CN101097204A

CN101097204A - 一种平行的多位点基因型实时定量检测技术

Info

Publication number: CN101097204A
Application number: CNA2006100282395A
Authority: CN
Inventors: 张露
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2006-06-28
Publication date: 2008-01-02

Abstract

本发明提供了通过一步反应平行对多个位点的基因型进行扩增检测并实时定量分析的方法。该方法通过连接酶反应生成多种不同核酸连接产物，并标记上荧光基团。反应与荧光标记的同时，荧光标记产物与固相阵列化的探针相结合，通过光的全反射或是平面波导所引起的倏逝场激发，或是通过荧光共振能量转换来激发荧光基团，实时检测多种连接酶反应产物。本发明的方法操作简便快速，能对多个核酸片段上少至单个碱基的变化进行定量检测，同时检测的目标分子通量高。

Description

一种平行的多位点基因型实时定量检测技术

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及核酸检测、基因诊断、基因序列分析、基因类型及多态性的分析以及基因表达的分析等领域。更具体地说，本发明涉及多位点基因突变检测多个位点碱基多态性分析，其中这些位点可以是在不同的基因片段上。

背景技术

在基因检测或是核酸序列分析中，通常要检测少到一个基因位点的突变或是单个碱基多态性变化。核酸连接酶反应包括连接酶检测反应(Ligase Detection Reaction，LDR)和连接酶链反应(Ligase Chain Reaction，LCR)就是为此目的而设计的。它可以单独使用或结合聚合酶链式反应(PCR)快速准确地检测少到一个碱基的变化。

核酸连接酶反应是Landegren等人于1988年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对探针A、B，它们完全覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，探针A、B间留下一个切口，加入连接酶封闭切口，两探针成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，探针不能与靶序列精确结合，切口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后探针仍是两个。显然，当靶序列中存在点突变时，检测连接产物结果是阴性的。

Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为连接酶反应的实用化奠定了基础。用Taq连接酶做连接酶反应只在两个保温点的循环(94℃、1min和65℃、3min)。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说连接酶反应是目前检测已知序列中有无点突变和单碱基多态性检测的最佳方法。

连接酶检测反应是通过设计两条能与靶序列DNA精确并且紧密杂交的寡核苷酸探针(本发明中也称为连接酶反应探针、或是分别称为区分探针和通用探针)完成的。寡核酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而在连接点有错配的相邻碱基则几乎不发生共价连接，连接产物通常是通过凝胶电泳观察其大小，或通过核酸杂交技术检测。这一过程如重复进行多个循环，则连接产物会呈线性增加(图1)。若此反应中有两对互补的与能靶序列DNA结合的寡核苷酸探针(本发明中也称为连接酶反应探针、或是分别称为区分探针和通用探针)进行循环的连接反应，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，则靶序列以指数形式扩增出来，或称之为连接酶链反应(图2)。

核酸连接酶反应除单独使用外，还可结合聚合酶链式反应，进一步提高其检测的灵敏度。可以在连接酶反应的一对寡核苷酸探针的两端加上一对引物序列，连接酶检测反应的产物再通过PCR反应进一步扩增(图3)。或是PCR扩增后，以PCR反应产物为靶序列DNA，通过连接酶检测反应检测PCR产物上的单碱基差异(图4)。

用于连接酶反应的寡核苷酸探针一般为20个左右碱基，使被检变异核苷酸位于即将连接的两个寡核苷酸探针连接点端。例如在图1-图4中第2步反应位于右侧寡核苷酸探针的5’端。同时，左侧寡核苷酸探针是5’荧光标记。右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的3’-OH相连接。当两段寡核苷酸探针与靶序列DNA紧密杂交上后，且在连接点无错配碱基时，DNA连接酶将两段寡核苷酸探针共价连接。如果某一寡核苷酸探针与靶序列DNA杂交不上，或是杂交上后连接点存在错配碱基，则DNA连接酶不能将两段寡核苷酸探针共价连接。

因此，连接酶反应对于单个碱基的差异极为敏感，它通常用于单个碱基位点的突变检测，或是单碱基多态性的分析。而且，连接酶链反应的扩增效率与PCR相当。同时，连接酶检测反应亦可以有多对寡核苷酸探针，而且多对寡核苷酸探针可以不局限于在靶DNA链的一段区域中。多个连接产物可通过与DNA阵列杂交的方法同时检测。所以，连接酶检测反应与DNA阵列技术相结合可同时检测多个位点的碱基差异。

但是，连接酶反应和检测是一多步反应，反应后需要烦琐的DNA电泳检测或是核酸杂交检测，因此检测步骤多、时间长，并且由此容易产生样品相互之间的交叉污染。使得连接酶反应对技术操作人员以及实验室要求很高，而且检测的错误率很高。连接酶反应最终在临床检测的应用受到了挑战。

因此，本领域中仍然需要有操作更为简单的平行检测多种核酸分子的点突变或基因多态性的方法。

发明内容

本发明者经过技术创新和深入研究，建立了能同时对核酸中多位点的基因型进行实时检测定量分析的方法。

具体而言，本发明第一方面提供了一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

b)对所述核酸分子进行核酸连接酶反应，得到经荧光基团标记的连接产物；

c)提供一固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种识别核酸探针分子；

d)使所述识别核酸探针分子与所述样品液相接触，从而使所述经荧光基团标记的连接产物与所述识别核酸探针分子结合；

e)用激发光源在固相载体与液体界面处产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述连接产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；

f)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中多种核酸分子的存在或量。

本发明另一方面提供了一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

b)对所述核酸分子进行核酸连接酶反应，得到经第一荧光基团标记的连接产物；

c)提供一固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种识别核酸探针分子，所述识别核酸探针分子上结合有第二荧光基团，其中所述第二荧光基团的发射谱与所述第一荧光基团的激发谱重叠，或所述第一荧光基团的发射谱与所述第二荧光基团的激发谱重叠；

d)使所述识别核酸探针分子与所述样品液相接触，从而使所述经第一荧光基团标记的连接产物与所述识别核酸探针分子相互结合；

e)用光激发所述第一荧光基团和所述第二荧光基团中的一个；

f)检测所述第一荧光基团和所述第二荧光基团中的另一个的信号发射的荧光位置和强度，从而确定样品中多种核酸分子的存在或量。

本发明的方法是全新的，其通过一步反应可高通量的对核酸分子中成百上千个位点的突变或基因型进行检测和定量。它有着操作简便，不需要连接酶反应后的开管检测步骤，检测时间短的优点，从而方便操作人员使用，并且降低样品间的交叉污染概率。并且，它能够对核酸中多个位点进行平行检测，多个位点不局限于核酸中的同一区段中，同时此技术能定量分析各位点上基因型相对比例。总的来说，它具有检测通量大、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、操作简便、全封闭反应等优点，将成为分子生物学研究以及临床检测的重要工具。

附图说明

图1为核酸连接酶检测反应示意图。

图2为核酸连接酶链反应示意图。

图3为核酸连接酶-PCR联合反应示意图。

图4为核酸PCR-连接酶联合反应示意图。

图5为全反射产生倏逝场的原理图。

图6显示了倏逝场强度与深度的关系随入射角度(A)和折射率(B)的变化。

图7为平面波导产生倏逝场的原理图。

图8为荧光共振能量转移原理图。

图9为多种核酸的实时定量反应的荧光变化曲线示意图。

图10A显示了核酸探针分子通过化学键连接在玻璃表面。

图10B显示了核酸探针分子通过聚合物连接包埋在金属氧化物表面。

图11为通过全反射产生倏逝场对多种核酸分子进行平行实时定量分析方法的梗概图。

图12显示了通过倏逝场实时激发与固定在载体表面的识别探针分子杂交的PCR-LDR联合反应产物上的荧光基团。

图13A显示，随着PCR-LDR联合反应的温度循环的进行，CCD检测到的被倏逝场激发检测HLA基因碱基多态性的探针点杂交上的荧光信号。

图13B为随着PCR-LDR联合反应的进行，通过倏逝场激发的各探针点，实时检测其荧光强度变化曲线，并由此获得的Ct值。

图14为通过平面波导产生倏逝场对多种核酸分子进行平行实时定量分析方法的梗概图。

图15为显示了通过倏逝场实时激发与固定在载体表面的识别探针分子杂交的LDR-PCR联合反应产物上的荧光基团。

图16A显示，随着LDR-PCR联合反应的温度循环的进行，CCD检测到的被倏逝场激发检测乙肝病毒耐药性突变的探针点杂交上的荧光信号。

图16B为随着LDR-PCR联合反应的进行，通过被倏逝场激发的各探针点，实时检测其荧光强度变化曲线，并由此获得的Ct值。

图17为通过荧光共振能量转移对多种核酸分子进行平行实时定量分析方法的梗概图。

图18为通过荧光共振能量转移实时激发与固定在载体表面的识别探针分子杂交的连接酶反应产物上的荧光基团。

图19A为随着连接酶链反应(LCR)的温度循环的进行，CCD检测到的通过荧光共振能量转移激发检测P53基因突变的探针点杂交上的荧光信号。

图19B为随连接酶链反应进行，通过荧光共振能量转移激发的各探针点，实时检测其荧光变化曲线，并由此获得的Ct值。

较佳实施方案

本发明第一方面提供了一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

适用于本发明方法的样品可以是各种形式，只要其中具有待检测的目标核酸分子即可。例如可以用本领域熟知或公开的方法(如限制性内切酶消化或机械方法)得到核酸样品，如总DNA、基因组DNA、cDNA、总RNA、mRNA等或其混合物。

本文所用的术语“核酸”、“核酸分子”可以互换使用，其指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。该术语“核酸”可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。另外，本发明的核酸分子还涵盖了核酸片段、核酸亚序列、核酸衍生物和核酸修饰物。所述的核酸长度可以各异，其可以是较大核酸分子的片段或较小的部分。较佳的是，待检测的核酸长度至少为30个碱基对，更佳的是长度为至少50个碱基对。待检测的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是单链或双链形式。其可从任何来源衍生待扩增的核酸。

在本发明的较佳实施方案中，本发明的方法可用于平行检测基因组中的碱基多态性及其量。在另一较佳实施方案中，本发明的方法可用来检测样品中多个基因位点的突变及其量。

在本发明方法中采用了一种固相载体，所述载体表面不同的位置固定了多种识别核酸探针分子，所述识别核酸探针分子对连接酶反应产物的核酸分子中的一段序列有特异性。更具体地说，该识别核酸探针分子对连接酶反应中所用探针(引物)对中不提供荧光标记的探针的全部序列或部分有特异性(互补性)。

本文所用的术语“固相载体”或“固体载体”是指核酸可固定于其上的对荧光基团的激发波长有低吸收的固体表面。例如，玻璃、尼龙膜、石英、陶瓷、金属、塑料、有机聚合物等材料都能做为本发明的固体载体，只要该载体在对要检测的荧光基团激发波长段的光低吸收，都能检测到明显的荧光信号。应当注意的是，对于载体并不必需是透明的，只要其对一定波长段的光低吸收，即对这一波段的光是透明的即可，其也可能在可见光的其他波段是不透明的。另外，固体载体的折射率需要大于所选液相的折射率，通常较佳的折射率需要大于1.33。在本发明中，优选的固相载体是玻璃。在较佳的实施方案中，这些载体宜经过化学方法修饰，从而带有活性基团，能与核酸上的氨基、醛基、磷酸基、或是修饰的巯基等形成稳定的连接，增强对核酸探针分子的固定能力。

本文所用的术语“固定”是指将核酸固定在固相支持物上，通过化学共价结合方式附着，或通过不可逆的被动吸附，或通过分子间的亲和力(例如利用生物素酰化的分子接头来固定于涂有亲和素的表面)。这种固定的强度必须足以在DNA变性条件下，不会因用水或缓冲水溶液洗涤而被除去。一种较佳的固定方法是采用双官能交联剂处理玻片，以得到带有反应性交联基团(如氨基、硫代或丙烯酸基团)的表面。所述交联剂可以是，例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐或马来酸酐、或异双官能团交联剂，如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺-4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)等。另外可参见文献：Nucleic Acids Research，29：e69，2001.AnalyticalBiochemistry，247：96-101，1997.Analytical Biochemistry，266：23-30，1999.NucleicAcids Research，30：4793-4802，2002。

固定于载体表面上的识别核酸探针分子可根据各种要检测的连接酶反应产物的序列信息进行设计，从而使其能够以特异性的方式结合各自要检测的连接酶反应产物。该探针的长度可以由本领域技术人员根据需求进行合适的选择，通常在6-2000个核苷酸(较佳8-50个核苷酸、更佳15-40个核苷酸)之间。另外，根据具体的用途，可能还需要采用修饰过的核酸探针。该核酸探针可用本领域技术人员熟知的方法来制备。识别核酸探针在固相载体上宜为空间上分开的阵列，其通常是这样构成的，将固相载体(如玻片)分成不同的区域，使每个区域中只含有一种核酸探针分子。通过DNA阵列技术，可使多种DNA探针分子排列在固体载体上。

用于核酸检测的识别核酸探针分子通常包括寡聚核苷酸、寡聚硫代核苷酸、肽核酸(peptide nucleic acid)、长链DNA分子、RNA分子、或者它们的修饰物。这些核酸探针分子可以通过化学键连接、物理吸附、或是聚合物包埋、蚀刻或粘联等方式固定在固体载体上。核酸探针还可通过接头或间隔臂连接在固相载体上。排列在固体载体上的识别探针分子通过碱基间的相互配对，与目标分子(反应产物)相结合。通常目标分子是被荧光基团标记上的，它可通过扩增反应使得荧光基团等标记的脱氧核苷三磷酸(dNTP)掺入到目标核酸分子的扩增产物中，或是通过荧光基团等标记的寡核苷酸引物或探针(连接酶反应探针)使反应产物带上荧光基团的方法。通过核酸杂交后，杂交结合上去的目标分子所带的荧光信号被检测到。

核酸连接酶反应是通过DNA连接酶，将与靶DNA分子退火结合上的只留有一个缺口(nick)的两段核酸探针分子共价连接成与靶序列完整的互补的一条链。并且如果靶序列中有点突变，探针不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后探针仍是两个。

在连接酶反应中，使用的是各种DNA连接酶，包括T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Pfu DNA连接酶、Tth DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶、以及它们遗传修饰的衍生物等。优选方案中使用的是热稳定的DNA连接酶，如Taq、Pfu、Tth、Ampligase DNA连接酶等，通过核酸变性、连接过程的多个循环后连接反应产物能呈线性或是指数的扩增。可用于本发明的连接酶反应包括连接酶检测反应(LDR)和连接酶链反应(LCR)。

在连接酶反应中使用的探针分子通常对每个要检测位点设计成两段，每段有10个以上的碱基与靶序列相互匹配，较佳方案为15-40个碱基与靶序列相匹配。将要检测的突变点设计在连接缺口的两端(如图1-图4)，可以是左边探针的3’端或是右边探针的5’端。另外，左边探针的3’端要带羟基，右边探针的5’端带磷酸基团。连接酶反应探针分子的中间(非连接位点)可以有一个或少数几个与靶核酸序列不匹配的碱基。探针分子中间少数不匹配碱基的存在，只要两条探针分子能与靶序列结合，将不会影响连接反应，并且还能提高连接酶反应的特异性。

在另一个实施方案中，两端探针中间可以留有几个碱基(例如2-10个、较佳为2-5个)的缺口。这时如果反应液中存在DNA聚合酶，则缺口将先被DNA聚合酶补齐后，再被DNA连接酶将切口连上，这种方案中，要检测的突变点将要求设计在右边探针的5’端。同样原理，在连接酶链反应中，则针对每个要检测位点需设计成两对相互互补的探针，进行链式的扩增反应，探针设计的要求同上。

在反应液中，除了含有要检测的靶核酸、DNA连接酶、DNA聚合酶(在探针间留有多个碱基缺口的情况下)、及相应的连接酶探针外，还要求在含有Tris-HCl，KCl，MgCl的缓冲液中，另外还有反应底物NAD+或是rATP，以及保护试剂二硫苏糖醇(DTT)和牛血清白蛋白(BSA)。较优的反应缓冲液为：20mM Tris-HCl(pH8.0)，5mMMgCl2，50mM KCl，10mM DTT，1mM NAD+(或rATP)；连接酶探针的浓度可在1pM到1uM间。连接酶反应通常在变性、连接两个保温点的循环进行，80度以上的变性温度和65度左右的连接温度。较佳的反应程序为：94℃、1min和60-65℃、3min，连接的温度随连接酶反应探针的退火温度而定。

如在反应液中加入热稳定的DNA聚合酶，以及相应的引物和脱氧核苷三磷酸(dNTP)，则在连接酶反应的同时能进行PCR扩增，进一步提高反应的灵敏度。

PCR反应是通过DNA聚合酶在体外进行复制，反转录复制的过程，从而同样地线性或是指数性的扩增其拷贝数。如本领域技术人员所知道的，扩增过程通常包括变性，退火，合成三个步骤，即双链核酸分子的解链(变性)，被解链的核酸分子与引物分子结合(退火)，聚合酶以解链的核酸分子为模板合成与之互补的DNA分子。

“聚合酶链式反应”或“PCR”指一种适用于核酸、RNA和/或DNA的小量特定片段的技术，其在例如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中有详细的描述。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列基本上相同或相似。两个引物的核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。聚合酶链式反应可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。本文所用的PCR被认为是扩增样品中核酸分子的一个但并非唯一的例子，该方法中采用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生特定片段的核酸。

在聚合酶链式反应中，双链的DNA分子在90℃以上变性成单链分子，然后在50-60℃与引物分子相结合，同时结合上DNA聚合酶，DNA聚合酶以此单链DNA分子为模版，脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物，复制出另一条与之互补的DNA，通常聚合酶链式反应中的DNA聚合酶最适的合成温度为70-78℃。通过复制，目标DNA分子扩增了一倍。这样多次的重复反应n个循环后，目标DNA分子扩增了近2ⁿ倍。具体可用于本发明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(T4 DNA聚合酶)、各种耐热细菌的热稳定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu、Tli、Tfl DNA聚合酶)以及它们遗传修饰的衍生物(TaqGold，VENTexo，Pfu exo)。优选的DNA聚合酶是没有3’到5’核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶。用于本发明的核苷三磷酸分子是脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。

当使用DNA连接酶和DNA聚合酶进行连接酶反应和PCR扩增联合反应时，由于两个反应条件近似，为简化反应步骤，减少检测时间，在优选的反应方案中，联合反应是在同一个反应空间同步进行的。

对于样品中要检测的目标分子为RNA分子时，可采用在反应液中加入T4 DNA连接酶，先在低温(37-45℃)连接生成DNA连接产物再通过连接酶反应或与PCR联合的连接反应扩增这一DNA连接产物，实现对RNA分子的检测。另一方案为采用能以RNA为模板的DNA聚合酶，如Tth DNA聚合酶，通过一步或两步反转录PCR反应扩增后，再通过连接酶反应，产生连接产物与识别探针分子杂交检测。

在连接酶反应中，对其中一段的连接酶探针分子通过合成的方法进行荧光标记，可使反应产物带上荧光基团。如联合PCR扩增反应，则在核酸连接产物进行扩增反应的过程中，通过在扩增引物上标记荧光基团或是在底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)上标记荧光基团，就可使反应产物标记上所需的荧光基团。因此，反应产物标记上荧光可通过使用有荧光基团标记的脱氧核苷三磷酸或荧光基团标记的核苷三磷酸类似衍生物、有荧光基团标记的寡核苷酸或有荧光基团标记的寡核苷酸修饰衍生物、或其组合等方法使反应产物被荧光基团标记。

标记荧光基团的技术是现有技术中所熟知的。常见的荧光基团包括，但不局限于，有机荧光分子类，如荧光素，TAMRA，Cy3，Cy5，Cy5.5，罗丹明，Alexa Fluor系列等；荧光蛋白类，如GFP，CFP，BFP，YFP等；含稀土金属离子的时间分辨荧光以及量子点(Quantum dot)四种。

在反应的连接或是退火过程中，连接产物或是PCR扩增产物会与固定在载体上的识别核酸探针分子相结合，设计固定在载体上的核酸探针分子要注意特异地不与合成的荧光标记的连接酶反应探针或是荧光标记的PCR扩增引物杂交。它们的较佳方案是特异与连接产物相结合。与固定在载体上的核酸探针分子相杂交的针对目标核酸分子的连接或扩增产物上的荧光基团得以被本发明的特异的方式激发。具体而言，这些荧光基团可以被载体内由光的全反射、或是平面波导所产生的倏逝场激发。

(i)光的全反射产生的倏逝场

众所周知，当光从高折射率(n₁，如玻璃)的介质(光密介质)照射到低折射率(n₂，液相如水)的介质(光疏介质)，并且入射角大于临界角(θc，θc＝sin^-1(n₂/n₁)当n₂＜n₁)时，光将在光密介质中发生全反射，从而不能折射到光疏介质中。然而，当光发生全反射时，光波会以电磁场的形式在入射点的地方渗透至光疏介质中，渗透的电磁场的强度随着渗透深度的加深而成指数衰减(图5)，其渗透的深度为：

d_p＝(λ/2πn₁)[1/(sin²θ-n₂ ²/n₁ ²)]^1/2(λ，光在真空中的波长；θ，入射角度)

其深度通常在100到300纳米之间。根据公式，它与入射角，入射光波长，折射率有关(图6)。这种通过全反射渗透到光疏介质的电磁场就被称为倏逝场。倏逝场和其他光源一样，也能激发荧光基团。如果光密介质表面镀有纳米量级(约100-200纳米)的金、银、铜等贵重金属膜或颗粒，将可以一定程度的增强倏逝场激发荧光的强度，增强程度为几倍到几十倍不等，增强程度与金属种类和厚度等因素有关(参见文献：Analytical Biochemstry，334：303-311，2004.Journal of Fluorescence，14：425-441，2004.Current Opinion in Biotechnology，16：55-61，2005)。因此，在本发明的一个较佳的实施方案中，光密介质(即固相载体)表面可以镀有小于1000纳米厚(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属膜，或者直径小于1000纳米(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜或其它贵金属。

由于倏逝场渗透的深度非常小，只有几百纳米，因此倏逝场只能激发贴近于介电层100-200纳米内的荧光基团，而绝大部分在光疏介质中的荧光基团不会受到激发。倏逝场激发的荧光信号强度相当于结合到载体表面的目标DNA分子的量。溶液中荧光标记的目标DNA分子的浓度越高，与DNA探针结合上的分子也越多，激发的荧光信号也越强。

(ii)平面波导产生的倏逝场

平面波导一般为100-300纳米的高折射率膜，例如五氧化二钽(Ta₂O₅)，二氧化钛(TiO₂)，氧化锌(ZnO)，氧化锆(ZrO₂)，氧化铌(Nb₂O₅)，氧化铪(HfO₂)等金属氧化物膜。其沉积在透明的低折射率的固体基材(如玻璃，透明聚合物等)上。激光通过棱镜或是光栅等方法耦合进该高折射率膜后，光在这一平面薄膜内传输。同时，它将在高折射率膜和低折射率层之间产生很强的随着渗透的深度的加深而成指数的衰减的倏逝场。倏逝场渗透的深度为：

该深度同样在大约100-200纳米(图7)。在这平面波导层上固定上核酸探针分子后，倏逝场将激发杂交上的荧光探针分子，如果在平面波导层上镀有纳米量级(约100-200纳米)的金、银、铜等贵重金属膜或颗粒，将可以一定程度的增强倏逝场激发荧光的强度，增强程度为几倍到几十倍不等，增强程度与金属种类和厚度等因素有关。同样的，由于平面波导产生的倏逝场穿透深度在纳米级，绝大部分在反应液这一光疏介质中的荧光基团不会受到激发，从而就能检测平面波导层上的特定位置的荧光强度。根据该荧光强度变化与核酸分子浓度的对应关系或制作标准曲线，就能检测溶液中各个目标核酸分子的浓度。

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

与探针分子结合的目标核酸分子扩增产物上的荧光基团也可以通过荧光共振能量转移(Flourescent resonance energy transfer，FRET)来激发。如图8所示，荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团在空间上距离较近，且其中一种生色团(供体)801的发射谱与另一种生色团(受体)807的激发谱有重叠时，当供体被激发时(如802所示)，受体809会因供体激发能的转移808而被激发。理论上讲，只要两个光谱有重叠，就会发生FRET，只是能量转移的效率与光谱重叠的积分、荧光量子效率和供体受体的距离等因素有关。(可参照文献：Proc Natl Acad Sci U S A 58：719-726，1967)能量转移50％时的距离R₀＝[8.8×10²³×κ²×n^-4×QY_d×J(λ)]^1/6，κ为极化方向因子，供体受体方向随机是通常为2/3，n为折射率，水溶液通常为1.33-1.34，QY_d为供体的荧光量子效率，J(λ)为供体的发射光谱与受体激发光谱重叠的积分强度。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多810，而受体发射的荧光却大大增强809，能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系。发生荧光共振能量转移时，分子间距离小于10nm。常用的FRET荧光基团对对于本领域技术人员而言是熟知的，其包括，但不局限于，CFP-YFP，CFP-dsRED，BFP-GFP，GFP-dsRED，YFP-dsRED，Cy3-Cy5，Alexa488-Cy3，FITC-罗丹明(TRITC)，YFP-TRITC，YFP-Cy3，Fluorescein-Tetramethylrhodamine，IAEDANS-Fluorescein，EDANS-Dabcyl，Fluorescein-QSY 7和QSY 9，Alexa Fluor 350-Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 546，AlexaFluor 488-Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 546-AlexaFluor 568，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor 594，AlexaFluor 555-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 546-AlexaFluor 647，Alexa Fluor 555-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 568-Alexa Fluor 647，AlexaFluor 594-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 350-QSY 35，Alexa Fluor 488-QSY 35，AlexaFluor 546-QSY 35，Alexa Fluor 350-dabcyl，Alexa Fluor 488-dabcyl，Alexa Fluor 546-dabcyl，Alexa Fluor 488-QSY 7和QSY 9，Alexa Fluor 546-QSY 7和QSY 9，Alexa Fluor555-QSY 7和QSY9，Alexa Fluor 568-QSY 7和QSY 9，Alexa Fluor 568-QSY 21，AlexaFluor 594-QSY 21，Alexa Fluor 647-QSY 21等。然而，本领域技术人员能够明了还能够将其它FRET荧光基团对用于本发明的方法中。

因此，利用荧光共振能量转移的方法检测时，只需要固定在固体载体上的识别探针分子804连接上荧光基团，而被检测的目标核酸805分子标记上另一种荧光基团。并且这两种荧光基团，其中一种生色团(供体)801的发射谱与另一种生色团(受体)807，809的激发谱有相当程度的重叠时，光激发供体802，而检测受体荧光811，那么只有杂交上的核酸分子806的荧光才能被检测到，大量的在溶液中的以及未被杂交上的探针上的背景荧光不被激发807，或是激发的光由于不发生荧光共振能量转移，发射的波长不同803，可以被滤镜过滤而不被检测到。这样，荧光信号强度相当于结合到载体表面的目标DNA分子的量。溶液中荧光标记的目标DNA分子的浓度越高，与DNA探针结合上的分子也越多，激发的荧光信号也越强。

上述两个方法中的荧光信号和强度可用常规的仪器来进行检测，例如可以采用电荷耦合器(Charge-Coupled Device，CCD)，光电倍增管(PMT)，光电探测器，或者光功率计等检测设备。荧光标记优选的检测系统是电荷耦合仪(CCD)照相机，它可任选地与放大装置(如显微镜)连接。

通常，本发明以上两种方法可以基于想类同的光学平台配置，它们包含如下配置：

激发光源：包括稳定的汞灯、氙灯、汞氙复合电弧灯光源；从紫外到红外波段不同波长的激光光源，包括气体激光，半导体激光。

中性密度滤光片：用以控制激发光的强度。

透镜组：用来整合光的条带，控制光的入射。

滤镜组：为选定的荧光基团组合配置合适的滤镜组，包括激发，发射，二色分光等。它可以削减光谱串色，提高要检测荧光的信号噪声比。

检测设备：其特征是能感应某一位置光强度，核心成分可从高灵敏度PMT或冷CCD，光电探测器，或者光功率计中选择。

本发明实际上还可以是一种实时定量连接酶反应技术，该技术在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积，实时监测整个反应进程，最后通过制作标准曲线对目标核酸分子进行定量分析的方法。在反应过程中产生的连接反应产物是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终反应不再以指数方式生成连接反应产物，从而进入平台期。在传统的连接酶反应中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测连接酶反应的最终产物，或是反应后通过DNA杂交方法检测，用此终点法对连接酶反应产物定量存在不可靠之处。与实时定量聚合酶链式反应类似，对整个反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线(图9)。在反应早期，产生荧光信号的水平不能与背景明显地区别，而后荧光信号的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在反应处于指数期的某一点上来检测反应产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在实时定量反应的指数增长期，首先需设定一定荧光信号的域值，如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。尽管本发明实施例中设定Ct值为扩增反应开始时信号值的3倍，然而，应当理解，本领域技术人员能够根据具体需求选择和确定合适的Ct值。

本发明研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，在利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线后，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

在本发明中，随着溶液中目标DNA分子的扩增，荧光标记的目标DNA分子的浓度可呈指数方式增加，与固定在载体表面的DNA探针分子结合上的也增多，相应探针位置上激发的荧光信号也增强。因此，能够在整个反应过程进行了多种探针的实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号。随之可以绘制成多条S型曲线，得出多个探针分子的Ct值，从而判断和检测目标核酸的种类、基因型和拷贝数。

为了更详细的叙述本发明，根据附图进行如下具体说明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用本领域技术人员所知的常规技术，这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1

作为实施例1，对适用本发明的核酸检测方法，以对人白细胞抗原A(HLA-A)基因第二外显子(以下称为目标基因)的碱基多态性的平行定量分析为例进行说明。

HLA基因的碱基多态性对控制T细胞识别和在组织器官移植中决定组织相容性上起着关键作用。本发明者用PCR-LDR联合反应检测HLA-A基因中外显子2上的一些碱基位点的多态性。取人的基因组DNA，在HLA-A基因内含子1和内含子2上设计一对引物，这对引物可扩增HLA-A外显子2序列，在此实施例中使用的PCR扩增引物为：

5’GGCAGGTCTCAGCCACTGCTCG(SEQ ID NO：1)

5’CGCAGGTCAGGACCCCTCATCCC(SEQ ID NO：2)

同时，针对HLA-A基因外显子2中的三个碱基多态性位点设计连接酶反应的连接探针分别为：

HLA-A249区分连接酶反应探针

5’atacgactcactataCTGGATAGAGCAGGAGGGG(SEQ ID NO：3)

5’taaccctcactaaaCTGGATAGAGCAGGAGGGT(SEQ ID NO：4)

HLA-A249通用连接酶反应探针：

5’PO₄-CCGGAGTATTGGGACCAGG-Cy3(SEQ ID NO：5)

HLA-A280区分连接酶反应探针

5’atacgactcactataTGGCAGGAGACACGGAATA(SEQ ID NO：6)

5’ttaaccctcactaaaTGGCAGGAGACACGGAATG(SEQ ID NO：7)

HLA-A280通用连接酶反应探针：

5’PO₄-TGAAGGCCCACTCACAGAC-Cy3(SEQ ID NO：8)

HLA-A301区分连接酶反应探针：

5’acgactcactatagGAAGGCCCACTCACAGACTG(SEQ ID NO：9)

5’aaccctcactaaagGAAGGCCCACTCACAGACTC(SEQ ID NO：10)

HLA-A301通用连接酶反应探针：

5’PO₄-ACCGAGCGAACCTGGG-Cy3(SEQ ID NO：11)

以上使用的连接酶反应探针中，区分探针3’端为羟基，通用探针5’端为磷酸基团，3’端为Cy3荧光基团标记。区分探针中大写字母的碱基为与模板序列匹配的碱基，小写字母的碱基为标签序列，用于区分两种连接产物。在这些连接酶反应探针中，序列中间有部分几个碱基由于碱基的多态性而可能不完全匹配，但它们并不会影响连接反应的进行，要检测的多态性碱基在区分探针的3’端，通过黑体标记上了。

针对连接酶反应的产物设计以下用于阵列化检测的探针用于检测识别连接酶反应产物：

HLA-A249阵列识别探针

5’CTGCTCTATCCAGTATAGTGAGTCGTAT-NH₂(SEQ ID NO：12)

5’CTGCTCTATCCAGTTTAGTGAGGGTTA-NH₂(SEQ ID NO：13)

HLA-A280阵列识别探针

5’GTCTCCTGCCATATAGTGAGTCGTAT-NH₂(SEQ ID NO：14)

5’GTCTCCTGCCATTTAGTGAGGGTTAA-NH₂(SEQ ID NO：15)

HLA-A301阵列识别探针：

5’GTGGGCCTTCCTATAGTGAGTCGT-NH₂(SEQ ID NO：16)

5’GTGGGCCTTCCTTTAGTGAGGGTT-NH₂(SEQ ID NO：17)

各种阵列识别探针分子通过化学连接方法固定在玻璃表面(图10A)，具体的固定方法可参照文献Analytical Biochemistry，266：23-30，1999.中的方法。当然，它们也能通过化学键连接，物理吸附，或是聚合物包埋等方式固定在其他透明的折射率比反应溶液高的其他固体载体上，如石英，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，PMMA等。

将人的基因组DNA与PCR扩增引物、连接酶反应探针、酶、反应缓冲液按以下浓度混合后加到反应舱中：

20mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM MgCl2，50mM KCl，10mM DTT，0.1mM dNTP，1mM NAD+；各种连接反应酶探针分别为1nM；PCR扩增引物各100nM；5u Taq DNA聚合酶；和20u Tth DNA连接酶。

反应在以下的温度循环中进行：96℃ 2min(变性)；10个如下循环：94℃，30s(变性)，68℃ 30s(引物退火)，74℃ 30s(延伸)；25个如下循环：94℃ 30s(变性)，58℃2min(退火、延伸、和连接)。

下面结合图11和图12对本发明实施例方法及过程进行详细说明。如图所示，各种核酸探针(阵列识别探针)1103，1104，1207通过DNA阵列的方法固定在K9玻璃1109，1209表面。固定探针的玻璃与一样品槽1101密合形成反应舱。将反应液加入到反应舱后，整个反应温度受到一个加热温度控制平台1105的控制，按照以上的温度循环，进行多个循环扩增和连接。首先的10个循环，由于设计的引物退火温度高于连接酶探针的退火温度，在65℃时，引物与人基因组DNA模板结合，在Taq DNA聚合酶作用下，主要进行PCR的扩增反应，基因组DNA的HLA-A外显子2的序列被扩增，得到扩增产物1211。10个循环后，降低退火温度为55℃，此时扩增引物与连接酶反应探针1203，1210都与模板DNA，即PCR扩增产物1211，相结合，同时进行PCR扩增和连接酶检测反应。Cy3(1201)标记的连接酶反应探针1203与通用探针1210与PCR反应的扩增产物1211退火相结合1212，在DNA连接酶1204作用下共价连接，连接酶反应产生的连接产物1202从而带上了Cy3荧光基团1201。

随着反应的进行，PCR扩增产物成指数增长，同时连接反应的产物也随之增长。在每个循环的55℃反应过程中，连接酶反应产物1208也将与固定的识别探针1207通过碱基的相互配对而结合。这种结合信号被全反射产生的倏逝场1206激发而被检测到。即，在55℃退火过程进行约2分钟后，氩离子激光器1106被打开，产生514纳米的激光。激光通过一透镜组1107，整合成线状后，通过棱镜1108，以大约75度的角度偶合进玻片1109中，由于入射角大于折射临界角(θc＝sin^-1(1.34/1.52))，激光在玻片中产生多次的全反射，从而产生倏逝场。

由于每一位点上的两种碱基多态性所带的标签序列不一样，阵列化的识别探针一半与标签序列匹配一半与通用序列相匹配，每种多态性对应的连接酶反应产物将特异的只与一种一种识别探针相结合。因此在与对应的连接酶反应产物1208杂交的识别探针分子1207位点上，倏逝场激发杂交上的目标基因片段上的Cy3荧光基团1205，使它产生552纳米左右的发射波长，此发射波长通过一中心波长550纳米的滤镜1111后，被CCD(1112)接收，通过CCD可检测到各探针点位置上的荧光信号强度1213。阵列上各点的信号的有无对应相应的碱基形态(图13A)。随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的信号值随之增大(图13A)，当某一点的信号值达到一域值，即扩增反应开始时信号值的3倍，记录这时的循环数Ct_i(i为探针编号)(图13B)。根据各个探针的Ct_i可以定量各种碱基形态的相对拷贝数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，而且起始拷贝数越多，Ct值越小，因此，根据Ct值可以推算出目标基因各种碱基形态起始的相对拷贝数。当然对于基因组来说，通常只要检测碱基的形态。

实施例2

作为实施例2，对适用本发明的核酸检测方法，以对检测乙肝病毒拉米夫定耐药性突变的定量分析为例进行说明。

乙肝病毒的耐药性通常是由于病毒基因的突变使得病毒DNA聚合酶上204号位点上的M氨基酸转变为I氨基酸或是V氨基酸，或是180号位点上的L氨基酸转变为M氨基酸。由于突变使得DNA聚合酶的空间结构发生变化，从而病毒DNA聚合酶逃过药物的作用。本发明者用LDR-PCR联合反应检测乙肝病毒上这两点的突变。

取乙肝病毒的基因组DNA。针对乙肝病毒DNA聚合酶基因的两个位点的碱基多态性设计连接酶反应的连接探针分别为：

pol-M204I区分探针：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCAatacgactcactataCCCCCAATACCACATCA ACC(SEQ ID NO：18)

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCtaaccctcactaaaCCCCCAATACCACATCA ACA(SEQ ID NO：19)

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCattgcgtacctcatCCCCCAATACCACATCA ACG(SEQ ID NO：20)

pol-M204I通用探针：

5’PO₄-ATATAACTGAAAGCCAAACAGTGGTGCGACACTACGGAGGATTA(SEQID NO：21)

pol-M204V区分探针：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCAatacgactcactataCCCAATACCACATCATGCAT(SEQ ID NO：22)

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCAtaaccctcactaaaCCCAATACCACATCAT GCAC(SEQ ID NO：23)

pol-M204V通用探针：

5’PO₄-ATAACTGAAAGCCAAACAGTGGGTGCGACACTACGGAGGATTA(SEQID NO：24)

pol-L180M区分探针：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCAatacgactcactataAATGGCACTAGTAAACTGAGGCAG(SEQ ID NO：25)

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCCAtaaccctcactaaaAATGGCACTAGTAAACTGAG GCAT(SEQ ID NO：26)

pol-L180M通用探针：

5’PO₄-GAGAAACGGGCTGAGGCCCTGCGACACTACGGAGGATTA(SEQ ID NO：27)

以上使用的连接酶反应探针中，区分探针3’端为羟基，通用探针5’端为磷酸基团。区分探针中正体大写字母的碱基为与模板序列匹配的碱基，小写字母的碱基为标签序列，用于区分两种连接产物，斜体大写字母的碱基为扩增引物结合序列。在这些连接酶反应探针中，序列中间有部分几个碱基由于碱基的多态性或突变而可能不完全匹配，但它们并不会影响连接反应的进行，另外，探针中有意加入一个不匹配位点(下划线标出)，以提高连接反应的特异性。要检测的多态性碱基在区分探针的3’端，通过黑体标记上了。

连接酶反应产物通过以下引物扩增：

5’GTCAATCTAGACGAGGTGCC(SEQ ID NO：28)

5’Cy5-TAATCCTCCGTAGTGTCGCA(SEQ ID NO：29)

pol-M204I阵列识别探针：

5’atacgactcactataCCCCAATACCACATC-NH₂(SEQ ID NO：30)

5’taaccctcactaaaCCCCAATACCACATC-NH₂(SEQ ID NO：31)

5’attgcgtacctcatCCCCCAATACCACATC-NH₂(SEQ ID NO：32)

pol-M204V阵列识别探针：

5’atacgactcactataCCCAATACCACATCA-NH₂(SEQ ID NO：33)

5’taaccctcactaaaCCCAATACCACATCA-NH₂(SEQ ID NO：34)

pol-L180M阵列识别探针：

5’atacgactcactataAATGGCACTAGTAAACTG-NH₂(SEQ ID NO：35)

5’taaccctcactaaaAATGGCACTAGTAAACTG-NH₂(SEQ ID NO：36)

各种阵列识别探针分子通过化学连接方法固定在五氧化二钽的表面。如图14所示，在一块约1mm厚的玻璃片或是透明塑料片1410表面的两头分别都刻蚀出一条约0.5mm宽的光栅1408，光栅周期约700纳米，深度约10-20纳米。再在整个玻璃表面，包括光栅部分都镀上一层约100-200纳米厚的五氧化二钽(Ta₂O₅)层1409，形成平面光波导层。在五氧化二钽的表面通过静电相互作用结合上一层多聚(L-赖氨酸)-接枝-聚乙二醇(PLL-g-PEG)的共聚合物，从而活化其表面(图10B)。

将乙肝病毒的基因组DNA与连接酶反应探针、PCR扩增引物、酶、反应缓冲液按以下浓度混合后加到反应舱中：

20mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM MgCl2，50mM KCl，10mM DTT，0.1mM dNTP，1mM NAD+；各种连接反应酶探针分别为0.1nM；PCR扩增引物各100nM；5u Taq DNA聚合酶；和20u Taq DNA连接酶。

反应在以下的温度循环中进行：96℃ 2min(变性)；10个如下循环：94℃ 30s(变性)，65℃ 2min(连接)；30个如下循环：94℃ 30s(变性)，55℃ 1min(引物退火、连接)，74℃ 30s(延伸)。

为更详细的说明此发明，通过图14和图15对本发明实施例方法及过程进行说明。将以上使用的探针(阵列识别探针)1403，1404，1507通过DNA阵列的方法，可以固定在结合有PLL-g-PEG共聚合物的五氧化二钽(Ta₂O₅)平面光波导层1409，1509表面(图10B)，并在两条光栅位置中间。固定探针的镀有五氧化二钽平面光波导层的玻璃片与一样品槽1401密合形成反应舱。将上面描述的反应液加入并充满反应舱，整个反应温度受到一个加热温度控制平台1405的控制，从而进行以上描述的温度循环过程。首先的10个循环的65℃时，由于设计的连接酶探针退火温度高于引物的退火温度，连接酶探针(区分探针和通用探针)与病毒基因组DNA模板结合，在Taq DNA连接酶作用下主要进行连接酶反应，匹配的连接酶反应探针相连接，生成连接酶反应产物1510。而后，特别是在后30个循环中，连接酶反应产物1510与引物1503相结合，在Taq DNA聚合酶1504作用下被指数扩增(虽然连接酶反应探针在DNA聚合酶作用下也能被延生复制，但它们不会被大量指数扩增，对结果无影响)。同时扩增的连接产物1502由于引物1503上Cy5的荧光基团标记1501而带上了Cy5荧光基团。

随着反应的进行，连接酶反应产物1510，1502成指数增长，同时被Cy5荧光基团标记。在55℃退火反应过程中，扩增的连接酶反应产物1502将与固定的识别探针1507通过碱基的相互配对而结合。这种结合信号被平面光波导产生的倏逝场1506激发而被检测到。即在55℃退火反应进行约一分钟后，氦氖激光器1406被打开，产生633纳米的激光。激光通过一透镜组1407，整合成线状后，以约15度角照射到光栅1408，通过光栅后偶合进五氧化二钽1409层，形成平面波导，并在五氧化二钽表面产生的倏逝场。

有些识别探针分子因为对应的连接酶反应产物被扩增而与之杂交上1507，倏逝场激发杂交上的连接酶反应产物上的Cy5荧光基团1505，使它产生约665纳米的发射波长1504，此发射波长通过一670纳米的滤镜1411后，被CCD(1412)接收，从而可检测到各探针点位置上的荧光信号强度1511。阵列上各点的信号大小不一(图16A)，对应于各突变体的量的不一样。随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的信号值随之增大，当某一点的信号值达到一域值，即扩增反应开始时信号值的3倍(图16B)，记录这时的循环数Ct_i(i为探针编号)。根据各个探针的Ct_i而定量个突变体的量。

实施例3

作为实施例3，对适用本发明的核酸检测方法，以连接酶链反应定量分析p53基因突变为例进行说明。

在此实例中，针对人的p53基因第4外显子上第72个编码子位点的突变检测，设计以下连接酶链反应的探针：

正向区分探针：

5’PO₄-GCGTGGCCCCTGCACCAGatacgactctg(SEQ ID NO：37)

5’PO₄-CCGTGGCCCCTGCACCAGtaactcgtcac(SEQ ID NO：38)

正向通用探针：

5’TAMRA-CCCAGAATGCCAGAGGCTGCTC(SEQ ID NO：39)

反向区分探针：

5’PO₄-CGGGGAGCAGCCTCTGGCA(SEQ ID NO：40)

5’PO₄-GGGGGAGCAGCCTCTGGCA(SEQ ID NO：41)

反向通用探针：

5’AGCTGCTGGTGCAGGGGCC(SEQ ID NO：42)

以上使用的连接酶反应探针中，通用探针3’端为羟基，区分探针5’端为磷酸基团，正向通用探针5’端用TAMRA荧光基团标记。区分探针中正体大写字母的碱基为与模板序列匹配的碱基，小写字母的碱基为标签序列，用于区分两种连接产物。另外，探针与模板结合后连接位点处有3-4个碱基的缺口，它们可以通过DNA聚合酶补平后连接，能提高连接反应的特异性。要检测的多态性碱基在区分探针的5’端(黑体标记)。

另外，设计FAM荧光标记的固定识别探针如下：

5’NH₂-CAGAGTCGTAT TCGCTGGTGC GAGGGCCACGC AGGGAG-FAM(SEQID NO：43)

5’NH₂-GTGACGAGTTA TCGCTGGTGC GAGGGCCACGG AGGGAG-FAM(SEQID NO：44)

在以上的识别探针中有意加入几个突变的碱基，目的只是为了使识别探针能更特异的识别两种连接产物，而几乎不与未连接反应探针结合，减少未连接探针的竞争结合。有意加入的突变碱基用下划线标出，p53基因突变点用黑体标出。

为更详细的说明此发明，通过图17和图18对本发明实施例方法及过程进行说明。如图，将上述各种识别探针1701，1702，1804用FAM荧光基团1803，1806标记上后，通过化学连接(如实施例1所述)固定在玻璃载体1703，1807表面，载体可以是金属，陶瓷，聚合物材料等任何固体材料上。固定探针的玻璃与一样品槽1705密合形成反应舱。取待测样品的cDNA，与连接酶链式反应液1704加入并充满整个反应舱，反应液包括：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM MgCl2，50mM KCl，10mM DTT，0.01mMdNTP，1mM NAD+；各种连接反应酶探针分别为100nM；1u Tfl DNA聚合酶；和50uTaq DNA连接酶。整个反应温度受到一个加热温度控制平台1711的控制，从而进行多个循环扩增，包括目标基因片段的反复变性(＞90℃)，退火和连接(65℃)的过程。反应温度控制程序为：96℃ 2min(变性)；10个如下循环，94℃ 30s(变性)，65℃ 2min(退火、补平、连接)；30个如下循环：90℃ 15s(变性)，65℃ 2min(退火、补平、连接)

连接酶链反应在连接酶1801的作用下，产生的连接产物片段1810因为TAMRA标记的连接反应探针1809而带上了TAMRA荧光基团1811，并呈指数扩增。在退火和连接过程中，连接酶反应产物1805与固定的探针1804通过碱基之间的相互配对而结合。在退火连接过程进行约2分钟后，氩离子激光器1708被打开，产生488纳米的激光。激光通过一透镜组1707，照射在固体载体表面固定的探针区域。样品中含有的靶DNA序列的连接反应产物1805被连接扩增标记上TAMRA荧光基团后，与对应的探针分子1804相杂交结合。488纳米的激光激发探针分子上的FAM基团1803而产生520纳米的发射波长，它被结合上的扩增DNA上的TAMRA基团1802所吸收1808，TAMRA基团产生590纳米的发射波长而呈红色1802。

如果在样品中没有的对应的基因变异，相应的连接产物将不会被扩增，其对应的识别探针分子1806不结合上有TAMRA基团的分子，被激发后，产生528纳米的蓝光1806。另外，溶液中的含有TAMRA基团1811的连接探针1809和被连接扩增而未杂交上的的DNA分子1810将不被激发。CCD(1710)通过一中心波长为600纳米的滤镜1709后被检测成相1812，由于杂交上的探针分子1804发出的590纳米的红光能够透过600纳米的滤镜，而没被杂交上的探针分子1806发出的518纳米的蓝光，被散射的488纳米的激光都不能透过。因此，CCD成像的各探针点位置上的信号强度，即为杂交上的DNA的量，其对应于相应的p53基因扩增产物的量(图19A)。

随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的信号值随之增大(图19A)，当某一点的信号值达到一域值，即扩增反应开始时信号值的3倍，记录这时的循环数Ct_i(i为探针编号)(图19B)。根据各个探针的Ct_i而能定量p53基因正常和突变cDNA的相对拷贝数。由于每种模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，而且起始拷贝数越多，Ct值越小，因此，根据Ct值可以推算出目标基因片段正常和突变体的相对拷贝数。

尽管本发明描述了具体的例子，但不可能罗列所有形式。本发明中的实例虽然都只使用一种荧光分子标记，但很显然多种荧光分子标记同样适用于本发明。特别是在实例中连接酶反应的探针分子都是采用一些标签序列来区分不同的连接产物，本发明者也能使用不同的荧光分子来区分不同的连接产物，例如不同突变或多态性靶序列生成的连接产物带上不同的荧光分子，通常这些荧光分子的发射波长不同，通过滤镜可以将它们区分开，这样在检测探针上不同波长的荧光信号将代表不同突变或多态性靶序列的存在和量。

另外，在实例中虽然列举的都是检测基因的突变和多态性分析，但很明显，这一发明还能推广应用于各种不同核酸序列存在的检测，而不单单是针对于一个或几个碱基变化的检测。由于连接酶反应不单是针对连接位点上碱基变化敏感，如果设计连接酶反应探针与模板序列匹配或不匹配，将决定连接酶反应探针与目标模板能否结合，它也就能敏感的反映出能否扩增出连接产物。基于此原理，此发明也能平行的检测多个基因的存在和量，且这多个基因可以是在不同的基因片段上。

总之，本发明中，使用的引物和探针设计灵活性很强，标记的方案也灵活多样，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

序列表

<110>张露

<120>一种平行的多位点基因型实时定量检测技术

<130>063320

<160>44

<170>PatentIn version 3.3

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Claims

1.一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤b)中，所述核酸连接酶反应包括使用探针对和DNA连接酶，所述探针对覆盖所述待检测的核酸分子，所述探针对中的一个探针被荧光基团标记，另一个探针与所述识别核酸探针分子特异性结合，反应至少包括核酸变性、核酸连接的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤b)中，通过使用有荧光基团标记的脱氧核苷三磷酸、有荧光基团标记的寡核苷酸、或其组合使连接产物被荧光基团标记。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体选自玻璃、尼龙膜、石英、陶瓷、金属、塑料或有机聚合物；所述识别核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在载体表面；

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体上镀有小于1000纳米厚的金属膜，或者直径小于1000纳米的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中还包括联合应用聚合酶链反应进行扩增。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述倏逝场是通过在所述固相载体内发生的光的全反射，或者通过平面波导产生的。

8.一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述步骤b)中，所述核酸连接酶反应包括使用探针对和DNA连接酶，所述探针对覆盖所述待检测的核酸分子，所述探针对中的一个探针被荧光基团标记，另一个探针与所述识别核酸探针分子特异性结合，反应至少包括核酸变性、核酸连接的步骤。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一荧光基团和第二荧光基团在相距1-10纳米时，一个荧光基团能吸收另一荧光基团发射光的能量而被激发。