CN101245373A

CN101245373A - 对核酸分子多片段基因进行平行检测和实时定量分析的方法

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Publication number: CN101245373A
Application number: CNA2007100376486A
Authority: CN
Inventors: 张露
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明提供了一种能通过一步反应较高通量地对多个基因片段或是多个核酸区域进行平行检测并实时定量分析的方法，并能准确检测这些基因片段或是核酸区域中单个碱基的变异。本发明的方法操作简便，不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，能高通量地对多个基因片段或是多个核酸区域进行定量检测，并能检测多个基因片段或是多个核酸区域中少至单个碱基的变化。

Description

对核酸分子多片段基因进行平行检测和实时定量分析的方法

技术领域

本发明涉及到核酸的检测，基因诊断，基因序列分析，基因类型及多态性的分析，以及基因表达的分析等生物技术领域。特别是在多个基因的检测上，以及多个基因的点突变检测或是单碱基多态性分析上。

背景技术

在基因检测或是核酸序列分析中，通常要检测不同基因片段或是不同核酸区域上的多个基因序列，甚至在这些片段或区域中少到一个基因位点的突变或是单个碱基多态性变化。多重PCR(multiple PCR)能对多个基因片段进行扩增，但扩增后很难分析扩增出的片段是所需检测的序列。且多重PCR中引物之间容易相互干扰，因而扩增条件难以优化，扩增片段数受到限制。多重PCR扩增后通过DNA微阵列检测，能较好的分析扩增序列是否为所需检测的基因序列，但操作较为繁琐，且准确率不高。

因此，本领域中需要开发出一种操作简便、重复性好、准确率高的检测多个基因片段或多个核酸区域的方法。

发明内容

本发明者经过深入研究，建立了能同时对多个基因片段或是多个核酸区域进行实时检测定量分析的方法，并且能检测这些基因片段或核酸区域中的点突变和单碱基多态性。

为实现上述目的，本发明提供了一种平行测定样品中多个基因片段或是多个核酸区域的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供样品液，所述样品液中包含待检测的基因片段或核酸区域；

b)提供固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种核酸探针分子；

c)提供至少一对一级引物，所述一级引物对中的至少一个引物包含与所述待测核酸分子互补的区域和不互补的区域；

d)提供至少一对二级引物，所述二级引物对中的至少一个与所述一级引物对中的所述至少一个引物的不互补区域的序列匹配；

e)使所述样品液、固相载体、一级引物、二级引物相互接触；

f)对所述样品中的待检测的基因片段或核酸区域进行扩增，在扩增反应时，用荧光基团标记扩增产物；

g)使所述扩增产物在扩增反应中和所述核酸探针分子相互杂交；

h)激发所述杂交上的扩增产物上的荧光分子，检测此荧光信号的位置和强度，从而确定样品中多种核酸分子的存在或量。

在一个较佳的实施方案中，所述核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在载体表面。

在另一较佳的实施方案中，所述核酸扩增反应包括通过DNA聚合酶、DNA反转录酶、RNA聚合酶、或是同时有多种这些酶参与的复制待测核酸分子片段的反应。

在另一较佳的实施方案中，所述一级引物每种的浓度是1pM-10nM，更优的是0.1-1nM。

在另一较佳的实施方案中，所述多个基因片段或多个核酸区域是同一基因的不同突变形式。

在另一较佳的实施方案中，在所述步骤f)中，通过使用有荧光基团标记的脱氧核苷三磷酸、有荧光基团标记的引物或其组合使扩增产物被荧光基团标记。

在另一较佳的实施方案中，所述激发杂交上的扩增产物上的荧光基团的方法包括通过倏逝场来激发，所述倏逝场通过在所述固相载体内发生的光的全内反射，或者通过平面波导来产生。

在另一较佳的实施方案中，所述激发所述杂交上的扩增产物上的荧光分子的方法包括通过荧光共振能量转换激发。

在另一较佳的实施方案中，所述荧光共振能量转换激发为所述扩增产物的荧光分子被连接在所述载体表面上的荧光基团的发射光所激发，或所述荧光共振能量转换激发为所述扩增产物的荧光分子的发射光激发连接在所述载体表面上的荧光基团。

在另一较佳的实施方案中，所述一级引物对中的至少一个引物中的不互补的区域包含标签序列。

本发明的方法是全新的，其通过一步反应能高通量的对多个基因片段或多个核酸区域进行检测，并且能对这些片段中的点突变和单碱基多态性进行检测和定量。更重要的是，它有着操作简便，重复性好，不需要反应后的开管检测步骤，检测时间短的优点，从而方便操作人员使用，并且降低样品间的交叉污染概率。同时，此技术也能定量分析多种基因型或是基因片段。总的来说，它具有检测通量大、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、操作简便、全封闭反应等优点，将成为分子生物学研究以及临床检测的重要工具。

附图说明

图1为二级引物链式聚合酶扩增反应和检测示意图。

图2为全反射产生倏逝场激发荧光基团的原理图。

图3为平面波导产生倏逝场激发荧光基团的原理图。

图4为通过荧光共振能量转移激发荧光基团的原理图。

图5显示了核酸探针分子通过化学键连接在玻璃表面。

图6为通过全反射产生倏逝场对多种核酸分子进行平行定量分析方法的示意图。

图7A显示，随着聚合酶链式反应的温度循环的进行，CCD检测到的被倏逝场激发的各探针点杂交上的荧光信号。

图7B为被倏逝场激发的各探针点实时定量聚合酶链式反应的荧光变化曲线。

图8为通过荧光共振能量转移对多种核酸分子进行平行定量分析方法的示意图。

图9A为随着聚合酶链式反应的温度循环的进行，CCD检测到的通过荧光共振能量转移激发的各探针点杂交上的荧光信号。

图9B为通过荧光共振能量转移激发的各探针点实时定量聚合酶链式反应的荧光变化曲线。

较佳实施方案

本发明提供了一种平行测定样品中多个基因片段或是多个核酸区域的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

适用于本发明方法的样品可以是各种形式，只要其中具有待检测的目标核酸分子即可。例如可以用本领域熟知或公开的方法(如限制性内切酶消化或机械方法)得到核酸样品，如总DNA、基因组DNA、cDNA、总RNA、mRNA等或其混合物。在较佳的实施方案中，所述样品为溶液形式。

本文所用的术语“核酸”、“核酸分子”可以互换使用，其指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。该术语“核酸”也可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。另外，本发明的核酸分子还涵盖了核酸片段、核酸区域、基因片段、核酸亚序列、核酸衍生物和核酸修饰物。所述的核酸长度可以各异，其可以是较大核酸分子的片段或较小的部分。较佳的是，待检测的核酸长度至少为30个碱基对，更佳的是长度为至少50个碱基对。待检测的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是单链或双链形式。其可从任何来源衍生待扩增的核酸。

在本发明方法中采用了一种固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种核酸探针分子，所述核酸探针分子对扩增反应产物的核酸分子中的一段序列有特异性。

本文所用的术语“固相载体”或“固体载体”是指核酸可固定于其上的对荧光基团的激发波长有低吸收的固体表面。例如，玻璃、尼龙膜、石英、陶瓷、金属、塑料、有机聚合物等材料都能做为本发明的固体载体，只要该载体在对要检测的荧光基团激发波长段的光低吸收，都能检测到明显的荧光信号。应当注意的是，对于载体并不必需是透明的，只要其对一定波长段的光低吸收，即对这一波段的光是透明的即可，其也可能在可见光的其他波段是不透明的。另外，固体载体的折射率需要大于所选液相的折射率，通常较佳的折射率需要大于1.33。在本发明中，优选的固相载体是玻璃。在较佳的实施方案中，这些载体宜经过化学方法修饰，从而带有活性基团，能与核酸上的氨基、醛基、磷酸基、或是修饰的巯基等形成稳定的连接，增强对核酸探针分子的固定能力。

本文所用的术语“固定”是指将核酸固定在固相支持物上，通过化学共价结合方式附着，或通过不可逆的被动吸附，或通过分子间的亲和力(例如利用生物素酰化的分子接头来固定于涂有亲和素的表面)。这种固定的强度必须足以在DNA变性条件下，不会因用水或缓冲水溶液洗涤而被除去。一种较佳的固定方法是采用双官能交联剂处理玻片，以得到带有反应性交联基团(如氨基、硫代或丙烯酸基团)的表面。所述交联剂可以是，例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐或马来酸酐、或异双官能团交联剂，如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺-4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)等。另外可参见文献：Nucleic Acids Research，29：e69，2001.Analytical Biochemistry，247：96-101，1997.Analytical Biochemistry，266：23-30，1999.Nucleic Acids Research，30：4793-4802，2002。

固定于载体表面上的核酸探针分子可根据各种要检测的反应产物的序列信息进行设计，从而使其能够以特异性的方式结合各自要检测的反应产物。该探针的长度可以由本领域技术人员根据需求进行合适的选择，通常在6-2000个核苷酸(较佳10-50个核苷酸、更佳15-30个核苷酸)之间。另外，根据具体的用途，可能还需要采用修饰过的核酸探针。该核酸探针可用本领域技术人员熟知的方法来制备。

核酸探针在固相载体上宜为空间上分开的阵列，其通常是这样构成的，将固相载体(如玻片)分成不同的区域，使每个区域中只含有一种核酸探针分子。通过DNA阵列技术，可使多种DNA探针分子排列在固体载体上。

用于核酸检测的核酸探针分子通常包括寡聚核苷酸、寡聚硫代核苷酸、肽核酸(peptide nucleic acid)、长链DNA分子、RNA分子、或者它们的修饰物。这些核酸探针分子可以通过化学键连接、物理吸附、或是聚合物包埋、蚀刻或粘联等方式固定在固体载体上。核酸探针还可通过接头或间隔臂连接在固相载体上(图5)。排列在固体载体上的DNA探针分子通过碱基间的相互配对，与目标分子(如反应产物)相结合。

在本发明中，通过二级引物扩增反应，可实现对待测样品中的多个基因片段进行扩增，从而达到检测多个特定基因片段是否存在的目的，并能检测多个基因中的点突变或是单碱基多态性。

在二级引物扩增反应中，使用了至少一对一级引物和至少一对二级引物。所用的一级引物对中至少一个引物包括与待测核酸分子互补的区域和与待测核酸分子不互补的区域两部分，二级引物对中的至少一个引物与一级引物对中的所述至少一个的不互补区域的序列相匹配。所述一级引物的序列宜在10-80个核苷酸之间，优选在20-60个核苷酸之间，更优选在20-40个核苷酸之间。引物长度超过80个时也能够实现所需的功能，只是该引物的合成不太方便。

更具体地说，对于一级引物而言，可包括两种情况：

(1)一级引物对中的两个引物(即上游引物和下游引物)均包含互补区域和不互补区域。在这种情况下，所述一级引物的长度宜在15-80个核苷酸之间，优选在20-60个核苷酸之间，更优选在20-40个核苷酸之间；其中，所述互补区域的长度宜为10-40个核苷酸，优选为10-30个核苷酸，更优选为15-20个核苷酸。所述不互补区域的长度宜为10-40个核苷酸，优选为10-30个核苷酸，更优选为15-20个核苷酸。

(2)一级引物对中的两个引物(即上游引物和下游引物)中只有一个包含互补区域和不互补区域，而另一个只含有互补区域。所述不含不互补区域的一级引物的长度可较另一引物短些，例如具有10-60个核苷酸，优选10-40个核苷酸，更优选为10-20个核苷酸。这时，只含有互补区域的一级引物也可作为这端的二级引物。

本文所用的术语“匹配”的含义不仅指两个序列之间信息完全一致或相同，还涵盖了两个序列基本上相同的情况。

判断两个序列“基本上相同的”一个指标是“相同性”百分数，即当用下文所述的本领域技术人员熟知的算法来比较和排列时，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸。在本发明中，“基本上相同”是指两个序列之间具有至少80％、较佳的90％、最佳的至少95％的核苷酸残基相同性。序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85：2444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包，GeneticsComputer Group，575Science Dr.，Madison，WI)等来进行。

判断两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个分子在严谨条件下相互杂交。在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)中，“严谨的杂交条件”和“严谨的杂交洗涤条件”取决于序列，而且在不同的环境参数下不同。通常，选择高度严谨的杂交和洗涤条件使得比在确定的离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。在“严谨条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，但不与无关序列杂交。在Tijssen(1993)《生物化学和分子生物学的实验室技术-与核酸探针的杂交》第2章第1部分(杂交原理以及核酸探针试验方法的综述”，Elsevier，New York)中提供了关于核酸杂交的广泛的指导。

在设计一级引物的序列时，一级引物中与待测核酸分子互补的区域位于其3’端，根据不同的待测核酸分子的序列不同，设计不同的序列。一级引物中与待测核酸分子不互补的区域通常为二级引物扩增和与固定的DNA探针杂交检测而设计。如图1所示，左图最上方显示了一级引物、二级引物和模板之间的关系，其中一级引物中有一部分与模板匹配或互补，另一部分与二级引物匹配或互补，该二级引物的5′端的星号表示荧光基团。

在本发明的一个实施方案中，所述一级引物与待测核酸分子不互补的区域中包括了一段标签序列。加入该标签序列的目的是为了能够设计特异的探针与某种扩增产物相结合。通常，多种基因类型的检测差异的碱基只有少数几个，甚至只有一个，差异小使得各种扩增产物与探针结合的交叉反应非常严重。因此，加上标签序列后使得少数一两的碱基的不同，放大成多个碱基的不同，因而设计探针十分容易，且不会发生交叉反应。另外，为了使一级引物不致于太长，标签序列也不用设计的太长，通常在3-10个碱基范围，较佳的在5-8个碱基范围内，对应的检测探针则要有一定长度，其通常在5-30个碱基范围，较佳的在10-25个碱基范围内。因为要保证在50-60度左右退火时能杂交上，探针只要跨过标签序列就行，因此，固定载体上的探针通常被设计成，除了与目的基因互补区域的部分序列外，还包括包括标签序列区和/或部分二级引物匹配区。

二级引物可设计成与一级引物中的不互补区域的全部序列或部分序列相匹配或互补。为简化反应，二级引物对的序列通常无需很多种，例如可以为1、2、3或4种，优选为1或2种。

在有些具体的实施方案中，一端的一级引物和二级引物可以共用同一个上游或下游的通用引物。也就是说，当要检测的多个目的基因中共同含有一段同源性较高的保守区时，一端的一级引物和二级引物可以设计在此区域，这时，这端的一级引物只含有互补区域，且一级引物和二级引物相同；而另一端，则根据这多个基因的不同序列，设计多种含互补区和不互补区的一级引物，以及相应的二级引物。

在扩增反应的过程中，一级引物先与目标核酸分子相结合，通过核酸扩增反应的延伸，使得扩增产物带上了原先目标核酸分子所不具有的不互补区序列。这样，一级引物的扩增产则能与二级引物相结合，进一步通过扩增反应而得到不断的复制。上述步骤可以依次进行。然而，在较佳方案中，反应液中可以同时含有两类引物，两步可同时进行，使操作更为简便。由于在扩增反应中有着二级引物的进一步扩增，因而一级引物的浓度不必太高，较佳浓度为0.1-1nM，这就使得一级引物之间的相互影响较小，从而使得扩增的平行性更好，扩增的通量更大，扩增条件更好选择。另外，对于选用相对成本较低的引物标记方法，则不需要荧光基团标记的多种引物，从而相对降低了成本，同时也降低了背景荧光。

在一个较佳的实施方案中，本发明的方法还能对多片段中单碱基突变的检测或是单碱基多态性进行检测。在检测单碱基突变或单碱基多态性的情况下，目标片段之间的差异性通常比较小，因此一级引物在PCR时就可能产生非特异性结合。通过设计引物使发生突变或有多态性的碱基设计在引物的最3′端，就可区分不同的序列，因为虽然3‘端不与目标序列互补的引物也会与模板结合，但是其不会延伸和扩增。因此，在本发明的一个较佳实施方案中，将一级引物设计成等位特异性的一级引物，从而可准确的检测多片段中单碱基突变的检测或是单碱基多态性。如图1右图所示，由于一级引物的3′末端与模板序列不匹配，从而导致扩增反应无法进行。

核酸分子能通过DNA聚合酶或是RNA聚合酶在体外进行复制，转录，反转录的过程，从而线性或是指数性的扩增其拷贝数。如本领域技术人员所知道的，扩增过程通常包括变性，退火，合成三个步骤，即双链核酸分子的解链(变性)，被解链的核酸分子与引物分子结合(退火)，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以解链的核酸分子为模板合成与之互补的DNA或RNA分子。

可用于本发明的核酸扩增方法包括，但不局限于，聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，随机引物扩增反应，复合聚合酶链式反应扩增等。在一个较佳的实施方案中，宜采用聚合酶链式反应。“聚合酶链式反应”或“PCR”指一种适用于核酸、RNA和/或DNA的小量特定片段的技术，其在例如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中有详细的描述。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列基本上相同或相似。两个引物的5′端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。聚合酶链式反应可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。本文所用的PCR被认为是扩增样品中核酸分子的一个但并非唯一的例子，该方法中采用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生特定片段的核酸。

在聚合酶链式反应中，双链的DNA分子在90℃以上变性成单链分子，然后在50-60℃与引物分子相结合，同时结合上DNA聚合酶，DNA聚合酶以此单链DNA分子为模版，脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物，复制出另一条与之互补的DNA，通常聚合酶链式反应中的DNA聚合酶最适的合成温度为70-78℃。通过复制，目标DNA分子扩增了一倍。这样多次的重复反应n个循环后，目标DNA分子扩增了近2n倍。具体可用于本发明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(T4DNA聚合酶)、各种耐热细菌的热稳定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu、Tli、Tfl DNA聚合酶)以及它们遗传修饰的衍生物(TaqGold，VENTexo，Pfu exo)。优选的DNA聚合酶是Taq或Tfl DNA聚合酶。较佳地，用于本发明的核苷三磷酸分子是脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或核糖核苷三磷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。

在核酸分子进行扩增反应的过程中，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)为底物进行合成，合成成新的扩增产物。因此，通过在扩增引物上标记荧光基团或是在底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)上标记荧光基团，就可使扩增的目标DNA分子就会标记上所需的荧光基团。

通常目标核酸分子通过扩增反应使得扩增产物被荧光基团标记上的，它可通过扩增反应使用荧光基团等标记的脱氧核苷三磷酸(dNTP)掺入到目标核酸分子的扩增产物中，或是通过荧光基团标记的二级寡核苷酸引物使反应产物带上荧光基团的方法。

标记荧光基团的技术是现有技术中所熟知的。常见的荧光基团包括，但不局限于，有机荧光分子类，如荧光素，TAMRA，Cy3，Cy5，Cy5.5，罗丹明，Alexa Fluor系列等；荧光蛋白类，如GFP，CFP，BFP，YFP等；含稀土金属离子的时间分辨荧光以及量子点(Quantum dot)四个种类。

在扩增反应的退火过程中，荧光基团标记的扩增产物会与固定在载体上的核酸探针分子相结合(图1)，设计固定在载体上的核酸探针分子要注意特异地不与二级引物相杂交。与固定在载体上的核酸探针分子相杂交的针对目标核酸分子的连接或扩增产物上的荧光基团得以被本发明的特异的方式激发。具体而言，这些荧光基团可以被载体内由光的全反射、或是平面波导所产生的倏逝场激发，也能通过荧光共振能量转换的方式所激发。

(1)倏逝场

(i)光的全反射产生的倏逝场

众所周知，当光从高折射率(n₁，如玻璃)的介质(光密介质)照射到低折射率(n₂，液相如水)的介质(光疏介质)，并且入射角大于临界角(θc，θc＝sin^-1(n₂/n₁)当n₂＜n₁)时，光将在光密介质中发生全反射，从而不能折射到光疏介质中。然而，当光发生全反射时，光波会以电磁场的形式在入射点的地方渗透至光疏介质中，渗透的电磁场的强度随着渗透深度的加深而成指数衰减(图2)，其渗透的深度为：

d_p＝(λ/2πn₁)[1/(sin²θ-n₂ ²/n₁ ²)]^1/2(λ，光在真空中的波长；θ，入射角度)

其深度通常在100到300纳米之间。根据公式，它与入射角，入射光波长，折射率有关。这种通过全反射渗透到光疏介质的电磁场就被称为倏逝场。倏逝场和其他光源一样，也能激发荧光基团。如果光密介质表面镀有纳米量级(约100-200纳米)的金、银、铜等贵重金属膜或颗粒，将可以一定程度的增强倏逝场激发荧光的强度，增强程度为几倍到几十倍不等，增强程度与金属种类和厚度等因素有关(参见文献：Analytical Biochemstry，334：303-311，2004.Journal of Fluorescence，14：425-441，2004.Current Opinion in Biotechnology，16：55-61，2005)。因此，在本发明的一个较佳的实施方案中，光密介质(即固相载体)表面可以镀有小于1000纳米厚(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属膜，或者直径小于1000纳米(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜或其它贵金属。

由于倏逝场渗透的深度非常小，只有几百纳米，因此倏逝场只能激发贴近于介电层100-200纳米内的荧光基团，而绝大部分在光疏介质中的荧光基团不会受到激发。倏逝场激发的荧光信号强度相当于结合到载体表面的目标分子扩增产物的量。溶液中荧光标记的目标分子的扩增产物浓度越高，与固定的探针结合上的分子也越多，激发的荧光信号也越强。

(ii)平面波导产生的倏逝场

平面波导一般为100-300纳米的高折射率膜，例如五氧化二钽(Ta₂O₅)，二氧化钛(TiO₂)，氧化锌(ZnO)，氧化锆(ZrO₂)，氧化铌(Nb₂O₅)，氧化铪(HfO₂)等金属氧化物膜。其沉积在透明的低折射率的固体基材(如玻璃，透明聚合物等)上。激光通过棱镜或是光栅等方法耦合进该高折射率膜后，光在这一平面薄膜内传输。同时，它将在高折射率膜和低折射率层之间产生很强的随着渗透的深度的加深而成指数的衰减的倏逝场(图3)。倏逝场渗透的深度为：

该深度同样在大约100-200纳米。在这平面波导层上固定上核酸探针分子后，倏逝场将激发杂交上的荧光探针分子，如果在平面波导层上镀有纳米量级(约100-200纳米)的金、银、铜等贵重金属膜或颗粒，将可以一定程度的增强倏逝场激发荧光的强度，增强程度为几倍到几十倍不等，增强程度与金属种类和厚度等因素有关。同样的，由于平面波导产生的倏逝场穿透深度在纳米级，绝大部分在反应液这一光疏介质中的荧光基团不会受到激发，从而就能检测平面波导层上的特定位置的荧光强度。

(2)荧光共振能量转换

与探针分子结合的目标核酸分子扩增产物上的荧光基团也可以通过荧光共振能量转移(Flourescent resonance energy transfer，FRET)来激发。如图4所示，荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团在空间上距离较近，且其中一种生色团(供体)401的发射谱与另一种生色团(受体)407的激发谱有重叠时，当供体被激发时(如402所示)，受体409会因供体激发能的转移408而被激发。理论上讲，只要两个光谱有重叠，就会发生FRET，只是能量转移的效率与光谱重叠的积分、荧光量子效率和供体受体的距离等因素有关。(可参照文献：Proc Natl Acad Sci U S A 58：719-726，1967)能量转移50％时的距离R₀＝[8.8×10²³×κ²×n^-4×QY_d ×J(λ)]^1/6

，κ为极化方向因子，供体受体方向随机是通常为2/3，n为折射率，水溶液通常为1.33，QY_d为供体的荧光量子效率，J(λ)为供体的发射光谱与受体激发光谱重叠的积分强度。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多410，而受体发射的荧光却大大增强409，能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系。发生荧光共振能量转移时，分子间距离小于10nm。常用的FRET荧光基团对对于本领域技术人员而言是熟知的，其包括，但不局限于，CFP-YFP，CFP-dsRED，BFP-GFP，GFP-dsRED，YFP-dsRED，Cy3-Cy5，Alexa488-Cy3，FITC-罗丹明(TRITC)，YFP-TRITC，YFP-Cy3，Fluorescein-Tetramethylrhodamine，IAEDANS-Fluorescein，EDANS-Dabcyl，Fluorescein-QSY 7andQSY 9，Alexa Fluor 350-Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 546，Alexa Fluor488-Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor568，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor555-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor647，Alexa Fluor 555-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 568-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor594-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 350-QSY 35，Alexa Fluor 488-QSY 35，Alexa Fluor546-QSY 35，Alexa Fluor 350-dabcyl，Alexa Fluor 488-dabcyl，Alexa Fluor 546-dabcyl，Alexa Fluor 488-QSY 7and QSY 9，Alexa Fluor 546-QSY 7and QSY 9，Alexa Fluor555-QSY 7and QSY9，Alexa Fluor 568-QSY 7and QSY 9，Alexa Fluor 568-QSY 21，Alexa Fluor 594-QSY 21，Alexa Fluor 647-QSY 21等。然而，本领域技术人员能够明了还能够将其它FRET荧光基团对用于本发明的方法中。

因此，利用荧光共振能量转移的方法检测时，只需要固定在固体载体上的探针分子404连接上荧光基团401，而被检测的目标核酸405分子标记上另一种荧光基团407。并且这两种荧光基团，其中一种生色团(供体)401的发射谱与另一种生色团(受体)407的激发谱有相当程度的重叠时，光源402激发供体410，而检测受体409发出的荧光411，那么只有杂交上的核酸分子406的荧光才能被检测到，大量的在溶液中的以及未被杂交上的探针上的背景荧光不被激发407，或是激发的光由于不发生荧光共振能量转移，发射的波长不同403，可以被滤镜过滤而不被检测到。这样，荧光信号强度相当于结合到载体表面的目标分子的扩增产物的量。溶液中荧光标记的扩增产物浓度越高，与固定的探针结合上的分子也越多，激发的荧光信号也越强。

上述两个方法中的荧光信号和强度可用常规的仪器来进行检测，例如可以采用电荷耦合器(Charge-Coupled Device，CCD)，光电倍增管(PMT)，光电探测器，或者光功率计等检测设备。荧光标记优选的检测系统是电荷耦合仪(CCD)照相机，它可任选地与放大装置(如显微镜)连接。

本发明所述的以上两种方法所用设备可以基于相类同的光学平台配置，它们通常包含如下配置：

激发光源：包括稳定的汞灯、氙灯、汞氙复合电弧灯光源；LED光源；从紫外到红外波段不同波长的激光光源，包括气体激光，半导体激光。

中性密度滤光片：用以控制激发光的强度。

透镜组：用来整合光的条带，控制光的入射。

滤镜组：为选定的荧光基团组合配置合适的滤镜组，包括激发，发射，二色分光等。它可以削减光谱串色，提高要检测荧光的信号噪声比。

检测设备：其特征是能感应某一位置光强度，核心成分可从高灵敏度PMT或冷CCD，光电探测器，或者光功率计中选择。

在本发明中，随着反应一步步扩增，荧光标记的扩增产物的浓度呈指数方式增加，与固定在载体表面的探针分子结合上的也增多，相应探针位置上激发的荧光信号也增强。因此，能够在整个核酸扩增反应过程进行了多种探针的实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号。随之可以绘制成多条S型曲线，得出多个探针分子的Ct值，从而判断和检测目标核酸的种类、突变和拷贝数。

本发明由此原理，实际上涉及一种多片段实时定量聚合酶链反应技术，该技术在上述的反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积，实时监测整个反应进程，它与实时定量PCR技术类似，最后可对多个目标核酸分子片段及其突变体进行定量分析。在PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终聚合酶链式反应不再以指数方式生成目标核酸扩增产物(或称为摸板)，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测聚合酶链式反应的最终扩增产物，用此终点法对聚合酶链式反应产物定量存在不可靠之处。在实时定量PCR反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条S形曲线。在聚合酶链式反应早期，产生荧光信号的水平不能与背景明显地区别，而后荧光信号的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在聚合酶链式反应处于指数期的某一点上来检测聚合酶链式反应产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在实时定量聚合酶链式反应反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。在本发明中，与实时定量聚合酶链式反应过程类似，在扩增反应中通过实时监测反映进程中与探针分子结合的荧光信号变化，也将得到一组S形曲线和相应的Ct值。根据各个Ct值，可判断和检测相应目标核酸的种类、突变和拷贝数。尽管本发明实施例中设定Ct值为扩增反应开始时信号值的3倍，然而，应当理解，本领域技术人员能够根据具体需求选择和确定合适的Ct值。本发明研究表明，每种模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，在利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线后，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，或是通过比较各个Ct值推算各种目标分子起始拷贝数的相对量。

为了更详细的叙述本发明，根据附图进行如下具体说明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用本领域技术人员所知的常规技术，这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1

作为实施例1，对适用本发明的核酸检测方法来分析多种基因类型的存在，以鉴定细菌种类和定量分析为例进行说明，通过倏逝场的方法进行实时检测。

核酸序列分析是对细菌鉴定的常用方法。通常，通过分析细菌相对较保守的基因序列，如16S-rRNA，23S-rRNA，GyrB，rpoD等基因，而检测鉴定细菌的属种。以分析16S-rRNA基因序列为例。上游引物设计在易变区，针对不同的细菌设计的一级引物不同；下游引物设计在保守区，各种细菌共用同一种下游引物。针对细菌DNA16SrDNA区域设计二级聚合酶链反应的上游和下游引物，其中上游引物分为一级引物和二级引物。

上游的一级引物为：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：

5’GTCAA TCTA GA CGA GGTGCCatacgactcactataGGCAATGGGGGCAACCCTGAC

C(SEQ ID NO：1)

单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCtaaccctcactaaaCGCAATGGACGAAAGTCTGAC

G(SEQ ID NO：2)

大肠杆菌(Escherichia.Coli)：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCattgcgtacctcatGCACAATGGGCGCAAGCCTGAT

GC(SEQ ID NO：3)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：

5’GTCAA TCTAGA CGA GGTGCCtatgctgagtgatatGGCAATGGACGGAAGTCTGACC(SEQ ID NO：4)

以上设计的一级引物中正体大写字母的碱基为与模板序列匹配的碱基，小写字母的碱基为标签序列，用于区分多种扩增产物，斜体大写字母的碱基为二级引物结合序列。在这些一级引物中，序列中间可能有一两个碱基由于碱基的多态性或突变而可能不完全匹配，但通过稍稍降低反应退火温度后不会影响PCR反应的进行。

上游的二级引物为：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCC(SEQ ID NO：5)

下游引物则采用以下细菌16S rDNA保守区段的通用引物：

5’Cy5-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3′(SEQ ID NO：6)

针对二级PCR反应的产物设计以下用于阵列化检测的探针用于检测识别扩增反应产物，探针带有-NH2标记：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：

5’atacgactcactataGGCAATGGGcccccaaaaa-NH₂(SEQ ID NO：7)

单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)：

5’taaccctcactaaaCGCAATGGACcccccaaaaa-NH₂(SEQ ID NO：8)

大肠杆菌(Escherichia.Coli)：

5’attgcgtacctcatGCACAATGGGcccccaaaaa-NH₂(SEQ ID NO：9)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：

5’tatgctgagtgatatGGCAATGGACcccccaaaaa-NH₂(SEQ ID NO：10)

最5’端小写的部分跟二级引物序列同源，中间的大写部分是标签序列，3’端和目标DNA互补/同源。

(以上cccccaaaaa序列为space片段，用于降低杂交上的空间位阻)

各种阵列识别探针分子通过化学连接方法固定在玻璃表面，具体的固定方法可参照文献Nucleic Acids Research，27：1970-1977，1999.中的方法。当然，它们也能通过化学键连接，物理吸附，或是聚合物包埋等方式固定在其他透明的折射率比反应溶液高的其他固体载体上，如石英，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，PMMA等。

取细菌样品的基因组DNA与dNTP、PCR二级扩增引物、酶、反应缓冲液等按以下浓度混合后加到反应舱中：

20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM MgCl2，75mM KCl，10mM DTT，0.1mM dNTP；各种一级引物浓度分别为0.1nM；二级引物浓度各200nM；20u Taq DNA polymerase。

反应在以下的温度循环中进行：

96℃2min(变性)

30个如下循环

94℃30s(变性)

60℃1min(引物退火)

74℃30s(延伸)

为更详细的说明此发明，下面结合图6对本发明实施例的方法及过程进行详细说明。如图所示，各种核酸探针603，604通过DNA阵列的方法固定在K9玻璃609，表面。固定探针的玻璃与一样品槽601密合形成反应舱。将反应液加入到反应舱后，整个反应温度受到一个加热温度控制平台605的控制，通常可通过半导体制冷片加热和制冷，按照以上的温度循环，进行多个循环扩增。在扩增反应的过程中，一级引物先与目标核酸分子相结合，通过核酸扩增反应的延伸，使得扩增产物带上了原先目标核酸分子所不具有的不互补区序列。从而使得一级引物的扩增产物则能与二级引物相结合，进一步通过扩增反应而得到不断的复制。由于二级引物上标记的Cy5荧光基团，最终的扩增产物也标记上了Cy5荧光基团(如图1)。

随着反应的进行，Cy5标记的PCR扩增产物成指数增长。在每个循环的60℃反应过程中，扩增反应产物也将与固定的识别探针通过碱基的相互配对而结合。这种结合信号被全反射产生的倏逝场激发而被检测到。即，在60℃退火过程进行约1分钟后，氦氖离子激光器606被打开，产生632纳米的激光。激光通过一透镜组607，整合成线状后，通过棱镜608，以大约75度的角度偶合进玻片609中，由于入射角大于折射临界角(θc＝sin^-1(1.33/1.52))，激光在玻片中产生多次的全反射，从而产生倏逝场。

由于每一类型的一级引物所带的标签序列不一样，阵列化的识别探针一部分与标签序列匹配另一部分与一级引物上与目的基因互补区序列相匹配，每种16S rDNA的基因类型对应的扩增反应产物将特异的只与一种识别探针相结合。因此在与对应的扩增产物杂交的识别探针分子位点上，倏逝场激发杂交上的目标基因片段上的Cy5荧光基团，使它产生660纳米左右的发射波长，此发射波长通过一中心波长660纳米的滤镜611后，被CCD(612)接收，通过CCD可检测到各探针点位置上的荧光信号强度。阵列上各点的信号的有无对应相应的碱基形态。随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的信号值随之增大(图7A)，当某一点的信号值达到一域值，即扩增反应开始时信号值的3倍，记录这时的循环数Ct_i(i为探针编号)(图7B)。根据各个探针的Ct_i可以定量各种碱基形态的相对拷贝数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，而且起始拷贝数越多，Ct值越小，因此，根据Ct值可以推算出各种目标基因的起始相对拷贝数。

实施例2

作为实施例2，对适用本发明的核酸检测方法，利用荧光共振能量转换检测的方法对人基因组多个区段的单碱基多态性的分析为例进行说明。

取人的基因组DNA。针对人染色体6p22中三个位点的碱基多态性设计一级扩增引物，分别为：

上游：

GTCAATCTAGACGAGGTGCCATACGACTCACTATAagcagactcaaatggatttctggg(SEQ ID NO：11)

GTCAATCTAGACGAGGTGCCTAACCCTCACTAAAagcagactcaaatggatttctgga(SEQID NO：12)

下游：CCAGTCACGACGTTGTAAAACGcttacgcataaacccccaag(SEQ ID NO：13)

上游：

GTCAATCTAGACGAGGTGCCATACGACTCACTATAgtacactaaggtgggagtaatt(SEQID NO：14)

GTCAATCTAGACGAGGTGCCGTAACCCTCACTATAAAgtacactaaggtgggagtaatc(SEQ ID NO：15)

下游：CCAGTCACGACGTTGTAAAACGatcacttcaccccacacac(SEQ ID NO：16)

上游：

GTCAATCTAGACGAGGTGCCATACGACTCACTATAgacatggtcttaaaatgtataaaac(SEQ ID NO：17)

GTCAATCTAGACGAGGTGCCTAACCCTCA CTAAA gacatggtcttaaaatgtataaaag(SEQ ID NO：18)

下游：CCAGTCACGACGTTGTAAAACGgcacgatactgaatgcacca(SEQ ID NO：19)

以上使用的一级引物中，正体小写字母的碱基为与模板序列匹配的碱基，其中3’末端带下划线的碱基为多态性的碱基。大写字母的碱基为不互补区，包括正体字母表示的二级引物结合区和斜体字母表示的区分多态性位点的标签序列。

设计的一对二级扩增引物分别为：

上游：Cy5-GTCAATCTAGACGAGGTGCC(SEQ ID NO：20)

下游：CCAGTCACGACGTTGTAAAACG(SEQ ID NO：21)

针对扩增反应的产物设计以下用于阵列化检测的探针用于检测识别目标扩增产物：

NH2-catttgagtctgctTATAGTGAGTCGTAT-TAMRA(SEQ ID NO：22)

NH2-catttgagtctgctTTTAGTGAGGGTTA-TAMRA(SEQ ID NO：23)

NH2-caccttagtgtacTATAGTGAGTCGTAT-TAMRA(SEQ ID NO：24)

NH2-caccttagtgtacTTTAGTGAGGGTTA-TAMRA(SEQ ID NO：25)

NH2-tttaagaccatgtcTATAGTGAGTCGTAT-TAMRA(SEQ ID NO：26)

NH2-tttaagaccatgtcTTTAGTGAGGGTTA-TAMRA(SEQ ID NO：27)

各种阵列识别探针分子通过化学连接方法固定在玻璃表面，具体的固定方法可参照文献Nucleic Acids Research，27：1970-1977，1999.中的方法。当然，它们也能通过化学键连接，物理吸附，或是聚合物包埋等方式固定在其他低背景荧光的固体载体上。

将人基因组DNA与二级扩增反应的引物、dNTP、酶、反应缓冲液等按以下浓度混合后加到反应舱中：

20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM MgCl2，75mM KCl，10mM DTT，0.1mM dNTP；各种一级引物浓度分别为0.5nM；二级引物浓度各200nM；20u Taq DNA polymerase。

反应在以下的温度循环中进行：

96℃2min(变性)

30个如下循环

94℃30s(变性)

60℃1min(引物退火)

74℃30s(延伸)

为更详细的说明此发明，下面结合图8对本发明实施例方法及过程进行详细说明。如图所示，各种核酸探针803，804通过DNA阵列的方法固定在固相载体表面809。固定探针的玻璃与一样品槽801密合形成反应舱。将反应液加入到反应舱后，整个反应温度受到一个加热温度控制平台805的控制，按照以上的温度循环，进行多个循环扩增。在扩增反应的过程中，一级引物先与目标核酸分子相结合，通过核酸扩增反应的延伸，使得扩增产物带上了原先目标核酸分子所不具有的不互补区序列。从而使得一级引物的扩增产物则能与二级引物相结合，进一步通过扩增反应而得到不断的复制。由于二级引物上标记的Cy5荧光基团，最终的扩增产物也标记上了Cy5荧光基团(如图1)。

随着反应的进行，Cy5标记的PCR扩增产物成指数增长。在每个循环的60℃退火过程中，扩增反应产物也将与固定的识别探针通过碱基的相互配对而结合。这种结合信号通过荧光共振能量转换激发而被检测到。即，在60℃退火过程进行约2分钟后，氩离子激光器806被打开，产生约514纳米的激光。激光通过一透镜组807，照射在固体载体表面固定的探针区域。当Cy5标记的扩增产物，与对应的TAMRA标记的探针分子相杂交结合。514纳米的激光激发探针分子上的TAMRA基团而产生590纳米左右的发射波长，而这一发射的荧光又被杂交上的扩增DNA上的Cy5基团所吸收，从而使Cy5基团产生660纳米的发射波长而呈红色(如图4)。

如果在样品中没有的对应的基因多态性的差异，相应的一级引物将不与DNA模板相结合，从而不会扩增出对应的扩增产物，其对应的识别探针分子不结合上有Cy5基团的分子，被激发后，将产生TAMRA产生的590纳米左右的发射光。另外，溶液中的含有未杂交上的Cy5基团将不被激发。CCD(810)通过一中心波长为660纳米的滤镜809后被检测成相，由于杂交上的探针分子发出的660纳米的红光能够透过660纳米的滤镜，而没被杂交上的探针分子发出的590纳米的蓝光，和被散射的514纳米的激光都不能透过。因此，CCD成像的各探针点位置上的信号强度，即为杂交上的DNA的量(图9A)。

随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的信号值随之增大，当某一点的信号值达到一域值，即扩增反应开始时信号值的3倍(图9B)，记录这时的循环数Ct_i(i为探针编号)。根据各个探针的Ct_i而定量各多态型的量。当然对于基因组来说，单拷贝的基因的量都是相等的，通常只要检测碱基的形态。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

序列表

<110>张露

<120>对核酸分子多片段基因进行平行检测和实时定量分析的方法

<130>070473

<160>27

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

gtcaatctag acgaggtgcc aatacgactc actataggca atgggggcaa ccctgacc 58

<210>2

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

gtcaatctag acgaggtgcc taaccctcac taaacgcaat ggacgaaagt ctgacg 56

<210>3

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gtcaatctag acgaggtgcc at tgcgtacc tcatgcacaa tgggcgcaag cctgatgc 58

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gtcaatctag acgaggtgcc atatgctgag tgatatggca atggacggaa gtctgacc 58

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gtcaatctag acgaggtgcc 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gtattaccgc ggctgctgg 19

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>探针

<400>7

atacgactca ctataggcaa tgggccccca aaaa 34

<210>8

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<213>人工序列

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<223>探针

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taaccctcac taaacgcaat ggacccccca aaaa 34

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>探针

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attgcgtacc tcatgcacaa tgggccccca aaaa 34

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<223>探针

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tatgctgagt gatatggcaa tggacccccc aaaaa 35

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gtcaatctag acgaggtgcc atacgactca ctataagcag actcaaatgg atttctggg 59

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gtcaatctag acgaggtgcc taaccctcac taaaagcaga ctcaaatgga tttctgga 58

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<213>人工序列

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<223>引物

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ccagtcacga cgttgtaaaa cgcttacgca taaaccccca ag 42

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<223>引物

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gtcaatctag acgaggtgcc atacgactca ctatagtaca ctaaggtggg agtaatt 57

<210>15

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<223>引物

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gtcaatctag acgaggtgcc gtaaccctca ctaaagtaca ctaaggtggg agtaatc 57

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<212>DNA

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ccagtcacga cgttgtaaaa cgatcacttc accccacaca c 41

<210>17

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gtcaatctag acgaggtgcc atacgactca ctatagacat ggtcttaaaa tgtataaaac 60

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gtcaatctag acgaggtgcc taaccctcac taaagacatg gtcttaaaat gtataaaag 59

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ccagtcacga cgttgtaaaa cggcacgata ctgaatgcac ca 42

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gtcaatctag acgaggtgcc 20

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ccagtcacga cgttgtaaaa cg 22

<210>22

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<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>探针

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catttgagtc tgcttatagt gagtcgtat 29

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<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>探针

<400>23

catttgagtc tgcttttagt gagggtta 28

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<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>探针

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caccttagtg tactatagtg agtcgtat 28

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<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>探针

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caccttagtg tactttagtg agggtta 27

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<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>探针

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tttaagacca tgtctatagt gagtcgtat 29

<210>27

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>探针

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tttaagacca tgtctttagt gagggtta 28

Claims

1. 一种平行测定样品中多个基因片段或是多个核酸区域的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在载体表面。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应包括通过DNA聚合酶、DNA反转录酶、RNA聚合酶、或是同时有多种这些酶参与的复制待测核酸分子片段的反应。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级引物每种的浓度是1pM-10nM，更优的是0.1-1nM。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个基因片段或多个核酸区域是同一基因的不同突变形式。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤f)中，通过使用有荧光基团标记的脱氧核苷三磷酸、有荧光基团标记的引物或其组合使扩增产物被荧光基团标记。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激发杂交上的扩增产物上的荧光基团的方法包括通过倏逝场来激发，所述倏逝场通过在所述固相载体内发生的光的全内反射，或者通过平面波导来产生。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激发所述杂交上的扩增产物上的荧光分子的方法包括通过荧光共振能量转换激发。

9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光共振能量转换激发为所述扩增产物的荧光分子被连接在所述载体表面上的荧光基团的发射光所激发，或所述荧光共振能量转换激发为所述扩增产物的荧光分子的发射光激发连接在所述载体表面上的荧光基团。

10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级引物对中的至少一个引物中的不互补的区域包含标签序列。