CN111041026B - 一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高通量测序技术领域,具体涉及一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法。本发明的核酸接头包括接头1和接头2,所述接头1为双链不等长寡核苷酸,包括长链和短链,所述长链的5’端为磷酸化修饰,所述长链的3’端和所述短链的3’端为能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰;所述接头2为单链寡核苷酸;所述接头2包含与所述接头1的长链5’端的互补区。该接头可有效减少接头自连的发生,实现了在接头连接后无需纯化可直接进行PCR扩增,构建的文库无明显的接头二聚体污染,有效降低了DNA样本的损失,提高了文库构建的效率和质量。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域,具体涉及一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法。
背景技术
随着测序技术的发展,基因组测序已经成为一种常规科学研究和临床诊断技术。高通量测序技术(下一代测序技术,NGS)通过在高密度芯片上实现大规模平行测序,具有数据产量高、单位数据成本低的特点,极大地推动了测序技术的实际应用。NGS测序过程中需要对样本DNA进行繁杂的文库构建步骤,文库构建过程中的DNA损失问题会影响测序质量,尤其是面对低投入量时,如何有效减少文库构建过程中多步纯化带来的DNA损失,充分利用投入DNA的遗传信息,提高DNA文库构建的成功率,是高通量测序技术改进和优化的关键要素之一。
目前,高通量测序技术常用的文库构建流程如下:(1)对全基因组DNA进行片段化(可选);(2)对片段化产物进行末端修复加“A”;(3)对加“A”产物进行接头连接;(4)对连接产物进行纯化收集;(5)对收集的接头连接产物进行PCR扩增;(6)对PCR扩增产物进行纯化收集。以上6个步骤中存在2步纯化操作,步骤繁琐;多次纯化耗时长、成本高;并且多步纯化不可避免地增加了DNA样本的损失。但是,若简化纯化步骤,例如:省略步骤(4)的纯化步骤直接进行步骤(5)的PCR过程,则会产生明显的接头二聚体等污染,影响后续的文库质量。因此,开发高效的接头,减少接头二聚体的产生对于提高文库构建效率和质量具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题,本发明的目的是提供一种高通量测序用核酸接头、利用该核酸接头的接头连接方法以及利用该核酸接头进行文库构建和高通量测序的方法。
在高通量测序中,不同测序平台使用的接头序列往往不同,但受接头的一般序列结构和长度的影响,在将DNA模板与接头连接过程中,接头之间自连的现象很难避免。本发明通过设计多种具有不同结构组成和末端修饰方式的接头,将其进行对比、组合和筛选,获得了一种性能优异的接头结构,其为双接头,其中一个接头是双链不等长寡核苷酸,另一个接头是单链寡核苷酸,两个接头的末端修饰采用特定的修饰方式。利用该接头进行文库构建能够有效降低接头之间的自连,实现在接头连接后可省略纯化步骤直接进行PCR扩增。
具体地,本发明的技术方案如下:
本发明提供一种核酸接头,其包括接头1和接头2,所述接头1为双链不等长寡核苷酸,包括长链和短链,所述长链的5’端为磷酸化修饰,所述长链的3’端和所述短链的3’端为能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰;所述接头2为单链寡核苷酸;所述接头2包含所述接头1的长链5’端的互补区和所述接头1的长链非互补区。
上述具有特定结构和特定末端修饰的接头1和接头2配合作用能够在有效减少接头自连,尤其是,长链3’端和短链3’端的修饰能够与双接头结构更好地配合,在更高效地降低接头自连的同时保证接头与DNA模板之间的连接效率,相较于仅进行长链的5’端和短链的3’端修饰具有更优的降低接头自连的效果。
本发明的核酸接头的设计示意图如图1所示。
优选地,所述接头1的长链为20~65bp;短链为12~20bp。
优选地,所述接头2的长度为25~35bp,其中,所述接头1的长链5’端互补区的长度为7~12bp。
通过对接头的长度以及互补区的长度设计,在有效降低接头自连率的同时更好地保证了接头与DNA模板之间的连接效率。
本发明中,能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰可为现有技术公开的能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰方式的任一种,优选为双脱氧修饰或NH2修饰。更优选为双脱氧修饰。
在上述接头结构和修饰方式的基础上,本发明针对不同的测序平台,开发了不同的核酸接头,所述核酸接头的序列为如下任一种:
(1)接头1的长链序列如下:
SEQ ID NO.1:AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAGGACGGAATCCAACTCCTTGGCTCACA;5’末端为磷酸化修饰,3’末端为双脱氧修饰;
接头1的短链序列如下:
SEQ ID NO.2:GGCCTCCGACTT;3’末端为双脱氧修饰;
接头2的序列如下:
SEQ ID NO.3:GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
(2)接头1的长链序列如下:
SEQ ID NO.4:GATCGGAAGAGCACACGTCT;5’末端为磷酸化修饰,3’末端为双脱氧修饰;
接头1的短链序列如下:
SEQ ID NO.5:GCTCTTCCGATCT;3’末端为双脱氧修饰;
接头2的序列下:
如SEQ ID NO.6:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
上述(1)、(2)中的接头序列可分别用于华大和Illumina测序平台的文库构建和测序。上述(1)、(2)中的接头序列为本发明经优化筛选得到,接头序列能够与接头结构和末端修饰很好地配合,可有效减少接头自连,实现在接头连接步骤后无需纯化即可进行PCR扩增,降低了样本DNA的损失,提高了文库构建效率和质量。
进一步地,本发明提供所述核酸接头在高通量测序文库构建中的应用。
本发明提供一种高通量测序文库构建试剂盒,其包含所述核酸接头。
优选地,所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA连接酶、dNTP。
进一步地,本发明提供一种接头连接方法,其为:将DNA测序模板与所述核酸接头进行连接。
优选地,所述接头连接方法包括:将所述DNA测序模板品与接头1连接后,通过高温变性使接头1中的短链脱离,在降温复性过程中使接头2与接头1中的长链互补配对,再通过连接反应连接接头2。通过上述两步连接更好地降低了接头之间自连的概率。
优选地,所述接头连接方法中,将所述DNA测序模板与接头1连接后,还包括如下步骤:在接头1的连接产物中加入接头2,依次在85℃~90℃反应3~5min;在30℃~40℃反应3~5min,在16℃~20℃反应2~3min;再进行连接反应。
更优选地,所述接头1和所述接头2的用量为至终浓度为0.1~0.4μmol/L。
作为本发明的一种优选方案,所述接头连接包括如下步骤:
(1)将经末端修复和加A的DNA测序模板与接头1连接,50μl反应体系如下:经末端修复和加A的DNA测序模板20μl,T4 DNA连接酶1μl,2×连接缓冲液25μl,接头1(10μM)2μl,水补足50μl;反应程序如下:20℃,15min;
(2)将步骤(1)的连接产物与接头2连接:52μl反应体系如下:步骤(1)的连接产物50μl,接头2(10μM)2μl;反应程序如下:85℃5min,35℃5min,20℃2min;在反应体系中加入2μl T4 DNA连接酶,再于20℃反应15min。
本发明提供一种高通量测序文库构建方法,其为:利用所述核酸接头或所述接头连接方法将DNA测序模板进行接头连接。
优选地,所述文库构建方法包括如下步骤:
(1)对DNA测序模板进行末端修复和加A;
(2)利用所述核酸接头或所述接头连接方法将步骤(1)的加A产物进行接头连接;
(3)对步骤(2)的接头连接产物进行PCR扩增。
优选地,所述DNA测序模板在进行接头连接前先进行末端修复和加A。
上述步骤(2)接头连接后,无需纯化,可直接进行步骤(3)的PCR扩增。
本发明提供一种高通量测序方法,包括:利用所述高通量测序文库构建方法进行文库构建,将构建的文库进行高通量测序。
本发明的有益效果在于:本发明提供的核酸接头可有效减少接头自连的发生,实现了在接头连接后无需纯化可直接进行PCR扩增,构建的文库无明显的接头二聚体污染,且能够保证较高的文库产量。利用本发明的核酸接头进行文库构建能够减少纯化步骤,降低DNA样本损失,保证了遗传信息的高效获得,提高了文库构建效率和质量。本发明的接头可适用于多个测序平台(华大、illumina、Thermo Fisher等)的文库构建和测序,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明发明内容部分核酸接头设计示意图,其中,Adaptor1代表接头1,Adaptor2代表接头2,Adaptor1.1代表接头1的长链,Adaptor1.2代表接头1的短链,P代表磷酸化修饰,ddOH代表双脱氧末端修饰。
图2为本发明实施例3中文库构建的流程示意图,其中,End-repair&A-tailing代表末端修复和加A;Adaptor1-ligation和Adaptor2-ligation分别代表接头1和接头2连接。
图3A、图3B、图3C分别为本发明实验例1中对比例1、实施例2和对比例2的样本1的文库质量检测峰图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1高通量测序用接头(1)
本实施例提供了一种高通量测序用接头,由接头1和接头2组成,接头1为双链不等长寡核苷酸,其长链序列如SEQ ID NO.1所示,短链序列如SEQ ID NO.2所示,长链5’端为磷酸化修饰,长链的3’端和短链的3’端为双脱氧修饰;接头2为单链寡核苷酸,序列如SEQ IDNO.3所示,接头2中含有与接头1的长链5’端的互补区。
上述高通量测序接头可用于华大测序平台的测序文库构建。
实施例2高通量测序用接头(2)
本实施例提供了一种高通量测序用接头,由接头1和接头2组成,接头1为双链不等长寡核苷酸,其长链序列如SEQ ID NO.4所示,短链序列如SEQ ID NO.5所示,长链5’端为磷酸化修饰,长链的3’端和短链的3’端为双脱氧修饰;接头2为单链寡核苷酸,序列如SEQ IDNO.6所示,接头2中含有与接头1的长链5’端的互补区。
上述高通量测序接头可用于Illumina测序平台的测序文库构建。
实施例3测序文库的构建
本实施例以cfDNA为测序样本(设置3个样本的平行实验),利用实施例1的接头进行测序文库构建,其流程示意图如图2所示,具体方法如下:
1、末端修复及加A:cfDNA的投入量为2ng,反应体系如表1所示;反应程序:65℃,20min。
表1末端修复及加A反应体系
试剂 | 体积(μl) |
cfDNA | 15 |
Taq酶 | 1 |
10×反应缓冲液 | 2 |
dNTPS | 1 |
H<sub>2</sub>O | 1 |
2、接头连接:分两步进行分别进行接头1和接头2的连接,具体如下:
将步骤1得到的末端修复及加A产物与接头1连接,反应体系如表2所示;反应程序:20℃,15min。
表2接头1的连接反应体系
试剂 | 体积(μl) |
末端修复及加A产物 | 20 |
T4 DNA连接酶 | 1 |
2×连接缓冲液 | 25 |
接头1(10μM) | 2 |
H<sub>2</sub>O | 2 |
在接头1的连接产物中加入接头2,接头2的连接反应体系如表3所示;反应程序如表4所示。
表3接头2的连接反应体系
试剂 | 体积(μl) |
接头1连接产物 | 50 |
接头2 | 2 |
T4 DNA连接酶 | 2 |
表4接头2的连接程序
温度(℃) | 时间(min) |
85℃ | 5min |
35℃ | 5min |
20℃ | 2min |
在上述接头2的连接反应体系中补充加入2μl T4 DNA连接酶,在20℃反应15min。
3、PCR扩增:对步骤2的接头连接产物直接进行PCR扩增,无需纯化,PCR扩增的反应体系如表5所示,反应程序如表6所示。
表5PCR扩增体系
试剂 | 体积(μl) |
接头连接产物 | 54 |
引物混合物 | 2 |
2×Hifi mix | 50 |
表6 PCR反应程序
4、PCR扩增产物纯化:加入与PCR扩增产物等体积的Ampure XP磁珠磁珠进行纯化,30μl双蒸水洗脱。
对比例1
本对比例以cfDNA为测序样本,采用华大测序平台常用的接头(接头1的序列如SEQID NO.1所示,接头2的序列如SEQ ID NO.3所示)进行测序文库的构建。
与实施例3的区别仅在于:
步骤2的接头连接:采用常规接头(接头1的序列如SEQ ID NO.1所示,接头2的序列如SEQ ID NO.3所示)进行接头连接,反应体系如表2所示,反应程序:20℃,15min。
在步骤2和步骤3之间设置纯化步骤:采用0.8倍体积的Ampure XP磁珠对接头连接产物进行纯化,20μl双蒸水洗脱。
对比例2
本对比例以cfDNA为测序样本,采用华大测序平台常用的接头(接头1的序列如SEQID NO.1所示,接头2的序列如SEQ ID NO.3所示)进行测序文库的构建。
与实施例3的区别仅在于:
步骤2的接头连接:采用常规接头(接头1的序列如SEQ ID NO.1所示,接头2的序列如SEQ ID NO.3所示)进行接头连接,反应体系如表2所示,反应程序:20℃,15min。
实验例1测序文库的产量和质量检测
对实施例3以及对比例1和2构建得到的文库进行浓度测定(实施例3以及对比例1和2文库的终体积均为30μl),结果如表7所示,结果表明,实施例3的文库产出与对比例1无显著差异,满足本次测试的实验目的,对比例2的文库产出浓度较高。
表7文库浓度检测
样本名称 | 对比例1(ng/μl) | 实施例3(ng/μl) | 对比例2(ng/μl) |
样本1 | 23.2 | 23.8 | 26.8 |
样本2 | 22.5 | 24.3 | 27.6 |
样本3 | 20.3 | 18.5 | 23.5 |
利用LabChip GX Touch对文库质量进行检测,对比例1、实施例3和对比例2中样本1的文库峰图质控结果如图3A、图3B和图3C所示,结果显示,对比例1(图3A)和实施例3(图3B)构建的文库峰形单一,无明显接头二聚体杂带,满足上机测序需求;并且,实施例3构建的文库能够检测到120bp-200bp文库,而对比例1则无法检测到该范围的文库,可见实施例1构建文库的测试检测范围明显优于对比例1。对比例2(图3C)构建的文库则呈现较多的小片段,未能达到上机需求。
综上所述,利用本发明实施例1的接头进行接头连接,无需进行接头连接产物的纯化,构建得到的文库中没有接头二聚体污染,且减少了DNA模板的损失,提高了文库质量,且能够保证较高的文库产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京优迅医学检验实验室有限公司
<120> 一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法
<130> KHP191117167.4
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca aggacggaat ccaactcctt ggctcaca 58
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcctccgac tt 12
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatcggaaga gcacacgtct 20
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcttccga tct 13
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
Claims (3)
1.一种核酸接头,其特征在于,包括接头1和接头2,所述接头1为双链不等长寡核苷酸,包括长链和短链,所述长链的5’端为磷酸化修饰,所述长链的3’端和所述短链的3’端为能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰;所述接头2为单链寡核苷酸;所述接头2包含所述接头1的长链5’端的互补区和所述接头1的长链非互补区;
所述接头1的长链为20~65bp;短链为12~20bp;
所述接头2的长度为25~35bp,其中,所述接头1的长链5’端的互补区的长度为7~12bp;
所述能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰为双脱氧修饰。
2.权利要求1所述的核酸接头在高通量测序文库构建中的应用。
3.一种高通量测序文库构建试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的核酸接头。
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CN111041026A (zh) | 2020-04-21 |
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