CN101942509B

CN101942509B - 检测两段未知的dna片段中共有/相同的dna序列的方法

Info

Publication number: CN101942509B
Application number: CN 201010198829
Authority: CN
Inventors: 卓超; 黎晓强
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF GUANGZHOU MEDICAL SCHOOL
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF GUANGZHOU MEDICAL SCHOOL
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2030-06-10
Also published as: CN101942509A

Abstract

本发明涉及检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于：首先对二个目标DNA片段进行酶切后分别加入能同酶切片段的5’端结合的接头之一和接头之二，然后将加入不同接头的酶切片段进行杂交、退火，再加入酶补齐双链DNA片段缺口，最后加入针对前述二个接头设计的引物进行PCR扩增，将所述二个目标DNA片段中一致的序列扩增出来。通过以上的处理，只有二个目标序列中一致的序列才能被扩增出来。再对扩增后的产物再进行测序，可以知道具体的核苷酸序列。本发明利用了PCR反应链内退火优于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，在生物、医学、遗传等广阔的领域具有较高的实用价值。具有操作简便、普通的实验室均可进行的特点。

Description

检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法

技术领域

本发明涉及一种检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，适用于发现和扩增两段未知的DNA片段中共有的、一致的DNA序列。属于基因技术领域。

背景技术

目前，对于两段DNA片段中的共有、一致序列的发现，常用的方法是对两个片段分别测序，然后比对两段碱基序列，发现其共有的一致序列。该方法缺点是：

1、必须对两段DNA片段进行全部测序后才能比对。目前的测序技术一个反应可以测约800个碱基，对于大于800个碱基的序列，必须根据已测的序列设计引物，然后进行多次反应，拼接结果得到全部序列。这种方法对于有特殊结构的DNA片段，以及比较大的DNA片段(例如＞10kb)不能很好的得到结果，无法比对。

2、很多时候研究者仅希望知道两段DNA片段之间的共有、一致的序列，并不希望知道它们的全序列。

3、对于大片段DNA或者是整个染色体组的比较，不仅费时、费力，而且相当的不经济。其他的方法如杂交技术，可以知道两个DNA片段间是否有共有序列，但序列的具体内容就无法知道。目前广泛运用的DNA芯片技术也可以用于研究，但该方法同测序一样，运用范围非常受限、而且价格昂贵。

发明内容

本发明的目的，是为了了解两段未知的DNA序列中共有的、一致的核苷酸序列，提供一种检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法。

本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于：首先对二个目标DNA片段进行酶切后分别加入能同酶切片段的5’端结合的接头之一和接头之二，然后将加入不同接头的酶切片段进行杂交、退火，再加入酶补齐双链DNA片段缺口，最后加入针对前述二个接头设计的引物进行PCR扩增，将所述二个目标DNA片段中一致的序列扩增出来。

通过以上的处理，只有二个目标序列中一致的序列才能被扩增出来。再对扩增后的产物再进行测序，可以知道具体的核苷酸序列。

本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到：

本发明的进一步的实施方案，其特征是：

1)利用酶切频率较高的限制性内切酶如Rsal等对需要比较的DNA片段A和片段B进行酶切，获得大小在300-600bp的酶切片段；

2)分别对二个酶切产物加入接头之一和接头之二，用T4连接酶进行连接，所述接头为特殊设计，5’端的核苷酸去掉了磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进行连接；

3)将两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在92℃～96℃条件下变性3～7分钟，然后在55℃～96℃条件下退火；

4)将退火后的产物用聚合酶补平两端的缺口，加入针对二个不同的接头设计的引物进行PCR扩增；仅有片段A和片段B中一致的、共有序列能够得到指数扩增；

5)通过指数扩增，检测出不同DNA片段中一致、共有的序列。

本发明的进一步的实施方案，其特征是：所述接头之一核苷酸序列如序列表SEQ ID№：1所示，所述接头之二核苷酸序列如序列表SEQ ID№：2所示，所述接PCR扩增引物序列如序列表SEQ ID№：3所示。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用了PCR反应链内退火优于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，在生物、医学、遗传等广阔的领域具有较高的实用价值。而且该方法操作简便，对实验条件要求不高，普通的实验室均可进行。

2、采用本发明可以对不同来源，不同大小的DNA片段的共有序列进行研究，不需要预先获知全部的核苷酸序列。

附图说明

图1是本发明具体实施例1的检测过程示意图。

具体实施方式

具体实施例1：

下面结合图例具体说明本发明的原理及步骤：

参照图1，本实施例的具体方法步骤如下：

1)利用酶切频率较高的限制性内切酶如Rsa l等对需要比较的DNA片段A和片段B进行酶切，获得大小在300-600bp的二个酶切片段，参照图1中的①处所示；

2)分别对前述二个酶切片段加入接头之一、接头之二，用T4连接酶进行连接，所述接头为特殊设计，即5’端的核苷酸去掉了磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进行连接；参照图1中的②处所示；

3)将所述两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在94℃条件下变性5分钟，然后在55℃条件下退火；如果片段A和片段B中存在共同的或一致的序列，经过处理后，就会出现图1中③处所示的a、b、c三种结合；如果没有共同的或一致的序列，即仅会出现图1中③处所示的a和b二种结合；

4)将退火后的片段A和片段B用聚合酶补平两端的缺口，加入针对二个不同的接头设计的引物进行PCR扩增；若片段A和片段B中存在一致的、共有序列，即能够得到指数扩增，如图1中④处的c所示；若片段A和片段B中不存在一致的、共有序列，由于“补平”后两段序列两端呈现“回文结构”，在PCR退火的过程的中形成“锅柄”样结构，即不能得到指数扩增；

5)通过指数扩增，检测出不同DNA片段中一致、共有的序列。

通过以上的步骤，达到了指数扩增不同DNA片段中一致、共有的序列的目的。再将PCR产物进行测序，就可以明确这段序列的核苷酸序列。

本实施例中，所述的酶切、退火、“补平”方法，可以采用常规的酶切、退火、“补平”技术，PCR扩增。

所使用的接头序列可以采用特殊的设计，例如：

使用的接头之一的核苷酸序列：

5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’

3’-GGCCCGTCCA-5’

使用的接头之二的核苷酸序列：

5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’

3’-GCCGGCTCCA-5’

其中，接头之一和接头之二的5’端的核苷酸均去掉磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进行连接。所述接头序列也可以根据实际的需求做出调整，例如加入酶切位点等。

本实施例中使用的PCR扩增引物序列为：

P1：5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’

P2：5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’

除了可以使用上述的接头之一、接头之二的核苷酸序列和PCR扩增引物序列外，本发明还可以另行设计其他接头核苷酸序列和PCR扩增引物序列。

本发明的应用实例1：

用于研究质粒的相同序列。

临床来源的2个菌株中各携带一个质粒，研究者希望得知到这两个质粒中是否存在有相同序列。运用本方案中的方法和步骤，如果2个质粒存在有相同的序列，则该序列将被指数级的扩增出来，如果没有相同的序列，则没有明显的扩增产物。对扩增出的产物测序可明确该相同序列的核苷酸排列情况。

本发明的应用实例2：

构建cDNA文库中的运用。

研究者在比较2个的菌株中的表达情况时，除了关心表达的不同外，同时也关心哪些基因的表达是相同的。提取全菌的RNA并逆转录成cDNA后，运用本方案中的方法和步骤，相同表达的基因将被指数级的扩增出来，再通过其测序获得核苷酸序列，用这些序列构建出2个菌的相同表达的cDNA文库。

本发明的应用实例3：

整合子中基因盒的研究。

整合子中通常包含有多个“基因盒”，而“基因盒”的数量和种类存在差异。当研究者希望知道2个整合子中的相同的“基因盒”的种类和数量，就可以运用运用本方案中的方法和步骤，将2个整合子中相同的“基因盒”的序列指数级的扩增出来，再测序即可知道是那种“基因盒”以及有几种相同的”基因盒”。

其他具体实施例：

本发明其他具体实施例的特点是：

将具体实施例1的第3步修改为：3)将两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在92℃条件下变性7分钟，然后在53℃条件下退火；或者首先在96℃条件下变性3分钟，然后在57℃条件下退火；如果片段A和片段B中有一致的序列，进过处理后，会出现图1中③所示的a、b、c等3种结合；如果没有一致的序列，仅会出现a和b的2种结合；其余同具体实施例1。

序列表

<110>广州医学院第一附属医院；广州呼吸疾病研究所

<120>检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法

<160>1

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>接头之一的核苷酸序列，用于检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列。

<400>1

5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’

3’-GGCCCGTCCA-5’

<210>2

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>接头之二的核苷酸序列，用于检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列。

<400>2

5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’

3’-GCCGGCTCCA-5’

210>3

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物序列，用于检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的PCR扩增。

<400>3

P1：5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’

P2：5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’

Claims

1.检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于：首先对二个目标DNA片段进行酶切后分别加入能同酶切片段的5’端结合的接头之一和接头之二，然后将加入不同接头的酶切片段进行杂交、退火，再加入酶补齐双链DNA片段缺口，最后加入针对前述二个接头设计的引物进行PCR扩增，将所述二个目标DNA片段中一致的序列扩增出来；所述接头之一的核苷酸序列如序列表SEQ ID№：1所示，所述接头之二的核苷酸序列如序列表SEQ ID№：2所示，所述接PCR扩增引物序列如序列表SEQ ID№：3所示。

2.根据权利要求1所述的检测两段未知的DNA片段中共有/相同的DNA序列的方法，其特征在于：

1）利用酶切频率较高的限制性内切酶Rsal对需要比较的DNA片段A和片段B进行酶切，获得大小在300-600bp的酶切片段；

2）分别对二个酶切产物加入接头之一和接头之二，用T4连接酶进行连接，所述接头为特殊设计，5’端的核苷酸去掉了磷酸基团，保证了接头仅能与酶切片段的5’进行连接；

3）将两个连接了不同接头的酶切片段混合，首先在92℃～96℃条件下变性3～7分钟，然后在55℃～96℃条件下退火；

4）将退火后的产物用聚合酶补平两端的缺口，加入针对二个不同的接头设计的引物进行PCR扩增；仅有片段A和片段B中一致的、共有序列能够得到指数扩增；

5）通过指数扩增，检测出不同DNA片段中一致、共有的序列。