JP2003515149A

JP2003515149A - 核酸プローブアレイ

Info

Publication number: JP2003515149A
Application number: JP2001539921A
Authority: JP
Inventors: ジョナサンエム．ロスバーグ，; ジョエルエス．ベイダー，
Original assignee: キュラジェンコーポレイション
Priority date: 1999-11-26
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2003-04-22
Also published as: WO2001038580A3; WO2001038580A2; WO2001038580A9; AU1792701A; AU783841B2; CA2392474A1; EP1234058A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸のアレイ中の別々の位置でクローン増幅された核酸を生成するための高感度な方法の発見に一部基づく。この方法は、好ましくは、核酸テンプレートを、そのアレイの表面に結合されたアンカープライマーにアニールさせることによって行われる。アレイ中の少なくとも１つのアンカープライマーは、標的核酸の５’および３’末端の配列に相補的な配列を有する。アンカープライマーへの所望の標的核酸のアニーリングは、その線状の標的核酸の５’および３’末端の並列または近接を生じる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、一般に、核酸に関し、そしてより詳細には、核酸の集団中の核酸を
同定するための核酸のアレイに関する。

【０００２】（発明の背景）多くの疾患は、特定のＤＮＡ配列に関連する。これらのＤＮＡ配列は、しばし
ば、ＤＮＡ配列多型と呼ばれ、非罹患個体中のその対応するＤＮＡ配列とは異な
る疾患状態に関連するＤＮＡ配列を示す。ＤＮＡ配列多型としては、例えば、あ
る配列における、第２の配列と比較した、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換
が挙げられ得る。特定のＤＮＡ配列多型の例は、配列５’−ＡＴＧＧ−３’に対
する、５’−ＡＴＣＧ−３’である。後者の配列の最初のヌクレオチド「Ｇ」は
、前者の配列においてヌクレオチド「Ｃ」に置換されている。前者の配列は、特
定の疾患状態に関連し、一方、後者の配列は、疾患に罹患していない個体におい
て見い出される。従って、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＣＧ−３’の存在は、そ
の個体が特定の疾患を有することを示す。この特定の型の配列多型は、その配列
の差異が１つのヌクレオチドにおける変化に起因することから、一ヌクレオチド
多型またはＳＮＰとして公知である。

【０００３】従って、１個ほどの少ないＤＮＡ塩基の変化の迅速な検出を可能にする技術は
、遺伝子分析における使用のための重要な方法である。ヒトゲノムのサイズは大
きいので（３０億塩基対オーダー）、多型を同定するための技術は、核酸の潜在
的に大きい集団において多型を含む配列を特異的に同定するのに十分高感度でな
ければならない。

【０００４】代表的に、ＤＮＡ配列多型分析は、個体からＤＮＡを単離し、その単離したＤ
ＮＡを操作（例えば、制限酵素でのＤＮＡの消化および／または単離したＤＮＡ
中の配列のサブセットの増幅によって）することによって行われる。次いで、操
作したＤＮＡをさらに試験して、特定の配列が存在するか否かを決定する。

【０００５】ＤＮＡ配列を分析するための技術には、ゲルベースの電気泳動分析、トンネル
電子マイクロスプレーのスキャニング、ハイブリダイゼーションによる配列決定
、および固体基材ベースの核酸分析が含まれる。これらの固体支持体としては、
例えば、ガラス表面、プラスチックマイクロタイタープレート、およびプラスチ
ッキシートが含まれ得る。これらの基材は、代表的に、複数の連結されたオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含み、これらは、例えば、この支持体に
吸着または共有結合され得る。

【０００６】基材ベースの核酸分析としては、既知のサンプル核酸または特定の配列多型を
含むことが疑われるサンプル核酸を、その固体支持体に結合されたプローブのア
レイに適用する工程を含み得る。この集団中の核酸は、基材に結合された相補的
配列（もしあれば）にハイブリダイズされる。次いで、ハイブリダイズしている
核酸配列を、検出工程において検出する。

【０００７】固体支持体マトリクスベースのハイブリダイゼーションおよび配列決定方法は
、高いサンプルＤＮＡ濃度を必要とし得、そして核酸サンプルの、固定されたオ
リゴヌクレオチドプローブとの、比較的遅いハイブリダイゼーション反応速度に
よって妨げられ得る。しばしば、少量のテンプレートＤＮＡのみが利用可能であ
る。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、核酸のアレイ中の別々の位置でクローン増幅された核酸を生成する
ための高感度な方法の発見に一部基づく。この方法は、好ましくは、核酸テンプ
レートを、そのアレイの表面に結合されたアンカープライマーにアニールさせる
ことによって行われる。アレイ中の少なくとも１つのアンカープライマーは、標
的核酸の５’および３’末端の配列に相補的な配列を有する。アンカープライマ
ーへの所望の標的核酸のアニーリングは、その線状の標的核酸の５’および３’
末端の並列または近接を生じる。

【０００９】このアニールされた線状標的核酸は、１回または２回の連結反応を使用して環
状化される。１つの実施形態において、１回の連結が使用される。この線状核酸
のアニーリングは、アンカープライマー上での標的核酸の５’および３’末端の
並列を生じる。リガーゼの添加は、この標的核酸の環状化を生じる。この環状化
された核酸は、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応におけるアンカープライマーの伸長のためのテン
プレートである。この環状核酸に相補的な配列の複数のコピーを含む、伸長され
たアンカープライマーが形成される。標的核酸に相補的な配列の２個以上のコピ
ーが共有結合したアンカープライマーを含む核酸はまた、本明細書中で、アンカ
ープライマー核酸−核酸コンカテマーと呼ばれる。

【００１０】この相補的配列の複数のコピーの存在は、この核酸の検出を容易にする。従っ
て、この方法は、アレイ上の別々の位置に結合した所望の核酸を検出する、非常
に高感度な方法を提供する。代表的に、アレイ中のほんの数個のアンカープライ
マーが、所定の反応において伸長されるので、高密度のアンカープライマーを含
むアレイが調製され得る。従って、本発明の方法および組成物は、所望の核酸が
高感度で検出され得る、高密度アレイを提供する。

【００１１】代替的な実施形態において、２回の連結事象が生じる。このアニールされた標
的核酸の５’および３’末端は、ギャップによって離される。ギャップに相補的
なオリゴヌクレオチドが、添加される。このギャップオリゴヌクレオチドに対す
る、このアニールされた標的核酸の末端の連結は、ローリングサークル増幅のテ
ンプレートとして作用し得る、共有結合して閉じた環状分子の形成を生じる。

【００１２】１回または２回の連結事象を使用する場合、テンプレートとしてこの環状核酸
分子を使用する、アンカープライマーの伸長は、基材中の別々の位置でのクロー
ン増幅された産物を生じる。

【００１３】この１回または２回のいずれかの連結反応の必要性は、所望の核酸分子の同定
における感度の増加を可能にする。なぜなら、この同定は、標的核酸分子の末端
ヌクレオチドとアンカープライマー中のその対応するヌクレオチドとの間の、完
全な対形成を必要とするからである。リガーゼ分子は、その３’および５’末端
ヌクレオチドが相補的ヌクレオチドと塩基対形成している基質を、優先的に連結
する。従って、標的核酸と標的核酸の末端または末端付近にミスマッチオリゴヌ
クレオチドを含むアンカープライマーとの二重鎖は、このリガーゼの基質ではな
く、従って、共有結合して閉じた環を生じない。

【００１４】従って、本発明は、核酸分子の集団中の標的核酸を同定しそしてクローン増幅
するためのアレイを使用するための、非常に高感度な方法を提供する。

【００１５】好ましいポリヌクレオチドアンカープライマーは、第１領域、第２領域および
第３領域を含む。第１領域は、標的核酸配列の５’領域に相補的な配列を含み、
そして第２領域は、標的核酸の３’領域に相補的な配列を含む。第１領域および
第２領域は、各々、４〜２５、４〜２０、８〜２０、１０〜１８または１２〜１
６ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、第１領域または第２領
域、あるいは両方は、例えば、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０また
は２５ヌクレオチド長である。第３領域は、例えば、４〜２０、６〜１８、８〜
１６または１０〜１４ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、第
３領域は、例えば、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０ヌク
レオチド長である。

【００１６】標的核酸配列は、例えば、１以上の制限酵素で核酸の開始集団を消化すること
によって生成される制限フラグメントを含み得る。

【００１７】いくつかの実施形態において、第１領域は、第１の制限エンドヌクレアーゼの
認識配列のいくらかまたは全部に相補的な配列、および標的核酸配列の配列に相
補的な領域を含む。この相補的領域は、好ましくは、この標的核酸配列の第１の
制限エンドヌクレアーゼの認識配列の３’側にある。

【００１８】第１領域は、さらに、標的核酸中の配列多型を規定するヌクレオチドに相補的
な問合せ（ｑｕｅｒｙ）ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、この問合せヌク
レオチドは、第１領域の３’末端（すなわち、そのポリヌクレオチドの３’末端
）にある。

【００１９】いくつかの実施形態において、第３領域は、第２の制限エンドヌクレアーゼの
認識配列のいくらかまたは全部に相補的な配列、および標的核酸配列の配列に相
補的な領域を含む。この相補的領域は、好ましくは、この標的核酸配列の第２の
制限エンドヌクレアーゼの認識配列の５’側に位置する。

【００２０】第１および第２の制限酵素は、同じであって異なってもよい。さらに、これら
の制限酵素は、例えば、ＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素であり得る。

【００２１】いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、４〜２５、８
〜２０または６〜１２ヌクレオチド長であり得る。例えば、特定の実施形態にお
いて、このオリゴヌクレオチドは、例えば、４、６、８、１０、１２、１６、１
８、２０または２５ヌクレオチド長であり得る。

【００２２】標的核酸は、配列多型を含み得るか、または配列多型を含むことが疑われ得る
。いくつかの実施形態において、多型は、例えば、標的核酸配列の５’末端また
は３’末端の２００、１００、７５、５０、２５または１５ヌクレオチド内、あ
るいは標的核酸配列の５’末端または３’末端に位置され得る。

【００２３】さらなる局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドアンカープライマー（
同一の配列または異なる配列のいずれか）のアレイを提供する。このアレイは、
第１の表面を有する支持体を備え、この第１の表面には、この固体支持体の第１
の表面に結合される複数のオリゴヌクレオチドアンカープライマーが連結されて
いる。表面に結合されたアンカープライマーは、標的核酸配列の５’領域に相補
的な第１領域、標的核酸配列の３’領域に相補的な第２領域、および第１領域と
第２領域との間に位置する任意の第３領域を含む。異なるオリゴヌクレオチドの
各々は、好ましくは、異なる所定の領域で、その固体支持体の表面に結合され、
そして異なる所定の配列を有する。

【００２４】この表面へのアンカープライマーの結合は、アニールされたアンカープライマ
ーの伸長前、伸長中または伸長後に生じ得る。従って、１つの実施形態において
、１以上のアンカープライマーは、固体基材に連結され、その後、このアンカー
プライマーが、標的核酸にアニールされそしてポリメラーゼの存在下で伸長され
る。あるいは、第２の実施形態において、アンカープライマーは、標的核酸に最
初にアニールされ、そしてそのアニールされたアンカーの３’ＯＨ末端が、ポリ
メラーゼで伸長される。次いで、この伸長されたアンカープライマーは、固体基
材に連結される。アンカープライマーの配列を変更することによって、核酸の集
団中に存在する別々の標的核酸を、特異的に増幅することが可能である。

【００２５】いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、１２〜１００、１８〜
５０または２４〜４０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、アンカ
ープライマーは、例えば、１２、１８、２４、４０または５０ヌクレオチド長で
ある。アレイは、固体支持体に結合された、少なくとも１００個、またはさらに
１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、または１，０００，０００
個、あるいは１０，０００，０００個またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチ
オを含み得る。

【００２６】好ましくは、所定の領域の各々は、他の所定の領域とは物理的に離されており
、例えば、これらの規定された領域は、１〜４００μｍ、４０〜１５０μｍまた
は１００〜１５０μｍ離されうる。

【００２７】別の局面において、本発明は、核酸の配列を決定する方法を提供する。この方
法は、複数の異なるアンカープライマー（例えば、上記のアンカープライマー）
を有する基材を提供する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この複
数のプライマーには、アレイ上の既知の位置で既知の配列のアンカープライマー
を含まれる。

【００２８】アンカープライマーは、標的核酸配列の５’領域に相補的な第１領域、標的核
酸配列の３’領域に相補的な第２領域、および必要に応じて、第１領域と第２領
域との間にある第３領域を含む。

【００２９】アレイ上の１以上のアンカープライマーに、環状標的核酸分子の集団を接触さ
せる。これらの標的環状核酸は、開環または閉環であり得る。

【００３０】いくつかの実施形態において、基材上のアンカープライマーに、第１領域およ
び第３領域を有するアンカープライマーのその第１領域および第３領域に相補的
な、５’領域および３’領域を有する環状核酸を接触させる。

【００３１】いくつかの実施形態において、環状標的核酸は、アレイ中のアンカープライマ
ーに、５’末端および３’末端を有する線状標的核酸をアニールすることによっ
て形成される。このアニーリングは、この標的核酸の５’末端および３’末端が
、アレイ中のアンカープライマーにおける相補的配列にアニールするのを可能に
する条件下で行う。次いで、この標的核酸のアニールされた末端に、アンカープ
ライマーの第３領域（ギャップ領域とも呼ばれ得る）に相補的なギャップオリゴ
ヌクレオチドおよびリガーゼを、このギャップオリゴヌクレオチドへのこの標的
核酸の５’末端および３’末端の連結を可能にするのに十分な条件下で接触させ
る。これは、閉じた環状標的核酸の形成を生じるいくつかの実施形態において、この閉じた環状分子に相同な配列は、それらの
ヌクレオチド配列を決定する前に増幅される。増幅は、例えば、閉環環状分子に
アニールされたアンカープライマーの３’ＯＨ末端を伸長することによって生じ
る。伸長は、この共有結合して閉じた環状標的分子の１以上のコピーに相補的な
ポリヌクレオチド産物の形成を可能にする条件下で、ポリメラーゼによって生じ
る。このポリヌクレオチド産物を同定し、これによって、この環状化した標的核
酸の配列を決定する。

【００３２】標的核酸は、配列多型（例えば、一ヌクレオチド配列多型）を含み得る。好ま
しくは、一ヌクレオチド多型は、上記アンカープライマーの上記第１領域におけ
る問合せヌクレオチド（例えば、アンカープライマーの３’末端の問合せヌクレ
オチド）に相補的である。

【００３３】いくつかの実施形態において、共有結合して閉じた環状核酸は、アレイ上の１
以上のアンカープライマーに、線状標的核酸を、この標的核酸の５’末端および
３’末端がこのアンカープライマーにアニールするのを可能にする条件下で接触
させることによって形成される。いくつかの実施形態において、５’および３’
末端は、そのアンカープライマー中の少なくとも４ヌクレオチドの第３の「ギャ
ップ領域」によって離されている。このギャップ領域が存在する場合、次いで、
この標的核酸の３’末端は、３’末端ヌクレオチドがそのアニールされた標的核
酸の５’末端に隣接する伸長産物を形成するのに十分な条件下で、ポリメラーゼ
によって伸長される。

【００３４】次に、この伸長産物の３’末端ヌクレオチドは、アニールされた標的核酸の５
’末端に連結され、これによって、閉じた環状分子を形成する。

【００３５】標的分子は、核酸分子の任意の集団（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の集団
）に由来し得る。

【００３６】いくつかの実施形態において、基材上のアンカープライマーに、線状標的核酸
を、その標的核酸の５’および３’末端がアンカープライマーにアニールするの
を可能にする条件下で接触させる。アンカープライマーにアニールされた場合、
この５’および３’末端は、アンカープライマー上の少なくとも６ヌクレオチド
のギャップ領域によって離される。

【００３７】次に、この標的核酸のアニールされた末端に、ギャップオリゴヌクレオチドお
よびリガーゼを接触させる。このギャップオリゴヌクレオチドは、アンカープラ
イマーのギャップ領域に相補的である。リガーゼは、ギャップオリゴヌクレオチ
ドへの標的核酸の５’および３’末端の連結を可能にするのに十分な条件下で添
加され、これによって、標的核酸およびギャップオリゴヌクレオチドのヌクレオ
チド配列を含む、共有結合して閉じた環状分子を形成する。この共有結合して閉
じた環状分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定し、これによって、標
的核酸の配列を決定する。

【００３８】いくつかの実施形態において、環状（閉環または開環）標的核酸を、例えば、
そのアニールされた標的核酸配列をテンプレートとして使用してアンカープライ
マーを伸長することによって、直接的に配列決定する。配列決定される標的核酸
は、配列多型を含み得るか、または配列多型を含むことが疑われ得る。いくつか
の実施形態において、多型は、例えば、５’または３’末端の２００、１００、
７５、５０、２５または１５ヌクレオチド内に、または標的核酸の５’またな３
’末端に位置し得る。いくつかの実施形態において、多型は、アンカープライマ
ーの３’末端領域に存在する問合せヌクレオチドに相補的なヌクレオチド（例え
ば、アンカープライマーの３’末端）にある。

【００３９】他の実施形態において、この環状化した標的核酸を、そのヌクレオチド配列を
決定する前に増幅する。増幅は、例えば、環状標的核酸にアニールしたアンカー
プライマーを伸長して、その環状標的分子に相補的な配列のコンカンテマーを生
成することによって生じ得る。次いで、この増幅したポリヌクレオチド産物の少
なくとも一部を同定し、これによって、この環状化した標的核酸の配列を決定す
る。

【００４０】線状標的核酸分子は、例えば、配列多型（例えば、一ヌクレオチド多型）を含
み得る。

【００４１】さらなる局面において、本発明は、核酸の配列を決定する方法を提供する。こ
の方法は、既知の配列の複数の異なるアンカープライマーを既知の位置に有する
基材を提供する工程を包含する。アンカープライマーは、標的核酸配列の５’領
域に相補的な第１領域、標的核酸配列の３’領域に相補的な第２領域、および、
必要に応じて、第１領域と第２領域との間に位置する第３領域を含む。次いで、
この基材に、線状標的核酸を、この標的核酸の５’および３’末端がアンカープ
ライマーにアニールするのを可能にする条件下で接触させる。好ましい実施形態
において、この５’および３’末端は、アンカープライマー上の少なくとも６ヌ
クレオチドの第２領域（これはまた、ギャップ領域として公知である）に対応す
る領域によって離される。次に、標的核酸の３’末端を、３’末端ヌクレオチド
がそのアニールされた標的核酸の５’末端に隣接する伸長産物を形成するのに十
分な条件下で、ポリメラーゼによって伸長される。この伸長産物の３’末端ヌク
レオチドは、このアニールされた標的核酸の５’末端に連結され、これによって
、標的核酸およびギャップオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、閉じ
た環状分子を形成する。この共有結合して閉じた環状分子の少なくとも一部分の
ヌクレオチド配列は、上記のように決定される。

【００４２】また、核酸分子の第１および第２の集団中の標的核酸の相対量を比較するため
の方法が、提供される。この方法は、固体支持体に結合した１つ以上の核酸アン
カープライマー、ならびに核酸分子の第１の集団に由来する第１の複数の環状一
本鎖核酸テンプレート、および核酸分子の第２の集団に由来する第２の複数の開
環または環状の一本鎖核酸分子を提供する工程を包含する。次いで、有効量の核
酸アンカープライマーが、第１の複数の環状一本鎖核酸分子に由来する一本鎖環
状テンプレートの少なくとも１つにアニーリングして、第１のプライムされた（
ｐｒｉｍｅｄ）一本鎖環状テンプレートが生じる。有効量のこの核酸アンカープ
ライマーはまた、第２の複数の環状一本鎖核酸分子からの一本鎖環状テンプレー
トの少なくとも１つとアニーリングして、第２のプライムされた一本鎖環状テン
プレートを生じる。第１および第２のプライムされたアンカープライマー−環状
テンプレート複合体が、第１のおよび第２の核酸分子の配列を決定するために使
用される。いくつかの実施形態において、これらの配列は、直接決定される。他
の実施形態において、これらの配列は、標的核酸を増幅した後、例えば、ポリメ
ラーゼを用いて核酸分子の第１の集団および第２の集団に由来する環状核酸テン
プレートの複数のコピーを生成する増幅の後に、決定される。

【００４３】標的核酸の配列は、有効量の配列決定プライマーを第１および第２の環状核酸
テンプレートにアニーリングして、第１および第２のプライムされた配列決定プ
ライマー−環状核酸テンプレート複合体を生じることによって、決定され得る。
次いで、この複合体が伸長されて、この第１および第２のプライムされた配列決
定プライマー−環状核酸テンプレート複合体に関係する第１および第２の配列決
定産物が生じる。次いで、この第１および第２の配列決定産物のレベルが比較さ
れる。この第１および第２の配列決定産物の相対レベルは、核酸配列の第１およ
び第２の集団中の標的核酸の相対レベルを示す。

【００４４】核酸分子のこの第１および第２の集団は、例えば、ゲノムＤＮＡ配列であって
も、またはＲＮＡ配列に由来してもよい。核酸配列の集団としては、例えば、刺
激に曝された細胞集団に由来する第１の核酸集団、および刺激に曝されていない
同じ細胞集団に由来する第２の核酸集団が挙げられ得る。刺激としては、例えば
、物理的刺激（例えば、熱）、マイトジェン、およびこの細胞集団中の細胞によ
り発現されるレセプターのリガンドが、挙げられ得る。さらに、核酸のこの第１
および第２の集団は、２つの異なる個体の細胞に由来し得る。

【００４５】所望される場合、複数の集団由来の核酸配列のレベル（例えば、３個、５個、
１０個、２５個、５０個、１００個、１，０００個または１０，０００個以上の
集団中の核酸分子）が、比較され得る。

【００４６】なおさらなる局面において、本発明は、ＲＮＡ分子の集団中のＲＮＡ分子を検
出するための方法を提供する。この方法は、ｃＤＮＡ分子の集団、および既知の
位置に既知の配列の複数の種々のアンカープライマーを有する基材を提供する。
このアンカープライマーは、標的核酸配列の５’領域と相補的な第１の領域、標
的核酸配列の３’領域と相補的な第２の領域、そして必要に応じて、この第１の
領域と第２の領域との間に位置する第３の領域（ギャップ領域としても知られる
）を含む。次いで、この基材は、この標的核酸の５’末端および３’末端がこの
アンカープライマーにアニーリングすることを可能にするに十分な条件下で、こ
のｃＤＮＡ分子集団中の線状標的核酸と接触させられる。この５’末端および３
’末端は、好ましくは、このアンカープライマー上で少なくとも６ヌクレオチド
のギャップ領域により隔てられている。次いで、このアニーリングした末端が、
この標的核酸の５’末端および３’末端がこのギャップオリゴヌクレオチドに連
結することを可能にするに十分な条件下で、このアンカープライマーのギャップ
領域と相補的なギャップオリゴヌクレオチド、およびリガーゼと、接触させられ
る。結果として、この標的核酸のヌクレオチド配列とこのギャップオリゴヌクレ
オチドとを含む、共有結合して閉じた環状分子が形成される。次いで、この共有
結合して閉じた環状分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列が決定され、それ
によりこのＲＮＡ分子が検出される。

【００４７】本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、付随する以下の説明に示される。本明
細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な任意の方法および
材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、ここに好ましい方法
および材料が記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、この説明およ
び特許請求の範囲から明らかである。本明細書および添付の特許請求の範囲にお
いて、単数形は、この文脈が明らかに他のように示さない限り、複数も包含する
。他のように定義されない限り、本明細書中にすべての技術用語および科学用語
は、本発明の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書
中に引用されるすべての特許および刊行物が、参考として援用される。

【００４８】（発明の詳細な説明）本発明は、例えば、核酸を同定および配列決定する際に使用され得る、ポリヌ
クレオチドおよびオリゴヌクレオチドのアンカープローブのアレイを提供する。

【００４９】（アンカープローブの構造）本発明のアンカープライマーが、図１に示される。アンカープライマー１００
が、この５’末端で基材１０２に付着している。このアンカープライマーは、領
域１０４、１０６、および１０８を含み、これらの領域は互いに連続している。

【００５０】図１には、この５’末端に領域１１４を有しかつこの３’末端に領域１１２を
有する、線状標的核酸１１０もまた示される。アンカープライマー１００の領域
１０４および１０８は、それぞれ、領域１１２および１１４と相補的なヌクレオ
チドを含む。従って、領域１０４および１０８中の配列は、線状標的核酸の末端
の捕捉を可能にする。いくつかの適用において、これらの末端領域１０４および
１０８は、制限酵素の認識配列を含み得、これらの認識配列に近接してｃＤＮＡ
配列またはゲノム配列（例えば、制限酵素で消化されたｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡのフラグメントの末端の配列）をともに含み得る。従って、領域１０４およ
び１０８は、制限酵素により生じるフラグメントに対応する一本鎖核酸を捕捉す
るように設計され得る。

【００５１】図１に示されるようなプライマー１００への標的核酸１１０のアニーリングに
より、この標的核酸１１０の３’−ＯＨ末端が、プライマー伸長またはポリヌク
レオチドへの連結のいずれかに利用可能になる。プライマー伸長において、この
標的核酸の末端１１２の３’ヒドロキシル基が、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオ
チド三リン酸、および所望される任意の関連因子の存在下で、アンカープライマ
ー１００のギャップ領域１０６をテンプレートとして使用して伸長される。この
プライマーの完全伸長は、伸長したプライマーの遊離３’−ＯＨ基とこの線状標
的核酸１１０の５’−ＰＯ₄基との並置を生じる。リガーゼの存在下で、この５
’−ＰＯ₄と３’−ＯＨとは、共有結合され得る。これは、この標的核酸１１０
の環状化を生じる。このアンカープライマー１００の領域１１２および１１４は
、好ましくは、それぞれ、領域１１２および１１４と完全に相補的なヌクレオチ
ドを含むが、プライマー伸長のこの要件において、このアンカープライマーと標
的核酸分子との間で、いくつかのミスマッチが許容され得る。

【００５２】別の実施形態において、このアニーリングした標的核酸１１０は、アニーリン
グおよびライゲーションを使用して、ギャップオリゴヌクレオチド１１６を使用
して環状化され得る。この実施形態において、標的核酸の末端領域１１２および
１１４は、好ましくは、アンカープライマー１００の領域１０４および１０８と
完全に相補的である。このギャップオリゴヌクレオチド１１６は、このアンカー
プライマーのギャップ領域１０６中のヌクレオチドと相補的であり、そしてこの
ギャップオリゴヌクレオチド１１６がこのアンカープライマーにアニーリングす
ることを可能にする条件下で、このアンカープライマー１０６と混合される。リ
ガーゼの存在下で、このギャップオリゴヌクレオチド１１６は、その３’−ＯＨ
によって、この標的核酸の５’−ＰＯ₄に共有結合する。このギャップオリゴヌ
クレオチドの５’−ＰＯ₄は、同じように、この標的核酸配列の３’−ＯＨに連
結される。好ましくは、このギャップオリゴヌクレオチド１１６は、好ましくは
、このギャップ領域１０６と完全に相補的である。従って、核酸系を検出するた
めの非常に感度のよい系が、（ａ）線状標的核酸配列の５’末端および３’末端
での相同性、および（ｂ）２つの別々のライゲーション事象に基づいて、環状核
酸分子が生成されることを要求することによって提供される。

【００５３】所望される場合、アニーリングした環状化した核酸が、直接配列決定され得る
。好ましい実施形態において、このアンカープライマーの３’末端領域は、問い
合わせヌクレオチドを含み、例えば、この３’末端は、このアンカープライマー
の３’末端の１５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレ
オチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、１ヌクレオチド内にあってもよいし
、またはこのアンカープライマーの３’末端にあってもよい。この問い合わせヌ
クレオチドは、所定のＳＮＰと関係するヌクレオチドを検出することができる、
ヌクレオチドである。標的核酸は、この標的核酸がこの問い合わせヌクレオチド
と相同なヌクレオチドを含む場合にこの標的核酸分子のハイブリダイゼーション
を生じる条件下で、このアンカープライマーとアニーリングされる。首尾良いア
ニーリング事象によって、この標的核酸分子をテンプレートとして使用して、こ
のアンカープライマーのプライマー伸長が可能になる。逆に、この問い合わせヌ
クレオチドと相補的なヌクレオチドを欠く標的核酸配列のアニーリング未遂は、
このアンカープライマー中の問い合わせヌクレオチドとこの標的核酸との間のミ
スマッチを生じる。このアンカープライマーは、この場合は伸長され得ない。

【００５４】所定のＳＮＰについて、アンカープライマープローブは、このＳＮＰと関係す
るヌクレオチドに応じて、その問い合わせヌクレオチドが変動する。従って、集
団のいくつかのメンバーにおける「Ａ」ヌクレオチドおよび他の位置の「Ｃ」ヌ
クレオチドの存在によって規定されるＳＮＰについて、このアンカープライマー
中の対応する問い合わせヌクレオチドは、それぞれ、「Ｃ」および「Ｔ」であり
得る。ヌクレオチド鎖分解性（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を欠くポリ
メラーゼ（例えば、ｅｘｏまたはｍｕｔＳポリメラーゼ）は、このアプローチを
使用して特に適する。

【００５５】あるいは、この環状化した核酸が増幅され得、そしてその増幅産物の配列が決
定され得る。このアンカープライマー１００の３’−ＯＨ末端は、配列決定反応
（例えば、ジデオキシ配列決定反応）をプライム（ｐｒｉｍｅ）するために利用
可能である。

【００５６】このアンカープライマー１００の３’−ＯＨ末端は、あるいは、この環状化し
た核酸がテンプレート核酸として作用する増幅（例えば、ローリングサークル増
幅（ＲＣＡ））をプライムし得る。このアンカープライマーの３’−ＯＨを使用
するＲＣＡは、この環状化した核酸テンプレートと相補的な配列の複数のコピー
を含む、基材１０２に共有結合した分子を生じる。

【００５７】本発明の別のアンカープライマーが、図２に示される。アンカープライマー２
００が、その５’末端で基材２０２に付着している。このアンカープライマーは
、２つの隣接する領域２０４および２０６を含み、これらの領域は、領域と相補
的である。

【００５８】図２におけるアンカープライマー２００に、領域２１２をその３’末端に有し
かつ領域２１４をその５’末端に有する線状標的核酸２１０が、アニーリングさ
れる。このアンカープライマー２００の領域２０４および２０６は、それぞれ、
領域２１２および２１４にアニーリングする。従って、制限酵素により生じるフ
ラグメントの末端と相補的な配列を、領域２０４および２０６中に含めることに
よって、このアンカープライマー２００は、所望の制限フラグメントを捕捉し得
る。適切なフラグメントとしては、多型（例えば、一ヌクレオチド多型）を含む
かまたは含むと疑われる、フラグメントが挙げられる。

【００５９】アンカープライマーの第３の型が、図３に示される。この図は、その５’末端
で基材３０２に付着した、アンカープライマー３００を示す。このアンカープラ
イマー３００は、その５’末端付近に、ヌクレオチド領域３０４を含む。

【００６０】図３にはまた、環状標的核酸３１０も示される。この標的核酸３１０は、ヌク
レオチド領域３０４と相補的な領域３１２を含む。

【００６１】この標的核酸３１０中には、核酸領域３５０も存在する。好ましい実施形態に
おいて、このヌクレオチド領域３０４は、複数の標的核酸中に存在するヌクレオ
チド領域３１２と相補的である。なおより好ましい実施形態において、このヌク
レオチド領域３１２は、核酸の開始集団のメンバーに連結された配列（例えば、
ベクター）中に存在する。

【００６２】アンカープライマーは、必要に応じて、さらなるエレメント、例えば、その５
’末端に、スペーサー配列、１つ以上の制限酵素認識部位、ＲＮＡポリメラーゼ
結合部位（例えば、Ｔ７プロモーター部位）を含み得る。

【００６３】このアダプター領域の１つ以上は、例えば、制限酵素認識部位を含み得るか、
または同定されたＤＮＡ配列中に存在する配列（例えば、既知の遺伝子中に存在
する配列）を含み得る。

【００６４】１つ以上のアダプター領域はまた、配列多型に隣接しそして／または配列多型
を包含することが既知である配列を同定する、配列もまた含み得る。このような
配列の例としては、問い合わせヌクレオチドが挙げられる。配列多型は、他は同
一である２つの核酸配列間で配列の差異を生じる、ヌクレオチドの置換、挿入、
欠失、または他の再配列を含む。配列多型の例は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ
）である。

【００６５】他の実施形態において、本明細書中に記載されるアンカープライマーアレイは
、このアレイに添加される前に環状化した標的核酸配列を、同定するかさもなく
ば特徴付けるために使用され得る。

【００６６】（固体支持体へのアンカープライマーに連結）一般に、塩基対形成し得る任意の核酸が、アンカープライマーとして使用され
得る。いくつかの実施形態において、このアンカープライマーはオリゴヌクレオ
チドである。本明細書中で利用される場合、用語オリゴヌクレオチドは、天然で
あるかもしくは改変されたモノマーまたは結合（例えば、デオキシリボヌクレオ
シド、リボヌクレオシド、これらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など
）の線状オリゴマーであって、モノマー−モノマー相互作用の規則正しいパター
ンによって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、線状オリゴマーを包含
する。これらの相互作用の型としては、例えば、ワトソン−クリック型の塩基対
形成、塩基スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、フーグスティーン型または逆フ
ーグスティーン型の塩基対形成などが挙げられ得る。一般的には、これらのモノ
マーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結されて、例えば
、３〜２００モノマー単位、８〜１５０モノマー単位、１０〜１００モノマー単
位、２０〜８０モノマー単位、または２５〜５０モノマー単位のサイズ範囲であ
る、オリゴヌクレオチドを形成する。

【００６７】本発明のオリゴヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。し
かし、例えば、酵素による処置が必要な場合など、天然に存在するヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドが、一般的にいは、生物学的機能の維持に必要である
。

【００６８】任意の材料が、その表面がプライマーの安定な付着および核酸配列の検出を可
能にする限り、固体支持体材料として使用され得る。この固体支持体材料は、平
面状であり得る。いくつかの実施形態において、この固体支持体は、必要に応じ
て、透明であり、例えば、ガラスである。

【００６９】このアンカープライマーは、この固体支持体上または固体支持体内に存在する
ように、この固体支持体に連結され得る。このアレイ上のアンカープライマー間
の距離は、部分的には、伸長したアンカープライマーテンプレートを検出しさら
に分析するために使用される方法および装置によって、決定される。伸長したア
ンカープライマーを検出するための方法は、下記に考察される。伸長したアンカ
ープライマーを検出するための装置もまた下記に考察され、そしてさらに、その
ような装置としては、高分子を検出するための当該分野で公知の装置が挙げられ
る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０６７７０は、共焦点走査顕微鏡、近接場
走査顕微鏡（ＳＮＯＭ）、走査トンネル顕微鏡、および原子間力顕微鏡のような
、装置を考察している。これらの装置は、１０ナノメーター（ｍａｎｏｍｅｔｅ
ｒ）台での分解を可能にする。

【００７０】従って、いくつかの実施形態において、複数のアンカープライマーが固体支持
体に連結され、それらがアレイ内で規則正しい間隔を空けるようにされる。固体
支持体上のプライマー間の距離は、例えば、１ｎｍ〜１５０μｍ、１０〜４００
μｍ、５０〜１５０μｍ、１００〜１５０μｍ、または１５０μｍであり得る。
好ましい実施形態において、アレイは、例えば、ナノメーター（ｍａｎｏｍｅｔ
ｅｒ）分解（例えば、１０ｎｍ×１０ｎｍ）で間隔が空けられる。ナノメーター
（ｍａｎｏｍｅｔｅｒ）分解を伴うアレイの構築が、ＰＣＴ出願ＷＯ００／０
６７７０に記載される。

【００７１】必要に応じて透明な固体支持体上の付着部位のアレイが、電子集積回路の構築
において一般的に使用されるリソグラフィー技術を使用して、構築される。これ
らの技術は、例えば、米国特許第５，５１４３，８５４号、同第５，４４５，９
３４号、同第５，７４４，３０５号および同第５，８００，９９２号；Ｃｈｅｅ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４；６１０〜６１４（１９９６）；Ｆｏｄｏｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３６４：５５５〜５５６（１９９３）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２５１：７６７〜７７３（１９９１）；Ｇｕｓｈｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２５０：２０３〜２１１（１９９７）；Ｋｉｎｏｓｉｔａら、Ｃｅ
ｌｌ９３：２１〜２４（１９９８）；Ｋａｔｏ−Ｙａｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９３７５〜１９３７７（１９９８）；ならびにＹａｓ
ｕｄａら、Ｃｅｌｌ９３：１１１７〜１１２４（１９９８）に記載される。写
真平版および電子ビームリソグラフィーは、改変された生体分子（例えば、タン
パク質または核酸）の付着を可能にする連結基を含む固体支持体または基材を感
光（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）する。例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２
８３：２７〜２８（１９９９）；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、ＨＡＮＤＢＯＯ
ＫＯＦＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＭＩＣＲＯＭＡＣＨＩＮＩＮＧ
ＡＮＤＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ、ＶＯＬＵＭＥＩ：ＭＩＣＲＯ
ＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ、ＶｏｌｕｍｅＰＭ３９、ＳＰＩＥＰｒｅｓｓ（１
９９７）を参照のこと。感光した部位のアレイが、Ｚａｓａｄｚｉｎｓｋｉら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：１７２６〜１７３３（１９９４）に記載されるような
薄膜技術を使用して、作製される。

【００７２】核酸を固体基材に付着するためのさらなる方法は、シラン処理（ｓｉａｌｉｎ
ｉｚｅｄ）表面を使用し、そして米国特許第６，１３６，９６２に開示される。
ジスルフィド結合を使用する付着が、米国特許第６，０３０，７８２号に記載さ
れる。これらの特許および刊行物のすべての内容が、その全体が参考として援用
される。

【００７３】アンカープライマーが、この感光した部位で固体基材に連結される。連結した
プライマーを含む固体基材の領域は、アンカーパッド（ａｎｃｈｏｒｐａｄ）
である。従って、この固体支持体上の感光した部位を特定することによって、ア
ンカーパッドのアレイまたはマトリックスを形成することが可能である。このア
ンカーパッドは、例えば、この固体支持体上に等しく空いた間隔でエッチングさ
れた小さい直径のスポットであり得る。

【００７４】固体支持体上の各感化された部位は、複数のアンカープライマーを潜在的に付
着し得る。従って、各アンカーパッドは、１つ以上のアンカープライマーを含み
得る。単一の生産的反応中心のみを有するパッド数（例えば、伸長反応の後に、
アンカープライマーから伸長される単一配列のみを有するパッドの数）を最大化
することが好ましい。これは、以下を含む技術によって達成され得るが、これら
に限定されない：（ｉ）表面上で洗浄されるビオチン化アンカープライマーの希
釈を変更すること；（ｉｉ）ビオチン化プライマーがアビジン表面と接触するイ
ンキュベーション時間を変更すること；または（ｉｉｉ）開放循環テンプレート
または閉鎖循環テンプレートの濃度を変化させて、その結果、平均して、各パッ
ド上の１つのプライマーのみが伸長されて配列決定テンプレートを生成すること
。

【００７５】いくつかの実施形態において、各個々のパッドは、たった１つの連結されたア
ンカープライマーを含む。１つのアンカープライマーのみを有するパッドは、固
体支持体に対して選択されたアンカープライマーの限定希釈を実施することによ
って作製され得、その結果、平均として、１つのアンカープライマーのみが、各
パッド上に沈着される。パッドに適用されるアンカープライマーの濃度は、例え
ば、ポアソン分布モデルを用いて算出され得る。

【００７６】単一アンカープライマーを含む反応パッド数を最大化するために、アンカープ
ライマーの濃度または循環テンプレートの濃度の範囲が変化する一連の希釈実験
を実施する。非常に希釈された濃度のプライマーに関して、プライマーおよび循
環テンプレートの同じパッドへの結合は、互いに独立し、そしてポアソン分布は
、任意の１つのパッド上で伸長されるアンカープライマーの数を特徴付ける。実
際に伸長されるプライマー数には変動性があるが、最大３７％のパッドは、単一
伸長アンカープライマーを有する（単一アンカーオリゴヌクレオチドを有するパ
ッドの数）。この数は、以下のようにして得ることができる。

【００７７】Ｎ_pを、パッド上のアンカープライマーの平均数にし、そしてｆをアンカープ
ライマーが循環テンプレートと共に伸長される確率にする。次いで、１パッド当
たりの伸長アンカープライマーの平均数は、Ｎ_pｆであり、これは、量ａとして
定義される。実際に伸長されるプライマー数には変動性がある。低濃度の限定に
おいて、プライマーおよび循環テンプレートの同じパッドへの結合は、互いに独
立し、そしてポアソン分布Ｐ（ｎ）は、任意のパッド上で伸長されるアンカープ
ライマーの数ｎを特徴付ける。この分布は、数学的に：Ｐ（ｎ）（ａⁿ／ｎ！）
ｅｘｐ（−ａ）、Ｐ（１）＝ａｅｘｐ（−ａ）によって規定され得る。確率の
Ｐ（１）は、ａ＝１に対してその最大値ｅｘｐ（−１）を想定し、パッドの３７
％は、単一伸長アンカープライマーを有する。

【００７８】アンカープライマー濃度および循環テンプレート濃度の範囲は、続いてスキャ
ンされ得、１に最も近いＮ_pｆの値を見出す。この分布を最適化するための好ま
しい方法は、各反応パッド上で複数のアンカープライマーを可能にすることであ
るが、限定希釈の循環テンプレートを使用し、その結果、平均して、各パッド上
１つのプライマーのみが、伸長されて配列決定テンプレートを生成する。

【００７９】あるいは、低い濃度のアンカープライマーにおいて、多くて１つのアンカープ
ライマーが、各反応パッド上で結合するようである。高濃度の循環テンプレート
は、各プライマーがおそらく伸長されるように、使用され得る。

【００８０】反応パッドが平面の表面上にアレイされるか、または光ファイバーアレイ（Ｆ
ＯＲＡ）である場合、個々のパッドは、側面が約１０μｍであり、隣接パッド間
は１００μｍの間隔がある。ゆえに、１ｃｍ表面上、総数約１０，０００個のマ
イクロ反応物が、ポアソン分布に従って沈着され、これらの約３７００個が、単
一アンカープライマーを含む。特定の実施形態において、プライマーオリゴヌク
レオチドが個体支持体上に付着され、例えば、ビオチン化によって改変された後
、酵素は、表面上の残存する使用されなかったアビジン結合部位に対して結合す
るために沈着される。

【００８１】他の実施形態において、複数のアンカープライマーは、アレイにおいて任意の
１つの個々のパッドに付着される。限定希釈の多数の循環核酸テンプレート（よ
り詳細には以下に記載される）は、そのように固定されるアンカープライマーに
ハイブリダイズされ得、その結果、平均して、各パッド上１つのプライマーのみ
が、核酸テンプレートにハイブリダイズされる。使用されるライブラリー濃度は
、例えば、限定希釈およびポアソン分布モデルを用いて算出され得る。

【００８２】アンカープライマーは、共有結合的または非共有結合的な相互作用を介して固
体支持体に付着され得る。当該分野で一般のこのような連結の例としては、以下
が挙げられる：Ｎｉ²⁺／ヘキサヒスチジン、ストレプトアビジン／ビオチン、ア
ビジン／ビオチン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチ
オン、モノクローナル抗体／抗原、およびマルトース結合タンパク質／マルトー
ス。適切なタグを含むサンプルは、感化された物質とインキュベートされ、その
結果、単一分子が、各感化された部位に付着される。

【００８３】ビオチン−（ストレプト−）アビジン方法論は、アンカーを固体支持体に固定
するためのいくつかの異なる方法を提供する。１つのビオチン−（ストレプト−
）アビジンベースのアンカー方法は、固体表面上で乾燥された光活性可能なビオ
チンアナログの薄層を使用する（ＨｅｎｇｓａｋｕｌおよびＣａｓｓ，１９９６
．ＢｉｏｃｏｎｇｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．７：２４９−２５４）。次いで、ビ
オチンアナログは、マスクを介して白色光に感光され、規定された活性化ビオチ
ンの領域を作製する。アビジン（またはストレプトアビジン）は、次いで添加さ
れ、そして活性化ビオチンへの結合を可能にする。アビジンは、ビオチン−（ス
トレプト−）アビジン連結を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを「アンカー
」するために使用され得る、遊離のビオチン結合部位を保有する。

【００８４】あるいは、アンカープライマーは、光除去可能な保護基を保有するビオチン誘
導体と共に固体支持体に付着され得る。この部分は、固体支持体（例えば、ガラ
ス表面）に付着されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に共有結合される。Ｐｉｒ
ｒｕｎｇおよびＨｕａｎｇ、１９９６．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．
７：３１７−３２１を参照のこと。次いで、マスクは、規定された照射領域内で
活性化ビオチンを作製するために使用される。次いで、アビジンは、照射領域に
局在化され得、ビオチン化ＤＮＡは、続いて、ＢＳＡ−ビオチン−アビジン−ビ
オチン連結を介して付着される。所望される場合、シランの中間層は、規定され
た領域にＢＳＡ結合を局在化するためにパターン化され得るシリコンジオキシド
シラン表面において自己アセンブルされた単層中に沈着される。例えば、Ｍｏｏ
ｎｅｙ，ＥＴａｌ．，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ９３：１２２８７−１２２９１を参照のこと。

【００８５】固体支持体上の各感化された部位は、複数のアンカープライマーを潜在的に付
着し得る。従って、各アンカーパッドは、１つ以上のアンカープライマーを含み
得る。単一生産的反応中心のみを有するパッド数（例えば、伸長反応の後に、ア
ンカープライマーから伸長された単一配列のみを有するパッドの数）を最大化す
ることは好ましい。これは、例えば、以下によって達成され得る：（ｉ）表面上
で洗浄されるビオチン化アンカープライマーの希釈を変更すること；（ｉｉ）ビ
オチン化プライマーがアビジン表面と接触するインキュベーション時間を変更す
ること；または（ｉｉｉ）開放循環テンプレートまたは閉鎖循環テンプレートの
濃度を変化させて、１つのプライマーのみが伸長されて配列決定テンプレートを
生成するパッドの数を最大化すること。

【００８６】（テンプレート核酸の調製）一般的に、テンプレート核酸は、アンカープライマーアレイにアニーリングす
るときに、テンプレート核酸の少なくとも一部が直鎖かつ一本鎖である限りは、
いかなる供給源由来でもあり得る。好ましくは、標的核酸を含むテンプレート核
酸は開環状の形態をとる。「開環」とは、５’リン酸基および３’ヒドロキシル
基を有する直鎖状の一本鎖核酸分子であり、すなわち、所定の開環核酸分子の末
端はＤＮＡリガーゼによって連結され得る。開環は、Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許
第５，８５４，０３３号で詳細に記載されている。例えば、アンカープライマー
への開環のアニーリングの後に、開環はＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ用）またはＲＮ
Ａリガーゼの存在下で閉環へと変換され得る。

【００８７】好ましい実施形態において、核酸集団の中の少なくとも１つの直鎖状標的核酸
は、その５’および３’末端に配列（すなわち、図１に示すような、アンカープ
ライマーの領域１０４および１０８に相補的である、領域１１２および１１４）
を有する。

【００８８】このオリゴヌクレオチドの５’および３’末端の領域１１２および１１４は、
特定の標的配列鎖上で互いに近接して塩基対形成するように設計され、従ってこ
の直鎖状オリゴヌクレオチドの末端は、ハイブリダイゼーションによって標的配
列に並置される。この並置によって、２つのプローブセグメントは（適切にハイ
ブリダイズした場合に）酵素的ライゲーションによって（例えばＴ₄ＤＮＡリガ
ーゼを用いて）共有結合することが可能になり、このように、このプローブをそ
の特定の標的配列に連鎖した環状に閉じられた分子へ変換する（例えば、Ｎｉｌ
ｓｓｏｎら、１９９４．Ｓｉｅｎｃｅ２６５：２０８５−２０８８を参照のこと
）。生じたプローブは、多数の遺伝子配列の同時分析に適している（例えば、Ｌ
ｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２；Ｎｉ
ｌｓｓｏｎら、１９９７．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２５２−２５５を参照の
こと）。

【００８９】核酸の最初の集団は、ライブラリー内に存在する場合、アンカープライマー配
列に対してアニーリングに利用可能な領域、またはアニーリングに利用可能にな
り得る領域を含んでいる限りは、一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る。

【００９０】ライブラリーテンプレートは、複数の要素（アンカープライマーに対して相補
的である１つ以上の領域を含むが、これに限定されない）を含み得る。例えば、
テンプレートライブラリーは、配列決定プライマーに対して相補的な領域、コン
トロールヌクレオチド領域、および目的の配列を含むインサート配列（すなわち
、後に特徴付けられるべき配列決定テンプレート）を含み得る。本明細書中で用
いられる場合、用語「相補体」は、特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズし
て一致した二重鎖を形成し得る、ヌクレオチド配列をいう。

【００９１】１つの実施形態において、ライブラリーテンプレートは以下のものを含む；（
ｉ）アンカープライマーに対して相補的である、２つの別個の領域（例えば、領
域１１４および１１２）、（ｉｉ）配列決定プライマーに対して相補的な１つの
領域、（ｉｉｉ）１つのコントロールヌクレオチド領域、（ｉｖ）配列決定され
るべきである、３０〜１００ヌクレオチドのインサート配列。もちろん、このテ
ンプレートは、これらの特徴の２つ、３つまたは４つ全てを含み得る。

【００９２】テンプレート核酸は、核酸の任意の供給源（例えば、任意の細胞、任意の組織
、または任意の生物）から構築され得、そして当該分野で認知された任意の方法
によって生成され得る。適切な方法は、例えば、ゲノムＤＮＡの超音波処理、お
よび、核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）の集団を断片化するための１つ以上の
制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）を用いた消化を含む。制限酵素は８塩基あるい
は６塩基の認識配列を認識し得るか、または縮重配列を認識し得る。いくつかの
実施形態において、この制限酵素はＩＩ型またはＩＩＳ型の制限酵素である。好
ましくは、この制限酵素の１つ以上は、別個の４塩基認識配列を有する。このよ
うな酵素の例としては、例えばＳａｕ３Ａ１、ＭｓｐＩおよびＴａｑＩが挙げら
れる。好ましくは、この酵素は、対応する制限酵素のための認識配列を含む領域
を有するアンカープライマーと共に、使用され得る。いくつかの実施形態におい
て、一方または両方のアダプター領域アンカープライマーは、既知の制限酵素認
識配列に近接するさらなる配列を含み、それによって、そのアンカープライマー
に対して、目的の特定の制限フラグメントの捕獲、またはアニーリングが可能に
なる。

【００９３】その標的核酸はまた、増幅（例えば、所望される標的配列のプライマー（ｐｒ
ｉｍｅｄ）増幅）によって生成され得る。

【００９４】あるいは、テンプレートライブラリーは、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ））から、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを生成するこ
とによって作製され得る。そのｃＤＮＡライブラリーは、所望される場合、３’
サイン配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）、内部フラグメント、あ
るいは５’フラグメントのいずれかを得るために、制限エンドヌクレアーゼおよ
び／またはプライマー増幅を用いてさらに処理され得る。このライブラリーは、
あるいは、アンカープライマー内のアダプター領域に対して相補的な配列を有す
るベクター中に、構築され得る。いくつかの実施形態において、このライブラリ
ーは、目的の配列（例えば、制限フラグメントにおける既知の配列多型、あるい
は推測される配列多型）を含む。

【００９５】（プライマー−テンプレートのアニーリングおよび増幅）（核酸複合体）核酸のライブラリーは、認知された技術を用いてアンカープライマー配列にア
ニーリングされる（例えば、Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｋｏｏｌ、米国特許第５
，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号を
参照のこと）。一般に、このアンカープライマーをテンプレート核酸配列にアニ
ーリングするための任意の手順は、アダプター領域またはアンカープライマー配
列における領域と、テンプレートライブラリーに存在する配列との間の特異的な
（すなわち、完全または完全に近い）相補性の形成を生じる限り、適切である。

【００９６】いくつかの実施形態において、環状テンプレートが、増幅される。多数のイン
ビボでの核酸増幅技術が、アンカープライマー配列を伸長させるために利用され
得る。好ましくは、増幅されたＤＮＡの大きさは、アンカーパッドの大きさより
も小さいべきであり、また係留するパッド間の距離よりも短いべきである。

【００９７】増幅は、代表的には、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮ
Ａ指向性ＤＮＡポリメラーゼ）、および１、２、３、または４つの型のヌクレオ
チド三リン酸、ならびに必要に応じて、補助結合タンパク質の存在下で実施され
る。一般に、プライマーの３’−ＯＨ基を伸長し得る任意のポリメラーゼは、３
’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く限り、使用され得る。適切なポリメラー
ゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓａｃｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉ
ｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ、およびＴｈｅｒｍ
ｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファー
ジＴ₄およびバクテリオファージＴ₇、ならびにＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラー
ゼＩＫｌｅｎｏｗフラグメントが挙げられる。適切なＲＮＡ指向性ＤＮＡポリ
メラーゼとしては、例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素、モロニ
ーマウスウイルス由来の逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルスＩ型由来の逆
転写酵素が挙げられる。

【００９８】多数のインビトロにおける核酸増幅技術が、記載されている。これらの増幅方
法論は、以下の方法論に区別され得る：（ｉ）温度サイクル−ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｓａｉｋｉら、１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：
１３５０−１３５４を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎｙ
、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９−
１９３；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０．Ｇｅｎｅｎ８９：１１７−１２２
を参照のこと）および転写に基づく増幅（例えば、Ｋｗｏｈら、１９８９．Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７を参照
のこと）ならびに（ｉｉ）等温増幅系（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）−自立（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）、配
列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）；ＱＢレプリカ
―ゼ系（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１１９７−１２０２を参照のこと）；鎖置換増幅ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄＲｅｓ．１９９２Ａｐｒ１１；２０（７）：１６９１−６；ならびに
ＰＮＡＳ１９９２Ｊａｎ１；８９（１）：３９２−６；およびＮＡＳＢＡ
ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．１９９１１２月；３５（３）：２７３−
８６に記載される方法。

【００９９】等温増幅としてはまた、ローリングサークル型ベースの増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ
−ｃｉｒｃｌｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）が挙げ
られる。ＲＣＡは、以下において議論される：例えば、Ｋｏｏｌ、米国特許第５
，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号；
Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒ．１５：３５−４０。ＲＣＡの結果は、アンカープライマーの３’末端から
伸長させた一本鎖ＤＮＡであり（そして、このようにして固体支持マトリクスに
連結される）、そして、これは、プライマー配列にアニールされる環状テンプレ
ートの複数のコピーを含むコンカタマーを含む。代表的に環状テンプレートの、
１０，０００以上のコピー（各々、約１００ヌクレオチドサイズの範囲の大きさ
を有する）は、ＲＣＡを用いて得られ得る。

【０１００】環状核酸分子のアンカープライマーへのアニーリング後のＲＮＡ増幅産物が、
図４に図解的に示される。環状テンプレート核酸４０２は、アンカープライマー
４０４にアニールされ、これは、その５’末端で１０６表面に連結されており、
そして伸長に利用可能な遊離の３’ＯＨを有する。この環状テンプレート核酸４
０２は、アンカープライマー４０４における配列の領域に相補的である２つのア
ダプター領域４０８および４１０を含む。配列決定プライマー（これは、以下に
記載される配列決定反応において使用される）に相補的な挿入部分４１２および
領域４１４もまた、環状テンプレート核酸４０２に含まれる。

【０１０１】アニーリングの際、アンカープライマー４０４上の遊離の３’−ＯＨは、テン
プレート核酸４０２内の配列を用いて伸長され得る。アンカープライマー４０２
は、複数回（各反復ごとに、環状テンプレート核酸に対して相補的な配列がアン
カー配列から伸長する配列に加える）、テンプレートにそって伸長され得る。４
回の反復、すなわち４回のローリングサークル型増幅は、伸長されたアンカープ
ライマー増幅産物４１４として図４に示される。アンカープライマーの伸長は、
基質４０６に共有結合された増幅産物を生じる。

【０１０２】ＲＣＡに基づく増幅は、最近、ヒトゲノムＤＮＡサンプル中の単一コピー遺伝
子を検出するための環状パドロックプローブの等温カスケード増幅反応をインビ
ボにおいて行うために利用されている（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２を参照のこと）。さらに、ＲＣＡはまた、固
相ベースのアッセイにおいて単一ＤＮＡ分子を検出するために利用されている（
Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２を参
照のこと）。

【０１０３】ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）は、等温条件下で線形反応速度論または
幾何反応速度論のいずれかで環状オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。２
つのプライマー（一方は、＋鎖に対してハイブリダイズし、もう一方は、−鎖に
対してハイブリダイズする）存在下で、両鎖のコンカタマーは、同時に合成され
得る。これは、短時間（すなわち、９０分未満）で各集団の１×１０⁹個以上の
コピーを可能にし、ヒトゲノム内の単一点変異の検出を可能にする。

【０１０４】単一のプライマーを用いて、ＲＣＡは、数分で、何百もの、共有結合的に閉鎖
した環のランダムに連結されたコピーを産生する。固体支持体マトリクスに結合
されている場合、このＤＮＡ産物は、その合成部位で結合されたままであり、こ
こで、このＤＮＡは、標識され得、集光され得、そして点光源としてイメージさ
れ得る。例えば、直線オリゴヌクレオチドプローブ（これはＲＣＡシグナルを生
成し得る）が、ガラス表面上に共有結合されている。これらのプローブによって
生成されるシグナルの色は、特異的な、標的に指向された連結事象の結果に依存
して、その標的の対立遺伝子状態を示す。ＲＣＡは、何百万もの個々のプローブ
分子を計数および分類することを可能にするので、これは、稀な体細胞変異の分
析に特に受けいれられる。ＲＣＡはまた、細胞学的調製物における、一コピーの
遺伝子に結合したパッドロックプローブの検出について有望であることを示す。

【０１０５】さらに、固相ＲＣＡ法はまた、溶液中の成分を検出する効果的な方法を供給す
るために開発されてきた。最初に、認識段階を使用し、表面に結合されている環
状テンプレートと二重鎖を形成するＤＮＡプライマーからなる、複合体を産生す
る。次いで、ポリメラーゼ酵素を使用して、この結合複合体を増幅する。ＲＣＡ
は、小さなＤＮＡプローブを使用し、これらのプローブを検出方法（以下にさら
に詳しく記載される方法を含む）を使用して強力なシグナルを提供するために増
幅する。

【０１０６】等温増幅系の他の例としては、（ｉ）自己持続的、配列複製（例えば、Ｇｕａ
ｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
７：１８７４〜１８７８を参照のこと）、（ｉｉ）Ｑβレプリカーゼ系（例えば
、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７〜
１２０１を参照のこと）、および（ｉｉｉ）核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ ^TM ；例えば、Ｋｉｅｖｉｔｓら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
３５：２７３〜２８６を参照のこと）が挙げられる。

【０１０７】（伸長アンカープライマーの同定方法）一般に、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドアレイは、当該分野で公知
である、任意の基材ベースの配列決定方法と組み合わせて使用され得る。これら
の方法はまた、従来の光学的および光ファイバーベースの検出シグナルの検出方
法と共に使用され得る。本明細書中に開示されるアレイおよび方法を使用して生
成された伸長アンカープライマーは、さらに、当該分野で公知の方法を使用して
分析され得る。例えば、伸長アンカープライマーの配列を決定し得るか、または
プローブ分子に相同な配列を同定し得る。これらの方法のいくつかは以下に記載
される。

【０１０８】伸長プローブアンカー中の１つ以上の配列は、伸長アンカープライマー産物を
ジデオキシターミネーター配列決定に供することにより決定され得る。これらの
配列決定産物の分析は、伸長アンカープライマー中の１つ以上のヌクレオチドの
同定を可能にする。

【０１０９】あるいは、ピロリン酸ベースの配列決定方法を使用して、伸長アンカープライ
マー中のヌクレオチドを同定し得る。例えば、Ｎｙｒｅｎら（Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０８：１７１〜１７５、１９９３）が、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性の、酵素発光測定無機ピロリン酸検出アッセイ（ＥＬＩＤ
Ａ）による検出に基づいた方法について記載する。

【０１１０】これらの方法は、マイクロ配列決定アッセイの一部で使用され得る。これらの
アッセイは、伸長アンカープライマーにおける目的の多型塩基のすぐ上流にハイ
ブリダイズする配列決定プライマーからの、一ヌクレオチドの伸長に基づく。ポ
リメラーゼを使用して、プライマーの３’末端を、相補的な１つの単一ｄｄＮＴ
Ｐ（鎖ターミネーター）で、その多型部位の選択されたヌクレオチドに特異的に
伸長する。次に、その組み込まれたヌクレオチドの正体が決定される。

【０１１１】１つの実施形態において、マイクロ配列決定反応を蛍光ｄｄＮＴＰを使用して
行い、そして伸長マイクロ配列決定プライマーを分析し、その組み込まれたヌク
レオチドの正体を決定する。マイクロ配列決定反応は、欧州特許第４１２８８
３号に記載される。あるいは、組み込まれるｄｄＮＴＰを、放射性標識し得るか
（Ｓｙｖａｎｅｎ、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ２２６：２２
５〜２３６、１９９４）またはフルオレセインに連結し得る（Ｌｉｖａｋおよび
Ｈａｉｎｅｒ、ＨｕｍａｎＭｕｔａｔｉｏｎ３：３７９〜３８５、１９９４
）。放射性標識したｄｄＮＴＰの検出は、シンチレーションベースの技術を介し
て達成され得る。フルオレセイン連結ｄｄＮＴＰの検出は、アルカリホスファタ
ーゼを結合体化した抗フルオレセイン抗体の結合、それに続く色素生産基質（例
えば、ρ−ニトロフェニルリン酸）とのインキュベーションに基づく。他の可能
なレポーター検出対としては、例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に連結した
ｄｄＮＴＰおよび抗ＤＮＰアルカリホスファターゼ結合体（Ｈａｒｊｕら、Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９／１１２２８２〜２２８７、１９９３）、またはビオチ
ン化ｄｄＮＴＰおよび基質としてのο−フェニレンジアミンを用いる西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンが挙げられる（ＷＯ９２／１５７
１２）。

【０１１２】当該分野で認識される他のアプローチを使用して、マイクロ配列決定プライマ
ーに付加されたヌクレオチドを検出し得る。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移に
基づく均一相の検出方法は、Ｃｈｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ
ｅａｒｃｈ２５：３４７〜３５３（１９９７）およびＣｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４／２０１０７５６〜１０７６１（
１９９７）に記載される。多型部位を含む増幅されたゲノムＤＮＡフラグメント
を、対立遺伝子色素標識ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび改
変Ｔａｑポリメラーゼの存在中で、５’−フルオレセイン標識プライマーととも
にインキュベートする。この色素標識プライマーは、テンプレート上に存在する
対立遺伝子に特異的なダイターミネーターによって１塩基伸長される。遺伝子
型決定反応の終わりに、反応混合液中の２つの色素の蛍光強度は、分離や精製な
しに直接分析される。全てのこれらの工程は同じチューブで実行され得、そして
蛍光の変化がリアルタイムでモニターされ得る。

【０１１３】あるいは、伸長されたプライマーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって
分析され得る。多型部位の塩基を、微小配列決定プライマー上に質量を添加する
ことによって同定する（ＨａｆｆＬ．Ａ．およびＳｍｉｒｎｏｖＩ．Ｐ．，
ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ，７：３７８−３８８，１９９７を参照のこと
）。

【０１１４】伸長アンカープライマーをまた、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおけ
るポリメラーゼ／リガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイを用いて検出し得る
。用語「酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ」は、本明細書中において、リガ
ーゼおよびポリメラーゼの特異性に基づく二重対立遺伝子性マーカー（ｂｉａｌ
ｌｅｌｉｃｍａｒｋｅｒ）の対立遺伝子を決定する任意の方法をいうために使
用される。

【０１１５】これらの方法の例は、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（「ＯＬＡ」）である
。ＯＬＡは、設計されて一本鎖標的分子の隣接配列にハイブリダイズし得る２つ
のオリゴヌクレオチドを使用する。１つのオリゴヌクレオチドを、ビオチン化し
、そして他方を、検出可能に標識する。正確な相補配列が標的分子中で見出され
る場合、オリゴヌクレオチドは、それらの末端が接し、捕獲され検出され得る連
結基質を作製するようにハイブリダイズする。ＯＬＡは、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ
Ｄ．Ａ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．８７：８９
２３−８９２７，１９９０）に記載される。好ましい実施形態において、特別の
増幅工程（例えば、ＰＣＲ）を使用して、ＯＬＡを用いて次いで検出される標的
ＤＮＡの指数的な増幅を達成する。

【０１１６】第２の連結ベースの方法は、リガーゼ鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲ中
の各オリゴヌクレオチド対の配列は、選択されて、この対が標的の同じ鎖の隣接
配列にハイブリダイズすることを可能にする。このようなハイブリダイゼーショ
ンは、テンプレート依存リガーゼのための基質を形成する。ＬＣＲを、伸長され
るアンカープライマーの同じ鎖の、近位配列および遠位配列を有するオリゴヌク
レオチドを用いて、伸長アンカープライマー上で実施し得る。１つの実施形態に
おいて、いずれかのオリゴヌクレオチドは、設計されて、伸長されるアンカープ
ライマー上の目的の部位を含む。このような実施形態において、反応条件は、標
的分子がオリゴヌクレオチドの目的部位に相補的である特定のヌクレオチドを含
むかまたは欠くかいずれかである場合のみ、このオリゴヌクレオチドが一緒に連
結されるように選択される。代替の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
二重対立遺伝子性マーカーを含まず、この結果、これらが標的分子にハイブリダ
イズする場合、ＷＯ９０／０１０６９に記載されるように「ギャップ」が作
製される。ついで、このギャップは、相補的ｄＮＴＰによってか（ＤＮＡポリメ
ラーゼによって媒介されるように）、またはオリゴヌクレオチドのさらなる対に
よって「充填される」。従って、各サイクルの終わりに、各一本鎖は、次のサイ
クルの間に標的として供与し得る補完物を有し、そして所望される配列の指数的
な対立遺伝子特異的増幅が得られる。

【０１１７】リガーゼ／ポリメラーゼ媒介のＧｅｎｅｔｉｃＢｉｔＡｎａｌｙｓｉｓ^TM は、核酸分子の予め選択された部位においてヌクレオチドの同一性を決定するた
めの別の方法である（ＷＯ９５／２１２７１）。この方法は、プライマー分子
の末端上で予め選択された部位に存在するヌクレオチドに相補的であるヌクレオ
チド三リン酸の取り込み、および第２のオリゴヌクレオチドに対するプライマー
の引続く連結を含む。この反応は、反応の固相に連結された特定の標識を検出す
るか、または溶液中の検出によってモニターされる。

【０１１８】伸長アンカープライマーの同一性を決定するさらなる方法は、核酸ハイブリダ
イゼーションを含む。伸長アンカープライマーの１つの形態に優先的または特異
的にハイブリダイズする特定のプロモーターが、設計され得る。ハイブリダイゼ
ーション条件は、十分にストリンジェント（伸長アンカープライマーの代替配列
間のハイブリダイゼーション強度に優位な差異が存在する）でなければならない
。例えば、条件は、好ましくは、選択されて、完全に一致した相同性の伸長アン
カープライマー配列およびプローブ配列との１つ以上のミスマッチを含む伸長ア
ンカープライマー配列に対するプローブ配列のハイブリダイゼーション間を識別
する。ストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件（この下では
、プローブが正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする）は、当該分野
で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと）。ストリ
ンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる状況下で異なる。一般的
に、ストリンジェントな条件は、特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５
℃低く、規定されたイオン強度およびｐＨで選択される。例としてであり限定で
はなく、高いストリンジェンシーの条件を用いる手順は、以下のようである：Ｄ
ＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、８時間〜一晩６５℃で
、６×ＳＳＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ
、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、およ
び５００ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で実行する。フィ
ルターを、４８時間６５℃（好ましいハイブリダイゼーション温度）で、１００
μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０⁶ｃｐｍの³²Ｐ標識プロ
ーブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でハイブリダイズする。あるい
は、ハイブリダイゼーション工程を、ＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ
ＮａＣｌおよび０．０５Ｍクエン酸ナトリウムに対応する）の存在下、６５
℃で実行し得る。続いて、フィルターの洗浄を、３７℃で１時間、２×ＳＳＣ、
０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを
含む溶液中で実行し得、０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４５分間での洗浄が続く。
あるいは、フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０
．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０．１×ＳＳＣおよび０．１％
ＳＤＳを含む溶液中、６８℃で１５分間隔で実行し得る。洗浄工程の後、ハイブ
リダイゼーションプローブを、オートラジオグラフィーによって検出しる。

【０１１９】あるいは、いくつかの実施形態において、標的配列に対して限定された数のミ
スマッチを含む伸長アンカープライマーを、プローブ配列を用いて検出し得る。
このような伸長アンカープライマーは、中程度のストリンジェンシー条件を用い
て検出され得る。例としてであり限定としてではなく、中程度のストリンジェン
シー条件を用いる手順は、以下のようである：ＤＮＡを含むフィルターを、プレ
ハイブリダイズし、次いで、５×ＳＳＣ緩衝液および標識プローブの存在下６０
℃の温度でハイブリダイズする。続いて、フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣを含
む溶液中、５０℃で実行し、そしてハイブリダイズしたプローブを、オートラジ
オグラフィーによって検出する。

【０１２０】分離または洗浄の必要がない高感度のハイブリダイゼーションアッセイが、記
載される（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ，８：７６
９−７７６，１９９８を参照のこと）。例えば、ＴａｑＭａｎ^TMアッセイは、蓄
積する増幅産物に特異的にアニールするＤＮＡプローブを消化するために、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用する。ＴａｑＭａｎ^TMプ
ローブは、蛍光エネルギー移動を介して相互作用するドナー−アクセプター色素
対を用いて標識される。増幅の間にポリメラーゼを進行させることによるＴａｑ
Ｍａｎ^TMプローブの切断は、このドナー色素を消光アクセプター色素から分離し
、ドナーの蛍光を大きく増加する。２つの対立遺伝子改変体を検出するために必
要な全ての試薬は、反応の開始に集められ、そして結果は、リアルタイムにモニ
ターされる（Ｌｉｖａｋら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，９：３４１−３
４２，１９９５を参照のこと）。

【０１２１】代替の同質のハイブリダイゼーションベースの手順において、分子標識が、対
立遺伝子の識別に使用される。分子標識は、均質溶液中で特定の核酸の存在を報
告するヘアピン型のオリゴヌクレオチドプローブである。これらがその標的に結
合する場合、これらは、内部消光されたフルオロホア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ
）の蛍光を回復する構造再編成を引き起こす（Ｔｙａｇｉら、ＮａｔｕｒｅＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４９−５３，１９９８）。

【０１２２】（他の実施形態）本発明はその詳細な説明と組合わせて記載されるが、前出の記載は例示するこ
とが意図され、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求
の範囲の範囲によって規定されることが理解される。他の局面、利点、および改
変は、前出の特許請求の範囲の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明に従うアンカープライマーの模式図である。

【図２】図２は、本発明に従う第２のアンカープライマーの模式図である。

【図３】図３は、本発明に従う第３のアンカープライマーの模式図である。

【図４】図４は、アンカープライマーに結合したローリングサークルベースの増幅産物
の模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＦ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA08 HA11 HA19 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC01 CC02 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR20 QR32 QR35 QR38 QR42 QR62 QR84 QS24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オリゴヌクレオチドアンカープライマーのアレイであって、
該アレイは以下：第１の表面を有する支持体；ならびに該支持体の表面に付着した複数の異なるアンカープライマー、を含み、ここで、該複数のアンカープライマーのうち少なくとも１つが、以下：
該アンカープライマーの３’末端の第１の領域であって、標的核酸配列の５’領
域に相補的な第１の領域；ならびに該アンカープライマーの５’末端の第２の領域であって、該標的核酸配列の３’
領域に相補的な第２の領域；ならびに必要に応じて、該アンカープライマーの第１の領域と第２の領域との間の第３の
領域；を含み、ここで、該アンカープライマーは、該表面の所定の領域で、該固体支持
体の表面に付着される、アレイ。
【請求項２】前記アンカープライマーの少なくとも１つが、前記標的核酸
の配列に相補的な配列の少なくとも１つのコピーに共有結合される、請求項１に
記載のアレイ。
【請求項３】前記アンカープライマーの少なくとも１つが、標的核酸中の
配列多型を規定するヌクレオチドに相補的な問い合わせヌクレオチドを含む第１
の領域を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項４】前記問い合わせヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの
３’末端にある、請求項１に記載のアレイ。
【請求項５】各アンカープライマーが、１２〜１００ヌクレオチドの長さ
である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項６】各アンカープライマーが、２４〜４０ヌクレオチドの長さで
ある、請求項１に記載のアレイ。
【請求項７】前記アレイが、固体支持体に付着した少なくとも１００個の
異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項８】前記アレイが、固体支持体に付着した少なくとも１０，００
０個の異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項９】前記アレイが、固体支持体に付着した少なくとも１００，０
００個の異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１０】前記所定の領域の各々が、他の所定の領域の各々から物理
的に隔てられる、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１１】前記所定の領域の少なくとも２つが、１０〜４００μｍ隔
てられる、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１２】前記所定の領域の少なくとも２つが、５０〜１５０μｍ隔
てられる、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１３】前記アンカープライマー領域の第３の領域の長さが、約４
〜２０ヌクレオチドである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１４】前記アンカープライマーの第３の領域の長さが、約６〜１
８ヌクレオチドである、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１５】前記アンカープライマーの第３の領域の長さが、約８〜１
６ヌクレオチドである、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１６】核酸の配列を決定する方法であって、該方法は、以下：請求項１に記載のアレイを提供する工程；該アレイを、開いたまたは閉じた環状標的核酸と、該標的核酸が該アレイ中の
１つ以上のアンカープライマーにアニールし得る条件下で、接触させる工程；な
らびに標的核酸の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１７】前記アレイ中のアンカープライマーが、第２の領域を含む
、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】請求項１７に記載の方法であって、前環状標的核酸が、以
下：前記アレイ中のオリゴヌクレオチドを、５’末端および３’末端を有する線状
標的核酸と、該標的核酸の５’末端および３’末端が該アレイ中のアンカープラ
イマー内の相補的な配列にアニーリングし得る条件下で、アニーリングする工程
；該標的核酸のアニールした末端を、少なくとも１つの該アンカープライマーの
ギャップ領域の第２の領域に相補的なギャップオリゴヌクレオチドおよびリガー
ゼと、該ギャップオリゴヌクレオチドに対する該標的核酸の５’末端および３’
末端の連結を可能にするのに十分な条件下で、接触させて、それにより、閉じた
環状標的核酸を形成する工程、により形成される、方法。
【請求項１９】共有的に閉じた前記環状標的核酸が、そのヌクレオチド配
列を決定する前に増幅される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法であって、前記増幅工程が、以下
：前記アニールしたアンカープライマーを、ポリメラーゼを用いて、共有的に閉
じた前記環状標的核酸の１つ以上のコピーに相補的なポリヌクレオチド産物の形
成を可能にする条件下で、伸長させる工程；ならびに該ポリヌクレオチド産物を同定して、それにより、該環状標的核酸の配列を決
定する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】前記標的核酸が、配列多型を含む、請求項１６に記載の方
法。
【請求項２２】前記一ヌクレオチド多型が、前記アンカープライマーの第
１の領域内の問い合わせ配列に相補的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記問い合わせヌクレオチドが、前記アンカープライマー
の３’末端にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】請求項２３に記載の方法であって、ここで、共有的に閉じ
た前記環状核酸が、以下：基材を線状標的核酸と、該標的核酸の５’末端および３’末端が前記アンカー
プライマーにアニールし得る条件下で、接触させる工程であって、ここで、該５
’末端および３’末端が、該アンカープライマー上の少なくとも６ヌクレオチド
のギャップ領域により隔てられる、工程；該標的核酸の３’末端を、ポリメラーゼを用いて、伸長産物を形成するのに十
分な条件下で伸長させる工程であって、該伸長産物の３’末端ヌクレオチドが、
該アニールした標的核酸の５’末端に隣接する、工程；ならびに該伸長した産物の３’末端ヌクレオチドを、該アニーリングした標的核酸の５
’末端に連結して、それにより、閉じた環状分子を形成する工程、により形成される、方法。
【請求項２５】前記標的核酸が、ＲＮＡ分子の集団由来である、請求項１
６に記載の方法。
【請求項２６】前記標的核酸が、ＤＮＡ分子の集団由来である、請求項１
６に記載の方法。
【請求項２７】核酸分子の第１および第２の集団中の標的核酸の相対量を
比較するための方法であって、該方法は、以下：固体支持体に連結した１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；核酸分子の第１の集団由来の第１の複数の環状一本鎖核酸テンプレート、およ
び核酸分子の第２の集団由来の第２の複数の環状一本鎖核酸分子を提供する工程
；核酸アンカープライマーの有効量を、該第１の複数の環状一本鎖核酸分子由来
の一本鎖環状テンプレートの少なくとも１つにアニーリングさせて、それにより
、第１のプライムした一本鎖環状テンプレートを得る工程；該核酸アンカープライマーの有効量を、該第２の複数の環状一本鎖核酸分子由
来の一本鎖環状テンプレートの少なくとも１つにアニーリングさせて、それによ
り、第２のプライムした一本鎖環状テンプレートを得る工程；該第１および第２のプライムしたアンカープライマー環状テンプレート複合体
を、ポリメラーゼと組合せて、該核酸分子の第１集団および第２集団由来の環状
核酸テンプレートの複数のコピーを生成させる工程；配列決定プライマーの有効量を、該第１および第２の環状核酸テンプレートに
アニーリングさせて、第１および第２のプライムした配列決定プライマー−環状
核酸テンプレート複合体を得る工程；該配列決定プライマーを、該第１および第２のプライムした配列決定プライマ
ー−環状核酸テンプレート複合体上に、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド
トリホスフェートを用いて、伸長させて、該第１および第２のプライムした配列
決定プライマー−環状核酸テンプレート複合体と会合した第１および第２の配列
決定産物を得る工程；該第１および第２の配列決定産物のレベルを測定する工程であって、ここで、
該第１および第２の配列決定産物の相対レベルは、該核酸配列の第１および第２
の集団中の該標的核酸の相対レベルを示す、工程、を包含する、方法。
【請求項２８】前記核酸分子の第１および第２の集団が、ゲノムＤＮＡ配
列である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記核酸配列の第１および第２の集団が、ＲＮＡ配列由来
である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】前記核酸の第１の集団が、刺激に曝露されている細胞集団
由来であり、そして前記核酸の第２の集団が、刺激に曝露されていない同じ細胞
集団由来である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】前記刺激が、物理的刺激である、請求項３０に記載の方法
。
【請求項３２】前記刺激が、マイトジェンである、請求項３０に記載の方
法。
【請求項３３】前記刺激が、前記細胞集団中の細胞により発現されるレセ
プターに対するリガンドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】前記核酸の第１および第２の集団が、２つの異なる固体の
細胞から得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】前記第１および第２の集団中の標的核酸の相対量を、核酸
分子の第３の集団中の標的核酸の量と比較する工程をさらに包含する、請求項２
９に記載の方法。
【請求項３６】表面に共有結合した核酸コンカテマーを生成する方法であ
って、該方法は、以下：オリゴヌクレオチドアンカープライマーを、５’末端および３’末端を有する
線状標的核酸に、該標的核酸の５’末端および３’末端が、該アンカープライマ
ー中の第１および第２の領域へのアニーリングを可能にする条件下で、アニーリ
ングする工程；該標的核酸のアニーリングした末端を、該アンカープライマーの第２の領域に
相補的なギャップオリゴヌクレオチドおよびリガーゼと、該ギャップオリゴヌク
レオチドに対する標的核酸の５’末端および３’末端の連結を可能にするのに十
分な条件下で、接触させて、それにより、該アンカープライマーにアニールした
閉じた環状標的核酸を形成する工程；該アニールしたアンカープライマーを、ポリメラーゼを用いて、共有的に閉じ
た環状標的核酸の１つ以上のコピーに相補的なポリヌクレオチド産物の形成を可
能にする条件下で、伸長させる工程であって、それにより、表面に共有結合した核酸コンカテマーを生成する工程、を包含する、方法。
【請求項３７】オリゴヌクレオチドのアレイであって、該アレイは、以下
：第１の表面を有する、支持体；該支持体上の所定の位置に付着した少なくとも１つのアンカープライマー、を含み、該アンカープライマーは、以下：該標的核酸配列の５’領域に相補的な第１の領域であって、該標的核酸配列に
相補的な配列の２つ以上のコピーに共有結合される、第１の領域；ならびに該アンカープライマーの５’末端の第２の領域であって、該標的核酸配列の３
’領域に相補的な、第２の領域；ならびに必要に応じて、該オリゴヌクレオチドアンカープライマーの第１の領域と第２
の領域との間の第３の領域；を含み、ここで、該アンカープライマーは、アドレス可能な様式で、該支持体上
に配置される、アレイ。
【請求項３８】前記アンカープライマーが、該支持体上の所定の位置の該
支持体に付着される、請求項３７に記載のアレイ。
【請求項３９】核酸分子を配列決定するためのオリゴヌクレオチドの使用
であって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、以下：該オリゴヌクレオチドの３’末端の第１の領域であって、標的核酸配列の５’
領域に相補的な、第１の領域；ならびに該オリゴヌクレオチドの５’末端の第２の領域であって、標的核酸配列の３’
領域に相補的な、第２の領域；ならびに必要に応じて、該オリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の間の第３の
領域、を含む、使用。
【請求項４０】前記オリゴヌクレオチドが、前記表面の所定の領域の前記
固体支持体の表面に付着される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】前記オリゴヌクレオチドが、前記表面の所定の位置で複数
のオリゴヌクレオチドのアレイとして提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】前記アレイが、固体支持体に付着した少なくとも１００個
の異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】前記アレイが、固体支持体に付着した少なくとも１０，０
００個の異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４４】前記アレイが、固体支持体に付着した少なくとも１００，
０００個の異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４５】前記所定の領域の各々が、他の所定の領域の各々から物理
的に隔てられた、請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】前記所定の領域の少なくとも２つが、１０〜４００μｍ隔
てられる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４７】前記所定の領域の少なくとも２つが、５０〜１５０μｍ隔
てられる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４８】前記オリゴヌクレオチドが、標的核酸中の配列多型を規定
するヌクレオチドに相補的な問い合わせヌクレオチドを含む第１の領域を含む、
請求項３９に記載の使用。
【請求項４９】前記問い合わせヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド
の３’末端にある、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】前記オリゴヌクレオチドが、１２〜１００ヌクレオチドの
長さである、請求項３９に記載の使用。
【請求項５１】前記オリゴヌクレオチドが、２４〜４０ヌクレオチドの長
さである、請求項３９に記載の使用。
【請求項５２】前記オリゴヌクレオチドの第３の領域の長さが、約４〜２
０ヌクレオチドである、請求項３９に記載の使用。
【請求項５３】請求項３９に記載の使用であって、以下：前記オリゴヌクレオチドを、５’末端および３’末端を有する線状標的核酸に
、該核酸の５’末端および３’末端が該オリゴヌクレオチド中の前記第１および
第２の領域にアニールし得る条件下で、アニーリングする工程；該標的核酸のアニールした末端を、該オリゴヌクレオチドの第２の領域に相補
的なギャップオリゴヌクレオチドおよびリガーゼと、該ギャップオリゴヌクレオ
チドに対する該標的核酸の５’末端および３’末端の連結を可能にするのに十分
な条件下で、接触させて、それにより、該アンカープライマーにアニールした閉
じた環状標的核酸を形成する工程、をさらに包含する、使用。
【請求項５４】請求項５３に記載の使用であって、以下：前記アニールしたオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼを用いて、共有的に閉
じた前記環状標的核酸の１つ以上のコピーに相補的なポリヌクレオチド産物の形
成を可能にする条件下で、伸長させる工程、をさらに包含する、使用。
【請求項５５】核酸の配列を決定する方法であって、該方法は、以下：アレイを提供する工程であって、該アレイは、以下：第１の表面を有する支持体；該支持体の表面に付着した複数の異なるアンカープライマー、を含み、ここで、該複数のアンカープライマーのうち少なくとも１つが、以下：該アンカープライマーの３’末端の第１の領域であって、標的核酸配列の５
’領域に相補的な、第１の領域；ならびに該アンカープライマーの５’末端の第２の領域であって、該第２の領域が標
的核酸配列の３’領域に相補的な、第２の領域；ならびに該アンカープライマーの第１の領域と第２の領域との間の第３の領域；を含み、ここで、該アンカープライマーは、該表面の所定の領域で、該固体支持体の
表面に付着される、工程、該アレイを標的核酸と、該標的核酸が該アレイ中の１つ以上のアンカープライ
マーにアニールし得る条件下で、接触させる工程であって、該標的核酸は、該１
つ以上のアンカープライマーの第１の領域にアニールする５’末端、および該ア
ンカープライマーの第２の領域にアニールする３’末端を有する、工程；該標的核酸のアニールした末端を、少なくとも１つの該アンカープライマーの
ギャップ領域の第２の領域に相補的なギャップオリゴヌクレオチドおよびリガー
ゼと、該ギャップオリゴヌクレオチドに対する該標的核酸の５’末端および３’
末端の連結を可能にするのに十分な条件下で、接触させて、それにより、閉じた
環状標的核酸を形成する工程；該アニールしたアンカープライマーを、ポリメラーゼを用いて、共有的に閉じ
た該環状標的核酸の１つ以上のコピーに相補的なポリヌクレオチド産物の形成を
可能にする条件下で、伸長させる工程；ならびに該ポリヌクレオチド産物の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定する工程
、を包含する、方法。