WO2017135383A1 - 偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤 - Google Patents
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- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
Definitions
- the present invention relates to a pseudo-circular double-stranded polynucleotide and a gene expression inhibitor using the same.
- RNA interference As a method for suppressing gene expression of a specific target gene, in recent years, RNA interference (RNA interference) is most often used for convenience.
- RNA interference method typically, a double-stranded ribonucleotide (siRNA) having a length of 21-23 bases having a sequence homologous to the target gene is used.
- siRNA double-stranded ribonucleotide
- the target gene It can suppress gene expression (US Patent Publication US2004 / 0259247).
- An object of the present invention is to provide a pseudo-circular double-stranded polynucleotide and a gene expression inhibitor using the same.
- One embodiment of the present invention is a first polynucleotide having a first region, a second region, and a third region in this order from the 5 ′ direction to the 3 ′ direction, the 3 ′ direction to the 5 ′ direction.
- the third region and the fourth region are each paired to form a double strand.
- the first region and the (3n + 3) region are a first polynucleotide having a base sequence that forms a double strand by pairing with each other.
- the first polynucleotide, the second polynucleotide, and the (n + 1) th polynucleotide may each consist of 29 to 99 nucleotides. At least one of the second region and the (3n + 2) region may be composed of 0 to 6 nucleotides.
- the first polynucleotide may be composed of ribodeoxynucleotides or may be composed of ribodeoxynucleotides and deoxynucleotides.
- the nucleotide constituting the first polynucleotide may include a modified nucleotide, and the modification may be due to polyethylene glycol, folic acid, or cholesterol.
- Another embodiment of the present invention is a polynucleotide pair of a first polynucleotide and a second polynucleotide. It may be a kit containing a polynucleotide pair.
- FIG. 1 For embodiments of the invention, include a first polynucleotide having a first region, a second region, and a third region in order from 5 ′ direction to 3 ′ direction, and from 3 ′ direction to 5 ′ direction, A pseudo-circular double-stranded polynucleotide consisting of two polynucleotides of a second polynucleotide having a fourth region, a fifth region, and a sixth region in order, wherein the third region of the first polynucleotide The region and the fourth region of the second polynucleotide each pair to form a duplex, and the first region of the first polynucleotide and the sixth region of the second polynucleotide each pair Pseudo-double-stranded polynucleotide forming a double strand.
- a further embodiment of the present invention is a pseudo-circular double-stranded polynucleotide composed of p polynucleotides (p is an even number of 4 or more), and the first region and the first region in order from the 5 ′ direction to the 3 ′ direction.
- a third region of the first polynucleotide having a second region and a third region, and a second region having a fourth region, a fifth region, and a sixth region in this order from the 3 ′ direction to the 5 ′ direction.
- the fourth region of each polynucleotide paired to form a duplex, the sixth region of the second polynucleotide, the 5 ′ direction to the 3 ′ direction, the seventh region and the eighth region in this order.
- the seventh region of the third polynucleotide having the ninth region are paired to form a double strand, and the (3m-2) region in order from the 5 ′ direction to the 3 ′ direction.
- the (3m-1) region and the 3m region of the mth polynucleotide having the 3m region And the (3m + 1) th region of the (m + 1) th polynucleotide having the (3m + 1) th region, the (3m + 2) th region, and the (3m + 3) th region in order from the 3 ′ direction to the 5 ′ direction, respectively.
- the (3m + 4) region of the (m + 2) th polynucleotide having the (3m + 6) region each pair to form a duplex (m is an odd number of 3 or more and (p-1) or less)
- the third p region of the p-th polynucleotide and the first region of the first polynucleotide are paired to form a double-stranded polynucleotide.
- a further embodiment of the present invention is a gene expression inhibitor comprising as an active ingredient the above-mentioned polynucleotide pair or any of the above-mentioned pseudo-circular double-stranded polynucleotides.
- each of the first region and the third region may be any of the following.
- the sense strand of the first gene to be suppressed and the sense strand of the second gene to be suppressed (2) The sense strand of the first gene to be suppressed and the second gene to be suppressed Antisense strand (3) The antisense strand of the first gene to be suppressed and the sense strand of the second gene to be suppressed (4) The antisense strand of the first gene to be suppressed and the expression suppressed Antisense strand of the second gene
- it is a schematic diagram of a pseudo-circular double-stranded polynucleotide when the pseudo-circular double-stranded polynucleotide is formed of two polynucleotides.
- it is a figure showing the result of the decomposition
- it is a figure showing the result of the decomposition
- Example of this invention it is a result figure of the experiment for confirming that pseudo
- it is a figure which shows the result of a control experiment in the experiment for showing that pseudo
- it is a figure which shows the result of pseudo
- Example of this invention it is a result figure of the experiment for showing that pseudo
- duplex refers to a region composed of two double-stranded polynucleotide chains, and does not include a region composed of a single polynucleotide chain.
- double strand may be composed of two polynucleotide chains, and may include a region composed of a single polynucleotide chain such as an overhang.
- the polynucleotide of the present invention is a first polynucleotide consisting of 29 to 99 nucleotides having a first region, a second region, and a third region in this order from 5 ′ direction to 3 ′ direction. From the 3 ′ direction to the 5 ′ direction, the second region consisting of 29 to 99 nucleotides having the fourth region, the fifth region and the sixth region in this order; The fourth region has a base sequence that forms a double chain by pairing with each other, and the (3n + 1) th region, the (3n + 2) th region, and the (3n + 3) th region from the 3 ′ direction to the 5 ′ direction in that order.
- the first region and the (3n + 3) region are paired respectively.
- An overhang (for example, TT dimer) may be bonded to the 3 ′ side of the third region so as not to pair with the fifth region.
- the number of nucleotides in each region of the first region, the second region, and the third region is not particularly limited, but the third region and the first region, the fourth region and the (3n + 3) region are Any length may be used as long as it has a function of suppressing gene expression when paired to form a double chain and cleaved at a double chain alone or at a double chain + overhang site. Accordingly, the number of nucleotides in each of the first and third regions may be, for example, 17 or more, preferably 18 or more, more preferably 19 or more, and 50 or less. It is sufficient that it is 30 or less, more preferably 27 or less.
- the number of nucleotides in the second region should be a number that functions as a double-stranded linker consisting of the third region and the fourth region and a double-stranded linker consisting of the first region and the (3n + 3) region.
- it may be 0 or more, preferably 1 or more, more preferably 2 or more, and may be 70 or less, preferably 8 or less. , More preferably 6 or less.
- the nucleotide has a gene expression suppressing function when cleaved by a single strand alone, it may be composed of only ribodeoxynucleotide or both ribodeoxynucleotide and deoxynucleotide. I do not care.
- the ribodeoxynucleotide or deoxynucleotide constituting the polynucleotide may be arbitrarily modified with 2′-O-methyl, 2′-fluoro or the like as long as the gene expression suppression function is not lost. Further, it may be modified with an organic molecule such as polyethylene glycol, folic acid, cholesterol, etc. that does not harm RNA interference.
- the third region of the first polynucleotide and the fourth region of the second polynucleotide are paired to form a duplex, Since the first region and the sixth region of the second polynucleotide pair with each other to form a duplex, and the second and fifth regions serve as linkers for the duplex,
- the two polynucleotides are capable of forming a heteropseudocyclic duplex polynucleotide having a duplex.
- each molecule of the first polynucleotide and the second polynucleotide can form a pseudo-circular double-stranded polynucleotide, but the first polynucleotide and the second polynucleotide bind alternately.
- multiple molecules of 2 such as 2 molecules, 4 molecules, etc. may form a pseudo-circular double-stranded polynucleotide.
- the third region of the first polynucleotide and the fourth region of the second polynucleotide Each have a sequence that forms a double strand by pairing
- the sixth region and the third polynucleotide of the second polynucleotide (from the 5 ′ direction to the 3 ′ direction, the seventh region and the Each of the seventh regions of the region 8 and the region 9 has a sequence forming a double strand by pairing with each other, and the m-th polynucleotide (from 5 ′ direction to 3 ′ direction)
- M is an odd number greater than or equal to 3 and less than or equal to (p-1))
- the third p region of the pth polynucleotide and the first region of the first polynucleotide are paired to form a double strand.
- the third region of the first polynucleotide and the fourth region of the second polynucleotide each pair to form a duplex
- the sixth region and the third region of the second polynucleotide The seventh region of the polynucleotide pairs with each other to form a duplex
- the third m region of the mth polynucleotide and the (3m + 1) region of the (m + 1) th polynucleotide pair with each other A sequence in which the (3m + 3) region of the (m + 1) th polynucleotide and the (3m + 4) region of the (m + 2) polynucleotide pair with each other to form a duplex.
- each polynucleotide has the same configuration (number of nucleotides, type, modification, etc.) as the first polynucleotide described in the section “Polynucleotide”. Note that the p polynucleotides may be all different or partially the same, and the type of the polynucleotide is not limited as long as it adopts the structure described above.
- a hetero-quasi-circular double-stranded polynucleotide comprising the first to p-th polynucleotides is obtained by chemically synthesizing p polynucleotides and annealing them. Chemical synthesis of a polynucleotide can be performed by a well-known method. Annealing can be performed by mixing p polynucleotides, heating and then cooling.
- the heating temperature is not particularly limited and can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the nucleotide sequence of the polynucleotide. For example, the heating temperature is 50 ° C to 100 ° C, 60 ° C to 90 ° C, or 70 ° C to 80 ° C.
- the cooling may be performed gradually, or may be incubated at a constant temperature for a predetermined time.
- the temperature is not particularly limited, and it is easy for those skilled in the art to select an appropriate temperature.
- incubation is performed in a range of 20 ° C. to 60 ° C., 30 ° C. to 50 ° C., or 35 ° C. to 45 ° C. That's fine.
- the time is not particularly limited, and for example, it may be incubated in the range of 30 seconds to 10 minutes, 1 to 5 minutes, or 2 to 4 minutes. It is not necessary to join the ends of the polynucleotides with an enzyme such as ligase after annealing.
- each siRNA can be introduced in an equimolar amount into one cell, and a plurality of genes up to the maximum number of double-stranded strands in one cell. Can be knocked down, and multiple siRNAs of different types can be introduced into one cell at an arbitrary ratio.
- each region of each polynucleotide is expressed by designing as shown in (1) to (4) of Table 1 below. It can function as an expression inhibitor of the first gene and the second gene to be suppressed.
- polynucleotide sequence for gene expression suppression can be easily designed using the rules known to those skilled in the art.
- siRNA as a pseudo-circular double-stranded polynucleotide
- the immune response is not activated in the cell, the cytotoxicity is low, and two or more genes are used in the same cell with two polynucleotides. It can be knocked down at the same time, and since the gene repression function is not expressed until the linker is decomposed, the expression of the gene repression function of gene repression is delayed or the half-life is adjusted by adjusting the length of the linker The effect of being able to do is acquired.
- gene expression suppression refers to suppression of intracellular protein production by gene expression using a double-stranded polynucleotide, and a typical example is RNA interference.
- Plasmid DNA (pcDNA3-EGFDP, pCMV DsRed-Express, pRL-TK, pGL3) expressing eGFP, DsRed, Renilla luciferase and firefly luciferase was introduced into E. coli JM109 competent cells. Thereafter, the cells were inoculated into 200 ml of LB medium containing 100 mg / ml of ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. Thereafter, plasmid DNA was recovered using the PureYield TM Plasmid Midipreps System (Promega).
- siRNA sequence for eGFP EGFP1 siRNA
- siRNA sequence for firefly luciferase Luc428 siRNA
- siRNA sequence for eGFP Sense: AAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC (SEQ ID NO: 1) Antisense: GGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU (SEQ ID NO: 2) SiRNA sequences for firefly luciferase: Sense: CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUU (SEQ ID NO: 3) Antisense: UAUUUUUUGGAUGAUUGGGA (SEQ ID NO: 4)
- LG sense CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU (SEQ ID NO: 5)
- LG anti UAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC (SEQ ID NO: 6)
- LG anti AA AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC (SEQ ID NO: 7)
- [4-1] RNaseR degradation test Add 10 ⁇ l Buffer 1 ⁇ l to the single-stranded RNA, pseudo-circular double-stranded RNA, and CHR-SAT6 RNA (corresponding to 5 pmol each) used for the preparation of pseudo-circular double-stranded RNA, and RNaseR 0.5 ⁇ l (10 units) was mixed and adjusted to 10 ⁇ l with sterile water. After the resulting RNA solution was reacted at 30 ° C. for 15 minutes, 1 ⁇ l of 6 ⁇ Loading Dye was added to 5 ⁇ l, and the change in the migration position of each RNA before and after RNaseR reaction treatment was confirmed by 12% native PAGE.
- RNaseR is an enzyme that degrades single-stranded RNA from both ends. As shown in FIG. 2, the single-stranded RNA was degraded, but the pseudo-circular double-stranded RNA was composed of 2 polynucleotides and 4 polynucleotides. Both were resistant to RNaseR. That is, it shows that the pseudo-circular double-stranded RNA does not have a single-stranded end. Note that CHR-SAT6 RNA, which is known to be circular, also showed resistance to RNaseR.
- RNase S1 degradation test Add 1 ⁇ l of 10 ⁇ Buffer to the single-stranded RNA, pseudo-circular double-stranded RNA solution, and CHR-SAT6 RNA (corresponding to 5 pmol each) used for the preparation of pseudo-circular double-stranded RNA.
- RNaseS1 1 ⁇ l (6.3 units) was mixed and adjusted to 10 ⁇ l with sterilized water.
- the obtained RNA solution was reacted at 30 ° C. for 15 min, 1 ⁇ l of 6 ⁇ Loading Dye was added to 5 ⁇ l, and the change in the migration position of each RNA before and after RNaseR reaction treatment was confirmed by 12% native PAGE.
- RNaseS1 is an enzyme that nonspecifically degrades single-stranded RNA. As shown in FIG. 3, single-stranded RNA was degraded, while pseudo-circular double-stranded RNA was also degraded, but only the double-stranded RNA remained undegraded. In addition, CHR-SAT6 RNA known to be circular showed resistance to RNaseR.
- Dicer treatment test In order to induce RNA interference in cells, it is necessary that the introduced RNA be processed into siRNA by Dicer. Therefore, Dicer treatment test was performed on the prepared pseudo-circular double-stranded RNA.
- RNA which is a single-stranded RNA
- the LG sense RNA which is a single-stranded RNA
- the pseudo-circular double-stranded RNA was confirmed to be cleaved by Dicer.
- pseudo-circular double-stranded RNA can function as siRNA.
- HEK293 cells were cultured to 80% confluence using a 10 cm petri dish. After removing the medium and washing the cells with 3 ⁇ l of 1 ⁇ PBS, HEK293 cells were detached from the petri dish by pipetting using 5 ⁇ l of 1 ⁇ PBS. The solution containing the detached cells was centrifuged to remove the supernatant, 100 ⁇ l of M-PER (registered trademark) Mammalian Protein Extraction Reagent was added, and the pelleted cells were lysed by rapid pipetting. The lysate was centrifuged and the supernatant was collected and stored at -80 ° C.
- M-PER registered trademark
- siRNA positive control
- siRNA having a random sequence negative control
- single-stranded RNA used for preparation of pseudo-circular double-stranded RNA (LG sense RNA) or pseudo-circular double-stranded RNA was introduced using Lipofectamine 3000, and fluorescence of eGFP and DsRed after 24 hours was observed with a phase-contrast fluorescence microscope.
- pseudo-circular double-stranded RNA is effective as a gene inhibitor.
- RNA positive control
- solvent alone referred to as -siRNA in FIG. 7
- single-stranded RNA used for the preparation of pseudo-circular double-stranded RNA LG sense RNA, LG anti RNA, or LG anti AA RNA
- pseudo-circular double-stranded RNA pseudo-circular double-stranded AA RNA
- Lipofectamine 3000 to express the firefly luciferase gene and the Renilla luciferase gene
- the relative knockdown efficiency of the firefly luciferase gene was calculated based on the luminescence intensity of Renilla luciferase by quantification using Dual-Glo Luciferase Assay Systen (Promega).
- FIG. 7 shows the relative expression level with the average expression level in the case of the solvent alone as 100.
- pseudo-circular double-stranded RNA is effective as a gene inhibitor.
- Example 2 knockdown of eGFP gene expression is used as an assay system, and it is shown that the number of nucleotides in the linker does not affect the effect of the pseudo-circular duplex.
- a nucleotide having the following sequence a total of nine pseudo-circular double-stranded RNAs were prepared in the same manner as in Example 1, including three sense strands and three antisense strands.
- a pseudo-circular double-stranded RNA composed of LG sense A1 and LG anti AA C1 is referred to as pseudo-circular A1C1, and others are named in the same manner.
- LG sense A1 CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU (SEQ ID NO: 8)
- LG sense A3 CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU (SEQ ID NO: 9)
- LG sense A6 CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU (SEQ ID NO: 10)
- LG anti AA C3 AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC (SEQ ID NO: 12)
- LG anti AA C6 AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC (SEQ ID NO:
- Example 3 Long-term knockdown of luciferase gene expression
- knockdown of luciferase gene expression is used as an assay system, and it is shown that the effect of pseudo-circular duplex lasts for a long time.
- the reporter gene and the pseudo-circular duplex were introduced into the cells in the same manner as in Example 1, and then the expression of luciferase as the reporter was quantified.
- expression was measured after 24 hours, but in this example, expression was also measured after 3 days and after 5 days. The result is shown in FIG.
- pseudo-circular double-stranded RNA Even when pseudo-circular double-stranded RNA was used, gene expression-inhibiting activity was observed even after 5 days from cell introduction, as in luc428 (positive control). Thus, the gene expression inhibitory activity of pseudo-circular double-stranded RNA is maintained over a long period of time.
- siRNA is known to induce interferon response and non-specifically suppress gene expression.
- an interferon response is induced, the expression of STAT is enhanced and activated by phosphorylation.
- This example shows that pseudocircular double-stranded RNA does not induce an interferon response.
- HEK293 cells were seeded in a 24-well plate at 15000 cells per well and cultured overnight.
- No treatment negative control
- Lipofectamine 3000 alone no RNA
- (6) luc428 only no Lipofectamine 3000
- negative control (7) Pseudocyclic A3C3 only (no Lipofectamine 3000) (negative control)
- the nucleotides were 20 pmol each).
- an anti-STAT1 antibody (Stat1 Rabbit mAb (42H3) (CST Japan)
- an anti-phosphorylated STAT1 antibody Phospho-Stat1 (Tyr701) Rabbit mAb (D4A7) (CST Japan)
- Phospho-Stat1 (Tyr701) Rabbit mAb (D4A7) (CST Japan)
- pseudo-circular double-stranded RNA When STAT1 expression and STAT1 phosphorylation were detected by chemiluminescence using Anti Mouse IgG, HRP-linked Whole Antibody (GE Healthcare) and Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare), As shown in FIG. 11, the pseudo-circular double-stranded RNA also had no interferon response-inducing activity, like luc428. Thus, pseudo-circular double-stranded RNA does not have interferon response inducing activity.
- a pseudo-circular double-stranded polynucleotide and a gene expression inhibitor using the same can be provided.
Abstract
本発明は、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤を提供することを目的とする。本発明の偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを製造するために、５'方向から３'方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドであって、３'方向から５'方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３'方向から５'方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドを用いる。
Description
本発明は偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤に関する。
特定の標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法として、近年、簡便性のためにＲＮＡ干渉（RNA interference; RNAi）が最もよく利用されている。
ＲＮＡ干渉法では、典型的には、標的遺伝子と相同な配列を有する２１－２３塩基長の二本鎖リボヌクレオチド（siRNA）が用いられ、このsiRNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子の遺伝子発現を抑制できる（米国特許公報US2004/0259247）。
これまで、ＲＮＡの構造体を構築することで、より機能的な技術にする試みがなされている（Nat Mater. 2012 vol.11 (No.4): pp.316-22.；Nat Nanotechnol.2011 vol.6 (No.2): pp.116-20.；Nat Chem. 2010 vol.2 (No.9): pp.772-9.；J Am Chem Soc. 2007 vol.129 (No.49): pp.15108-9.）が、実用化されたものは存在しない。
本発明は、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤を提供することを課題とする。
本発明の一実施態様は、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドである。第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び第（ｎ＋１）のポリヌクレオチドが、それぞれ２９個から９９個のヌクレオチドからなるものでもよい。第２の領域および第（３ｎ＋２）の領域のうちの少なくとも一つが、０～６個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記第１のポリヌクレオチドは、リボデオキシヌクレオチドで構成されていても、リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドで構成されていてもよい。また、第１のポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが、修飾されているヌクレオチドを含んでもよく、修飾は、ポリエチレングリコール、葉酸、またはコレステロールによるものでもよい。
本発明の他の実施態様は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドペアである。ポリヌクレオチドペアを含有するキットであってもよい。
本発明のさらなる実施態様は、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチド、及び３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの２個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドである。
本発明のさらなる実施態様は、ｐ個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって（ｐは４以上の偶数）、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドの第３の領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ－２）の領域と第（３ｍ－１）の領域と第３ｍの領域を有する第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し（ｍは３以上（ｐ－１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドである。
本発明のさらなる実施態様は、前記ポリヌクレオチドペア、または前記いずれかの偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤である。前記偽環状二重鎖ポリヌクレオチドにおいて、前記第１の領域と前記第３の領域が、それぞれ以下のいずれかであってもよい。
（１）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（２）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
（３）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（４）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
（２）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
（３）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（４）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
本明細書で、二重鎖とは、二重になった２本のポリヌクレオチド鎖からなる領域を言い、１重のポリヌクレオチド鎖からなる領域は含まないものとする。一方、二本鎖とは、２本のポリヌクレオチド鎖からなればよく、オーバーハングなど１重のポリヌクレオチド鎖からなる領域を含んでも構わないものとする。
＝＝ポリヌクレオチド＝＝
本発明のポリヌクレオチドは、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドである。第３の領域の３‘側に、第５の領域と対合しないようにオーバーハング（例えば、ＴＴのダイマー）を結合させておいてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドである。第３の領域の３‘側に、第５の領域と対合しないようにオーバーハング（例えば、ＴＴのダイマー）を結合させておいてもよい。
第１の領域、第２の領域、第３の領域の各領域のヌクレオチド数は特に限定されないが、第３の領域及び第１の領域と、第４の領域及び第（３ｎ＋３）の領域は、それぞれ対合して二重鎖を形成し、二重鎖単独または二重鎖＋オーバーハング部位で切断された場合に遺伝子発現抑制機能を有する長さであればよい。従って、第１および第３の各領域のヌクレオチドの個数は、例えば、１７個以上であればよく、１８個以上であることが好ましく、１９個以上であることがより好ましく、また、５０個以下であればよく、３０個以下であることが好ましく、２７個以下であることがより好ましい。一方、第２の領域におけるヌクレオチド数は、第３の領域と第４の領域からなる二重鎖及び第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域からなる二重鎖のリンカーとして機能する個数であればよく、例えば、０個以上であればよく、１個以上であることが好ましく、２個以上であることがより好ましく、また、７０個以下であればよく、８個以下であることが好ましく、６個以下であることがより好ましい。
なお、ヌクレオチドは、二重鎖単独で切断された場合に遺伝子発現抑制機能を有するのであれば、リボデオキシヌクレオチドのみで構成されていても、リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの両方で構成されていても構わない。また、ポリヌクレオチドを構成するリボデオキシヌクレオチドやデオキシヌクレオチドは、遺伝子発現抑制機能を失わない限り、2'-O-メチル、2'-フルオロなどによって、任意に修飾されていても構わない。また、ポリエチレングリコール、葉酸、コレステロールなどのRNA干渉作用を害さない有機分子で修飾されていてもよい。
＝＝偽環状二重鎖ポリヌクレオチド＝＝
偽環状二重鎖ポリヌクレオチドが２個のポリヌクレオチドで形成される場合、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有する。従って、図１に示すように、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２の領域および第５の領域は二重鎖に対するリンカーとなるため、第１及び第２のポリヌクレオチドは、二重鎖を有するヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することが可能になる。構造的に、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの１分子ずつが偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することができるが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが交互に結合して、２分子ずつ、４分子ずつなど、２の倍数個の分子が偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成してもよい。
偽環状二重鎖ポリヌクレオチドが２個のポリヌクレオチドで形成される場合、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有する。従って、図１に示すように、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２の領域および第５の領域は二重鎖に対するリンカーとなるため、第１及び第２のポリヌクレオチドは、二重鎖を有するヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することが可能になる。構造的に、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの１分子ずつが偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することができるが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが交互に結合して、２分子ずつ、４分子ずつなど、２の倍数個の分子が偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成してもよい。
一般に、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドがｐ個のポリヌクレオチドから形成される場合（ｐは４以上の偶数）、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と第３のポリヌクレオチド（５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する）の第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第ｍのポリヌクレオチド（５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ－２）の領域と第（３ｍ－１）の領域と第３ｍの領域を有する）の第３ｍの領域と第（ｍ＋１）のポリヌクレオチド（３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する）の第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と第（ｍ＋２）のポリヌクレオチド（５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する）の第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し（ｍは３以上（ｐ－１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有する。従って、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２の領域、第５の領域、第（３ｍ－１）の領域、および第（３ｍ＋２）の領域は二重鎖に対するリンカーとなるため、第１～第ｐのポリヌクレオチドは、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することが可能になる。ここで、各ポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の項で述べた第１のポリヌクレオチドと同様の構成（ヌクレオチドの個数、種類、修飾など）を有する。なお、ｐ個のポリヌクレオチドは、全て異なっていても、一部同じであってもよく、上述の構造を採っていれば、ポリヌクレオチドの種類は限定されない。
第１～第ｐのポリヌクレオチドからなるヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドは、ｐ個のポリヌクレオチドを化学合成してアニールすることで得られる。ポリヌクレオチドの化学合成は、周知の方法で行うことができる。アニーリングは、ｐ個のポリヌクレオチドを混合し、加熱した後で、冷却することで行うことができる。加熱の温度は特に限定されず、ポリヌクレオチドの塩基配列を考慮して、当業者が容易に決定することができるが、例えば、５０℃～１００℃、６０℃～９０℃、あるいは７０℃～８０℃などの範囲にまで加熱すればよい。冷却は、徐々に冷却させてもよいが、一定温度で所定時間インキュベートしてもよい。温度は特に限定されず、適切な温度を選択することは当業者には容易であるが、例えば、２０℃～６０℃、３０℃～５０℃、あるいは３５℃～４５℃などの範囲でインキュベートすればよい。時間も特に限定されず、例えば、３０秒～１０分、１～５分、あるいは２～４分などの範囲でインキュベートすればよい。なお、アニーリングの後、リガーゼなどの酵素によってポリヌクレオチドの端同士を結合する必要はない。
＝＝遺伝子抑制剤＝＝
本発明のヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを細胞に投与すると、第２の領域、第５の領域、第（３ｍ－１）の領域、および第（３ｍ＋２）の領域で構成されるリンカー部分が分解され、各二重鎖がそれぞれ分離し、独立にｓｉＲＮＡとして機能する。従って、各二重鎖の配列をｓｉＲＮＡの配列として設計することによって、１つの細胞内に等モルで各ｓｉＲＮＡを導入することや、１つの細胞内で最大二重鎖の個数分まで複数の遺伝子の発現をノックダウンすることや、１つの細胞内に任意の比率で種類の異なる複数のｓｉＲＮＡを導入することが可能になる。
本発明のヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを細胞に投与すると、第２の領域、第５の領域、第（３ｍ－１）の領域、および第（３ｍ＋２）の領域で構成されるリンカー部分が分解され、各二重鎖がそれぞれ分離し、独立にｓｉＲＮＡとして機能する。従って、各二重鎖の配列をｓｉＲＮＡの配列として設計することによって、１つの細胞内に等モルで各ｓｉＲＮＡを導入することや、１つの細胞内で最大二重鎖の個数分まで複数の遺伝子の発現をノックダウンすることや、１つの細胞内に任意の比率で種類の異なる複数のｓｉＲＮＡを導入することが可能になる。
たとえば、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドが２個のポリヌクレオチドで形成される場合、各ポリヌクレオチドの各領域を、以下の表１の（１）～（４）のように設計することによって、発現抑制対象の第１の遺伝子及び第２の遺伝子の発現抑制剤として機能させることができる。
なお、遺伝子発現抑制のためのポリヌクレオチド配列は、当業者に公知であるルールなどを用いて容易に設計することができる。
このように、siRNAを偽環状二重鎖ポリヌクレオチドとすることにより、細胞内で免疫反応が活性化されず、細胞毒性が低いこと、二本のポリヌクレオチドで２つ以上の遺伝子を同一細胞で同時にノックダウンすることができること、リンカーが分解されるまで遺伝子抑制機能が発現しないので、遺伝子抑制の遺伝子発現抑制機能の発現を遅らせたり、リンカーの長さを調節することで半減期を調節したりすることができること、などの効果が得られる。
なお、本明細書で「遺伝子発現抑制」とは、二重鎖ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子発現によるタンパク質の細胞内産生を抑制することであって、典型的な例としてRNA干渉が挙げられる。
［実施例１］
［１］レポーターアッセイ用プラスミドDNAの調製
eGFP、DsRed、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドDNA（pcDNA3-EGFDP、pCMV DsRed-Express、pRL-TK、pGL3）を大腸菌JM109コンピテントセルに導入した後、アンピシリン100mg/mlを含有したＬＢ培地200mlにそれぞれ植菌し、37℃で16時間振盪培養を行った。その後PureYieldTM Plasmid Midipreps System (Promega社製)を用いてプラスミドDNAを回収した。
［１］レポーターアッセイ用プラスミドDNAの調製
eGFP、DsRed、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドDNA（pcDNA3-EGFDP、pCMV DsRed-Express、pRL-TK、pGL3）を大腸菌JM109コンピテントセルに導入した後、アンピシリン100mg/mlを含有したＬＢ培地200mlにそれぞれ植菌し、37℃で16時間振盪培養を行った。その後PureYieldTM Plasmid Midipreps System (Promega社製)を用いてプラスミドDNAを回収した。
［２］siRNAの調製
レポーターアッセイにおいて、eGFPに対するsiRNA配列（EGFP1 siRNA）およびホタルルシフェラーゼに対するsiRNA配列（Luc428 siRNA）をそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして実験に使用した。なお、各RNAは受託有機合成（JBios社）により得た。各配列を以下に示す。
レポーターアッセイにおいて、eGFPに対するsiRNA配列（EGFP1 siRNA）およびホタルルシフェラーゼに対するsiRNA配列（Luc428 siRNA）をそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして実験に使用した。なお、各RNAは受託有機合成（JBios社）により得た。各配列を以下に示す。
eGFPに対するsiRNA配列：
Sense: AAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１）
Antisense: GGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号２）
ホタルルシフェラーゼに対するsiRNA配列：
Sense: CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUU（配列番号３）
Antisense: UAUUUUUUGGAUGAUUGGGA（配列番号４）
Sense: AAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１）
Antisense: GGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号２）
ホタルルシフェラーゼに対するsiRNA配列：
Sense: CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUU（配列番号３）
Antisense: UAUUUUUUGGAUGAUUGGGA（配列番号４）
［３］偽環状二重鎖RNAの調製
受託有機合成（JBios社）により得たLG sense RNA及びLG anti RNAを50μMになるように滅菌水で溶解し、30μlずつのRNAと5×anneling Buffer 15μlを混合した。混合溶液を90℃で1分間加熱し、37℃で60分静置し、アニーリングを行うことによって、20μM偽環状二重鎖RNAを得た。また、同様の手順で、異なる組み合わせの一本鎖RNA(LG sense RNA及びLG anti AA RNA)より偽環状二重鎖AA RNAを調製した。これらの偽環状二重鎖RNAは、eGFP及びホタルルシフェラーゼのレポータープラスミドの転写産物における共通配列をターゲットとする。
受託有機合成（JBios社）により得たLG sense RNA及びLG anti RNAを50μMになるように滅菌水で溶解し、30μlずつのRNAと5×anneling Buffer 15μlを混合した。混合溶液を90℃で1分間加熱し、37℃で60分静置し、アニーリングを行うことによって、20μM偽環状二重鎖RNAを得た。また、同様の手順で、異なる組み合わせの一本鎖RNA(LG sense RNA及びLG anti AA RNA)より偽環状二重鎖AA RNAを調製した。これらの偽環状二重鎖RNAは、eGFP及びホタルルシフェラーゼのレポータープラスミドの転写産物における共通配列をターゲットとする。
各配列を以下に示す。
LG sense:
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号５）
LG anti:
UAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号６）
LG anti AA:
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号７）
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号５）
LG anti:
UAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号６）
LG anti AA:
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号７）
［４］RNaseによる分解試験
［３］で得られた偽環状二重鎖RNAが、図１で示されるような偽環状構造を形成していることを確認するために、RNaseR、RNaseS1を用いた分解試験を行った。本実施例では、コントロールとして、既に環状構造を有していることが知られているCHR-SAT6 RNAを使用した。
［３］で得られた偽環状二重鎖RNAが、図１で示されるような偽環状構造を形成していることを確認するために、RNaseR、RNaseS1を用いた分解試験を行った。本実施例では、コントロールとして、既に環状構造を有していることが知られているCHR-SAT6 RNAを使用した。
［４－１］RNaseR分解試験
偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA、偽環状二重鎖RNA、CHR-SAT6 RNA（各5 pmol相当）に10×Buffer 1 μlを加え、RNaseR 0.5 μl（10 units）を混合して、滅菌水で10 μlに調整した。得られたRNA溶液を30℃で15分間反応させた後、5 μlに6×Loading Dye 1 μlを加え、12 % native PAGEにてRNaseR反応処理前後の各RNAの泳動位置の変化を確認した。
偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA、偽環状二重鎖RNA、CHR-SAT6 RNA（各5 pmol相当）に10×Buffer 1 μlを加え、RNaseR 0.5 μl（10 units）を混合して、滅菌水で10 μlに調整した。得られたRNA溶液を30℃で15分間反応させた後、5 μlに6×Loading Dye 1 μlを加え、12 % native PAGEにてRNaseR反応処理前後の各RNAの泳動位置の変化を確認した。
RNaseRは、１本鎖RNAを両端から分解する酵素である。図２に示すように、一本鎖RNAは分解されたが、偽環状二重鎖RNAは、２個のポリヌクレオチドで構成されているもの及び４個のポリヌクレオチドで構成されているものは、両方ともRNaseRに耐性を示した。すなわち、偽環状二重鎖RNAは一本鎖端を持たないことを示している。なお、環状であることが知られているCHR-SAT6 RNAも、RNaseRに耐性を示した。
［４－２］RNaseS1分解試験
偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA、偽環状二重鎖RNA溶液、CHR-SAT6 RNA（各5 pmol相当）に10×Buffer 1 μlを加え、RNaseS1 1 μl（6.3 units）を混合して、滅菌水で10 μlに調整した。得られたRNA溶液を30℃で15 min反応させた後、5 μlに6×Loading Dye 1 μlを加え、12 % native PAGEにてRNaseR反応処理前後の各RNAの泳動位置の変化を確認した。
偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA、偽環状二重鎖RNA溶液、CHR-SAT6 RNA（各5 pmol相当）に10×Buffer 1 μlを加え、RNaseS1 1 μl（6.3 units）を混合して、滅菌水で10 μlに調整した。得られたRNA溶液を30℃で15 min反応させた後、5 μlに6×Loading Dye 1 μlを加え、12 % native PAGEにてRNaseR反応処理前後の各RNAの泳動位置の変化を確認した。
RNaseS1は、１本鎖RNAを非特異的に分解する酵素である。図３に示すように、一本鎖RNAは分解され、一方、偽環状二重鎖RNAも分解されたが、二重鎖RNAのみが分解されずに残っている。なお、環状であることが知られているCHR-SAT6 RNAは、RNaseRに耐性を示した。
［４－３］Dicer処理試験
細胞内でRNA干渉を誘導するためには、導入したRNAがDicerによってsiRNAへとプロセシングされる必要がある。そこで調製した偽環状二重鎖RNAのDicer処理試験を行った。
細胞内でRNA干渉を誘導するためには、導入したRNAがDicerによってsiRNAへとプロセシングされる必要がある。そこで調製した偽環状二重鎖RNAのDicer処理試験を行った。
Recombinant Dicer Enzyme Kit (Genlantis社）に従い、一本鎖RNA(LG sense RNA)、偽環状RNA 各3 μl、10 mM ATP 4.0 μl、50mM MgCl2 2.0 μl、Reaction Buffer 16 μl、Dicer Enzyme （4 units）8 μlを混合し、滅菌水を用いて40 μlに調製した。その後、37 ℃にてインキュベーションし、目的の時間ごとに8 μlサンプリングしてDicer stop solution 2 μlと混合し、-20 ℃にて凍結保存した。全てのサンプリング終了後、回収したサンプルを氷上で緩やかに溶解し、12 % native PAGEにて偽環状RNAの分解挙動を確認した。（図４）
図４に示されるように、一本鎖RNAであるLG sense RNAは加水分解による分解が確認されたがDicerによる切断産物は確認されなかった。一方、偽環状二重鎖RNAはDicerによる切断が確認された。このように、偽環状二重鎖RNAは、siRNAとして機能しうる。
図４に示されるように、一本鎖RNAであるLG sense RNAは加水分解による分解が確認されたがDicerによる切断産物は確認されなかった。一方、偽環状二重鎖RNAはDicerによる切断が確認された。このように、偽環状二重鎖RNAは、siRNAとして機能しうる。
［５］細胞抽出液処理試験
本実験ではHEK293細胞より抽出した細胞抽出液を実験に使用した。
本実験ではHEK293細胞より抽出した細胞抽出液を実験に使用した。
［５－１］細胞抽出液の調製
10cmシャーレを用いて、HEK293細胞を80%コンフルエントになるまで培養した。培地を除去して1×PBS 3 μlで細胞を洗った後、1×PBS 5 μlを用いて、ピペッティングによりHEK293細胞をシャーレより剥がした。剥がした細胞を含む溶液を遠心して上清を除去し、M-PER（登録商標） Mammalian Protein Extraction Reagent 100 μlを加え、素早くピペッティングをおこなうことでペレット状の細胞を溶解した。溶解液を遠心して上清を回収し、-80℃で保存した。
10cmシャーレを用いて、HEK293細胞を80%コンフルエントになるまで培養した。培地を除去して1×PBS 3 μlで細胞を洗った後、1×PBS 5 μlを用いて、ピペッティングによりHEK293細胞をシャーレより剥がした。剥がした細胞を含む溶液を遠心して上清を除去し、M-PER（登録商標） Mammalian Protein Extraction Reagent 100 μlを加え、素早くピペッティングをおこなうことでペレット状の細胞を溶解した。溶解液を遠心して上清を回収し、-80℃で保存した。
［５－２］細胞抽出液中でのRNAの安定性評価実験
［５－１］で調製した細胞抽出液とRNAを37℃で、0分、10分、60分、及び90分の各時間インキュベートし、変性PAGEあるいはPAGEによってRNAの安定性を評価した。（図５）
図５に示されるように、一本鎖RNAであるLG sense RNAは60分以内に分解されたのに対し、偽環状RNAおよび環状RNA（CHR-SAT6）の分解はほとんど認められなかった。このように、偽環状RNAは一本鎖RNAより安定に存在しうる。
［５－１］で調製した細胞抽出液とRNAを37℃で、0分、10分、60分、及び90分の各時間インキュベートし、変性PAGEあるいはPAGEによってRNAの安定性を評価した。（図５）
図５に示されるように、一本鎖RNAであるLG sense RNAは60分以内に分解されたのに対し、偽環状RNAおよび環状RNA（CHR-SAT6）の分解はほとんど認められなかった。このように、偽環状RNAは一本鎖RNAより安定に存在しうる。
［６］細胞導入
HEK293細胞に、レポーター発現プラスミドに加え、各レポーター遺伝子に対するsiRNA（ポジティブコントロール）、ランダムな配列を有するsiRNA（ネガティブコントロール）、偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA(LG sense RNA)、または偽環状二重鎖RNAをリポフェクタミン3000を用いて導入し、24時間後のeGFPおよびDsRedの蛍光を位相差蛍光顕微鏡にて観察した。
HEK293細胞に、レポーター発現プラスミドに加え、各レポーター遺伝子に対するsiRNA（ポジティブコントロール）、ランダムな配列を有するsiRNA（ネガティブコントロール）、偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA(LG sense RNA)、または偽環状二重鎖RNAをリポフェクタミン3000を用いて導入し、24時間後のeGFPおよびDsRedの蛍光を位相差蛍光顕微鏡にて観察した。
図６に示すように、レポーター特異的な、ポジティブコントロールまたは偽環状二重鎖RNAを導入したときに、レポーター発現の抑制が観察された。このように、偽環状二重鎖RNAは、遺伝子抑制剤として有効である。
次に、HEK293細胞に、レポーター発現プラスミドに加え、各レポーター遺伝子に対するsiRNA（ポジティブコントロール）、溶媒のみ（図７では-siRNAと記す）、偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA(LG sense RNA、LG anti RNA、またはLG anti AA RNA)、偽環状二重鎖RNA、または偽環状二重鎖AA RNAをリポフェクタミン3000を用いて導入し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の発現を、Dual-Glo Luciferase Assay Systen（プロメガ社）を用いて定量し、ウミシイタケルシフェラーゼの発光強度をもとにホタルルシフェラーゼ遺伝子の相対的なノックダウン効率を算出した。溶媒のみの場合の平均発現レベルを１００とした相対発現量を図７に示す。
その結果、一本鎖RNAを導入したときには、レポーター発現の抑制は観察されず、偽環状二重鎖を導入したときに、レポーター発現の抑制が観察された。このように、偽環状二重鎖RNAは、遺伝子抑制剤として有効である。
［実施例２］
本実施例では、eGFP遺伝子発現のノックダウンをアッセイ系とし、リンカーのヌクレオチドの個数が、偽環状二重鎖の効果に影響がないことを示す。
まず、下記配列を有するヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、センス鎖３通りとアンチセンス鎖３通りの合計９通りの偽環状二重鎖RNAを調製した。例えば、LG sense A1とLG anti AA C1からなる偽環状二重鎖RNAを偽環状Ａ１Ｃ１と称し、他も同様に命名した。
LG sense A1：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号８）
LG sense A3：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号９）
LG sense A6：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号１０）
LG anti AA C1：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１１）
LG anti AA C3：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１２）
LG anti AA C6：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１３）
調製物を12 % native PAGEで分離することで、偽環状二重鎖RNAが形成されていることを確認した。その結果を図８に示す。
次に、実施例１と同様にして、レポーター遺伝子の発現に対する、これらのヌクレオチド及び偽環状二重鎖RNAの効果を、レポーター遺伝子からのeGFPによる蛍光を観察することにより調べたところ、図９に示すように、ヌクレオチド単独及びluc428（陰性対照）では発現抑制が観察されず、偽環状二重鎖RNAおよびEGFP1（陽性対照）では発現抑制が観察された。
このように、偽環状二重鎖RNAのリンカー長は、遺伝子抑制効果に影響を及ぼさない。
本実施例では、eGFP遺伝子発現のノックダウンをアッセイ系とし、リンカーのヌクレオチドの個数が、偽環状二重鎖の効果に影響がないことを示す。
まず、下記配列を有するヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、センス鎖３通りとアンチセンス鎖３通りの合計９通りの偽環状二重鎖RNAを調製した。例えば、LG sense A1とLG anti AA C1からなる偽環状二重鎖RNAを偽環状Ａ１Ｃ１と称し、他も同様に命名した。
LG sense A1：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号８）
LG sense A3：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号９）
LG sense A6：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号１０）
LG anti AA C1：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１１）
LG anti AA C3：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１２）
LG anti AA C6：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１３）
調製物を12 % native PAGEで分離することで、偽環状二重鎖RNAが形成されていることを確認した。その結果を図８に示す。
次に、実施例１と同様にして、レポーター遺伝子の発現に対する、これらのヌクレオチド及び偽環状二重鎖RNAの効果を、レポーター遺伝子からのeGFPによる蛍光を観察することにより調べたところ、図９に示すように、ヌクレオチド単独及びluc428（陰性対照）では発現抑制が観察されず、偽環状二重鎖RNAおよびEGFP1（陽性対照）では発現抑制が観察された。
このように、偽環状二重鎖RNAのリンカー長は、遺伝子抑制効果に影響を及ぼさない。
［実施例３］ルシフェラーゼ遺伝子発現の長期ノックダウン
本実施例では、ルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンをアッセイ系とし、偽環状二重鎖の効果が長期的に続くことを示す。
実施例２で調製した偽環状二重鎖RNAを用い、実施例１と同様にレポーター遺伝子と偽環状二重鎖を細胞に導入した後、レポーターであるルシフェラーゼの発現を定量化した。なお、実施例１では２４時間後に発現を測定したが、本実施例では、その後、３日後と５日後にも発現を測定した。その結果を図１０に示す。
偽環状二重鎖RNAを用いても、luc428（陽性対照）と同様に、細胞導入して５日後でも、遺伝子発現抑制活性が観察された。
このように、偽環状二重鎖RNAの遺伝子発現抑制活性は、長期にわたって維持される。
本実施例では、ルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンをアッセイ系とし、偽環状二重鎖の効果が長期的に続くことを示す。
実施例２で調製した偽環状二重鎖RNAを用い、実施例１と同様にレポーター遺伝子と偽環状二重鎖を細胞に導入した後、レポーターであるルシフェラーゼの発現を定量化した。なお、実施例１では２４時間後に発現を測定したが、本実施例では、その後、３日後と５日後にも発現を測定した。その結果を図１０に示す。
偽環状二重鎖RNAを用いても、luc428（陽性対照）と同様に、細胞導入して５日後でも、遺伝子発現抑制活性が観察された。
このように、偽環状二重鎖RNAの遺伝子発現抑制活性は、長期にわたって維持される。
［実施例４］インターフェロン応答の誘導
哺乳動物細胞において、siRNAがインターフェロン応答を誘導し、非特異的に遺伝子発現を抑制することが知られている。インターフェロン応答が誘導された場合、ＳＴＡＴの発現が亢進し、かつリン酸化によって活性化される。本実施例では、偽環状二重鎖RNAがインターフェロン応答を誘導しないことを示す。
哺乳動物細胞において、siRNAがインターフェロン応答を誘導し、非特異的に遺伝子発現を抑制することが知られている。インターフェロン応答が誘導された場合、ＳＴＡＴの発現が亢進し、かつリン酸化によって活性化される。本実施例では、偽環状二重鎖RNAがインターフェロン応答を誘導しないことを示す。
まず、実施例１と同様の培養条件で、２４ウェルプレートに、ＨＥＫ２９３細胞を１ウェルあたり１５０００個となるように播種し、一晩培養した。各プレートにおいて、
（１）何も処理しない（陰性対照）
（２）luc428をリポフェクタミン3000で導入
（３）polyICをリポフェクタミン3000で導入（陽性対照）
（４）偽環状Ａ３Ｃ３をリポフェクタミン3000で導入
（５）リポフェクタミン3000のみ（RNAなし）（陰性対照）
（６）luc428のみ（リポフェクタミン3000なし）（陰性対照）
（７）偽環状Ａ３Ｃ３のみ（リポフェクタミン3000なし）（陰性対照）
の各処理を行った（ヌクレオチドは、それぞれ20 pmol）。そして、２４時間後にＰＢＳで細胞を洗浄した後で細胞を回収し、M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(PIERCE)を用いて抽出物を得て、ウエスタンブロッティングを行った。一次抗体として、抗ＳＴＡＴ１抗体（Stat1 Rabbit mAb(42H3)（ＣＳＴジャパン））及び抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体（Phospho-Stat1(Tyr701)Rabbit mAb(D4A7)（ＣＳＴジャパン））を用い、二次抗体として、Anti Mouse IgG, HRP-linked Whole Antibody（ＧＥヘルスケア）を用い、Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（ＧＥヘルスケア）を用いた化学発光によって、ＳＴＡＴ１の発現及びＳＴＡＴ１のリン酸化を検出したところ、図１１に示すように、偽環状二重鎖RNAも、luc428と同様に、インターフェロン応答の誘導活性は有さなかった。
このように、偽環状二重鎖RNAは、インターフェロン応答の誘導活性を有しない。
（１）何も処理しない（陰性対照）
（２）luc428をリポフェクタミン3000で導入
（３）polyICをリポフェクタミン3000で導入（陽性対照）
（４）偽環状Ａ３Ｃ３をリポフェクタミン3000で導入
（５）リポフェクタミン3000のみ（RNAなし）（陰性対照）
（６）luc428のみ（リポフェクタミン3000なし）（陰性対照）
（７）偽環状Ａ３Ｃ３のみ（リポフェクタミン3000なし）（陰性対照）
の各処理を行った（ヌクレオチドは、それぞれ20 pmol）。そして、２４時間後にＰＢＳで細胞を洗浄した後で細胞を回収し、M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(PIERCE)を用いて抽出物を得て、ウエスタンブロッティングを行った。一次抗体として、抗ＳＴＡＴ１抗体（Stat1 Rabbit mAb(42H3)（ＣＳＴジャパン））及び抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体（Phospho-Stat1(Tyr701)Rabbit mAb(D4A7)（ＣＳＴジャパン））を用い、二次抗体として、Anti Mouse IgG, HRP-linked Whole Antibody（ＧＥヘルスケア）を用い、Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（ＧＥヘルスケア）を用いた化学発光によって、ＳＴＡＴ１の発現及びＳＴＡＴ１のリン酸化を検出したところ、図１１に示すように、偽環状二重鎖RNAも、luc428と同様に、インターフェロン応答の誘導活性は有さなかった。
このように、偽環状二重鎖RNAは、インターフェロン応答の誘導活性を有しない。
本発明によって、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤を提供することができるようになった。
Claims (15)
- ５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチド。
- 第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び第（ｎ＋１）のポリヌクレオチドが、それぞれ２９個から９９個のヌクレオチドからなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 第２の領域および第（３ｎ＋２）の領域のうちの少なくとも一つが、０～６個のヌクレオチドからなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
- ｎ＝１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
- リボデオキシヌクレオチドで構成されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
- リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドで構成されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
- 第１のポリヌクレオチドを構成する前記ヌクレオチドが、修飾されているヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
- 前記修飾が、ポリエチレングリコール、葉酸、またはコレステロールである、請求項７に記載の第１のポリヌクレオチド。
- 請求項４に記載の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドペア。
- 請求項９に記載のポリヌクレオチドペアを含有するキット。
- ５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチド、及び３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの２個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチド。
- ｐ個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって（ｐは４以上の偶数）、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドの第３の領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ－２）の領域と第（３ｍ－１）の領域と第３ｍの領域を有する第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し（ｍは３以上（ｐ－１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチド。
- 請求項９に記載のポリヌクレオチドペアを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤。
- 請求項１１または１２に記載の偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤。
- 前記第１の領域と前記第３の領域が、それぞれ以下のいずれかである請求項１２に記載の遺伝子発現抑制剤。
（１）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（２）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
（３）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（４）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017565630A JPWO2017135383A1 (ja) | 2016-02-03 | 2017-02-02 | 偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤 |
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|---|---|---|---|
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| PCT/JP2017/003837 WO2017135383A1 (ja) | 2016-02-03 | 2017-02-02 | 偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤 |
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|---|---|
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05501498A (ja) * | 1989-11-21 | 1993-03-25 | ダイナル・エイ・エス | クローニング方法及びキット |
| JP2003515149A (ja) * | 1999-11-26 | 2003-04-22 | キュラジェン コーポレイション | 核酸プローブアレイ |
| WO2011103394A2 (en) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Agave Pharma Inc. | Methods for gene inhibition |
| WO2015083001A2 (en) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Vanadis Diagnostics | Nucleic acid probe and method of detecting genomic fragments |
-
2017
- 2017-02-02 JP JP2017565630A patent/JPWO2017135383A1/ja active Pending
- 2017-02-02 WO PCT/JP2017/003837 patent/WO2017135383A1/ja active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05501498A (ja) * | 1989-11-21 | 1993-03-25 | ダイナル・エイ・エス | クローニング方法及びキット |
| JP2003515149A (ja) * | 1999-11-26 | 2003-04-22 | キュラジェン コーポレイション | 核酸プローブアレイ |
| WO2011103394A2 (en) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Agave Pharma Inc. | Methods for gene inhibition |
| WO2015083001A2 (en) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Vanadis Diagnostics | Nucleic acid probe and method of detecting genomic fragments |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ABE, N. ET AL.: "Dumbbell-shaped nanocircular RNAs for RNA interference", J. AM. CHEM. SOC., vol. 129, 2007, pages 15108 - 15109, XP008120979, DOI: doi:10.1021/ja0754453 * |
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|---|---|
| JPWO2017135383A1 (ja) | 2018-12-06 |
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