JP2000517192A - Dnaへの特徴付け - Google Patents
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- 【特許請求の範囲】 1.cDNAを特徴付けるための方法において、 (a)各cDNA、またはそれらから単離された断片から、各々が、予め決められた 長さの未知の配列をもつ粘着末端を含む第一と第二の部分断片でありかつ、第一 の断片が該末尾をもつものを作製することを目的として、一つ以上のcDNAまたは それらから単離された断片の集団であり、そのうちそれぞれが、mRNAの3'ポリ- A側末端に相補的な鎖及び末尾部分をもつものである集団を含むサンプルを、第 一のサンプリング用エンドヌクレアーゼによって、末尾に隣接する基準部位から の既知の置換を行なう第一のサンプリング部位で切断すること、 (b)第一の部分断片または第二の部分断片を、それらの粘着末端配列によって 部分集団に分類し、また、各部分集団の粘着末端配列を第一の粘着末端として記 録すること、 (c)各部分断片から、予め決められた長さの未知の配列をもつ第二の粘着末端 を含む、さらに別の部分断片を作製するために、第一のサンプリング用エンドヌ クレアーゼと同じか、または別の第二のサンプリング用エンドヌクレアーゼによ って、第一のサンプリング部位から既知の置換を行なう第二のサンプリング部位 で各部分集団中の部分断片を切断すること、および、 (d)各第二の粘着末端の配列を決定することを含む、cDNAを特徴付けるための 方法において、各部分断片の有する第一と第二の粘着末端配列が集合したものの 長さが6個から10個であり、また、基準部位及び第一と第二の粘着末端の配列及 び相対的位置が、そのcDNAまたはその各cDNAを特徴付けている方法。 2.第一のサンプリング用エンドヌクレアーゼで切断されたサンプルが、一つ以 上のcDNAの集団を含むサンプルを、制限酵素で切断し、その制限部位が、基準部 位である断片を単離して作出されたcDNAの単離断片を含む、請求項1記載の方法 。 3.第一のサンプリング用エンドヌクレアーゼが第一の認識部位に結合して、 制限酵素の認識部位から予め定められた置換位置にある、第一のサンプリング部 位で切断する、請求項2記載の方法。 4.第一の認識部位が、単離された断片の制限部位にハイブリダイズする第一の アダプターオリゴヌクレオチドの中に備えられている、請求項3記載の方法。 5.制限酵素が、4塩基対の結合部位を認識する、請求項2ないし4のいずれか に記載の方法。 6.第二の部分断片が、ステップ(b)で分類される、請求項2ないし5のいずれか に記載の方法。 7.第一のサンプリング用エンドヌクレアーゼが、基準部位に結合して、基準部 位から予め決められた置換位置にある第一のサンプリング部位で切断を行なう、 請求項1記載の方法。 8.第一のサンプリング用エンドヌクレアーゼが、II型制限酵素を含む、上記請 求項のいずれかに記載の方法。 9.第二のサンプリング用エンドヌクレアーゼが、第二の認識部位に結合して、 第一のサンプリング部位から予め決められた置換位置にある第二のサンプリング 部位で切断を行なう、上記請求項のいずれかに記載の方法。 10.第二のサンプリング用エンドヌクレアーゼが、II型制限酵素を含む、請求項 9記載の方法。 11.第二の認識部位が、第一の粘着末端にハイブリダイズする第二のアダプター オリゴヌクレオチドの中に備えられている、請求項9または10記載の方法。 12.cDNAの尾部、または、それらの断片が、固相基体に結合している、上記請求 項のいずれかに記載の方法。 13.各部分断片の有する第一と第二の粘着末端配列が集合したものの長さが8個 である、上記請求項のいずれかに記載の方法。 14.各粘着末端の長さが4個である、請求項13記載の方法。 15.部分断片を分類するステップ(b)に、部分断片をサンプルのアレイに分割し て、各サンプルを別々の容器に入れること;サンプルのアレイを、固相 親和性基体のそれぞれが第一の粘着末端として予め定められた同じ長さの独自の 塩基配列をもつている固相親和性基体のアレイと接触させて、各サンプルが、可 能な塩基配列の一つと接触し、また、互いに相補的な、ユニークな塩基配列と第 一の粘着末端との間だけでハイブリダイゼーションが起こるように、サンプルの アレイを、予め定められた長さのあらゆる可能な塩基配列に接触するようにする こと;および、ハイブリダイズしなかった材料を容器から洗い流すことが含まれ る、上記請求項のいずれかに記載の方法。 16.各第二の粘着末端配列を決定するステップ(d)が、ステップ(c)から生じたさ らなる部分断片を単離すること及び、これらのさらなる断片を、各アダプターオ リゴヌクレオチドが、標識及び第二の粘着末端と同じ、予め定められた長さのユ ニークな塩基配列をもっておりかつ、アレイが、予め決められた長さの、あらゆ る可能な塩基配列を含んでいるような該アダプターオリゴヌクレオチドのアレイ と、あるサイクルで接触させることを含み、該サイクルには、このアレイの各ア ダプターオリゴヌクレオチドと単離された部分断片とがハイブリダイズする条件 下で連続的に接触させること、ハイブリダイズしなかったアダプターオリゴヌク レオチドを除去すること、および、標識を検出することによって、ハイブリダイ ズしたアダプターオリゴヌクレオチドが存在するのを判定することが含まれ、ア レイ中のアダプターを全てテストし終わるまで、このサイクルを繰り返すことを 含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。 17.部分断片を分類するステップ(b)が、(i)ユニークな第一の粘着末端をもつ 部分集団のそれぞれを、アレイ中の同定可能な位置でハイブリダイズさせるため に、第一の粘着末端として予め定められた同じ長さのユニークな塩基配列をもっ ていて、アレイ中の位置によって同定することができるオリゴヌクレオチドセッ トで、予め定められた長さの可能な塩基配列がすべて、そのアレイの中に存在し ているようなオリゴヌクレオチドセットのアレイを含むハイブリダイゼーション 用アレイと、該部分断片を結合させること、および(ii)第一の粘着末端配列を 同定するための位置を決定す ることを含む、請求項1ないし14のいずれかに記載の方法。 18.ステップ(c)で切断された部分断片が、その過程によってさらに作出される 部分断片がハイブリダイゼーション用アレイに結合されたままのものであるよう 、ハイブリダイゼーション用アレイに結合しているものであり、各第二の粘着末 端配列を決定するステップ(d)には、さらなる部分断片を、ハイブリダイゼーシ ョンを行なう条件下で、各アダプターオリゴヌクレオチドが、標識及び第二の粘 着末端と同じ予め定められた長さのユニークな塩基配列を有し、かつアレイが予 め決められた長さのあらゆる可能な塩基配列を含んでいるようなアダプターオリ ゴヌクレオチドのアレイと接触させること、ハイブリダイズしなかったアダプタ ーオリゴヌクレオチドを除去すること、および、標識を検出することによって、 ハイブリダイズしたアダプターオリゴヌクレオチドの位置を決めることが含まれ る、請求項17記載の方法。 19.上記請求項のいずれかに記載の方法にしたがって、cDNAを特徴付けることを 含む、サンプル中のcDNAを同定するための方法において、サンプル中のそのcDNA またはその各cDNAを同定することを目的として、上記方法によって得られた基準 部位と第一ならびに第二の粘着末端の配列および相対的位置を、既知のcDNAの基 準部位と第一ならびに第二の粘着末端の配列および相対的位置と比較する方法。 20.請求項1から14のいずれかに記載の方法を実施することを含む、サンプル中 の一つ以上の特定のcDNAをアッセイするための方法において、基準部位が予め決 められており、分類ステップ(b)における第一の粘着末端配列のそれぞれが、予 め決められている第一の粘着末端配列であり、ステップ(d)における第二の粘着 末端配列のそれぞれが、予め決められている第二の粘着末端配列のためのアッセ イによって決定され、基準部位及び予め決められている第一ならびに第二の粘着 末端の相対的位置によって、その各特定のcDNAまたは各特定のcDNAが特徴づけら れる、アッセイするための方法。 21.基準部位と第一ならびに第二の粘着末端配列が、一つ以上の既知の標的 cDNAに一致する配列を選択することによって予め決定されている、請求項20記載 の方法。
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