DNA、合成DNA、扩增DNA、互补DNA(cDNA)等。也可以使用RNA，诸如mRNA、核糖体RNA、tRNA等。核酸类似物也可用作本文的模板。本文所用的引物可以是DNA、RNA或其类似物。
流通池的通道可以从入口直接延伸到出口，如图1至图4所示。在一些构型中，通道可被构造成在其中的流体的主体流中没有任何弯曲或曲线。另选地，通道可具有曲线或弯曲。例如，通道可缠绕在流通池的表面上，如图9A中的流通池700所示例。在此，每个通道包括用于检测分析物的三个区域。更具体地，将端口721连接到端口720的通道包括检测区域701、705和709。检测区域与通道中的其他区域相比相对较宽，以便容纳用于呈现阵列的相对较大的表面积。流体从入口端口721直接流入相对较宽的检测区域701中，然后通过弯曲区域703，该弯曲区域在702处变窄并且在704处结束的180°转弯保持变窄，在704处该通道变宽到检测区域705。在穿过变宽的检测区域705之后，流体穿过弯曲区域707，该弯曲区域在706处变窄并且在708处结束的180°转弯保持变窄，在708处该通道变宽到检测区域709。在穿过变宽的检测区域709之后，流体穿过在710处开始的变窄的90°转弯，并且将流体引导至出口720。180°弯曲区段的形状用于在一种流体与另一种流体交换的过程中在两种流体之间保持相对平坦的前部。通过将弯曲部760的内壁构造成具有与弯曲部的外壁761相同或非常相似的长度来实现平坦前部。这种构型在转弯的内侧产生垫圈的蘑菇形区域771。将端口723连接到端口724的通道具有与将端口720连接到端口721的通道相似的形状和特征。如图9B所示，与液体790交换的泡沫790在横穿曲线时以及在曲线的两侧将保持平坦前部799，因此证明通道的形状实现有效的和空间均匀的流体交换。
本公开的流通池可包括一个或多个基准点，所述基准点可用于流通池在x和y维度上的2维配准。如图10所示，基准点881可以存在于插置在两个透明基板之间的垫圈805中。垫圈805还用于界定流通池800中的通道801和802。用于产生基准点881的有效方法是使用IR或UV激光在压敏粘合剂(例如，得自Adhesives Research,Glen Rock PA的白色聚酯
Figure BDA0003828323010000371
8939)中切出孔。所得的孔881具有发光边缘890，当使用光度计观察时，该发光边缘产生明显的环形851。不希望受制于机制，据信发光是由激光与PSA中的粘合剂相互作用的产物引起的。
将基准点881结合到垫圈材料中的优点在于，使用常规制造工艺可用于相对于通道准确地定位垫圈并将基准点准确地放置在垫圈中，从而在基准点与通道中存在的阵列之间产生高置信度空间关系。尽管图10中的基准点具有圆形形状，但可形成多种形状中的任一种形状，包括例如具有有利于某些配准算法的对称关系的形状(例如，正方形、三角形、规则凸多边形、同心圆、同心多边形等)。非对称或不规则形状的基准点也可以是有用的。
各种其他基准点和用于产生基准点的技术示于图11中。图11A示出了具有通过PSA层52附接到盖51的基板53的流通池的剖面；盖51中的孔62延伸穿过PSA层52，其中孔62填充有掺杂有发光体的液体粘合剂54。当从盖51上方观察时，基准点将产生由孔62的形状限定的填充形状。例如，圆柱形孔将产生圆形基准点。基准点可具有类似于本文在用于液体粘合剂的通孔的上下文中所阐述的剖面形状。
图11B示出了用于将流通池染色以产生基准点的过程。流通池以剖面表示，示出了通过PSA层52附接到盖51的基板53。盖51具有穿过PSA层52延伸到基板53中的表面61的孔62。孔62填充有掺杂有发光体的液体54，并且该液体被去除而在表面61上留下发光色斑。在这种构型中，表面61易于被发光体染色，而盖和PSA的表面不吸收发光体。使用能够吸收发光体的盖71、PSA层72和基板73的构型示于图11C中。接触发光体的盖71的表面将被染色(参见剖视图中的表面79和80)。类似地，接触发光体的PSA层72的表面将被染色(参见剖视图中的表面75、76、77和78)。表面74也将被染色。当从盖上方观察时，图11B和图11C中的基准点将产生由孔62的形状限定的填充形状。
图11D示出了具有通过PSA层86附接到盖85的基板87的流通池的剖面，其中PSA层包含发光材料。在这种构型中，盖85对于发光材料的激发或发射是不透明的。因为盖85中的孔82比PSA层86中的孔宽，并且因为两个层中的孔都是圆形的，所以当从盖85上方观察时，基准点将表现为发光环。发光环的部分88和89示于图11D的剖视图中。
可用作基准点的掺杂剂或用作分析物的标记物的示例性发光体包括但不限于荧光纳米晶体；量子点；绿色荧光蛋白及其色移突变体，藻胆蛋白，诸如藻蓝蛋白和藻红蛋白，d-罗丹明受体染料，包括二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]等；荧光素供体染料，包括荧光素、6-FAM等；花青染料，诸如Cy3B；Alexa染料、SETA染料、Atto染料，诸如与Cy3B形成FRET对的atto 647N等。其他包括但不限于MDCC(7-二乙基氨基-3-[([(2-马来酰亚胺基)乙基]氨基)羰基]香豆素)、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、德克萨斯红、Cy5、LC red 705和LC red 640。本领域已知的其他发光体诸如Principles of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(编),Plenum Pub Corp,第2版(1999年7月)和Richard P.Hoagland的Molecular Probes Handbook第6版(所述文献中的每一篇以引用方式并入本文)中所述的那些可以是有用的。在特定实施方案中，本文所用的发光体或发光材料可具有至少0.2、0.5、0.8或更高的荧光量子产率。
图12示出了包括膨胀接头970和971的流通池盖900的顶视图，所述膨胀接头分别将翼部931和930连接到窗口区域910。膨胀接头970和971由低硬度材料(即，具有低硬度的材料)制成。膨胀接头适应当流通池经受温度变化时例如在热循环过程中发生的运动。膨胀接头防止当盖由热膨胀系数(CTE)与盖所附接的另一基板或垫圈的CTE不同的材料制成时可能发生的破裂或翘曲。
在一个示例性实施方案中，公开了一种流通池，该流通池包括：(a)插置在第一基板与第二基板之间的垫圈，其中垫圈、第一基板和第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的其中垫圈在第一基板上具有界定用于容纳水性液体的通道的覆盖区；(b)位于垫圈中的通孔，该通孔包含将第一基板粘结到第二基板的固化液体粘合剂，其中通过垫圈将通孔中的固化液体粘合剂与通道分离；以及(c)将通道连接到流通池外部的第一通道端口，其中第一通道端口对于水性液体是可渗透的。在任何实施方案的示例性变型中，公开了任何公开的实施方案的流通池，该流通池还包括将通孔连接到流通池外部的通孔端口。在任何实施方案的示例性变型中，公开了任何公开的实施方案的流通池，该流通池还包括将通孔连接到流通池外部的第二通孔端口。在任何实施方案的示例性变型中，公开了任何公开的实施方案的流通池，其中垫圈包括多个通孔，所述通孔各自包含将第一基板粘结到第二基板的固化液体粘合剂，其中通孔中的固化液体粘合剂通过垫圈与通道分离。在任何实施方案的示例性变型中，公开了任何公开的实施方案的流通池，其中通道包括分析物阵列。在任何实施方案的示例性变型中，分析物阵列在通道中附接到第一基板。在任何实施方案的示例性变型中，第二分析物阵列在通道中附接到第二基板。在任何实施方案的示例性变型中，分析物包括核酸，不同的核酸附接到阵列的相应位点。在任何实施方案的示例性变型中，阵列包括每mm2至少100个位点。在任何实施方案的示例性变型中，垫圈在第二基板上具有界定用于容纳水性液体的通道的覆盖区。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板上的覆盖区具有与第二基板上的覆盖区相同的形状。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板包括形成通道的第一侧的平坦表面，并且第二基板包括形成通道的第二侧的平坦表面。在任何实施方案的示例性变型中，公开了将通道连接到流通池外部的第二通道端口，其中第二通道端口对于水性液体是可渗透的。在任何实施方案的示例性变型中，水性液体存在于通道中。在任何实施方案的示例性变型中，水性液体在通道上施加至少10PSI的正压。在任何实施方案的示例性变型中，垫圈包含压敏粘合剂，压敏粘合剂与第一基板和第二基板中的一者或两者接触。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板和第二基板包含相同的材料。在任何实施方案的示例性变型中，材料包括玻璃或塑料。在任何实施方案的示例性变型中，玻璃包括硅烷或有机硅烷涂层。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板包含与第二基板的材料不同的材料。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板包含玻璃，并且第二基板包含塑料。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板包含透明材料和热膨胀接头。在任何实施方案的示例性变型中，通孔连续地环绕通道。在任何实施方案的示例性变型中，通孔连续地环绕流通池中的多个通道中的各个通道。在任何实施方案的示例性变型中，垫圈界定通道中的第一基板与第二基板之间的距离。在任何实施方案的示例性变型中，该距离大于0.1mm且小于1cm。在任何实施方案的示例性变型中，通道的体积大于10μl且小于10ml。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板和第二基板中的一者或两者对于UV、VIS或IR辐射是透明的。在任何实施方案的示例性变型中，固化液体粘合剂包括发光材料。在任何实施方案的示例性变型中，垫圈包含发光材料。在任何实施方案的示例性变型中，通道包括至少九十度的转弯，其中转弯具有内壁和外壁，内壁具有与外壁基本上相同的长度。
在另一个示例性实施方案中，公开了一种制造流通池的方法，该方法包括(a)将垫圈插置在第一基板与第二基板之间以界定用于容纳水性液体的通道，其中垫圈、第一基板和第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的；(b)将液体粘合剂递送到垫圈中的通孔；以及(c)允许液体粘合剂将第一基板粘结到第二基板，其中通过垫圈将液体粘合剂与通道分离。在任何实施方案的示例性变型中，步骤(b)在步骤(a)之前执行。在任何实施方案的示例性变型中，液体粘合剂通过第一基板、第二基板或垫圈中的通孔入口端口递送。在任何实施方案的示例性变型中，流通池包括通孔出口端口，当液体粘合剂通过通孔入口端口递送时，空气通过该通孔出口端口排出。在任何实施方案的示例性变型中，步骤(c)包括施加热或光以允许液体粘合剂将第一基板粘结到第二基板和垫圈。在任何实施方案的示例性变型中，还公开了在通道中形成分析物阵列。在任何实施方案的示例性变型中，分析物包括核酸，不同的核酸附接到阵列的相应位点。在任何实施方案的示例性变型中，通过将分析物附接到通道的第一基板来形成阵列。在任何实施方案的示例性变型中，公开了使用压敏粘合剂将垫圈粘附到第一基板。在任何实施方案的示例性变型中，公开了使用压敏粘合剂将垫圈粘附到第二基板。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板和第二基板包含相同的材料。在任何实施方案的示例性变型中，材料包括玻璃或塑料。在任何实施方案的示例性变型中，玻璃包括硅烷或有机硅烷涂层。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板包含与第二基板的材料不同的材料。在任何实施方案的示例性变型中，第一基板包含玻璃，并且第二基板包含塑料。在任何实施方案的示例性变型中，公开了容纳至少第一通道端口的容器，其中该容器限定盆。在任何实施方案的示例性变型中，容器被构造成与移液管适配器配合，其中移液管适配器被构造成便于将核酸文库起始材料引入流通池中。在任何实施方案的示例性变型中，公开了一种移液管适配器，其中移液管适配器与容器的盘配合。在任何实施方案的示例性变型中，移液管适配器包括与第一通道端口对齐的移液管流体入口，该移液管流体入口被构造成容纳移液管。在任何实施方案的示例性变型中，移液管适配器包括包覆件，当移液管适配器与容器配合时，该包覆件与第一通道端口对齐。在任何实施方案的示例性变型中，容器被构造成与将流通池通道连接到流体递送设备的适配器配合。在任何实施方案的示例性变型中，流体递送设备包括至少一个流体管线，所述流体管线流体地联接到流体系统，使得试剂和其他流体可被递送到流通池的通道。在任何实施方案的示例性变型中，适配器包括与至少一个流体管线配合的包覆件。在任何实施方案的示例性变型中，包覆件使得高压流体能够流过至少一个流体管线，并抑制流体从所述至少一个流体管线泄漏。在任何实施方案的示例性变型中，包覆件使得高压流体能够流过至少一个流体管线，并抑制流体在所述至少一个流体管线与流通池之间的界面处从所述至少一个流体管线泄漏。
在另一个示例性实施方案中，公开了一种用于促进流体相对于流通池的进入或离开的适配器装置，该适配器包括：被构造成与流通池配合的外壳体，该壳体包括与流通池的入口或出口对齐的第一端口，该端口被构造成容纳相对于流通池递送或接收流体的管；以及第一包覆件，该第一包覆件定位在壳体内并与第一端口对齐，该第一包覆件被构造成相对于流通池固定管。在任何实施方案的示例性变型中，管是移液管。在任何实施方案的示例性变型中，管联接到流体系统，使得试剂和其他流体可被递送到流通池的通道。在任何实施方案的示例性变型中，第一包覆件由有机硅制成。在任何实施方案的示例性变型中，第一端口与流通池的入口对齐。在任何实施方案的示例性变型中，壳体还包括与流通池的出口对齐的第二端口，并且还包括定位在壳体内并与第二端口对齐的第二包覆件。在任何实施方案的示例性变型中，包覆件使得高压流体能够流过管并抑制流体从管泄漏。
在本申请通篇中参考了各种出版物、专利和/或专利申请。这些文献的公开内容据此全文以引用方式并入本申请。已经描述了多个实施方案。然而，应当理解，可以作出各种修改。因此，其他实施方案也在下述权利要求的范围内。
虽然本说明书包含许多细节，但是这些不应被解释为对所要求保护的本发明的范围或可能要求保护的范围的限制，而是作为对特定实施方案的具体特征的描述。本说明书中在单独的实施方案的上下文中描述的某些特征还可以组合方式在单个实施方案中实现。相反，在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以在多个实施方案中单独地或以任何合适的子组合来实现。此外，尽管特征可能在上文中被描述为在某些组合中起作用并且甚至最初被如此要求保护，但是来自所要求保护的组合的一个或多个特征在一些情况下可以从该组合中删除，并且所要求保护的组合可以针对子组合或子组合的变型。类似地，虽然在附图中以特定顺序描绘了操作，但是这不应被理解为要求以所示的特定次序或按顺序次序执行这些操作，或者执行所有示出的操作以实现期望的结果。仅公开了一些实例和具体实施。可基于所公开的内容对所描述的实例和具体实施以及其他具体实施进行变化、修改和增强。

Claims (31)

1.一种流通池，其包括：
(a)插置在第一基板与第二基板之间的垫圈，其中所述垫圈、所述第一基板和所述第二基板对于水性液体和液体粘合剂是不可渗透的，其中所述垫圈在所述第一基板上具有界定用于容纳所述水性液体的通道的覆盖区；
(b)位于所述垫圈中的通孔，所述通孔包含将所述第一基板粘结到所述第二基板的固化液体粘合剂，其中所述通孔中的所述固化液体粘合剂通过所述垫圈与所述通道分离；以及
(c)第一通道端口，所述第一通道端口将所述通道连接到所述流通池的外部，其中所述第一通道端口对于所述水性液体是可渗透的。
2.如权利要求1所述的流通池，其还包括将所述通孔连接到所述流通池的外部的通孔端口。
3.如权利要求2所述的流通池，其还包括将所述通孔连接到所述流通池的外部的第二通孔端口。
4.如权利要求1所述的流通池，其中所述垫圈包括多个通孔，所述通孔各自包含将所述第一基板粘结到所述第二基板的固化液体粘合剂，其中所述通孔中的所述固化液体粘合剂通过所述垫圈与所述通道分离。
5.如权利要求1所述的流通池，其中所述通道包括分析物阵列。
6.如权利要求5所述的流通池，其中所述分析物阵列在所述通道中附接到所述第一基板。
7.如权利要求6所述的流通池，其中第二分析物阵列在所述通道中附接到所述第二基板。
8.如权利要求5所述的流通池，其中所述分析物包括核酸，不同的核酸附接到所述阵列的相应位点。
9.如权利要求8所述的流通池，其中所述阵列包括每mm2至少100个位点。
10.如权利要求1所述的流通池，其中所述垫圈在所述第二基板上具有界定用于容纳所述水性液体的通道的覆盖区。
11.如权利要求1所述的流通池，其中所述第一基板上的所述覆盖区具有与所述第二基板上的所述覆盖区相同的形状。
12.如权利要求11所述的流通池，其中所述第一基板包括形成所述通道的第一侧的平坦表面，并且所述第二基板包括形成所述通道的第二侧的平坦表面。
13.如权利要求1所述的流通池，其还包括将所述通道连接到所述流通池的外部的第二通道端口，其中所述第二通道端口对于所述水性液体是可渗透的。
14.如权利要求1所述的流通池，其中所述水性液体存在于所述通道中。
15.如权利要求14所述的流通池，其中所述水性液体在所述通道上施加至少10PSI的正压。
16.如权利要求1所述的流通池，其中所述垫圈包含压敏粘合剂，所述压敏粘合剂与所述第一基板和所述第二基板中的一者或两者接触。
17.如权利要求1所述的流通池，其中所述第一基板和所述第二基板包含相同的材料。
18.如权利要求17所述的流通池，其中所述材料包括玻璃或塑料。
19.如权利要求18所述的流通池，其中所述玻璃包括硅烷或有机硅烷涂层。
20.如权利要求1所述的流通池，其中所述第一基板包含与所述第二基板的材料不同的材料。
21.如权利要求20所述的流通池，其中所述第一基板包含玻璃，并且所述第二基板包含塑料。
22.如权利要求20所述的流通池，其中所述第一基板包含透明材料和热膨胀接头。
23.如权利要求1所述的流通池，其中所述通孔连续地环绕所述通道。
24.如权利要求1所述的流通池，其中所述通孔连续地环绕所述流通池中的多个通道中的各个通道。
25.如权利要求1所述的流通池，其中所述垫圈界定所述通道中的所述第一基板与所述第二基板之间的距离。
26.如权利要求25所述的流通池，其中所述距离大于0.1mm且小于1cm。
27.如权利要求1所述的流通池，其中所述通道的体积大于10μl且小于10ml。
28.如权利要求1所述的流通池，其中所述第一基板和所述第二基板中的一者或两者对于UV、VIS或IR辐射是透明的。
29.如权利要求1所述的流通池，其中所述固化液体粘合剂包括发光材料。
30.如权利要求1所述的流通池，其中所述垫圈包含发光材料。
31.如权利要求1所述的流通池，其中所述通道包括至少九十度的转弯，其中所述转弯具有内壁和外壁，所述内壁具有与所述外壁基本上相同的长度。
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