JPH11164700A - Ｄｎａ検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ゲル電気泳動など繁雑な作業を伴わずにＤＮ
Ａの長さとコピー数を知ることができるＤＮＡ検出方法
を提供する。 【解決手段】 二本鎖ＤＮＡの濃度とインターカレータ
ーの蛍光強度の間には図１に示すように一定の関係が有
り、インターカレーターの蛍光強度からＤＮＡ量を求め
ることができる。一方、プローブ蛍光の強度からＤＮＡ
のコピー数を求めることができる。従って、両者の比か
ら次式のようにＤＮＡ鎖長の概略値を得る。ｋは比例定
数である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ診断、ＤＮ
Ａ分析などにおけるＤＮＡ検出方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡの分析や検査あるいは診断には、
ＤＮＡプローブを用いる方法や、ＰＣＲ（polymerase c
hain reaction）が広く用いられている。ＤＮＡの検出
方法には、感度が高いことから光、特にレーザー光照射
による蛍光検出が用いられる。ＤＮＡプローブ法では、
蛍光標識ＤＮＡプローブとビオチンなどの捕獲剤のつい
たプローブを同時に検体に作用させ、目的とするＤＮＡ
がある時は両プローブがターゲットＤＮＡを介して結合
するサンドイッチ法や、ＰＣＲで増やした二本鎖ＤＮＡ
にインターカレーター（二本鎖ＤＮＡの間に入り込む性
質のある蛍光体）を加えて光を照射し、インターカレー
ターからの蛍光を測定する方法などが用いられている。
これらはＤＮＡプローブがハイブリダイズするか、ある
いは二本鎖ＤＮＡが増幅されてくるかを調べるものであ
る。

【０００３】ＰＣＲによれば、非常にわずかな量のＤＮ
Ａでもそのコピー数を数桁増やして検出することができ
る。ＰＣＲは非常に感度が高く、わずかなコンタミなど
があってもこれを増幅するため、ゲル電気泳動による生
成物のチェックがなされる。すなわち、ＰＣＲプライマ
ーによるＤＮＡの増幅と、生成物が予期した長さを持つ
かどうかで、ターゲットＤＮＡの存否を決定する。ＤＮ
Ａの長さ決定にはアガロース、あるいはポリアクリルア
ミドゲル電気泳動が用いられる。しかしこれらの分離法
では、分離できるＤＮＡのサイズは数キロ塩基から２０
キロ塩基以下である。ＤＮＡサイズがこれ以上になる
と、分離が非常に困難になる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】サンドイッチ法などハ
イブリダイズによるＤＮＡの検出方法では二つのプロー
ブが必要であり、また手間も掛かる。ゲル電気泳動によ
るＤＮＡ鎖長の測定は正確であるが、やはり手間がかか
る難点がある。特にサンプルの数が多くなると、この手
間は膨大となる。ゲル電気泳動などの分子ふるいを用い
ないＤＮＡ鎖長の計測法として、ＤＮＡをゲル中で引き
伸ばし、インターカレーターを二本鎖ＤＮＡ中に入り込
ませ、ＤＮＡの蛍光像を顕微鏡で測定して長さ計測する
方法などが知られている。しかし、この方法は、ＤＮＡ
の長さが光学顕微鏡で見える数十キロ塩基以上の場合に
しか適用できず、多くの遺伝子診断で対象となる１００
塩基から数キロ塩基のＤＮＡ、特にＰＣＲで増幅可能な
サイズのＤＮＡには適用できない難点があった。

【０００５】そこで、簡便にハイブリダイズしたＤＮＡ
あるいは相補鎖合成で生成したＤＮＡの鎖長を知る方法
の開発が望まれている。特にゲルによる分子サイズ分離
によらず、ＤＮＡ鎖長を知る方法が望まれている。本発
明は、このようなＤＮＡ検出の現状に鑑みてなされたも
ので、ゲル電気泳動などの繁雑な作業を伴わずにＤＮＡ
の長さとコピー数を知ることができるＤＮＡの検出方法
を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明においては、二本
鎖ＤＮＡのコピー数を一定にするか、コピー数に依存し
た信号をＤＮＡに結合した標識蛍光体の発光から得る。
一方、二本鎖ＤＮＡの長さ及び量に関する情報をインタ
ーカレーターの発光から得る。そして、この２つの情報
を組み合わせることで、ＤＮＡの鎖長を求める。また、
ＤＮＡプローブに標識蛍光体を付け、ターゲットＤＮＡ
にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたときだけ蛍
光を発する手段を提供する。すなわち、本発明のＤＮＡ
検出方法は、二本鎖ＤＮＡの間に入り込み光照射により
蛍光を発するインターカレーターと前記ＤＮＡに共有結
合などの化学結合で結合した蛍光体とを同時に溶液中に
含む状態で光照射し、インターカレーターから発せられ
る蛍光強度と前記蛍光体から発せられる蛍光強度とを計
測してＤＮＡの量と長さを測定することを特徴とする。

【０００７】また、本発明のＤＮＡ検出方法は、一本鎖
状のＤＮＡに化学結合した蛍光体の蛍光発光を妨害する
が、二本鎖状のＤＮＡに共有結合などの化学結合で結合
した蛍光体の蛍光発光は許容する物質を被測定溶液中に
保持して蛍光計測することにより二本鎖ＤＮＡを検出す
ることを特徴とする。前記ＤＮＡ検出方法においては、
蛍光標識ＤＮＡプローブを検体を含む溶液中に加えター
ゲットＤＮＡにハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを生
成し、インターカレーター共存下で光照射して蛍光を計
測することができる。蛍光標識ＤＮＡプローブをターゲ
ットＤＮＡにハイブリダイズさせた後、相補鎖合成を行
って二本鎖ＤＮＡを生成してもよい。

【０００８】また、本発明のＤＮＡ検出方法は、ＤＮＡ
の分子数に依存する第１の信号と、ＤＮＡの鎖長と分子
数の両方に依存する第２の信号とを計測し、第１の信号
と第２の信号を用いてＤＮＡの鎖長情報を得ることを特
徴とする。この場合、ＤＮＡの分子数に依存する信号
は、ＤＮＡ末端近傍に導入された標識蛍光体から発せら
れる蛍光強度、あるいはターゲットＤＮＡのＰＣＲ増幅
領域の中間に蛍光標識とその蛍光を消光する物質を異な
る位置に保持したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅時に
共存させ、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせ、Ｄ
ＮＡ相補鎖合成時に酵素のエクソヌクレアーゼ活性によ
り断片化し、蛍光標識ヌクレオチドを遊離させて、その
蛍光強度を測定しその強度から相補鎖合成した二本鎖Ｄ
ＮＡ量を見積もることにより得ることができる。また、
ＤＮＡの鎖長と分子数の両方に依存する信号は、ＤＮＡ
分子の光吸収、あるいは二本鎖ＤＮＡ分子の間に捕獲さ
れた蛍光体（インターカレーター）から発せられる蛍光
強度により得ることができる。ＤＮＡの鎖長情報は、例
えば、ＤＮＡの末端近傍に標識された蛍光体からの蛍光
信号と、二本鎖ＤＮＡの間に入ったインターカレーター
からの蛍光信号との比をとることにより得ることができ
る。

【０００９】また、本発明のＤＮＡ検出方法は、固体表
面上の所定の領域に、あるいは固体表面上に所定の密度
で二本鎖ＤＮＡを保持し、前記二本鎖ＤＮＡの間に入っ
たインターカレーターから発せられる蛍光強度から二本
鎖ＤＮＡの鎖長を決定することを特徴とする。例えば、
固体表面の所定面積からの蛍光信号を計測することで被
計測ＤＮＡ分子数を略一定とし、計測された蛍光強度か
らＤＮＡ鎖長を求めることができる。

【００１０】また、本発明のＤＮＡ検出方法は、一本鎖
ＤＮＡに結合した標識蛍光体と選択的に結合し消光させ
る特性を持ち、二本鎖ＤＮＡに捕獲されてその特性を失
うか減じる試薬をＤＮＡを含む溶液中に共存させ、蛍光
検出により二本鎖ＤＮＡの量あるいは長さを計測するこ
とを特徴とする。インターカレーターによる二本鎖ＤＮ
Ａの検出にはＡｒレーザーなど高価なレーザーが用いら
れるが、本発明の場合には標識蛍光体として種々のもの
を選ぶことができるので半導体レーザーなどで励起でき
る蛍光体を選べば安価な検出装置を作ることができる。
本発明によると、ゲル電気泳動などの繁雑な作業を伴う
ことなく、例えばオプチカルファイバーによる光照射と
オプチカルファイバーによる蛍光検出を用い、単に検体
ＤＮＡの含まれる溶液中にファイバーを入れて蛍光を計
るだけでＤＮＡの長さとコピー数を知ることができる。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。ＤＮＡを蛍光標識して光学的に検出する方
法は、取り扱いやすい方法として知られている。蛍光標
識には、ＤＮＡの末端（末端近傍）をアミノ基などを介
して共有結合で蛍光体とつなげる方法と、二本鎖ＤＮＡ
の間に入り込む性質のある蛍光体（インターカレータ
ー）を用いて標識する方法とがある。前者はＤＮＡのコ
ピー数に応じた蛍光強度を出すが、後者の蛍光強度はＤ
ＮＡの長さと量（分子数）による。ＤＮＡ量とインター
カレーターの比率を一定にすればインターカレーターか
らの発光量はＤＮＡの量及び長さに比例することが知ら
れているが、これを利用するにはＤＮＡ量に応じてイン
ターカレーターの量を変化させる必要があり、ＤＮＡの
長さあるいは量の定量分析には利用できない。

【００１２】図１は、一定量（４μＭ）のエチジウムホ
モダイマー（インターカレーター）共存下で、エチジウ
ムホモダイマーからの蛍光強度とＤＮＡ量の関係を調べ
たものである。ここでは、ＤＮＡとして１０９６ｂｐの
二本鎖ＤＮＡを用いた。図１から、二本鎖ＤＮＡの濃度
とインターカレーターの蛍光強度との間には一定の関係
が有ることが分かる。この関係を利用すると、インター
カレーターの蛍光強度からＤＮＡ量を求めることができ
る。

【００１３】一方、プローブ蛍光の強度からＤＮＡのコ
ピー数を求めることができる。そして、両者の比をとる
と、ＤＮＡのコピー数にかかわらずＤＮＡの長さに依存
したほぼ一定の値になる。このため、両者の比からＤＮ
Ａ鎖長の概略値を得ることができる。本発明ではこれを
利用して、次の〔数１〕のように、２種類の蛍光強度の
比から、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡの長さを知る。ｋは比
例定数である。

【００１４】

【数１】

【００１５】一方、蛍光体の中にはインターカレーター
と相互作用し、一本鎖状ではほとんど蛍光を発せず、二
本鎖では蛍光を出すものもある。これを利用すると、ハ
イブリダイズしたＤＮＡプローブの量やＰＣＲ増幅され
たＤＮＡの長さを計測することができる。以下、本発明
の実施の形態を詳細に説明する。

【００１６】〔実施の形態１〕図２を用いて、本発明の
実施の形態１について説明する。ＰＣＲプライマーとし
てプライマー１及びプライマー２を用意する。プライマ
ー１は蛍光体３により標識されており、プライマー２は
ビオチン４により標識されている。ＤＮＡ試料を入れＰ
ＣＲ増幅すると、ビオチンと蛍光体がそれぞれ両端に結
合した二本鎖ＤＮＡ５が生成する。アビジン６を保持し
た固体表面７（たとえば溶液を通過させ得る多孔質ガラ
スや磁気ビーズなど）を用い８のように二本鎖ＤＮＡを
捕獲し、未反応のプライマー１を除去し、蛍光を測定す
る。未反応のプライマー２はアビジンに捕獲されるが蛍
光体を持っていないし、二本鎖でもないので計測には差
し仕えない。

【００１７】次いで、インターカレーター９を含む溶液
を加えると、インターカレーター９は二本鎖の間に入り
込みインターカレーターと二本鎖ＤＮＡのコンプレクス
１０を形成し、光照射により蛍光を発する。インタカレ
ーター由来の蛍光の強度は図１に示したように二本鎖Ｄ
ＮＡの数及び長さに依存する。インターカレーターとし
てはエチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー、
ピコグリーン、ヨーヨーなどが知られている。ここでは
二本鎖ＤＮＡに対する特異性が高いエチジウムホモダイ
マーを用いた。一方、蛍光標識としては、テキサスレッ
ド、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネイト等があ
るが、ここではＣｙ５を用いた。

【００１８】図３は、エチジウムホモダイマーとＣｙ５
標識した二本鎖ＤＮＡのコンプレクスの励起スペクトル
１１と、二本鎖ＤＮＡとコンプレクスを形成したエチジ
ウムホモダイマーの蛍光発光スペクトル１３及びＣｙ５
の蛍光発光スペクトル１２を示す図である。エチジウム
ホモダイマーの励起には５３２ｎｍのＹＡＧレーザー
を、Ｃｙ５の励起には６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー
を用いた。蛍光測定は、ＹＡＧレーザーの迷光を防ぐた
め、オレンジフィルタを使用して測定した。

【００１９】図４には、両者の蛍光強度から求めたＤＮ
Ａ量及びコピー数の比のＤＮＡ塩基長依存性を示した。
ＤＮＡ量は、エチジウムホモダイマーの蛍光強度より図
１の検量線を用いて求めた。コピー数は、Ｃｙ５の蛍光
強度より求めた。Ｃｙ５の蛍光強度とＤＮＡ末端量、す
なわちコピー数は比例する。図４から、両者はほぼ比例
関係にあることがわかる。このように、蛍光強度の比を
測定すればＤＮＡの長さがわかる。用いる蛍光体は、他
の蛍光体でも良い。また、ＤＮＡの全量（主として二本
鎖ＤＮＡの量である）は、例えば波長２６７ｎｍ近傍の
紫外線吸収などによっても測定することができる。

【００２０】〔実施の形態２〕実施の形態１では、未反
応のプローブと反応プローブを分けるのにビオチン標識
を用いたが、ビオチンを用いずにグラスミルクやスピン
カラムで未反応の蛍光標識プライマーを除去しても良
い。エチジウムホモダイマーはＡｒレーザーやＹＡＧレ
ーザーで励起できるが、これらのレーザーは高価であ
り、安価な半導体レーザーを使えると都合がよい。イン
ターカレーターであるエチジウムホモダイマーは一本鎖
ＤＮＡに結合した蛍光体と相互作用し、この蛍光体から
の蛍光を消光する性質があることを見出した。また、エ
チジウムホモダイマーは一定の比率まで二本鎖ＤＮＡに
選択的に取り込まれるが、二本鎖ＤＮＡの量があまり多
くなく余剰のエチジウムホモダイマーがあると、これは
一本鎖ＤＮＡに結合した蛍光体からの蛍光の消光に用い
られる。

【００２１】はじめにプライマーに付いた蛍光体の蛍光
を消光するのに十分のエチジウムホモダイマーを加えて
おき、ＰＣＲ増幅で二本鎖ＤＮＡを増やしていくと、エ
チジウムホモダイマーは二本鎖ＤＮＡに入り込み、溶液
中で自由な状態のものは減少する。このため光を照射す
ると、プライマーについた蛍光体の消光が一部解除され
て蛍光が現れる。蛍光の強度は二本鎖ＤＮＡの中に入り
込んだエチジウムホモダイマーの量に比例するので、生
成したＤＮＡのコピー数と長さの積に比例する。この場
合、蛍光体にＣｙ５を用いているので、６３３ｎｍのＨ
ｅ−Ｎｅレーザーあるいは半導体レーザーが使用でき
る。さらに長波長の蛍光体を使用することもできる。こ
のようなエチジウムホモダイマーによる消光は、ＤＮＡ
に結合したＣｙ５、テキサスレッド、ＦＩＴＣ（フルオ
レセインイソチオシアネート）など種々の蛍光体で確認
された。また、未反応の蛍光プローブを除去すると、二
本鎖ＤＮＡのコピー数に比例した情報が得られる。

【００２２】図５は、添加したエチジウムホモダイマー
の量とプローブに標識された蛍光体（Ｃｙ５）からの蛍
光強度の関係を示す図である。二本鎖ＤＮＡに取り込ま
れたエチジウムホモダイマーからの蛍光はＤＮＡ量が少
ない時は二本鎖ＤＮＡを一部解離し、蛍光が弱くなる。
ＤＮＡが多くなると二本鎖が復活して蛍光が強くなる。
このため、エチジウムホモダイマーなどのインターカレ
ーターからの蛍光強度を用いたのでは定量しにくいが、
ＤＮＡに標識した蛍光体からの発光は残存ホモダイマー
の減少量すなわち二本鎖ＤＮＡに捕獲されたエチジウム
ホモダイマーの量に比例するので定量分析しやすく都合
がよい。

【００２３】〔実施の形態３〕本実施の形態は、生成す
るコピー数をそろえる、あるいは一定のコピー数になる
ように調整する例である。この場合、ＰＣＲプライマー
としては蛍光標識のないものを用いて良い。プライマー
１とプライマー２を用意するが、プライマー１を１ピコ
モル、プライマー２を１０ピコモル用いてＰＣＲを行
う。生成されるＤＮＡのコピー数はプライマー１の量で
決まる。なお、プライマー１の量とプライマー２の量を
両方少なくすると、反応速度が遅くなかなか平衡に到達
しないので実用的ではない。

【００２４】図６は、ＤＮＡの塩基長をパラメータとし
たＰＣＲの回数とインターカレーターからの蛍光強度の
関係を示す図である。この図は、ＤＮＡの塩基長を１０
０塩基長、２００塩基長、４００塩基長と変化させた時
に、ＰＣＲの回数とともにインターカレーターから発す
る蛍光強度がどのように増えるかを示したもので、ＰＣ
Ｒの回数が２０回までは蛍光強度は増加するが、それ以
上では増幅があまり行われず、各塩基長毎にほぼ一定の
強度になることがわかる。この飽和領域の蛍光強度はＤ
ＮＡの塩基長にほぼ比例しており、較正曲線を作ってお
けば蛍光強度から塩基長がわかる。

【００２５】このような非対称ＰＣＲを行う時、量の少
ない方のプライマー１を蛍光体１で標識しておき、ＰＣ
Ｒで得られたＤＮＡをインターカレーターとなる蛍光体
２で標識し、両蛍光の強度からＤＮＡ鎖長を知ることも
できる。ＰＣＲでできる産物のコピー数を飽和状態にし
たとき、プライマー１が相補鎖伸張に使われた割合はほ
ぼ一定であるので、蛍光体１と２の割合からＤＮＡの長
さを知ることができる。この場合、未反応のプライマー
１からの蛍光は無視することができるので、ビオチンア
ビジン反応やスピンカラムを用いてＤＮＡをプライマー
から分離する必要はない。

【００２６】〔実施の形態４〕本実施の形態は、固体表
面に一定の割合でＤＮＡを捕獲し、一定の領域に光を照
射してそこからでる蛍光を計測してＤＮＡの長さを知る
方法である。すなわち、固体表面上の所定の領域に、あ
るいは固体表面上に所定の密度で二本鎖ＤＮＡを保持
し、前記二本鎖ＤＮＡの間に入ったインターカレーター
から発せられる蛍光強度を計測する。固体表面上に保持
する二本鎖ＤＮＡの密度は、固体表面にプローブを固定
するための反応条件を調整することにより任意に設定可
能である。

【００２７】固体表面の所定面積からの蛍光信号を計測
することで被計測ＤＮＡ分子数を略一定とすると、計測
された蛍光強度からＤＮＡ鎖長を求めることができる。
図７は、固体表面上の一定面積からの蛍光信号を計測す
る方法を説明する図であり、（ａ）はＣＣＤカメラ等の
撮像手段を使用する例を示し、（ｂ）は光電子増倍管等
の光検出器を使用する例を示す。図７（ａ）において
は、結像レンズ２２を介して撮像手段２３によって固体
表面２０を撮像する。撮像手段２３では、固体表面２０
上の検出したい所定面積の領域２１からの蛍光信号のみ
を加算して出力する。また、図７（ｂ）の例では、結像
レンズ２２の結像面にスリット２４を配置し、固体表面
２０からの蛍光のうち所定面積の領域２１からの蛍光の
みが光電子増倍管２５に入射するように制限する。

【００２８】固体表面にＰＣＲ増幅したＤＮＡ鎖を固定
する方法には、固体表面にＰＣＲプライマーをあらかじ
め固定して固相液相間でＰＣＲを行う方法と、ビオチン
標識されたＤＮＡ鎖をＰＣＲで作り固体表面に捕獲する
方法がある。ここでは前者の例を説明する。ＤＮＡ分析
の一つに、ＤＮＡ鎖長をゲル電気泳動で分析するフラグ
メントアナリシスがある。ＤＮＡを制限酵素で切断し、
得られたＤＮＡの長さをゲル電気泳動で調べるのである
が、生成断片の数が多くなると十分な分析ができないこ
とがある。そこで、生成したＤＮＡ断片の末端塩基配列
により、まずＤＮＡ断片を分類し、各グループ毎に長さ
分離する方法を本発明者は提案している（特開平８−７
０８９８号公報、特開平８−１７３１６４号公報、特開
平７−１１６０００号公報など）。すなわち、制限酵素
切断したＤＮＡ断片の末端にオリゴマーをライゲーショ
ンにより結合する。結合するオリゴマーは５’末端がＣ
ｙ５標識されている。

【００２９】導入したオリゴマー及び制限酵素の切断部
配列と相補的な配列を持つプライマーを用いると、各切
断断片の相補鎖を合成することができる。この時、３’
末端に２塩基からなる任意の配列をＤＮＡ断片の選別用
に付けておくと、プライマーの３’末端と完全に相補な
ＤＮＡ断片にハイブリダイズしたプライマーだけが伸長
する。そこで、１６種の各プライマー毎に相補鎖合成を
行い、生成物の長さ分析をすれば、一度の電気泳動で分
析するＤＮＡ断片の数は１６分の１となるのでより詳し
い分析ができる。

【００３０】しかし、ゲル電気泳動は手間のかかるもの
であり、電気泳動なしに各グループのＤＮＡ断片の長さ
を知り、分析に利用できれば都合が良い。そこで１６種
のプライマーを区画されたセルに固定し、相補鎖合成す
ると、鋳型となったＤＮＡの５’末端がＣｙ５標識さ
れ、相補鎖合成された側のＤＮＡがセルに固定された状
態の二本鎖ＤＮＡが得られる。Ｃｙ５の蛍光を測定した
後、インターカレーターを加えて標識し、光を照射して
蛍光を観測することにより長さ情報を得る。

【００３１】ＤＮＡ断片の数が多い時には、両端の任意
配列の組み合わせ２５６種のセルを用いればより詳しい
分析ができる。この場合、まず１６種の選別配列を持つ
Ｃｙ５標識プライマーを用いて相補鎖合成を行いその生
成物を取り出す。１６種の選別配列を持つプライマーを
それぞれ固定したセルを持つ１６個のチップ上に前記生
成物をハイブリダイズせしめ、相補鎖合成を行う。得ら
れたＤＮＡ二本鎖をインターカレーターで標識し、それ
ぞれのセルからのＣｙ５由来蛍光とインターカレーター
由来の蛍光を計測する。即ち、実施の形態１と同様に末
端Ｃｙ５とインターカレーター由来の蛍光を調べること
で、各セルに固定されたＤＮＡ鎖の長さを知ることがで
きる。

【００３２】〔実施の形態５〕本発明の方法は、ＰＣＲ
産物以外にも適用できる。ターゲットとする二本鎖ＤＮ
Ａの末端に、ＤＮＡポリメラーゼあるいはターミナルト
ランスフェラーゼを用いて蛍光標識ヌクレオチドを付加
する。末端に蛍光標識の入った二本鎖ＤＮＡを得て、前
の例と同じようにインターカレーターを加えてからフィ
ルターあるいはスピンカラムを用いて余剰の蛍光標識ヌ
クレオチドと、エチジウムホモダイマーを除去する。残
存物には過剰のエチジウムホモダイマーは含まれておら
ず、エチジウムホモダイマーによる消光は問題にならな
いので、これから蛍光を測定し、末端に付加した蛍光体
の発する蛍光強度とインターカレーターの発する蛍光強
度の比からＤＮＡの鎖長を求める。

【００３３】〔実施の形態６〕次の実施の形態は、ライ
ゲーションで蛍光標識ＤＮＡオリゴマーを結合させ分析
した例である。ライゲーションの効率は１００％ではな
いので、オリゴマーにはビオチンを蛍光体とあわせてつ
けたものを用いた。ターゲットＤＮＡに上記オリゴマー
を混ぜ、ライゲースを加えてオリゴマーをターゲットＤ
ＮＡに結合させる。スピンカラムを用いて、オリゴマー
及びライゲースなどターゲットＤＮＡ以外を除去する。
ターゲットＤＮＡの中にはオリゴマーが付加したものも
有れば、元のままのものもある。ここで、計測に必要な
蛍光体を付加されたＤＮＡだけを取り出すために、表面
にアビジンを持つビーズを加えて、蛍光体及びビオチン
の付加したターゲットＤＮＡを抜き出す。

【００３４】これに変わる方法として、オリゴマーには
ビオチンを付加しておかず、またＤＮＡポリメラーゼあ
るいはターミナルトランスフェラーゼによりヌクレオチ
ドの付加が起こらない構造にしておき、スピンカラム処
理後のターゲットＤＮＡにビオチン標識ダイデオキシヌ
クレオチドとＤＮＡポリメラーゼあるいはターミナルト
ランスフェラーゼを用い、未反応のＤＮＡにビオチンを
導入した後、これをアビジン付きビーズを用いて除去し
ても良い。いずれにせよ蛍光体つきのターゲットＤＮＡ
だけを得る。以下の蛍光測定及びＤＮＡ鎖長の算出方法
は、前記した実施の形態と同様である。

【００３５】〔実施の形態７〕これまでの例では蛍光標
識プローブを蛍光計測に先だって除去して測定してきた
が、このような手間をかけないで測定を行うこともでき
る。図８は、プローブが一本鎖のとき、二本鎖のとき、
及び二本鎖ＤＮＡにインターカレーターを加えたときに
末端標識蛍光体（Ｃｙ５）から発せられる蛍光がどのよ
うに変化するか示したものである。

【００３６】一本鎖ＤＮＡでは、加えるエチジウムホモ
ダイマーの濃度を増すとともに標識蛍光体からの蛍光は
減少する。比較的長さの短い二本鎖プローブでは、最初
蛍光強度の減少の仕方は緩やかであるが、高いエチジウ
ムホモダイマー濃度で、やはり蛍光強度は大きく減少す
る。一方、長いＤＮＡ二本鎖（ここでは１００マー以上
を用いた）では、短い二本鎖ＤＮＡと似た変化を示す
が、標識蛍光強度の減少にはより多くのエチジウムホモ
ダイマーを必要とする。蛍光強度の大きな減少は二本鎖
ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに分解して起こるものと思われ
る。エチジウムホモダイマーの濃度を３μＭとすると、
一本鎖ＤＮＡに起因した蛍光信号は十分小さくでき、一
方二本鎖ＤＮＡに起因した信号はあまり弱くせずに検出
できる。

【００３７】末端標識蛍光体及びインターカレーターの
蛍光強度のＤＮＡ長さ依存から求めたＤＮＡ鎖長と、電
気泳動法で求めた実際の鎖長の関係を図９に示した。蛍
光プライマーを除去せずに測定しても、かなり良い精度
でＤＮＡの鎖長測定ができることが分かる。ここでは末
端標識蛍光体としてＣｙ５を用い、インターカレーター
としてエチジウムホモダイマーを用いたが、他の蛍光体
及びインターカレーターを用いても同様の結果が得られ
る。

【００３８】一本鎖ＤＮＡに標識された蛍光体からの蛍
光の消光は、共存するインターカレーターの量に依存す
る。インターカレーターは二本鎖ＤＮＡに強く捕獲され
るので残存のインターカレーターは二本鎖ＤＮＡの長さ
が長くなると、また、二本鎖ＤＮＡのコピー数が多くな
るほど少なくなる。そこで、ＤＮＡのコピー数をほぼ一
定にすると、ＤＮＡ鎖長とともに残存しているプライマ
ー標識蛍光体からの蛍光を大きくできる。これはインタ
ーカレーターが蛍光を出さない場合でも生成したＤＮＡ
を検出できる利点がある。

【００３９】本発明のように、末端標識蛍光体から出る
蛍光と二本鎖の間に全体に平均的に入り込んだインター
カレーター蛍光体からの蛍光との比を用いて長さを求め
る方法は、長さの違うＤＮＡが混在している場合にはう
まくゆかない。この場合には、何等かの方法で異種ＤＮ
Ａを分離する必要がある。ＤＮＡサイズが大きく違う時
には、膜やゲルを用いて分離してから長さ計測できる。
もちろん、このサイズ分離で鎖長がわかる場合には蛍光
比をとる必要はないが、分離はできても１０ｋｂあるい
は２０ｋｂよりターゲットＤＮＡが長くそのサイズがわ
からない時には、本発明で提案した方法を使用できる。

【００４０】サイズ分離を利用する他に、ＤＮＡ断片の
末端配列の違いでＤＮＡを分離してそれぞれの長さを蛍
光比で計ることもできる。ターゲットＤＮＡの長さがあ
まり長くなく、ＰＣＲなどの相補鎖合成で同じ長さのＤ
ＮＡが得られる場合には、実施の形態４に示したのと類
似の方法で、各ＤＮＡの長さをオリゴチップを利用して
知ることができる。すなわち、ＤＮＡに蛍光標識したプ
ライミングサイトを付け、末端配列を識別できるプライ
マーを保持したオリゴチップを用いて相補鎖合成を行
い、ＤＮＡを配列が違うもの毎に異なるセル上に保持
し、インターカレーターの蛍光と末端蛍光の比から長さ
を知ることができる。

【００４１】一方、ＤＮＡの長さが長く、ＰＣＲや相補
鎖合成ではもとのＤＮＡ鎖を合成できない場合には、Ｄ
ＮＡ選別用のプライマーは使用できない。この場合に
は、Class IIの制限酵素を用いる。ＤＮＡの末端にClas
s IIの制限酵素の認識配列を持つオリゴマーを結合させ
る。Class IIの制限酵素は認識部位から離れたところを
切断する酵素である。Class IIの酵素で切断すると、
３’あるいは５’側が数塩基だけのびた端ができる。こ
の部分の配列はＤＮＡにより異なると予想される。そこ
で蛍光標識した二本鎖オリゴマーを用意する。この端
は、ＤＮＡとライゲーションで結合できるように数塩基
だけ一本鎖状態である。一本鎖状態の部分の配列が相補
的な場合にだけライゲーションはうまくゆく。この配列
をいろいろ変えたオリゴマーを用意することで、ＤＮＡ
を選別することができる。

【００４２】〔実施の形態８〕本実施の形態は、相補鎖
合成で生成した二本鎖ＤＮＡのコピー数すなわち分子数
を酵素のエクソヌクレアーゼ活性を利用して見積もる方
法である。ＰＣＲに用いる２種のプライマー（プライマ
ー１及びプライマー２）に加えて、増幅領域にハイブリ
ダイズするＤＮＡプローブを用意する。このプローブに
は、蛍光標識とそれを消光する化学物質が共有結合で異
なるヌクレオチドに付けられている。溶液中では光をあ
てても消光剤が付いているので蛍光はほとんど発しな
い。しかし、蛍光標識と消光剤が分離されると蛍光が観
測される。この標識プローブをＰＣＲ反応のときに共存
させると、ターゲットにハイブリダイズしたプローブは
酵素のエクソヌクレアーゼ活性により端から各ヌクレオ
チドに分解され、蛍光標識１の付いたヌクレオチドは消
光剤の付いたヌクレオチドと分離され蛍光１を発するよ
うになる。すなわち、合成ＤＮＡのコピー数に応じた強
度で蛍光が観測される（米国特許第５，２１０，０１５
号）。一方、二本鎖ＤＮＡに入り込み蛍光を発するイン
ターカレーターを加えると、生成した二本鎖ＤＮＡの量
に応じた蛍光２が観測されるので、この蛍光２とプロー
ブに標識されていた蛍光１とからＤＮＡの長さと量を知
ることができる。

【００４３】また、二本鎖ＤＮＡの総量を知るには、ヌ
クレオチドに結合した蛍光標識２（必ずしもヌクレオチ
ドに結合している必要はない）と相互作用し、その蛍光
を消光するインターカレーターを用いてもよい。すなわ
ち、蛍光標識ヌクレオチドと消光用のインターカレータ
ーを混合し、ちょうど過不足なく消光される量のインタ
ーカレーターを標識ヌクレオチドに加えてＰＣＲ産物に
共存させる。もちろん、この標識ヌクレオチドはＰＣＲ
プライマーであってもよいし、消光さえ起こればヌクレ
オチドに結合した蛍光でなくてもよい。インターカレー
ターは二本鎖ＤＮＡがあると間に入り込み、溶液中の実
効濃度が低下する。このため、二本鎖に捕獲されたイン
ターカレーターの量に応じて消光が起こらなくなり、蛍
光２が観測される。前と同様に、蛍光１及び蛍光２の強
度から分子数＋ＤＮＡの総数が分かり、ＤＮＡの長さを
知ることができる。

【００４４】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、ＤＮ
Ａ鎖長を、ＤＮＡを電気泳動などの繁雑な作業によるこ
となしに知ることができる。また、ＰＣＲなどで生成し
た二本鎖ＤＮＡ量を高価なレーザーを用いず安価な半導
体レーザーで計測する手段を提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】インターカレーターからの蛍光強度とＤＮＡ量
の関係を示す図。

【図２】本発明による方法の一例を説明する図。

【図３】エチジウムホモダイマーとＣｙ５標識した二本
鎖ＤＮＡのコンプレクスの励起スペクトルと、二本鎖Ｄ
ＮＡとコンプレクスを形成したエチジウムホモダイマー
の蛍光発光スペクトル及びＣｙ５の蛍光発光スペクトル
を示す図。

【図４】蛍光強度から求めたＤＮＡ量及びコピー数の比
のＤＮＡ塩基長依存性を示す図。

【図５】添加したエチジウムホモダイマーの量とプロー
ブに標識された蛍光体からの蛍光強度の関係を示す図。

【図６】ＤＮＡの塩基長をパラメータとしたＰＣＲの回
数とインターカレーターからの蛍光強度の関係を示す
図。

【図７】固体表面上の一定面積からの蛍光信号を計測す
る方法を説明する図。

【図８】一本鎖プローブ、二本鎖プローブ及び二本鎖Ｄ
ＮＡにインターカレーターを加えたときに末端標識蛍光
体からでる蛍光の変化を示す図。

【図９】末端標識蛍光体及びインターカレーターの蛍光
強度のＤＮＡ長さ依存から求めたＤＮＡ鎖長と、電気泳
動法で求めた実際の鎖長の関係を示す図。

【符号の説明】

１…プライマー１、２…プライマー２、３…蛍光体、４
…ビオチン、５…二本鎖ＤＮＡ、６…アビジン、７…固
体表面、９…インターカレーター、１０…インターカレ
ーターと二本鎖ＤＮＡのコンプレクス、２０…固体表
面、２１…所定面積の領域、２２…結像レンズ、２３…
撮像手段、２４…スリット、２５…光電子増倍管

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 二本鎖ＤＮＡの間に入り込み光照射によ
   り蛍光を発するインターカレーターと前記ＤＮＡに結合
   した蛍光体とを同時に溶液中に含む状態で光照射し、前
   記インターカレーターから発せられる蛍光強度と前記蛍
   光体から発せられる蛍光強度とを計測してＤＮＡの量と
   長さを測定することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
2. 【請求項２】 一本鎖状のＤＮＡに結合した蛍光体の蛍
   光発光を妨害するが、二本鎖状のＤＮＡに結合した蛍光
   体の蛍光発光は許容する物質を被測定溶液中に保持して
   蛍光計測することにより二本鎖ＤＮＡを検出することを
   特徴とするＤＮＡ検出方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡ検出方法に
   おいて、蛍光標識ＤＮＡプローブを検体を含む溶液中に
   加えターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせて二本鎖Ｄ
   ＮＡを生成し、インターカレーター共存下で光照射して
   蛍光を計測することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
4. 【請求項４】 ＤＮＡの分子数に依存する第１の信号
   と、ＤＮＡの鎖長と分子数の両方に依存する第２の信号
   とを計測し、前記第１の信号と第２の信号を用いてＤＮ
   Ａの鎖長情報を得ることを特徴とするＤＮＡ検出方法。
5. 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡ検出方法におい
   て、前記ＤＮＡの分子数に依存する信号をＤＮＡ末端近
   傍に導入された標識蛍光体から発せられる蛍光強度によ
   り得ることを特徴とするＤＮＡ検出方法。
6. 【請求項６】 請求項４記載のＤＮＡ検出方法におい
   て、前記ＤＮＡの鎖長と分子数の両方に依存する信号を
   ＤＮＡ分子の光吸収により得ることを特徴とするＤＮＡ
   検出方法。
7. 【請求項７】 請求項４記載のＤＮＡ検出方法におい
   て、前記ＤＮＡの鎖長と分子数の両方に依存する信号を
   二本鎖ＤＮＡ分子の間に捕獲された蛍光体から発せられ
   る蛍光強度により得ることを特徴とするＤＮＡ検出方
   法。
8. 【請求項８】 請求項４記載のＤＮＡ検出方法におい
   て、前記ＤＮＡの鎖長情報を、ＤＮＡの末端近傍に標識
   された蛍光体からの蛍光信号と、二本鎖ＤＮＡの間に入
   ったインターカレーターからの蛍光信号との比をとるこ
   とにより得ることを特徴とするＤＮＡ検出方法。
9. 【請求項９】 固体表面上の所定の領域に、あるいは固
   体表面上に所定の密度で二本鎖ＤＮＡを保持し、前記二
   本鎖ＤＮＡの間に入ったインターカレーターから発せら
   れる蛍光強度から二本鎖ＤＮＡの鎖長を決定することを
   特徴とするＤＮＡ検出方法。
10. 【請求項１０】 請求項９記載のＤＮＡ検出方法におい
    て、固体表面の所定面積からの蛍光信号を計測すること
    で被計測ＤＮＡ分子数を略一定とし、計測された蛍光強
    度からＤＮＡ鎖長を求めることを特徴とするＤＮＡ検出
    方法。
11. 【請求項１１】 一本鎖ＤＮＡに結合した標識蛍光体と
    選択的に結合し消光させる特性を持ち、二本鎖ＤＮＡに
    捕獲されてその特性を失うか減じる試薬をＤＮＡを含む
    溶液中に共存させ、蛍光検出により二本鎖ＤＮＡの量あ
    るいは長さを計測することを特徴とするＤＮＡ検出方
    法。
12. 【請求項１２】 ＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡの分子
    数と長さを計測する方法において、ＰＣＲ増幅用の２種
    のプライマーに加えて、増幅部位の中間にハイブリダイ
    ズするオリゴヌクレオチドであり蛍光標識とその蛍光を
    消光する性質の化学物質を異なるヌクレオチドに共有結
    合で結合したオリゴヌクレオチドを共存させＰＣＲ増幅
    を行い、酵素のエクソヌクレアーゼ活性を利用して、ハ
    イブリダイズしたオリゴヌクレオチドを分解し、蛍光標
    識された部分のヌクレオチドをオリゴマーから切断分離
    し、また、生成した二本鎖ＤＮＡの間に入り込み蛍光を
    発するインターカレーターを共存させて蛍光検出を行
    い、インターカレーターからの蛍光により、二本鎖ＤＮ
    Ａの総量を知り、切断遊離した蛍光標識からでる蛍光に
    より二本鎖ＤＮＡの分子数を知り、これらからＤＮＡ鎖
    長と分子数を得ることを特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 ＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡの分子
    数と長さを計測する方法において、ＰＣＲ増幅用の２種
    のプライマーに加えて、増幅部位の中間にハイブリダイ
    ズするオリゴヌクレオチドであり蛍光標識１とその蛍光
    を消光する性質の化学物質を異なるヌクレオチドに共有
    結合で結合したオリゴヌクレオチドを共存させＰＣＲ増
    幅を行い、酵素のエクソヌクレアーゼ活性を利用して、
    ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを分解し、蛍光
    標識された部分のヌクレオチドをオリゴマーから切断分
    離し、また、インターカレーターであり、溶液中で共存
    させるとヌクレオチドに結合した蛍光２を消光する性質
    を持ち、また生成した二本鎖ＤＮＡの間に入り込み安定
    に保持され蛍光２を消光する性質を失うインターカレー
    ターを共存させて蛍光検出を行い、蛍光２の蛍光によ
    り、二本鎖ＤＮＡの総量を知り、切断遊離した蛍光標識
    １から出る蛍光により二本鎖ＤＮＡの分子数を知り、こ
    れらからＤＮＡ鎖長と分子数を得ることを特徴とする方
    法。