JP7203276B2

JP7203276B2 - メチル化されたｄｎａの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法及びキット

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Publication number: JP7203276B2
Application number: JP2022502317A
Authority: JP
Inventors: 楊林; 張艷艷; 王其偉; 盧佳; 陳芳; 蒋慧
Original assignee: MGI Tech Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2023-01-12
Anticipated expiration: 2039-05-21
Also published as: EP3950956A1; US20220056519A1; EP3950956A4; CN113811618B; WO2020232635A1; CN113811618A; JP2022525373A

Description

本発明は、遺伝子シーケンシング分野に関し、具体的に、メチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法及びキットに関する。

ＤＮＡメチル化はエピジェネティックな調節修飾であり、塩基配列を変えることなく、タンパク質合成の調節に関与する。人間にとって、ＤＮＡメチル化は非常に巧妙な化学修飾であり、肉親の心配、体の老化、喫煙、アルコール依存症、さらには肥満さえも、メチル化によってゲノムに忠実に記録される。ゲノムは日記のようなもので、メチル化は、人体の経験を記録する文字として使用される。ＤＮＡメチル化は重要なエピジェネティックマーカー情報であり、全ゲノム範囲内のすべてのＣサイトのメチル化レベルデータを取得することは、エピジェネティックの時空間特異性の研究にとって重要な意味がある。次世代のハイスループットシーケンシングプラットフォームに基づいて、全ゲノムのＤＮＡメチル化レベルマップを描き、特定の種の高精度なメチル化修飾パターンの分析を行うことは、エピゲノミクス研究において画期的な重要性を持ち、細胞分化や組織発生などの基本的なメカニズムの研究、動植物の育種、人間の健康や病気の研究の基礎を築くことは確実である。

全ゲノムメチル化シーケンシングＷＧＢＳ（ＷｈｏｌｅＧｅｎｏｍｅＢｉｓｕｌｆｉｔｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、即ち全ゲノムバイサルファイトシーケンシングは、生物学的メチル化を研究するために最も一般的に使用される手段であり、すべてのメチル化サイトをカバーすることができ、より包括的なメチル化プロファイルを取得することができる。しかし、ハイスループットシーケンシングでは多くの課題に直面している。１、バイサルファイト処理はＤＮＡを一本鎖にし、深刻な損傷を引き起こす。２、バイサルファイト処理後の非メチル化Ｃ塩基はＵ塩基に変換され、ゲノム全体のＧＣ含有量が極端に変化するため、後続の増幅が極めて大きな偏りを引き起こす。３、ライブラリー構築にはマイクログラムレベルの開始ＤＮＡが必要であり、微量のＤＮＡに対する非常に効果的なライブラリーの構築方法は困難である。臨床試験とある特定の研究に対して、全ゲノムメチル化シーケンシング操作は複雑であり、且つコストが高すぎるため、ターゲットを絞ったメチル化シーケンシング技術を使用すると、これらの問題を効果的に解決できる。

ターゲットを絞ったメチル化シーケンシング技術は、プローブキャプチャーとマルチＰＣＲベースのシーケンシング技術に分けられることができ、プローブキャプチャーの場合、高い開始量が要求され、血漿無細胞ＤＮＡなどの一部の微量サンプルに対して、キャプチャが困難であり、プローブキャプチャープローブの設計と操作プロセスが複雑すぎ、検出周期が長く、コストが高くなる。ＤＮＡ重亜硫酸塩処理に基づくマルチＰＣＲは、要求される開始量が低く、操作が簡単であり、感度が高いが、該技術にはさらなる改善が必要である。

本発明は、関連技術における技術的問題の１つを少なくともある程度解決することを目的としている。このため、本発明の１つの目的は、メチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法、システム及び応用を提供することである。本発明による方法を通じてメチル化されたＤＮＡのサンプルの標的領域に対してライブラリーを構築し、ライブラリー構築プロセス中に、メチル化されたＤＮＡのサンプルの１つの鎖のみを増幅し、ライブラリーを構築する。特異的プライマーとユニバーサルプライマーを設計することによって増幅し、目的の産物を取得し、プライマーダイマーの問題を効果的に解決する。同時に、複数の特異的プライマーを使用して同じメチル化されたＤＮＡテンプレートの標的領域を増幅し、増幅の特異性を確保することができる。

本発明の発明者は、研究中に、ＤＮＡ重亜硫酸塩処理に基づくマルチＰＣＲは、操作が簡単であり、感度が高いが、技術的要件が高いことに気づいた。マイクロドロップ技術を使用して単一分子ＢＳ－ＰＣＲを行うことは、約９０００のターゲットを検出できることが以前に報告されているが、開始量が高く、２μｇのＤＮＡが必要である。２０１５年、ＬｕＷｅｎなどの研究者は、ＣｐＧアイランドの特徴的な配列をプライマー結合サイトとして巧みに利用し、ＰＣＲ技術に基づくＭＣＴＡ－ｓｅｑを開発し、大量のＣｐＧアイランド領域のメチル化信号を同時に検出できるようになった。該技術は非常に感度が高く、７．５ｐｇのｇＤＮＡを検出できるが、ＭＣＴＡ－ｓｅｑは固定ＣＧＩＰａｎｅｌに似ており、ターゲットを絞ったシーケンシングプラットフォームとして、柔軟性がわずかに不十分である。このため、要求される開始量が低く、柔軟性が強いターゲットを絞ったメチル化技術は、将来のターゲットを絞ったメチル化の発展方向である。

発明者は、如何にしてスーパーマルチターゲット増幅を効果的に実行するかが主なボトルネックであることを研究を通じて発見しており、数万のゲノム増幅サブシーケンシングの開発も非常に挑戦的な作業であり、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ変換後の配列のマルチメチル化ＰＣＲは言うまでもなく、主にＰＣＲプロセス中に深刻なプライマーダイマーが形成されるためである。重亜硫酸塩処理後のＤＮＡのマルチＰＣＲを行うプロセス中に、ＤＮＡが重亜硫酸塩処理された後、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、ゲノム内のほとんどのシトシンが非メチル化されているため、配列のほとんどの塩基は前のＡ／Ｔ／Ｃ／ＧからＡ／Ｔ／Ｇに変更される。従来のＰＣＲでは、一方のプライマーはプラス鎖用に設計され、もう一方は相補鎖用に設計されるため、ＰＣＲに使用される一方の鎖はＡＴＧに富む配列であり、もう一方の鎖はＡＴＣに富む配列であり、このような「天然相補」のプライマー配列はプライマーダイマーを容易に形成することができる。プライマーのペア数が増えると、プライマーダイマーの形成も急激に増加し、マルチＰＣＲプロセス中に、プライマーダイマーの生成により多すぎるプライマーが使い果たされ、マルチＰＣＲが失敗してしまう。このため、重亜硫酸塩のマルチＰＣＲの問題を解決するには、プライマーがプライマーダイマーを形成しやすい問題を先に解決する必要がある。

プライマーダイマーの問題に対して、発明者は一方向のプライマー増幅方法を創造的に発明した。ＤＮＡテンプレートの２本の鎖のうちの一方の鎖のみに対して特異的プライマーを設計し、すべての特異的プライマーにはＡＴＧまたはＡＴＣのみが含まれ、これらのプライマーが互いにプライマーダイマーを形成することは困難である。これらの一方向の特異的プライマーといくつかの固定ユニバーサルプライマーを介して増幅し、目的の産物を取得し、プライマーダイマーの問題を効果的に解決することができる。

具体的に、本発明は、以下のような技術案を提供する。

本発明の第１の態様によれば、本発明は、メチル化されたＤＮＡの標的領域に基づくシーケンシングライブラリーの構築方法を提供し、前記方法は、（１）前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに基づいて、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端にユニバーサル配列を接続し、重亜硫酸水素塩でＤＮＡのサンプルを処理して、変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、（２）第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーを用いて前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルに対して第１の増幅を行い、第１の増幅産物を取得するステップであって、前記第１の特異的プライマーは前記標的領域の上流に位置し、前記第１のユニバーサルプライマーは前記ユニバーサル配列と少なくとも部分的にマッチするかまたは重なり、前記ユニバーサル配列は標的領域の下流に位置するステップと、（３）第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーを使用して前記第１の増幅産物に対して第２の増幅を行い、第２の増幅産物を取得し、シーケンシングライブラリーを得るステップを含み、ここで、前記第２の特異的プライマーは前記第１の特異的プライマーの下流と前記標的領域の上流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第２の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーは前記第１のユニバーサルプライマーの一部の配列に重なるか、または前記第２の特異的プライマーが前記標的領域の下流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第１の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーが前記第２の特異的プライマーの一部の配列に重なる。

本発明によるメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づくシーケンシングライブラリーの構築方法は、メチル化されたＤＮＡテンプレートの１本の鎖に対して特異的プライマーを設計することにより、標的領域の充実、ライブラリー構築の目的を達成する。まず、メチル化されたＤＮＡテンプレートの少なくとも一端にユニバーサル配列を導入し、重亜硫酸塩処理を行い、または最初に重亜硫酸塩処理を行い、次にユニバーサル配列を導入してもよい。即ち、まず、変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する。次に、該ＤＮＡのサンプルの１本の鎖のみに対してプライマーを設計する。即ち第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーを介して該ＤＮＡのサンプルの１本の鎖を増幅し、第１の特異的プライマーが該ＤＮＡのサンプルの１本の鎖にマッチ可能であり、第１のユニバーサルプライマーがユニバーサル配列にマッチ可能であり、それにより、特異的増幅を実現する。そして、用いられるＤＮＡテンプレートは重亜硫酸塩変換後のサンプルであるため、設計された第１の特異的プライマーは塩基Ａ、Ｔ、Ｇまたは塩基Ａ、Ｔ、Ｃに富む配列であり、互い間にダイマーを形成しない。第１のユニバーサルプライマーにＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇという４種の塩基が含まれ、第１の特異的プライマーとプライマーダイマーを形成しないため、プライマーダイマーの形成を完全に回避することができる。

それと同時に、プライマー増幅の特異性を確保するために、第１の特異的プライマーの下流と標的領域の上流または標的領域の下流に１本の第２の特異的プライマーをさらに設計し、第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーを使用して、第１の増幅産物に対して第２の増幅を行い、第２の増幅産物を取得し、必要なシーケンシングライブラリーが得られる。

本発明の実施例によれば、以上のようなメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法は、以下のような技術的特徴をさらに含むことができる。

本発明のいくつかの実施例において、ステップ（３）において、前記第２の特異的プライマーの５’端は前記第２のユニバーサルプライマーの３’端の少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーの３’端は前記第１のユニバーサルプライマーの５’端の一部の配列に重なる。第２の特異的プライマーの５’端の配列は第２のユニバーサルプライマーの３’端の少なくとも一部の配列に重なることができ、３’端の配列はＤＮＡテンプレート上の第１の特異的プライマーの下流と標的領域の上流に位置するテンプレート領域にマッチすることができ、それにより、第１の増幅産物に基づいて、標的領域の特異的増幅を実現することができる。

本発明のいくつかの実施例において、ステップ（３）において、前記第２の特異的プライマーの５’端は前記ラベルプライマーの３’端の少なくとも一部の配列に重なり、前記第２のユニバーサルプライマーの３’端は前記第１の特異的プライマーの５’端の一部の配列に重なる。第２の特異的プライマーの５’端の配列はラベルプライマーの３’端の少なくとも一部の配列に重なり、その３’端の配列はＤＮＡテンプレート上の標的領域の下流に位置するテンプレート領域にマッチすることができ、これにより標的領域の特異的増幅を実現することができる。

本発明のいくつかの実施例において、ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、これらのラベル配列は、シーケンシングプラットフォームによく使用される異なるサンプルを区別するためのいくつかのラベル配列にすることができ、複数の混合サンプルのシーケンシングに同時に用いられることに便利であり、実施例によれば、これらのラベル配列の長さは８～１２ｂｐ、例えば１０ｂｐ、８ｂｐなどであってもよい。

本発明のいくつかの実施例において、ステップ（１）は、（１－ａ）重亜硫酸水素塩を使用して前記メチル化されたＤＮＡのサンプルを処理し、変換されたＤＮＡのサンプルを取得するステップと、（１－ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと第１のシーケンシング配列付きのランダムプライマーを使用して、前記変換されたＤＮＡのサンプルを複製し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップとをさらに含み、前記ランダムプライマーの３’端はランダム塩基配列であり、前記ランダムプライマーの５’端はユニバーサル配列である。

本発明のいくつかの実施例において、前記ランダム塩基配列は６～１２個であり、前記ランダム塩基はＡ、Ｔ、ＣまたはＧである。

本発明のいくつかの実施例において、前記ランダム塩基配列は６～１２個であり、前記ランダム塩基はＡ、ＴまたはＣである。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル配列はシーケンシングリンカー配列または固定配列である。

本発明のいくつかの実施例において、前記シーケンシングリンカー配列または前記固定配列のシトシンはメチル化修飾されたシトシンである。

本発明のいくつかの実施例において、ステップ（１）は、（１－１）前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに対して末端修復して塩基Ａを追加し、修復されたＤＮＡのサンプルを取得するステップと、（１－２）前記修復されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端とユニバーサル配列を接続し、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、（１－３）重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、をさらに含む。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル配列は、シーケンシングリンカー配列または修飾されたシーケンシングリンカー配列のうちの少なくとも１つから選ばれるものである。

本発明のいくつかの実施例において、前記修飾されたシーケンシングリンカー配列は、１本の鎖シトシンに対してメチル化修飾を行い、１本の鎖シトシンに対してメチル化修飾を行わないシーケンシングリンカー配列、１本の鎖の３’端塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されたシーケンシングリンカー配列、固定配列とランダム配列付きのシーケンシングリンカー配列、または１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾された固定配列とランダム配列付きのシーケンシングリンカー配列である。

本発明のいくつかの実施例において、前記ランダム配列は分子ラベル配列である。大量の異なる分子ラベル配列を介して元のＤＮＡテンプレートの個数をカウントし、後続の分子ラベル配列の統計によって元のテンプレートの個数を追跡し、シーケンシングまたはＰＣＲプロセス中に生成されるエラーを修正することにより、ＤＮＡテンプレートの正確な検出と定量的研究を実現することができる。

本発明のいくつかの実施例において、ステップ（１）は、ユニバーサル配列が埋め込まれたトランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡのサンプルに対して切断と転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、をさらに含む。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル配列はトランスポザーゼエフェクター配列またはシーケンシングリンカー付きのトランスポザーゼエフェクター配列であり、好ましくはトランスポザーゼエフェクター配列であり、前記トランスポザーゼは、Ｔｎ５、ＭｕＡまたは他の類似の機能を持つトランスポザーゼであってもよく、好ましくはＴｎ５トランスポザーゼである。

本発明のいくつかの実施例において、トランスポザーゼエフェクター配列のシトシンはメチル化修飾されたシトシンである。非メチル化されたシトシンからグアニンへの変換は１００％起こるプロセスではなく、変換される場合と変換されない場合があるため、ユニバーサルプライマーを使用した後続の増幅は不確実性を高めることになる。メチル化修飾されたシトシンは、後続の亜硫酸塩処理の条件下でウラシルに変換されず、配列情報は変更されない。このため、より正確にシーケンシングするために、トランスポザーゼエフェクター配列のシトシンにメチル化修飾を行うことができる。勿論、シトシンにメチル化修飾を行わなくてもよい。

本発明のいくつかの実施例において、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルはゲノムＤＮＡ、断片化されたゲノムＤＮＡ、または遊離ＤＮＡである。

本発明の第２の態様によれば、本発明はメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築するシステムを提供し、前記システムは、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに基づいて、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端にユニバーサル配列が接続され、且つ重亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡのサンプルを構築し、変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するユニバーサル変換モジュールと、前記ユニバーサル変換モジュールに接続され、第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーを使用して前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルに対して第１の増幅を行い、第１の増幅産物を取得する第１の増幅モジュールであって、前記第１の特異的プライマーは前記標的領域の上流に位置し、前記第１のユニバーサルプライマーは前記ユニバーサル配列と少なくとも部分的にマッチするかまたは重なる第１の増幅モジュールと、前記第１の増幅モジュールに接続され、第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーを使用して前記第１の増幅産物に対して第２の増幅を行い、第２の増幅産物を取得し、シーケンシングライブラリーを得る第２の増幅モジュールとを備え、ここで、前記第２の特異的プライマーは前記第１の特異的プライマーの下流と前記標的領域の上流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第２の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーは前記第１のユニバーサルプライマーの一部の配列に重なるか、または前記第２の特異的プライマーが前記標的領域の下流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第１の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーが前記第２の特異的プライマーの一部の配列に重なる。

本発明の実施例によれば、以上のようなメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築するシステムは、以下のような技術的特徴をさらに含むことができる。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記第２の増幅モジュールにおける前記第２の特異的プライマーの５’端は前記第２のユニバーサルプライマーの３’端の少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーの３’端は前記第１のユニバーサルプライマーの５’端の一部の配列に重なる。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記第２の増幅モジュールにおける前記第２の特異的プライマーの５’端は前記ラベルプライマー３’端の少なくとも一部の配列に重なり、前記第２のユニバーサルプライマーの３’端は前記第１の特異的プライマーの５’端の一部の配列に重なる。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記ラベル配列の長さは８～１２ｂｐである。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル変換モジュールは、重亜硫酸水素塩を使用して前記メチル化されたＤＮＡのサンプルを処理し、変換されたＤＮＡのサンプルを取得する変換ユニットと、前記変換ユニットに接続され、ＤＮＡポリメラーゼと第１のシーケンシングプライマーを使用して、前記変換されたＤＮＡのサンプルを複製し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する増幅ユニットとを備え、前記第１のシーケンシングプライマーの３’端はランダム塩基であり、前記第１のシーケンシングプライマーの５’端はユニバーサル配列である。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記ランダム塩基は６～１２個であり、前記ランダム塩基はＡ、Ｔ、ＣまたはＧである。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記ランダム塩基は６～１２個であり、前記ランダム塩基はＡ、ＴまたはＣである。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記ユニバーサル配列はシーケンシングリンカー配列または固定配列である。

本発明のいくつかの実施例において、以上のシステムでは、前記シーケンシングリンカー配列または前記固定配列のシトシンはメチル化修飾されたシトシンである。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル変換モジュールは、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに対して末端修復して塩基Ａを追加し、修復されたＤＮＡのサンプルを取得するための修復ユニットと、前記修復ユニットに接続され、前記修復されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端とユニバーサル配列を接続し、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するための接続ユニットと、前記接続ユニットに接続され、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する変換ユニットと、をさらに備える。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル変換モジュールでは、前記ユニバーサル配列は、シーケンシングリンカー配列または修飾されたシーケンシングリンカー配列のうちの少なくとも１つから選ばれるものである。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル変換モジュールでは、前記修飾されたシーケンシングリンカー配列は、１本の鎖のシトシンに対してメチル化修飾を行い、１本の鎖のシトシンに対してメチル化修飾を行わないシーケンシングリンカー配列、１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されたシーケンシングリンカー配列、固定配列とランダム配列付きのシーケンシングリンカー配列、または１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾された固定配列とランダム配列付きのシーケンシングリンカー配列である。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル変換モジュールでは、前記ランダム配列は分子ラベル配列である。大量の異なる分子ラベル配列を介して元のＤＮＡテンプレートの個数をカウントし、後続の分子ラベル配列の統計によって元のテンプレートの個数を追跡し、シーケンシングまたはＰＣＲプロセス中に生成されるエラーを修正することにより、ＤＮＡテンプレートの正確な検出と定量的研究を実現することができる。

本発明のいくつかの実施例において、前記ユニバーサル変換モジュールは、ユニバーサル配列が埋め込まれたトランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡのサンプルに転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する転置ユニットと、前記転置ユニットに接続され、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する変換ユニットと、をさらに備える。

本発明のいくつかの実施例において、以上の転置ユニットでは、前記ユニバーサル配列はトランスポザーゼエフェクター配列またはシーケンシングリンカー付きのトランスポザーゼエフェクター配列であり、好ましくはトランスポザーゼエフェクター配列である。

本発明のいくつかの実施例において、以上の転置ユニットでは、前記トランスポザーゼエフェクター配列のシトシンはメチル化修飾されたシトシンである。

本発明のいくつかの実施例において、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルはゲノムＤＮＡ、断片化されたゲノムＤＮＡまたは遊離ＤＮＡである。

以上の本発明のいずれかの実施例におけるメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法の利点と技術的特徴についての説明は、同様に本発明における上記いずれかの実施例におけるメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築するシステムに適用され、ここで繰り返して説明しない。

本発明の第３の態様によれば、本発明は、メチル化されたＤＮＡのサンプルをシーケンシングする方法を提供し、前記方法は、
前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに基づいて、本発明の第１の態様のいずれかの実施例に記載の方法に従って、または本発明の第２の態様のいずれかの実施例に記載のシステムを使用して、シーケンシングライブラリーを構築するステップと、前記シーケンシングライブラリーに対してハイスループットシーケンシングを行い、シーケンシング結果を取得するステップと、を含む。

本発明のいくつかの実施例において、シーケンシングプラットフォームを使用して前記シーケンシングライブラリーに対してハイスループットシーケンシングを行い、前記シーケンシングプラットフォームは、ＭＧＩＳＥＱ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐｒｏｔｏｎのうちの少なくとも１つから選ばれるものである。

本発明の第４の態様によれば、本発明は、メチル化されたＤＮＡのサンプルのメチル化状態を特定する方法を提供し、前記方法は、
前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに基づいて、本発明の第１の態様のいずれかの実施例に記載の方法に従って、または本発明の第２の態様のいずれかの実施例に記載のシステムを使用して、シーケンシングライブラリーを構築するステップと、前記シーケンシングライブラリーに対してハイスループットシーケンシングを行い、シーケンシング結果を取得するステップと、前記シーケンシング結果と参照ゲノムを比較し、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルのメチル化状態を特定するステップと、を含む。

本発明のいくつかの実施例において、前記参照ゲノムはヒトゲノムｈｇ１９またはＹａｎｈｕａｎｇゲノムである。

本発明の第５の態様によれば、本発明は、キットを提供し、前記キットは、ユニバーサル配列、ラベルプライマー、第１のユニバーサルプライマー、第２のユニバーサルプライマー及びメチル化ルーチン検出試薬を含み、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記第１のユニバーサルプライマーは前記ユニバーサル配列に少なくとも部分的にマッチするかまたは重なり、前記第１のユニバーサルプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１であり、前記第２のユニバーサルプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：２２である。前記メチル化ルーチン検出試薬は、例えば重亜硫酸塩検出試薬または対応するキットなどであってもよい。

本発明の実施例によれば、以上のようなキットは、さらに以下のような追加の技術的特徴を含む。
本発明のいくつかの実施例において、前記ラベルプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：２３で示す通りである。

本発明のいくつかの実施例において、前記キットは、第１の特異的プライマーと第２の特異的プライマーをさらに含み、前記第１の特異的プライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１～ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示す配列を含み、前記第２の特異的プライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１～ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示す配列を含む。

本発明のいくつかの実施例において、前記キットは、本発明の第１の態様に記載の方法を使用してメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する。

本発明の上記および／または追加の態様と利点は、以下の図面を組み合わせた実施例の説明から明らかになり、理解しやすくなる。
本発明の一実施例によるランダムプライマーライブラリー構築のフローチャートである。本発明の一実施例によるリンカー接続ライブラリー構築のフローチャートである。本発明の一実施例によるトランスポゾンライブラリー構築のフローチャートである。本発明の一実施例による異なるリンカー配列の模式図である。本発明の一実施例によるシーケンシングライブラリーの品質検査チャートである。本発明の一実施例による各アンプリコンのシーケンシング深度の結果図である。本発明の一実施例によるシーケンシングライブラリーの品質検査チャートである。本発明の一実施例による各アンプリコンのシーケンシング深度の結果図である。本発明の実施例によるメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築するシステムの構造模式図である。本発明の実施例によるユニバーサル変換モジュールの構造模式図である。本発明の実施例によるユニバーサル変換モジュールの構造模式図である。本発明の実施例によるユニバーサル変換モジュールの構造模式図である。

以下、本発明の実施例を詳細に説明し、前記実施例の例を図面に示し、最初から最終まで同じまたは類似の符号は、同じまたは類似の素子または同じまたは類似の機能を有する素子を示す。以下、図面を参照して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を解釈するために使用され、本発明を限定するためのものと見なされるべきではない。

本願をより直感的に理解するために、以下、本願に存在している用語を解釈及び説明する。当業者は、これらの解釈及び説明はがより便利な理解のためだけであり、本願の保護範囲を制限するものと見なされるべきではないことを理解する必要がある。本明細書において、特に明記しない限り、２つの核酸配列が接続されている場合、それは、３’－５’ホスホジエステル結合によって接続されることを意味する。本明細書において、特に明記しない限り、塩基を表す場合、塩基Ｎまたはｎは任意の塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを表す。

本明細書において、「上流」、「下流」という用語は、ヌクレオチド５’－３’の配列順序に従って、２つまたは複数の核酸配列を比較して、上流に位置する核酸配列は、下流に位置する核酸配列よりも、その認識またはマッチ領域がテンプレート配列の５’端に近い。勿論、異なる核酸配列の長さは異なる可能性があるため、認識またはマッチされる領域の長さも異なる可能性がある。Ａ核酸配列がＢ核酸配列の下流に位置することを意味する場合、Ａ核酸配列の３’端の認識または結合サイトのみが、Ｂ核酸配列の３’端の認識または結合サイトよりも、テンプレート配列の３’端に近くすればよい。

本明細書において、２つの核酸配列間の「マッチ」を表す場合、２つの核酸配列の塩基の間に補完的なペアリングが発生することを意味する。２つの核酸配列は少なくとも一部の配列が重なる場合、２つの核酸配列が少なくとも一部の同じ核酸配列を有する。

本明細書において、「重亜硫酸水素塩」、「亜硫酸塩」または「バイサルファイト」のいずれの処理であっても、ＤＮＡ中のシトシンをウラシルに脱アミノ化する試薬またはプロセスを指す。このため、重亜硫酸水素塩処理、亜硫酸塩処理、またはバイサルファイト処理に関わらず、本発明の保護範囲に含まれる。

メチル化されたＤＮＡを増幅するプロセス中に、複数対のメチル化特異的プライマーの間のプライマーダイマー問題を解決するために、本発明は、一方向のプライマー増幅方法を創造的に発明しており、即ちＤＮＡテンプレートの１本の鎖のみに対してプライマー設計を行い、これにより、設計された特異的プライマーはいずれもＡ、Ｔ、ＧまたはＡ、Ｔ、Ｃのみを含み、互い間にプライマーダイマーを形成し難い。同時に、プライマー増幅の特異性を確保するために、２回目のＰＣＲ増幅のプロセス中に、１回目の増幅された産物に対して、その上に特異的プライマーを設計して増幅し、さらに増幅の特異性を確保する。それにより、調製されたシーケンシングライブラリーはシーケンシングの要件を満たす。

詳しくは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）はＴｎ５トランスポゾンによって転置され、切断されたｇＤＮＡまたは遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子がリンカーによって接続されるか、またはＤＮＡがランダムに元のＤＮＡに複製されて一部のユニバーサル配列を導入し、ユニバーサル配列を導入したＤＮＡに重亜硫酸塩処理（ＢＳ処理）を行い、重亜硫酸塩変換後のＤＮＡ配列（元のＤＮＡ非メチル化修飾されたシトシン（Ｃ）がウラシル（Ｕ）に変換される）を取得する。導入されたユニバーサル配列に対してユニバーサルプライマーを設計し、変換されたＤＮＡ配列の標的領域の上流に特異的プライマーを設計し、特異的プライマーはＤＮＡテンプレート上の１本の鎖のみに対して設計され、ユニバーサルプライマーと特異的プライマーを介してＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物を取得する。同時に、増幅の特異性を増加するために、上記の特異的プライマーの下流にネストされたプライマーを設計するか、標的領域の下流に特異的プライマーを設計し、ネストされたプライマーまたは特異的プライマーはＤＮＡテンプレート上の１本の鎖のみに対して設計され、ネストされたプライマーまたは下流の特異的プライマーとユニバーサルプライマーを介して第１のステップのＰＣＲ産物に対して第２のステップの増幅を行い、最終に、重亜硫酸塩処理後のテンプレートに対するＰＣＲ増幅産物（ＢＳ－ＰＣＲ）を取得する。

本発明の一態様において、本発明は、メチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法を提供し、（１）前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに基づいて、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端にユニバーサル配列が接続され、且つ重亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡのサンプルを構築し、変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、（２）第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーを使用して前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルに対して第１の増幅を行い、第１の増幅産物を取得し、前記第１の特異的プライマーは前記標的領域の上流に位置し、前記第１のユニバーサルプライマーは前記ユニバーサル配列の少なくとも一部に重なるかまたはマッチし、前記ユニバーサル配列は標的領域の下流に位置するステップと、（３）第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーを使用して前記第１の増幅産物に対して第２の増幅を行い、第２の増幅産物を取得し、シーケンシングライブラリーを得るステップと、を含み、前記第２の特異的プライマーは前記第１の特異的プライマーの下流と前記標的領域の上流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第２の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーは前記第１のユニバーサルプライマーの一部の配列に重なるか、または、前記第２の特異的プライマーが前記標的領域の下流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第１の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーが前記第２の特異的プライマーの一部の配列に重なる。

変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するプロセス中に、ユニバーサル配列と重亜硫酸塩処理の順序に従って、必要に応じて、異なる方法を採用できる。
本発明の少なくともいくつかの実施形態において、以下のような方法によってユニバーサル配列を導入する。
ｇＤＮＡ、切断されたｇＤＮＡまたはｃｆＤＮＡは、最初に、重亜硫酸塩でＤＮＡ分子を処理し、次に、第１のシーケンシングプライマー、即ち３’端に６－１２個のランダムＮ塩基（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇからなる縮重塩基）または６－１２個のランダムＨ塩基（Ａ／Ｔ／Ｃからなる縮重塩基）が付き、５’端に一部、全部のシーケンシングリンカー配列または固定配列（配列のシトシンにはメチル化修飾されたシトシンを優先的に使用する）が付くプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを使用してテンプレートを複製し、５’端にユニバーサル配列付きの重亜硫酸塩処理後のＤＮＡテンプレート（図１に示す）を取得する。使用可能なシーケンシングリンカー配列はＭＧＩプラットフォームのシーケンシングリンカーを含み、ｉｌｌｕｍｉｎａとｐｒｏｔｏｎプラットフォームのシーケンシングリンカー配列も含むが、これらに制限されない。少なくともいくつかの実施例において、使用可能なＤＮＡポリメラーゼは通常のｒＴａｑ、Ｆｕｓｉｏｎであってもよいし、Ｂｓｔまたはｐｈｉ２９等であってもよい。

本発明の少なくともいくつかの実施形態において、以下のような方法によってユニバーサル配列を導入する。
切断されたｇＤＮＡまたはｃｆＤＮＡに対して末端修復して塩基Ａを追加し、次に、特定のリンカー配列を追加し、配列は一部、全部のシーケンシングリンカー配列または修飾されたシーケンシングリンカー配列であってもよく、これらの修飾されたシーケンシングリンカー配列は、１本の鎖の３端塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されている固定配列付きのシーケンシングリンカー配列、または固定配列付きのシーケンシングリンカー配列、または１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されている固定配列付きのシーケンシングリンカー配列であってもよく、図４に示すような符号１、符号２、符号３及び符号４に示す。精製後、亜硫酸塩を使用してユニバーサル配列を加えた産物を処理して、変換されたＤＮＡテンプレート（図２）を取得する。

本発明の他のいくつかの実施形態において、以下のような方法によってユニバーサル配列を導入する。
Ｔｎ５トランスポザーゼに一部のリンカー配列が埋め込まれ、該リンカーはＴｎ５トランスポザーゼ自体の有効な１９ｂｐの特定の配列であってもよいし、有効な配列＋他の配列（例えばシーケンシングリンカー配列）の組み合わせである可能性があり、１９ｂｐの特定の配列を優先的に使用し、１９ｂｐの特定の配列のシトシンにはメチル化修飾されたシトシンを優先的に使用し、Ｔｎ５転置によってｇＤＮＡを転置して特定のリンカーを加えて、精製後、重亜硫酸塩を使用して特定のリンカーを加えた産物を処理し、変換されたＤＮＡテンプレート（図３に示す）を取得する。

上記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得した後、一方向特異的プライマーによってＰＣＲ増幅を行ってシーケンシングライブラリーを取得し、増幅方法は、以下のような任意の１つを採用することができる。
本発明の少なくともいくつかの実施形態において、以下のような方法によってＰＣＲ増幅を行ってシーケンシングライブラリーを取得する。
第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーによって亜硫酸塩処理後のＤＮＡに対して第１のステップのＰＣＲ増幅を行う。第１のユニバーサルプライマーの３’端の配列は上記の導入されたユニバーサル配列の一部または全部に相補的であるか、重なる。例えば、第１のユニバーサル配列の５’端はシーケンシングリンカー配列の一部または全部（優先的に一部の配列である）である。第１の特異的プライマー配列の結合サイトは増幅に必要な標的領域の上流に位置し、重亜硫酸塩処理後のＤＮＡテンプレート配列に対して設計され、得られた産物は精製された後、さらに第２の特異的プライマー（以下の実施例ではネストされたプライマーとも呼ばれる）、第２のユニバーサルプライマー、ラベルプライマーによって第２のステップのＰＣＲ増幅を行う。第２のステップのＰＣＲの第１のサイクルでは、第２の特異的プライマーとラベルプライマーを最初にＰＣＲを行い、後続のサイクルでは第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーによって一緒に複数回のＰＣＲを行う。第２の特異的プライマーの５’端は第２のユニバーサルプライマーの３’端の一部または全部の配列に重なり、第２の特異的プライマーの３’端は特異性配列であり、特異性配列は第１の特異的プライマーと標的領域との間に設計され、第２のユニバーサルプライマーはシーケンシングユニバーサルリンカーの一部または全部の配列であってもよく、３’端と第２の特異的プライマーの５’端は一部または全部の配列が同じであり、ラベルプライマーの３’端と第１のユニバーサルプライマーの５’端は一部または全部の配列が同じであり、中央に８－１２ｂｐの固定ラベル配列（各プラットフォームは、サンプルミックスのラベル配列を区別するために使用される）を有し、後続のマルチサンプルの混合シーケンシング（図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ）に用いられる。

本発明の他のいくつかの実施形態において、以下のような方法によってＰＣＲ増幅を行ってシーケンシングライブラリーを取得する。

第１の特異的プライマー（以下の実施例では上流の特異的プライマーとも呼ばれる）と第１のユニバーサルプライマーによって亜硫酸塩処理後のＤＮＡに対して第１のステップのＰＣＲ増幅を行う。第１のユニバーサルプライマーの３’端の配列は上記導入されたユニバーサル配列の一部または全部に相補的であるか、または重なり（ここでのユニバーサル配列にはシーケンシングリンカー配列以外の固定配列を優先的に使用する）、第１の特異的プライマーの３’端の特異性配列は、増幅に必要な標的領域の上流に設計され、重亜硫酸塩処理後のＤＮＡテンプレート配列に対して設計され、５’端はシーケンシングリンカー配列の一部または全部の配列（優先的に一部の配列である）である。得られた産物は精製された後、さらに第２の特異的プライマー（対応的に、以下の実施例では下流の特異的プライマーとも呼ばれる）、第２のユニバーサルプライマー、及びラベルプライマーによって第２のステップのＰＣＲ増幅を行う。第２のステップのＰＣＲの第１のサイクルでは、第２の特異的プライマーと第２のユニバーサルプライマーに対して最初にＰＣＲ増幅を行い、後続のサイクルでは第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーによって一緒に複数回のＰＣＲを行い、下流の特異的プライマーの５’端とラベルプライマーの３’端は一部または全部の配列が重なり、第２の特異的プライマーの３’端は特異性配列であり、特異性配列は標的領域の下流に設計され、第２のユニバーサルプライマーはシーケンシングリンカー配列の一部または全部の配列であってもよく、その３’端と第１の特異的プライマーの５’端は一部または全部の配列が重なり、ラベルプライマーの３’端と第２の特異的プライマーの５’端は一部または全部の配列が同じであり、中央に８－１２ｂｐの固定ラベル配列（各プラットフォームは、サンプルミックスのラベル配列を区別するために使用される）を有し、後続のマルチサンプルの混合シーケンシング（図１Ｂ、図２Ｂ、図３Ｂ）に用いられる。

本発明の他の態様によれば、本発明は、メチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築するシステムを提供し、図９に示すように、ユニバーサル変換モジュール、第１の増幅モジュール及び第２の増幅モジュールを備え、各モジュールは順次に接続される。前記ユニバーサル変換モジュールは、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに基づいて、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端にユニバーサル配列が接続され、且つ重亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡのサンプルを構築し、変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する。前記第１の増幅モジュールは、第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーを使用して前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルに対して第１の増幅を行い、第１の増幅産物を取得し、前記第１の特異的プライマーは前記標的領域の上流に位置し、前記第１のユニバーサルプライマーは前記ユニバーサル配列と少なくとも部分的にマッチするかまたは重なる。前記第２の増幅モジュールは、第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーを使用して前記第１の増幅産物に対して第２の増幅を行い、第２の増幅産物を取得し、シーケンシングライブラリーが得られる。前記第２の特異的プライマー、前記ユニバーサルプライマー及び前記ラベルプライマーは、（ｉ）または（ｉｉ）に示すように、（ｉ）前記第２の特異的プライマーは前記第１の特異的プライマーの下流と前記標的領域の上流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第２の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーは前記第１のユニバーサルプライマーの一部の配列に重なり、（ｉｉ）前記第２の特異的プライマーが前記標的領域の下流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーは前記第１の特異的プライマーの少なくとも一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーが前記第２の特異的プライマーの一部の配列に重なる。

本発明の少なくともいくつかの実施形態において、前記ユニバーサル変換モジュールは、図１０に示すように、変換ユニットと変換ユニットに接続される増幅ユニットを備える。前記変換ユニットは、重亜硫酸水素塩を使用してメチル化されたＤＮＡのサンプルを処理し、変換されたＤＮＡのサンプルを取得する。前記増幅ユニットは、ＤＮＡポリメラーゼと第１のシーケンシングプライマーを使用して、前記変換されたＤＮＡのサンプルを複製し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得し、前記第１のシーケンシングプライマーの３’端はランダム塩基であり、前記第１のシーケンシングプライマーの５’端はユニバーサル配列である。

本発明の少なくともいくつかの実施形態において、前記ユニバーサル変換モジュールは、図１１に示すように、修復ユニット、接続ユニット及び変換ユニットを備え、各ユニットは順次に接続される。前記修復ユニットは、前記メチル化されたＤＮＡのサンプルに対して末端修復して塩基Ａを追加し、修復されたＤＮＡのサンプルを取得するために使用される。前記接続ユニットは、前記修復されたＤＮＡのサンプルの少なくとも一端とユニバーサル配列を接続し、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するために使用される。前記変換ユニットは、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するために使用される。

本発明の少なくともいくつかの実施形態において、前記ユニバーサル変換モジュールは、図１２に示すように、転置ユニットと転置ユニットに接続される変換ユニットを備える。前記転置ユニットは、トランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡのサンプルに対して切断と転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する。前記トランスポザーゼにはユニバーサル配列が埋め込まれている。前記変換ユニットは、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する。

以下、実施例を組み合わせて本発明の手段を解釈する。当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を制限するためのものではない。実施例に具体的な技術または条件が示されない場合、本分野内の文献に記載されている技術または条件に従って、または製品仕様に従って行う。用いられる試薬または機器はメーカーが示されない場合、市場で購入できる従来の製品である。

実施例１メチル化マルチＰＣＲライブラリー構築シーケンシング
実験設計
１００ｎｇＹａｎｈｕａｎｇゲノムＤＮＡで重亜硫酸塩処理を行い、次に、発明のステップに従ってＤＮＡターゲットを絞ったメチル化ライブラリーを調製し、ライブラリーをＭＧＩＳＥＱ－２０００シーケンサーにオンマシンシーケンシングを行い、シーケンシングタイプはＰＥ１００であり、次に、データ利用率、比較率、アンプリコン特異性、均一性などの性能を含むデータ分析を行った。

１、重亜硫酸塩処理
ＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＧｏｌｄＫｉｔ^TM（米国ＺＹＭＯ社製商品番号Ｄ５００５）キットを使用して、上記のＤＮＡに対して重亜硫酸塩共処理を行った。

溶液の調製
ＣＴ変換試薬（ＣＴＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）溶液の調製
キットからＣＴ変換試薬（固体混合物）を取り出して、それぞれ９００μＬの水、５０μＬのＭ－溶解緩衝液（Ｍ－ＤｉｓｓｏｌｖｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）及び３００μＬのＭ－希釈緩衝液（Ｍ－ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ）を添加し、室温で溶解し且つ１０分間振とうし、またはシェーカーで１０分間揺らした。

Ｍ－洗浄緩衝液の調製
Ｍ－洗浄緩衝液に２４ｍＬの１００％のエタノールを添加して用意した。

具体的なステップは以下の通りであった。
（１）ＰＣＲチューブに１３０μＬのＣＴ変換試薬溶液と上記ＤＮＡを添加し、軽くフリックし、またはピペットで混合サンプルを懸濁した。
次に、サンプルチューブをＰＣＲマシンに置き、以下のステップに従って操作した。
９８℃で５分間保持し、６４℃で２．５時間保持した。
上記の操作を完成した後、直ちに次のステップの操作を行った。
（２）Ｚｙｍｏ－ＳｐｉｎＩＣ^TM Ｃｏｌｕｍｎを収集チューブ（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ）に入れ、６００μＬのＭ－結合緩衝液（Ｍ－ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）を添加した。
次に、重亜硫酸塩処理されたサンプルをＭ－結合緩衝液を含有するＺｙｍｏ－ＳｐｉｎＩＣ^TM Ｃｏｌｕｍｎに添加し、蓋をして逆さまに均一に混ぜた。
全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０秒間遠心分離し、収集チューブ内の収集液を捨てる。カラムに１００μＬのＭ－洗浄緩衝液を添加し、全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０秒間遠心分離し、収集チューブ内の液体を捨てた。
カラムに２００μＬのＭ－ＤｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加し、室温で１５ｍｉｎ置き、全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０ｓ遠心分離し、収集チューブ内の液体を捨てた。
カラムに２００μＬのＭ－洗浄緩衝液を添加し、全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０ｓ遠心分離し、収集チューブ内の液体を捨て、このステップを１回繰り返した。
Ｚｙｍｏ－ＳｐｉｎＩＣ^TM Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍＬＥＰチューブに置き、４０μＬのＭ－溶出緩衝液ｒをカラムマトリックスに添加し、室温で２ｍｉｎ置き、全速（＞１０，０００ｘｇ）で遠心分離し、標的のフラグメントＤＮＡを溶出した。

２、ＤＮＡ複製
（１）ＰＣＲチューブ内で以下の反応系に従って重亜硫酸塩処理されたＤＮＡに対してＤＮＡ複製を行った。

ランダムプライマー配列（即ち本明細書に言及された第１のシーケンシングプライマー）は、ＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）であり、ここで、ＮはＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇの４種の塩基からなるランダム配列であった。

（２）上記反応系をＰＣＲマシンに置き、６５度で、１０分間反応させた。
（３）反応した後、１．５×ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製（Ｂｅｃｋｍａｎ社製ＡＭＰｕｒｅＸＰ、商品番号Ａ６３８８１）し、最終に、精製産物を２２μｌの溶出緩衝液に溶解した。

３、１回目のＰＣＲ
（１）ＰＣＲチューブ内で以下の反応系に従ってＰＣＲ系を調製した。

（２）ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった。
９４℃ １ｍｉｎ
９４℃ ３０ｓ
５８℃ ２ｍｉｎ
７２℃ ３０ｓ
上記９４℃３０ｓ，５８℃２ｍｉｎ，７２℃３０ｓを１サイクルとして１５サイクル。
７２℃ ５ｍｉｎ
１２℃ 保持
（３）反応した後、１．５×ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に精製産物を２２μｌの溶出緩衝液に溶解した。

３、２回目のＰＣＲ
（１）ＰＣＲチューブ内で以下の反応系に従ってＰＣＲ系を調製した。ネストされたプライマープールを以下の表１２に示し、ラベルプライマーを以下の表１３に示す。

（２）ＰＣＲ反応条件
９４℃ １ｍｉｎ
９４℃ ３０ｓ
５８℃ ２ｍｉｎ
７２℃ ３０ｓ
上記９４℃３０ｓ，５８℃２ｍｉｎ，７２℃３０ｓを１サイクルとして２０サイクル。
７２℃ ５ｍｉｎ
１２℃ 保持
（３）反応した後、１．０×ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に精製産物２２μｌの溶出緩衝液に溶解した。

４、ライブラリー検出
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＵＳＡ）を使用してライブラリーインサートフラグメントのサイズ及び含有量を検出した。その結果を図５に示す。
５、オンマシンシーケンシング
得られたライブラリーに対してハイスループットシーケンシングを行った。シーケンシングプラットフォームがＭＧＩＳＥＱ－２０００であり、シーケンシングタイプがＰＥ１００であった。シーケンシング後のデータを比較した後、オフマシンデータ、利用可能なデータ、比較率、ＧＣ含有量などを含む様々な基本パラメータを統計した。その結果を以下の表４に示す。各アンプリコンの深度を図６に示す。図６では横座標は、異なるＣｐＧサイトを表す。

表４では、サンプル１～サンプル３は、それぞれ同じサンプルに対して３回繰り返したものを表し、比較率とは、ゲノムに比較する比率を指し、特異性とは、標的領域のｒｅａｄｓがシーケンシング全体のｒｅａｄｓ全体を占める比率を指し、均一性とは、標的領域の深度が標的領域の平均深度より０．１倍大きい個数は標的領域の総数を占める比率を指す。

表４から分かるように、各サンプルのリンカー濾過比は約１％であり、図５に示すようなライブラリー品質検査結果を組み合わせて、形成されたプライマーダイマーが非常に少なく、比較率がいずれも８８－８９％であり、特異性が７７－７９％であり、性能が良好であったことを表す。且つ各アンプリコンの深度の均一性が良好であった。

実施例２メチル化マルチＰＣＲライブラリー構築シーケンシング
実験設計
２００－３００ｂｐに切断されたＹａｎｈｕａｎｇゲノムＤＮＡを使用して、次に、本発明によって提供された方法に従ってＤＮＡターゲットを絞ったメチル化ライブラリーを調製し、ライブラリーをＭＧＩＳＥＱ－２０００シーケンサーにオンマシンシーケンシングを行い、シーケンシングタイプがＰＥ１００であり、そして、データ利用率、比較率、アンプリコン特異性、均一性などの性能を含むデータ分析を行った。

１、末端修復
（１）前のステップで得られたＤＮＡフラグメントを以下の表で１．５ｍＬの遠心分離管内で末端修復反応系を調製した。

（２）上記反応系を２０℃のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に置き、３０ｍｉｎ反応する。反応した後、ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に精製産物を３４μｌの溶出緩衝液に溶解した。上記試薬にはいずれもｅｎｚｙｍａｔｉｃ社製の試薬が使用された。

２、末端への塩基Ａの添加
（１）前のステップで得られたＤＮＡを以下の表に従って１．５ｍＬの遠心分離管内で塩基Ａを添加する反応系を調製した。

（２）上記反応系を３７℃のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に置き、３０ｍｉｎ反応させた。反応した後、ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に、精製産物を２０μｌの溶出緩衝液に溶解した。

２、メチル化リンカー１の接続
（１）前のステップで得られたＤＮＡを以下の表に従ってメチル化リンカー（「メチル化ラベルリンカー」と呼ばれる場合もある）の接続反応系を調製した。

＊メチル化リンカー配列は、以下の通りであった。
リンカー１：５’／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
リンカー２：５’ＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴｄｄＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）
リンカー１配列におけるＣはいずれもメチル化修飾によって保護され、リンカー２におけるシトシンはメチル化修飾によって保護されても、保護されなくてもよく、リンカー２における３端の最後の塩基は、テンプレートとの接続を防止するためにブロック修飾され、即ちジデオキシ修飾が実行された。
（２）上記反応系を２０℃のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に置き、１５ｍｉｎ反応し、接続産物を取得した。反応した後、ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に精製産物を２２μｌの溶出緩衝液に溶解した。

３、亜硫酸塩処理
キットＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＧｏｌｄＫｉｔ^TM（ＺＹＭＯ社製）を使用して上記接続されたＤＮＡに対して重亜硫酸塩共処理を行った。
（１）試薬の準備
ＣＴ変換試薬（ＣＴＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）溶液の調製
キットからＣＴ変換試薬（固体混合物）を取り出して、それぞれ９００μＬの水、５０μＬのＭ－溶解緩衝液（Ｍ－ＤｉｓｓｏｌｖｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）及び３００μＬのＭ－希釈緩衝液（Ｍ－ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ）を添加し、室温で溶解し且つ１０分間振とうし、またはシェーカーで１０分間揺れらした。
Ｍ－洗浄緩衝液の調製：Ｍ－洗浄緩衝液に２４ｍＬの１００％のエタノールを添加して、用意した。
（２）ＰＣＲチューブに１３０μＬのＣＴ変換試薬溶液と上記接続されたＤＮＡを添加し、軽くフリックし、またはピペットで混合サンプルを懸濁した。
次に、サンプルチューブをＰＣＲマシンに置き、以下のステップに従って操作した。
９８℃で５分間保持し、６４℃で２．５時間保持した。
上記の操作を完成した後、直ちに次のステップの操作を行うか、４℃で保管して（最も多く２０時間）、使用に準備した。
（３）Ｚｙｍｏ－ＳｐｉｎＩＣ^TM Ｃｏｌｕｍｎを収集チューブ（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ）に入れ、６００μＬのＭ－結合緩衝液（Ｍ－ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）を添加した。
次に、上記重亜硫酸塩処理されたサンプルをＭ－結合緩衝液を含有するＺｙｍｏ－ＳｐｉｎＩＣ^TM Ｃｏｌｕｍｎに添加し、蓋をして逆さまに均一に混ぜた。
全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０秒間遠心分離し、収集チューブ内の収集液を捨てた。
カラムに１００μＬのＭ－洗浄緩衝液を添加し、全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０秒間遠心分離し、収集チューブ内の液体を捨てた。
カラムに２００μＬのＭ－ＤｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加し、室温で１５ｍｉｎ置き、全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０ｓ遠心分離し、収集チューブ内の液体を捨てた。
カラムに２００μＬのＭ－洗浄緩衝液を添加し、全速（＞１０，０００ｘｇ）で３０ｓ遠心分離し、収集チューブ内の液体を捨て、このステップを１回繰り返した。
Ｚｙｍｏ－ＳｐｉｎＩＣ^TM Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍＬＥＰチューブに置き、１８μＬのＭ－溶出緩衝液ｒをカラムマトリックスに添加し、室温で２ｍｉｎ置き、全速（＞１０，０００ｘｇ）で遠心分離し、標的のフラグメントＤＮＡを溶出した。

４、１回目のＰＣＲ
（１）ＰＣＲチューブ内で以下の反応系に従ってＰＣＲ系を調製した。上流特異的プライマープールに含まれるプライマーを以下の表１１に示し、第１のユニバーサルプライマーを以下の表１３に示す。

（２）ＰＣＲ反応条件
９４℃ １ｍｉｎ
９４℃ ３０ｓ
５８℃ ２ｍｉｎ
７２℃ ３０ｓ
上記９４℃３０ｓ，５８℃２ｍｉｎ，７２℃３０ｓを１サイクルとして１５サイクル。
７２℃ ５ｍｉｎ
１２℃ 保持
反応した後、１．５×ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に精製産物を２２μｌの溶出緩衝液に溶解した。

５、２回目のＰＣＲ
（１）ＰＣＲチューブ内で以下の反応系に従ってＰＣＲ系を調製した。ネストされたプライマープールに含まれるプライマーを以下の表１２に示し、第２のユニバーサルプライマーとラベルプライマーを以下の表１３に示す。

（２）ＰＣＲ反応条件
９４℃ １ｍｉｎ
９４℃ ３０ｓ
５８℃ ２ｍｉｎ
７２℃ ３０ｓ
上記９４℃３０ｓ，５８℃２ｍｉｎ，７２℃３０ｓを１サイクルとして２０サイクル。
７２℃ ５ｍｉｎ
１２℃ 保持
反応した後、１．０×ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを使用して精製し、最終に精製産物２２μｌの溶出緩衝液に溶解した。

６、ライブラリー検出
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＵＳＡ）を使用してライブラリーインサートフラグメントのサイズ及び含有量を検出した。その結果を図７に示す。

７、オンマシンシーケンシング
得られたライブラリーに対してハイスループットシーケンシングを行った。シーケンシングプラットフォームが華大智造のＭＧＩＳＥＱ－２０００であり、シーケンシングタイプがＰＥ１００であった。シーケンシング後のデータを比較した後、オフマシンデータ、利用可能なデータ、比較率、特異性及び均一性などを含む様々な基本パラメータを統計した。その結果を表１０に示す。各アンプリコンのシーケンシング深度を図８に示す。

表１０では、サンプル１～サンプル３は、それぞれ同じサンプルに対して３回繰り返したものを表し、比較率とは、ゲノムに比較する比率を指し、特異性とは、標的領域のｒｅａｄｓがシーケンシング全体のｒｅａｄｓ全体を占める比率を指し、均一性とは、標的領域の深度が標的領域の平均深度より０．１倍大きい個数は標的領域の総数を占める比率を指す。

表１０、図７及び図８の結果から分かるように、本発明によって提供された増幅方法を使用すると、リンカー濾過比が約１％であり、プライマーダイマーが少なく、比較率が８４－８６％であり、特異性が８９－９０％であり、性能が良好であり、そして、各アンプリコンの間のカバー深度の均一性が良好であった。

第１の特異的プライマープールは上記のプライマーにより等モルで混合してなり、Ｙ塩基はＣ／Ｔの縮重塩基であった。

第２の特異的プライマープールは上記プライマーにより等モルで混合してなり、Ｙ塩基はＣ／Ｔの縮重塩基であった。

Ｎ塩基はＭＧＩシーケンシングプラットフォーム上のｂａｒｃｏｄｅ配列であった。

本発明の説明では、「第１」、「第２」などの用語は、説明目的でのみ使用され、相対的な重要性を示すまたは暗示する、または示された技術的特徴の数を暗黙的に示すと理解することはできない。これにより、「第１」、「第２」で限定される特徴には、少なくとも１つの該特徴が明示的または暗黙的に含まれる可能性がある。本発明の説明では、「複数」は、特に明確に具体的に限定されない限り、少なくとも２つ、例えば２つ、３つなどを意味する。

本発明において、特に明確に規定及び限定されない限り、「連結」、「接続」、「固定」などの用語は、広い意味で理解されるべきである、例えば、固定接続、取り外し可能接続、または一体化であってもよいし、機械的接続、電気的接続または相互通信可能であってもよく、直接接続、中間媒体を介した間接的接続であってもよいし、２つの素子の内部の連通または２つの素子の相互作用関係であってもよい。当業者にとって、具体的な場合によって本発明における上記用語の具体的な意味を理解することができる。

本明細書の説明において、参照用語「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体的な例」、または「いくつかの例」などの説明は、該実施例または例を組み合わせて説明する具体的な特徴、構造、材料または特点が本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれることを意味する。本明細書では、上記用語の模式的な叙述は必ずしも同じ実施例または例に向けられているわけではない。そして、説明される具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例において適切な方法で組み合わせることができる。なお、互いに矛盾がない場合、当業者は、本明細書に説明された異なる実施例または例及び異なる実施例または例の特徴を結合及び組み合わせすることができる。

以上で本発明の実施例を示し及び説明したが、上記の実施例は例示的なものであり、本発明を制限するものと理解することができず、当業者は、本発明の範囲から逸脱せずに、上記実施例に対して変化、修正、置換及び変形を行うことができる。

Claims

メチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法であって、
（１）メチル化されたＤＮＡに基づいて、前記メチル化されたＤＮＡの少なくとも一端にユニバーサル配列を接続し、重亜硫酸水素塩でＤＮＡを処理して、変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡを取得するステップであって、前記ユニバーサル配列は、シーケンシングリンカー配列または固定配列であり、前記シーケンシングリンカー配列または前記固定配列におけるシトシンは、メチル化修飾されたシトシンであるステップと、
（２）第１の特異的プライマーと第１のユニバーサルプライマーを使用して前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡに対して第１の増幅を行い、第１の増幅産物を取得するステップであって、
前記第１の特異的プライマーは前記標的領域の上流に位置し、前記第１のユニバーサルプライマーは前記ユニバーサル配列と一部または全部がマッチするかまたは重なり、前記ユニバーサル配列は標的領域の下流に位置するステップと、
（３）第２の特異的プライマー、第２のユニバーサルプライマー及びラベルプライマーを使用して前記第１の増幅産物に対して第２の増幅を行い、第２の増幅産物を取得し、シーケンシングライブラリーを得るステップと、を含み、
前記第２の特異的プライマー、前記第２のユニバーサルプライマー及び前記ラベルプライマーは、（ｉ）または（ｉｉ）に示すものであり、
（ｉ）前記第２の特異的プライマーが前記第１の特異的プライマーの下流と前記標的領域の上流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーが前記第２の特異的プライマーの一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーが前記第１のユニバーサルプライマーの一部の配列に重なり、
（ｉｉ）前記第２の特異的プライマーが前記標的領域の下流に位置し、前記第２のユニバーサルプライマーが前記第１の特異的プライマーの一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーにラベル配列が含まれ、前記ラベルプライマーが前記第２の特異的プライマーの一部の配列に重なり、
前記第１の特異的プライマーと前記第２の特異的プライマーは、ＤＮＡテンプレートの２本の鎖のうちの一方の鎖に対して設計される、
ことを特徴とするメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築する方法。
ステップ（３）において、前記第２の特異的プライマー、前記第２のユニバーサルプライマー及び前記ラベルプライマーが（ｉ）に示すものであり、前記第２の特異的プライマーの５’端は前記第２のユニバーサルプライマーの３’端の一部の配列に重なり、前記ラベルプライマーの３’端は前記第１のユニバーサルプライマーの５’端の一部の配列に重なる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップ（３）において、前記第２の特異的プライマー、前記第２のユニバーサルプライマー及び前記ラベルプライマーが（ｉｉ）に示すものであり、前記第２の特異的プライマーの５’端は前記ラベルプライマーの３’端の一部の配列に重なり、前記第２のユニバーサルプライマーの３’端は前記第１の特異的プライマーの５’端の一部の配列に重なる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップ（１）は、
（１－ａ）重亜硫酸水素塩を使用して前記メチル化されたＤＮＡを処理し、変換されたＤＮＡを取得するステップと、
（１－ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと第１のシーケンシングプライマーを使用して、前記変換されたＤＮＡを複製し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡを取得するステップと、をさらに含み、前記第１のシーケンシングプライマーの３’端はＡ、Ｔ、Ｃから選ばれる６～１２個の塩基であり、前記第１のシーケンシングプライマーの５’端はユニバーサル配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップ（１）は、
（１－１）前記メチル化されたＤＮＡに対して末端修復して塩基Ａを追加し、修復されたＤＮＡを取得するステップと、
（１－２）前記修復されたＤＮＡの少なくとも一端とユニバーサル配列を接続し、ユニバーサル配列付きのＤＮＡを取得するステップと、
（１－３）重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡを取得するステップと、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記ユニバーサル配列は、修飾されたシーケンシングリンカー配列であり、
前記修飾されたシーケンシングリンカー配列は、１本の鎖のシトシンに対してメチル化修飾を行い、１本の鎖のシトシンに対してメチル化修飾を行わず、１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されたシーケンシングリンカー配列、固定配列とランダム配列付きのシーケンシングリンカー配列、または１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾された固定配列とランダム配列付きのシーケンシングリンカー配列であり、
前記ランダム配列は分子ラベル配列である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
ステップ（１）は、
ユニバーサル配列が埋め込まれたトランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡに対して切断と転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡを取得するステップと、
重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡを取得するステップと、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記ユニバーサル配列はトランスポザーゼエフェクター配列またはシーケンシングリンカー付きのＴｎ５トランスポザーゼエフェクター配列である、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
前記トランスポザーゼエフェクター配列のシトシンはメチル化修飾されたシトシンである、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
ステップ（１）は、
ユニバーサル配列が埋め込まれたトランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡのサンプルに対して切断と転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、
重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
メチル化されたＤＮＡのメチル化状態を特定する方法であって、
前記メチル化されたＤＮＡに基づいて、請求項１に記載の方法に従って、シーケンシングライブラリーを構築するステップと、
前記シーケンシングライブラリーに対してハイスループットシーケンシングを行い、シーケンシング結果を取得するステップと、
前記シーケンシング結果と参照ゲノムを比較し、前記メチル化されたＤＮＡのメチル化状態を特定するステップと、を含む、ことを特徴とするメチル化されたＤＮＡのメチル化状態を特定する方法。
キットであって、前記キットは、請求項１に記載の方法を使用してメチル化されたＤＮＡの標的領域に基づいてシーケンシングライブラリーを構築することに用いられるものであり、前記キットは、
メチル化されたＤＮＡの少なくとも一端に接続するためのユニバーサル配列と、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２３で示されるラベルプライマーと、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される第１のユニバーサルプライマーと、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２２で示される第２のユニバーサルプライマーと、
重亜硫酸塩検出試薬と、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１～ＳＥＱＩＤＮＯ：１０のいずれか１つで示される第１の特異的プライマーと、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１～ＳＥＱＩＤＮＯ：２０のいずれか１つで示される第２の特異的プライマーと、を含み、
前記ユニバーサル配列は、シーケンシングリンカー配列または固定配列であり、前記シーケンシングリンカー配列または前記固定配列におけるシトシンは、メチル化修飾されたシトシンである、ことを特徴とするキット。