JP5020734B2 - 核酸解析方法及び装置 - Google Patents
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Description
サンガー法、パイロシークエンス法、一塩基伸長反応法等を利用することができる。また、解析するプライマ下流の塩基配列は必ずしも3’末端からの配列でなくてもよく、好ましくは5〜20塩基長程度、より好ましくは20〜100塩基長程度である。
図1は、本発明を利用したDNA解析方法を示したものである。以下、実際の計測手順に従って配列決定法を説明する。
実施例1では核酸試料の両末端側の配列を解読したが、解析は片側末端側の配列のみでも実現できる。実施例1と同様に、同一のタグ配列を両末端に有する(タグ)−(核酸試料)−(タグ)を調製する。このフラグメントを熱変性し、生じた2本の相補的な1本鎖フラグメントは、いずれも同一配列のタグ部を有しており、固相上に固定しているプライマ(タグと相補的配列を有する)とハイブリダイズする。実施例1と同様に固相に固定化したプライマを基点としたシーケンス反応を行うことで、あるフラグメントの5’末端側の塩基配列と、前記フラグメントと相補的なフラグメントの5’末端側の塩基配列とが、それぞれ基板上の異なる位置において解読される。次いで、通常の塩基伸長反応によって相補鎖を形成することで、基板上の各フラグメントの長さを測定する。前記2本の相補的な1本鎖フラグメントは、その長さが同じである。それ以外の核酸試料はランダムな長さで調製されているため、同じ長さのフラグメント同士を相補鎖をなすものとして選択することにより、核酸試料の両末端の塩基配列情報と、その長さ情報を取得できる。
図3は、本発明の解析方法を使ったDNA解析装置の構成図である。装置は正立型の顕微鏡様の装置構成であり、基板14に捕捉するDNA分子の伸長状態を蛍光検出にて測定する。なお倒立型の顕微鏡様の装置構成にすることも可能である。なお、本操作は単分子蛍光検出法に基づく場合、測定はHEPAフィルタを介したクリーンルーム様の環境にて行う。
配列番号2−人工配列の説明:プライマ
Claims (16)
- 解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない2箇所の塩基配列と、前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定することにより、前記解析対象核酸の塩基配列を解析する方法であって:
固相化したプライマに1本鎖化した前記フラグメントをハイブリダイズさせ、前記プライマからの伸長反応を行うとともに、前記プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、
前記伸長反応で生じた2本鎖核酸の長さを測定する工程、
を含むことを特徴とする核酸解析方法。 - 解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない2箇所の塩基配列と、前記塩基配列に挟まれた領域の長さを測定することにより、前記解析対象核酸の塩基配列を解析する方法であって:
固相化した第1プライマに1本鎖化した前記フラグメントをハイブリダイズさせ、前記第1プライマからの伸長反応を行うとともに、前記第1プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、
前記第1プライマ伸長鎖を一本鎖化して、第2プライマをハイブリダイズさせ、前記第2プライマからの伸長反応を行うとともに、前記第2プライマ下流の塩基配列の少なくとも一部を解析する工程と、
前記伸長反応で生じた2本鎖核酸の長さを測定する工程、
を含むことを特徴とする核酸解析方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記フラグメントの両方の鎖が同一のプライマにハイブリダイズするものであって、
前記伸長反応で生じた2本鎖核酸の長さが同一である2つの1本鎖フラグメントを選択し、それらが相補鎖をなすものとして前記解析対象核酸の塩基配列を解析することを特徴とする核酸解析方法。 - 前記フラグメントがその両末端にタグ配列を付加されたものである、請求項1に記載の核酸解析方法。
- 前記プライマが前記タグ配列と少なくとも一部において相補的である、請求項4に記載の核酸解析方法。
- 前記伸長反応で生じた2本鎖核酸にインターカレータを反応させ、その発光強度から前記2本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項1に記載の核酸解析方法。
- 2本鎖核酸の長さとインターカレータとの発光強度との相関を求めることにより、前記2本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項6に記載の核酸解析方法。
- 前記伸長反応を標識された基質を用いて行い、そのシグナル強度から前記2本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項1に記載の核酸解析方法。
- 前記標識が蛍光物質によるものであり、その蛍光強度から前記2本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項8に記載の核酸解析方法。
- 前記標識が放射性物質によるものであり、その放射線強度から前記2本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項8に記載の核酸解析方法。
- 前記標識が化学発光基質によるものであり、その化学発光強度から前記2本鎖核酸の長さを測定することを特徴とする請求項8に記載の核酸解析方法。
- 表面にプライマが配置された基板と、
基板上に核酸試料あるいは試薬を分注するための分注機構と、
核酸の変性、ハイブリダイゼーションを行うための温調機構と、
塩基配列決定及び核酸の長さ測定のための照射検出機構と、
前記機構を制御するための制御機構と、
前記検出結果を解析するための解析機構と、
前記解析結果を出力するための出力機構と、
を有し、
前記解析機構が、解析対象核酸に由来する複数のフラグメントについて、各フラグメント上の隣接しない2箇所の塩基配列と前記塩基配列に挟まれた領域の長さから、前記解析対象核酸の塩基配列を解析することを特徴とする核酸解析装置。 - 表面にプライマが配置された基板と、
基板上に核酸試料あるいは試薬を分注するための分注機構と、
核酸の変性、ハイブリダイゼーションを行うための温調機構と、
塩基配列決定及び核酸の長さ測定のための照射検出機構と、
前記機構を制御するための制御機構と、
前記検出結果を解析するための解析機構と、
前記解析結果を出力するための出力機構と、
を有し、
前記基板上にサイズマーカが配置されていることを特徴とする核酸解析装置。 - 前記基板上のサイズマーカが長さの異なる2以上の2本鎖DNAであることを特徴とする請求項13に記載の核酸解析装置。
- 前記基板上のサイズマーカが固定されている領域は、プライマが固定されている領域から隔離されていることを特徴とする請求項13に記載の核酸解析装置。
- 前記基板上のサイズマーカが固定されている領域は、プライマが固定されている領域の温調領域範囲外であることを特徴とする請求項13に記載の核酸解析装置。
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