CN103421881A - 在薄壁容器中对核酸分子进行分析和检测的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在薄壁容器中对核酸分子进行分析和检测的方法和装置。本发明的方法和装置借助高折射率液体将激发光以高于临界角的角度射入薄壁的反应容器中，从而产生光的全反射引起的倏逝场(Evanescent Field)激发。倏逝场激发与容器内壁上固定的探针相结合的目标产物上的荧光基团，而反应溶液中大量未结合的目标分子或是荧光基团几乎不被激发。通过检测荧光信号强度的变化来定量核酸分子的量。本发明的方法不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，因此成本低、检测的目标分子通量高。

Description

在薄壁容器中对核酸分子进行分析和检测的方法和装置

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及在薄壁容器中对核酸分子进行分析和检测的方法和装置。本发明的方法和装置可用于核酸的检测、基因诊断、基因序列分析、基因类型及多态性的分析、以及基因表达的分析等生物技术领域，特别是在基因检测的实时定量聚合酶链式反应(Realtime quality PCR)、连接酶反应和阵列化的核酸检测领域。

背景技术

自从1985年，Kary Mullis发明聚合酶链式反应以来，聚合酶链式反应技术一下子成为了分子生物学发展以来最具影响力的技术革命之一。它使得核酸检测成为一种成熟的，高灵敏度，快速的检测技术，并且很快的广泛应用到分子生物学研究和微生物病原体体的临床检测中，包括真菌、细菌、病毒等的检测。Kary Mullis也因此于1993年获得了诺贝尔奖。

但是，聚合酶链式反应后需要烦琐的DNA电泳检测，并且由此容易产生样品相互之间的交叉污染。使得聚合酶链式反应对技术操作人员以及实验室要求很高，而且检测的错误率很高。聚合酶链式反应最终在临床检测的应用受到了挑战。

聚合酶链式反应可以结合上逆转录反应、连接酶反应等，使得聚合酶链式反应被应用于核酸检测的多个方面。

到二十世纪九十年代的中后期，在聚合酶链式反应技术和荧光技术基础上发展起来的实时定量聚合酶链式反应(Real time quality PCR)技术，实现了PCR从定性到定量的飞跃，减去了DNA电泳检测，使得操作简便了一些，并且省去了DNA电泳检测的时间。同时也使得交叉污染的机率降低了，提高了检测的准确性，并且能够更准确的量化被检测的核酸分子。这一技术的检测线形范围能达到7-9个数量级，灵敏度能检测到低到几个拷贝的核酸分子，精确性可以达到小于3%的偏差。它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，并且开始被临床检测所接受。

临床微生物的检测是实时定量聚合酶链式反应技术现在在临床检测的最重要的领域，它比传统的临床微生物检测技术大大的缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度，而且操作更加简便。目前，主要用于一些常见病毒，如HIV，HBV，HCV等的临床检测，或是难培养的细菌，如结核杆菌的检测上。在生命科学研究，特别是基因表达的定量分析上，实时定量聚合酶链式反应技术也有着非常广泛的应用。实时定量聚合酶链式反应技术同时也被应用在环境监测，公共卫生检测，生物武器检测等分析上。

但是，很多核酸检测需要检测和定量的核酸分子不止一种。而实时定量聚合酶链式反应技术又恰恰难进行多种核酸的平行检测和定量分析。很多生物技术公司，包括ABI，Invitrogen等，或是生物技术研究室都在试图开发多通量的核酸平行检测和定量分析技术。这些多种核酸的实时定量聚合酶链式反应技术，或是通过用多种不同光谱的荧光分子来标记不同的探针分子来检测不同的核酸分子，或者是在多个反应管道中分别进行多个实时定量聚合酶链式反应。而这些技术或是要求多种不同光波段的荧光分子，或是需要高密度的反应管道，使得原先就已经比较昂贵的实时定量聚合酶链式反应技术，其试剂和仪器成本成倍的增长。而且，它们的检测通量受到了荧光分子种类和反应管道体积的限制。

随着DNA芯片技术的兴起，平行地对多种核酸进行监测成为可能。但是生物芯片操作程序繁琐，人员要求高；检测重复性、准确性差；检测的时间长等因素，限制了芯片技术对多种核酸进行监测的应用。

因此，本领域中迫切需要提供改进的、操作简便的能同时对多种核酸分子进行实时定量检测的方法。

发明内容

本发明者经过深入研究，建立了能同时对多种核酸分子进行实时定量检测的方法。

在本发明的第一方面，提供一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一反应容器，其内壁固定有一种或多种核酸探针，所述的一种或多种核酸探针特异性针对所述的一种或多种核酸分子；

在所述的反应容器内装入核酸反应液以及待测样品并浸没所述的核酸探针；

b)提供一高折射率液体装载容器，其中装有高折射率液体且能控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度；设置一激发光源通过所述高折射率液体，在固定有核酸探针的反应容器内壁与核酸反应液的界面处产生倏逝场；

将a)的反应容器放置于该高折射率液体装载容器，且反应容器中固定有核酸探针的壁浸埋于高折射率液体；进行核酸反应，在核酸反应中对核酸反应产物标记荧光基团；

c)核酸反应进行中或完成后，通过倏逝场激发核酸分子的荧光基团，产生荧光信号；

d)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中一种或多种核酸分子的存在或量。

在一个优选例中，所述核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在反应容器的内壁。

在另一优选例中，所述倏逝场是通过在所述反应容器壁与核酸反应液的界面发生的光的全反射而产生。

在另一优选例中，所述反应容器壁厚小于1mm。

在另一优选例中，所述的反应容器的壁厚为0.02-1mm；更佳地为0.05-0.5mm；更佳地为0.08-0.2mm。

在另一优选例中，所述反应容器的制作材料选自(但不限于)：玻璃、石英、塑料或有机聚合物。

在另一优选例中，所述的有机聚合物选自：聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯。

在另一优选例中，所述反应容器内壁上镀有厚度小于1000nm厚的金属膜，或者直径小于1000nm的金属颗粒(较佳地，金属颗粒在反应容器内壁的镀层厚度小于1000nm)，其中所述金属选自金、银、铜。

在另一优选例中，所述高折射率液体为折射率大于核酸反应液的折射率的液体；较佳地，为折射率大于1.34的液体。

在另一优选例中，所述的高折射率液体的折射率为1.34-2.0。

在另一优选例中，所述的高折射率液体装载容器中包括一温度控制装置，以控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度。

在另一优选例中，所述核酸反应包括(但不限于)：核酸连接酶反应、逆转录反应、核酸杂交反应、聚合酶链反应(PCR)等，或者这些反应的组合反应。

在本发明的另一方面，提供一种测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分：

一反应容器，其内壁固定有一种或多种核酸探针，所述的一种或多种核酸探针特异性针对所述的一种或多种核酸分子；所述的反应容器的内部用于容纳核酸反应液和待测样品；

一可容纳所述反应容器的高折射率液体装载容器，所述的高折射率液体装载容器中装有高折射率液体且能够控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度；

一激发光源，该激发光源产生的光通过所述高折射率液体，在固定有核酸探针的反应容器内壁与核酸反应液的界面处产生倏逝场；

一光信号检测器，用于检测由倏逝场激发形成的荧光信号。

在一个优选例中，所述的高折射率液体装载容器中包括一温度控制装置，以控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度。

在本发明的另一方面，提供所述的装置的用途，用于平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、全反射产生倏逝场的原理图。

图2、反应容器设计图。

图3、光通过高折射率液体进入容器壁发生全反射示意图。

图4、倏逝场激发与反应容器内壁的探针分子杂交的目标核酸上的荧光基团。

图5、在薄壁容器中通过倏逝场激发的实时定量聚合酶链式反应的荧光信号图。各小图下的数字代表循环次数(20-40次)。

图6、在薄壁容器中通过倏逝场激发的实时定量聚合酶链式反应的荧光信号变化曲线。

其中，各附图标记解释如下：

101：高折射率介质；         102：低折射率介质；

103：入射光；               104：全反射光；

105：高折射率介质与低折射率介质的界面；

106：倏逝场；               107：指数衰减；

201：探针；                 301：薄壁管；

302：矿物油；               304：入射光；

305：薄壁管底与反应液界面； 306：反射光；

308：PCR反应液；            309：光源；

310：滤镜；                 311：CCD；

403：扩增引物；             404：扩增产物；

405：倏逝场；               408：结合产物；

409：激发荧光；             410：发射波长。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种改进的平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法。该方法基于倏逝场的原理，借助高折射率液体将激发光以高于临界角的角度射入薄壁的反应容器中，从而产生光的全反射引起的倏逝场激发；倏逝场激发与在容器内壁上固定的探针相结合的目标产物上的荧光基团，而反应溶液中大量未结合的目标分子或是荧光基团几乎不被激发；通过检测荧光信号强度的变化来定量核酸分子的量。本发明的方法不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，因此成本低、检测的目标分子通量高。

本发明第一方面提供一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一反应容器，其内壁固定有一种或多种核酸探针，所述的一种或多种核酸探针特异性针对所述的一种或多种核酸分子；

在所述的反应容器内装入核酸反应液以及待测样品并浸没所述的核酸探针；

b)提供一高折射率液体装载容器，其中装有高折射率液体且能控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度；所述高折射率液体装载容器中还设置一激发光源，该激发光源产生的光能够通过所述高折射率液体和所述反应容器壁，在固定有核酸探针的反应容器内壁与核酸反应液的界面处产生倏逝场；

将a)的反应容器放置于该高折射率液体装载容器，且反应容器中固定有核酸探针的壁浸埋于高折射率液体；进行核酸反应，在核酸反应中对核酸反应产物标记荧光基团；

c)核酸反应进行中或完成后，通过倏逝场激发核酸分子的荧光基团，产生荧光信号；

d)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中多种核酸分子的存在或量。

适用于本发明方法的样品可以是各种形式，只要其中具有待检测的目标核酸分子即可。例如可以用本领域熟知或公开的方法(如限制性内切酶消化或机械方法)得到核酸样品，如总DNA、基因组DNA、cDNA、总RNA、mRNA等混合物。

本文所用的术语“核酸”、“核酸分子”可以互换使用，其指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。该术语“核酸”也可以是cDNA和基因编码的mRNA。本发明的核酸分子还涵盖了核酸片段、核酸亚序列、核酸衍生物和核酸修饰物。所述的核酸长度可以各异，其可以是较大核酸分子的片段或较小的部分。较佳的是，待检测的核酸长度至少为30个碱基对，更佳的是长度为至少50个碱基对，例如30-4000个、50-2000个或50-1000个碱基对。待检测的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是单链或双链形式。其可从任何来源衍生待扩增的核酸。

在本发明方法中采用了一个反应容器，在所述容器的内壁不同的位置固定了一种或多种核酸探针分子，所述核酸探针分子对样品中的所述核酸分子有特异性。所述的容器包含有玻璃、石英、塑料、有机聚合物等材料。在这些材料表面可以固定上核酸探针分子，且对荧光基团的激发波长有低吸收的固体表面，都能作为本发明的反应容器的材料。只要该材料在对要检测的荧光基团激发波长段的光低吸收，都能检测到明显的荧光信号。应当注意的是，对于容器材料并不必需是透明的，只要其对一定波长段的光低吸收，即对这一波段的光是透明的即可，其也可能在可见光的其他波段是不透明的。另外，固定探针的材料的折射率需要大于所选液相的折射率，通常较佳的折射率需要大于1.34。在本发明中，优选的固定探针的材料是玻璃、聚丙烯、聚碳酸酯等。在较佳的实施方案中，这些材料宜经过化学方法修饰，从而带有活性基团，能与核酸上的氨基、醛基、磷酸基、或是修饰的巯基等形成稳定的连接，增强对核酸探针分子的固定能力。如本文所用，折射率(refractive index)是光在真空中的相速度与光在介质中的相速度之比值。

本文所用的术语“固定”是指将核酸探针固定在固相支持物上，即反应容器的内表面上，通过化学共价结合方式附着，或通过不可逆的被动吸附，或通过分子间的亲和力(例如利用生物素酰化的分子接头来固定于涂有亲和素的表面)。这种固定的强度必须足以在DNA变性条件下，不会因用水或缓冲水溶液洗涤而被除去。一种较佳的固定方法是采用双官能交联剂处理玻璃或石英基材，以得到带有反应性交联基团(如氨基、硫代或丙烯酸基团)的表面。所述交联剂可以是，例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐或马来酸酐、或异双官能团交联剂，如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺-4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)等。另外可参见文献：Nucleic Acids Research，29：e69，2001.Analytical Biochemistry，247：96-101，1997.AnalyticalBiochemistry，266：23-30，1999.Nucleic Acids Research，30：4793-4802，2002。

另一些较佳的固定方案是在聚丙烯或聚碳酸酯等聚合物塑料基材上通过紫外照射和1-fluoro-2-nitro-4-azibenzene处理后活化材料表面，或者是聚碳酸酯的表面通过紫外线和ozone处理活化。这些活化的聚合物的表面都能共价连接核酸探针分子。可参见文献：Analytical Biochemistry，306：74-78，2002.Analytical Biochemistry，317：76-84，2003。

固定于容器内壁上的核酸探针分子可根据目标基因的信息进行设计，从而使其能够以特异性的方式分别与样品中的多种目标核酸分子或其扩增产物特异性结合。该探针的长度可以由本领域技术人员根据需求进行合适的选择，通常在6-2000个核苷酸(较佳10-50个核苷酸、更佳15-30个核苷酸)之间。另外，根据具体的用途，可能还需要采用修饰过的核酸探针。该核酸探针可用本领域技术人员熟知的方法来制备。

核酸探针在固定在容器内宜为空间上分开的阵列，其通常是这样构成的，将容器内壁分成不同的区域，使每个区域中只含有一种核酸探针分子。通过DNA阵列技术，可使多种DNA探针分子排列在容器内壁上。

用于核酸检测的核酸探针分子通常包括寡聚核苷酸、寡聚硫代核苷酸、肽核酸(peptide nucleic acid)、长链DNA分子、RNA分子、或者它们的修饰物。这些核酸探针分子可以通过化学键连接、物理吸附、或是聚合物包埋、蚀刻或粘联等方式固定在固体载体上。核酸探针还可通过接头或间隔臂连接在固相载体上。排列在固体载体上的DNA探针分子通过碱基间的相互配对，与目标分子(如扩增产物)相结合。通常目标分子是被荧光基团标记上的，它可通过扩增反应使得荧光基团等标记的脱氧核苷三磷酸(dNTP)掺入到目标核酸分子的扩增产物中，或是通过荧光基团等标记的引物使扩增产物带上荧光基团的方法。通过杂交后洗脱，杂交结合上去的目标分子所带的荧光信号被检测到。

核酸分子能通过DNA聚合酶或是RNA聚合酶在体外进行复制，转录，反转录的过程，从而线性或是指数性的扩增其拷贝数。如本领域技术人员所知道的，扩增过程通常包括变性，退火，合成三个步骤，即双链核酸分子的解链(变性)，被解链的核酸分子与引物分子结合(退火)，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以解链的核酸分子为模板合成与之互补的DNA或RNA分子。

可用于本发明的核酸反应包括，但不局限于，聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，随机引物扩增反应，复合聚合酶链式反应扩增，连接酶反应，杂交反应等。在一个较佳的实施方案中，宜采用聚合酶链式反应。“聚合酶链式反应”或“PCR”指一种适用于核酸、RNA和/或DNA的小量特定片段的技术，其在例如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中有详细的描述。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列基本上相同或相似。两个引物的5’端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。聚合酶链式反应可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。本文所用的PCR被认为是扩增样品中核酸分子的一个但并非唯一的例子，该方法中采用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生特定片段的核酸。

在聚合酶链式反应中，双链的DNA分子在90℃以上变性成单链分子，然后在50-60℃与引物分子相结合，同时结合上DNA聚合酶，DNA聚合酶以此单链DNA分子为模版，脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物，复制出另一条与之互补的DNA，通常聚合酶链式反应中的DNA聚合酶最适的合成温度为70-78℃。通过复制，目标DNA分子扩增了一倍。这样多次的重复反应n个循环后，目标DNA分子扩增了近2ⁿ倍。具体可用于本发明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(T4DNA聚合酶)、各种耐热细菌的热稳定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu、Tli、Tfl DNA聚合酶)以及它们遗传修饰的衍生物(TaqGold，VENTexo，Pfu exo)。优选的DNA聚合酶是Taq或Tfl DNA聚合酶。较佳地，用于本发明的核苷三磷酸分子是脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或核糖核苷三磷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。

在核酸分子进行扩增反应的过程中，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)为底物进行合成，合成成新的扩增产物。因此，通过在扩增引物上标记荧光基团或是在底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)上标记荧光基团，就可使扩增的目标DNA分子就会标记上所需的荧光基团。

核酸连接酶反应包括连接酶检测反应（Ligase Detection Reaction，LDR）和连接酶链反应（Ligase Chain Reaction,LCR）。它可以单独使用或结合聚合酶链式反应（PCR）快速准确地检测少到一个碱基的变化。

核酸连接酶反应是Landegren等人于1988年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个切口（nick），加入连接酶封闭切口，两探针成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，探针不能与靶序列精确结合，切口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后探针仍是两个。显然，当靶序列中存在点突变时，检测连接产物结果是阴性的。

Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为连接酶反应的实用化奠定了基础。用Taq连接酶做连接酶反应只在两个保温点的循环（94℃、1min和65℃、3min）。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说连接酶反应是目前检测已知序列中有无点突变和单碱基多态性检测的最佳方法。连接酶反应的产物也能被特异性设计的探针相结合并被识别。

标记荧光基团的技术是现有技术中所熟知的。常见的荧光基团包括，但不局限于，有机荧光分子类，如荧光素，TAMRA，Cy3，Cy5，Cy5.5，罗丹明，Alexa Fluor系列等；荧光蛋白类，如GFP，CFP，BFP，YFP等；含稀土金属离子的时间分辨荧光以及量子点(Quantum dot)四种。

在扩增反应的退火过程中，因反应液与固定的探针相接触，前一轮扩增得到的待检测核酸分子扩增产物在与扩增引物结合的同时，也会与固定在反应容器内壁上固定的核酸探针分子相结合，从而使结合上的目标核酸分子扩增产物上的荧光基团得以被本发明的特异性的方式激发。具体而言，目标核酸分子扩增产物上的荧光基团可以被载体内由光的全反射所产生的倏逝场激发。

倏逝场的原理如图1所示，当光从高折射率(n₁，如玻璃)的介质101(光密介质)照射到低折射率(n₂，液相如水)的介质102(光疏介质)，并且入射光103角度大于临界角(θc，θc=sin^-1(n₂/n₁)当n₂<n₁)时，光将在光密介质中发生全反射104，从而不能折射到光疏介质中。然而，当光发生全反射时，光波会以电磁场的形式在入射点的地方穿过界面105渗透至光疏介质中，产生倏逝场106，渗透的电磁场的强度随着渗透深度的加深而成指数衰减107，其渗透的深度为：

d_p=(λ/2πn₁)[1/(sin²θ-n₂ ²/n₁ ²)]^1/2(λ，光在真空中的波长；θ，入射角度)

其深度通常在100到300nm之间。根据公式，它与入射角，入射光波长，折射率有关。这种通过全反射渗透到光疏介质的电磁场就被称为倏逝场。倏逝场和其他光源一样，也能激发荧光基团。如果光密介质表面镀有纳米量级(约100-200nm)的金、银、铜等贵重金属膜或颗粒，将可以一定程度的增强倏逝场激发荧光的强度，增强程度为几倍到几十倍不等，增强程度与金属种类和厚度等因素有关(参见文献：Analytical Biochemstry，334：303-311，2004.Journal of Fluorescence，14：425-441，2004.Current Opinion in Biotechnology，16：55-61，2005)。因此，在本发明的一个较佳的实施方案中，光密介质(即固相载体)表面可以镀有小于1000纳米厚(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属膜，或者直径小于1000纳米(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜或其它贵金属。

由于倏逝场渗透的深度非常小，只有几百纳米，因此倏逝场只能激发贴近于介电层100-200纳米内的荧光基团，而绝大部分在光疏介质中的荧光基团不会受到激发。倏逝场激发的荧光信号强度相当于结合到载体表面的目标DNA分子的量。溶液中目标DNA分子的浓度越高，与DNA探针结合上的分子也越多，激发的荧光信号也越强。

要实现全反射产生的倏逝场，就需要将光射入到光密介质中。在此发明中，光密介质是反应容器壁。通常核酸反应的效率对温度敏感，所以核酸反应容器的壁厚小于1mm，甚至更佳要求小于0.2mm，以达到好的导热效果。对于如此薄的容器壁，要将光整合入容器壁中，而不让光散射入反应液中(光散射进入反应液将激发反应液中的荧光基团，产生强烈的背景荧光)，是有难度的。为了克服这一难点，本发明人反应容器浸入一种高折射率液体中，这种液体要求折射率大于核酸反应液，也就是折射率大于1.34，较佳的方案是折射率与固定探针的容器壁的折射率相当，或者折射率大于容器壁的折射率。这种液体包含但不限于甘油、松节油、矿物油、甲苯、乙苯、对二甲苯等，或者这些液体的混合物。荧光的激发光源是先通过所述高折射率液体，就容易以大于临界角的角度照射到反应容器内壁和反应液的界面上发生全反射的。

高折射率的液体可以控制其温度，使其达到核酸反应所需的最适温度。在较佳实施例中，高折射率液体保持聚合酶链式反应的退火阶段所需的温度，因为在此温度下需要通过倏逝场激发探针上结合的荧光分子并检测其荧光强度。根据核酸反应的需要，高折射率液体的温度依赖于核酸反应所需的温度和检测阶段的温度。

本发明另一方面提供一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分：

一反应容器，其内壁固定有一种或多种核酸探针，所述的一种或多种核酸探针特异性针对所述的一种或多种核酸分子；所述的反应容器的内部用于容纳核酸反应液和待测样品；

一可容纳所述反应容器的高折射率液体装载容器，所述的高折射率液体装载容器中装有高折射率液体且能够控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度；

一激发光源，该激发光源产生的光通过所述高折射率液体，在固定有核酸探针的反应容器内壁与核酸反应液的界面处产生倏逝场；

一光信号检测器，用于检测由倏逝场激发形成的荧光信号。

通常，本发明的以上方法可以基于相类同的光学平台配置，它们包含如下配置：

激发光源：包括稳定的汞灯、氙灯、汞氙复合电弧灯光源；从紫外到红外波段不同波长的激光光源，包括气体激光，半导体激光。

中性密度滤光片：用以控制激发光的强度。

透镜组：用来整合光的条带，控制光的入射。

滤镜组：为选定的荧光基团组合配置合适的滤镜组，包括激发，发射，二色分光等。它可以削减光谱串色，提高要检测荧光的信号噪声比。

检测设备：其特征是能感应某一位置光强度，核心成分可从高灵敏度PMT或冷CCD，光电探测器，或者光功率计中选择。所述方法和装置中的荧光信号和强度可用常规的仪器来进行检测，例如可以采用电荷耦合器(Charge-Coupled Device，CCD)，光电倍增管(PMT)，光电探测器，或者光功率计等检测设备。荧光标记优选的检测系统是电荷耦合仪(CCD)照相机，它可任选地与放大装置(如显微镜)连接。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供了一种实时定量聚合酶链式反应技术，该技术在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积，实时监测整个聚合酶链式反应进程，最后通过制作标准曲线对目标核酸分子的扩增产物进行定量分析的方法。在聚合酶链式反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终聚合酶链式反应不再以指数方式生成目标核酸扩增产物(或称为摸板)，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测聚合酶链式反应的最终扩增产物，用此终点法对聚合酶链式反应产物定量存在不可靠之处。在实时定量聚合酶链式反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在聚合酶链式反应早期，产生荧光信号的水平不能与背景明显地区别，而后荧光信号的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在聚合酶链式反应处于指数期的某一点上来检测聚合酶链式反应产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在实时定量聚合酶链式反应反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。尽管本发明实施例中设定Ct值为扩增反应开始时信号值的3倍，然而，应当理解，本领域技术人员能够根据具体需求选择和确定合适的Ct值。

本发明研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，在利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线后，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

在本发明中，随着溶液中目标DNA分子的扩增，荧光标记的目标DNA分子的浓度呈指数方式增加，与固定在载体表面的DNA探针分子结合上的也增多，相应探针位置上激发的荧光信号也增强。因此，能够在整个核酸扩增反应过程进行了多种探针的实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号。随之可以绘制成多条S型曲线，得出多个探针分子的Ct值，从而判断和检测目标核酸的种类和拷贝数。这种核酸扩增反应可以包括聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，随机引物扩增反应，连接酶反应或是其他聚合酶链式反应相关的扩增技术，以及包含有这些扩增反应过程的反应。其特征为包括核酸的变性和退火的过程，并能增加特定多核苷酸链的反应。

为了更详细的叙述本发明，根据附图进行如下具体说明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用本领域技术人员所知的常规技术，这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1

利用本发明的装置来检测待测样品中以下七种病原体细菌的存在情况：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)，大肠杆菌(Escherichia.Coli)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。

上述七种细菌基因组都存在16S rDNA基因。因此以该基因序列中的保守性位点来设计通用的扩增引物如下：

5’-Cy5-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3’(M=A+C)(SEQ ID NO：1)；

5’-Cy5-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3’(SEQ ID NO：2)。

并且，针对上述七种病原体细菌的16S rDNA基因的区别性位点设计探针，合成专一性的DNA探针：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；简写S.aureus)：

NH₂-C₆-5’-CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCG-3’(SEQID NO：3)；

单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes；简写L.monocytogenes)：

NH₂-C₆-5’-AACGGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGG-3’(SEQ ID NO：4)；

大肠杆菌(Escherichia.Coli；简写E.Coli)：

NH₂-C₆-5’-CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACG-3’(SEQ ID NO：5)；

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae；简写S.pneumoniae)：

NH₂-C₆-5’-AGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGAT-3’(SEQID NO：6)；

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis；简写N.meningitidis)：

NH₂-C₆-5’-GCAGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTG-3’(SEQ IDNO：7)；

屎肠球菌(Enterococcus faecium；简写)：

NH₂-C₆-5’-CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAA-3’(SEQ IDNO：8)；

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa；简写P.aeruginosa)：

NH₂-C₆-5’-GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGG-3’(SEQ ID NO：9)。

本实施例中，采用的反应容器是由透明聚丙烯材料(折射率1.49)制成的圆柱形薄壁管301，如图2所示。薄壁管底面直径为0.8cm，管高为1.2cm，壁厚约0.2mm。薄壁管经过紫外照射和臭氧(ozone)、十六烷三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide；CTAB)处理后，聚丙烯材料的表面基团被活化。

然后通过将所述特异性探针201阵列式地固定在聚丙烯表面(具体的固定方法可参照文献Analytical Biochemistry，317：76-84，2003中的方法)，每种探针重复点3个点。

为更详细的说明本发明，下面结合图3和图4对本发明实施例方法及过程进行详细说明。如图所示，各核酸探针201通过DNA阵列的方法固定在聚丙烯反应容器的底表面。从要检测的组织或样品中分离纯化总DNA后，将总DNA与聚合酶链式反应的反应液308混合，反应液包括：Taq DNA聚合酶(2U)，包括5mM的1XTaq DNA聚合酶对应的扩增缓冲液，Cy5标记的扩增引物403(50pM)，底物dNTP(200μM)，反应体积约为100ul。将反应液加入反应容器301中，盖好盖子，确保反应容器密封。

控制这个DNA扩增反应的是三个装有透明矿物油(折射率1.48)的小槽，三个槽中的矿物油分别受到一个温度控制平台的控制，分别保持在95℃(变性)、55℃(退火)和72℃(链延伸)。将反应容器循环地分别放置在95℃、55℃和72℃的矿物油中，能进行聚合酶链式反应，扩增出带有Cy5荧光基团的扩增产物404。

其中，进行聚合酶链式反应的过程如下：首先95℃预变性2min；之后55℃ 30s，72℃ 30s，95℃ 30s，进行20-40个循环；最后在72℃ 3min。

在55℃的矿物油中，埋有一个产生632纳米波长激光的激光光源309。光304以70度的角度通过矿物油302(折射率约1.48)和薄壁管301(折射率约1.49)的底部。由于入射角大于折射临界角(θc=sin^-1(1.34/1.49))，激光的薄壁管底部与反应液的界面305发生全反射产生反射光306，从而在反应液中产生倏逝场405。

在聚合酶链式反应的退火阶段(55℃的矿物油中)，扩增产物能和固定在薄壁管底部的探针结合，获得结合产物408。这一区域的扩增产物上的荧光基团，因为靠近全反射的界面，能被倏逝场激发，Cy5基团被激发后产生荧光409。而反应液中的Cy5荧光基团因为绝大部分不能靠近全反射的界面而不能被激发。

Cy5的荧光基团被倏逝场激发后产生670纳米的发射波长410，此发射波长通过一中心波长670纳米的滤镜310后，被CCD(311)接收，通过CCD可检测到各探针点位置上的荧光信号强度。阵列上各点的信号大小不一，对应于目标基因扩增的产物量的不同。随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的荧光强度随之增大。

计算各探针(三个重复点)对应的荧光信号强度的平均值，根据荧光强度对扩增循环数作图，可以得到一个S形的扩增曲线(图6)。当某一点的信号值达到一域值，比如扩增反应开始时信号值的3倍，记录这时的循环数Ct_i。根据各个探针的Ct_i可以定量目标基因的各种选择性拼接形式的相对拷贝数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系(PCR扩增原理)，而且起始拷贝数越多，Ct值越小，因此，根据Ct值可以推算出目标基因片段起始的相对拷贝数。

根据上述装置和方法，对来自多种细菌DNA的混合物进行检测，结果如图5，各小图中对应的探针从上到下分别为：绿脓杆菌，肺炎链球菌，屎肠球菌，脑膜炎奈瑟球菌，单核细胞增生利斯特菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。根据荧光信号的平均值，得到的S形的扩增曲线如图6。由该图可见，所述的待测样品中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌呈现阳性，三种阳性细菌的存在量以金黄色葡萄球菌最多。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一反应容器，其内壁固定有一种或多种核酸探针，所述的一种或多种核酸探针特异性针对所述的一种或多种核酸分子；

在所述的反应容器内装入核酸反应液以及待测样品并浸没所述的核酸探针；

b)提供一高折射率液体装载容器，其中装有高折射率液体且能控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度；设置一激发光源通过所述高折射率液体，在固定有核酸探针的反应容器内壁与核酸反应液的界面处产生倏逝场；

将a)的反应容器放置于该高折射率液体装载容器，且反应容器中固定有核酸探针的壁浸埋于高折射率液体；进行核酸反应，在核酸反应中对核酸反应产物标记荧光基团；

c)核酸反应进行中或完成后，通过倏逝场激发核酸分子的荧光基团，产生荧光信号；

d)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中一种或多种核酸分子的存在或量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应容器壁厚小于1mm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应容器的制作材料选自：玻璃、石英、塑料或有机聚合物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应容器内壁上镀有厚度小于1000nm厚的金属膜，或者直径小于1000nm的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高折射率液体为折射率大于核酸反应液的折射率的液体；较佳地，为折射率大于1.34的液体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高折射率液体装载容器中包括一温度控制装置，以控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸反应包括：核酸连接酶反应、逆转录反应、核酸杂交反应、聚合酶链反应等，或者这些反应的组合反应。

8.一种测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分：

一反应容器，其内壁固定有一种或多种核酸探针，所述的一种或多种核酸探针特异性针对所述的一种或多种核酸分子；所述的反应容器的内部用于容纳核酸反应液和待测样品；

一可容纳所述反应容器的高折射率液体装载容器，所述的高折射率液体装载容器中装有高折射率液体且能够控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度；

一激发光源，该激发光源产生的光通过所述高折射率液体，在固定有核酸探针的反应容器内壁与核酸反应液的界面处产生倏逝场；

一光信号检测器，用于检测由倏逝场激发形成的荧光信号。

9.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述的高折射率液体装载容器中包括一温度控制装置，以控制高折射率液体的温度至核酸反应所需温度。

10.权利要求8-9任一所述的装置的用途，用于平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量。

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