JP2020516281A - 試料核酸にアダプターを付着する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この国際特許出願は、2017年4月14日に出願された米国仮特許出願番号第62/485,769号、2017年4月18日に出願された第62/486,663号、および2017年6月8日に出願された第62/517,145号の優先日の利益を主張しており、そしてまた2017年4月14日に出願された国際特許出願第PCT/US2017/027809号の優先日の利益を主張しており、各々は、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
本出願は、2018年4月10日作成の1キロバイトのテキストファイル512837−ST25内の配列を含み、前記テキストファイルは参照により組み込まれる。
分析のために患者試料からDNA分子を調製することは、一般に、まず一本鎖オーバーハングを修復して増幅およびシーケンシングのためにアダプターへのライゲーションを可能にすることを含む。修復は、オーバーハング鎖を消化するまたは反対鎖を伸長して平滑末端を生成し、続いて5’末端をリン酸化して平滑末端をアダプターにライゲーションすることにより達成可能である。あるいは、平滑末端化の後、平滑末端はTaqポリメラーゼを用いてA尾部付加することが可能である。A尾部付加断片はアニールされ、3’末端に単一ヌクレオチドT尾部を含むアダプターとライゲーションされる。この立体配置は所望のアダプター−DNA分子ライゲーションに有利であるが、シーケンシングをすることができる分子への試料中のDNA分子の全体変換効率は、利用可能である核酸の量がごく少量である試料についてはそれでも容認しがたいほど低いことがある。
本発明は、分析のために核酸を調製する方法であって、
(a)5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を提供する1つまたは複数の酵素ならびに4つの標準ヌクレオチドタイプの作用により試料中の一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を平滑末端とするステップであって、5’末端を有する一本鎖オーバーハングが、ポリメラーゼ活性による相補鎖の伸長のための鋳型として働き、3’末端を有する一本鎖オーバーハングが、プルーフリーディング活性により消化されて平滑末端化核酸を生じる、ステップと;(b)平滑末端化核酸を試料の他の成分から分離せずに、3’−5’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼの作用により平滑末端化核酸の末端に尾部を付加するステップであって、これにより平滑末端化核酸の3’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加が実施され、Aが優先的に、次にGが優先的に、次にCまたはTが付加される、ステップと;(c)ステップ(c)の核酸を3’末端に単一ヌクレオチドTまたはCオーバーハングを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターにアニールするステップと;(d)核酸をアダプターにライゲーションするステップとを含む、方法を提供する。必要に応じて、方法は、ステップ(a)の後、1つまたは複数の酵素を変性させるステップをさらに含む。必要に応じて、方法は、試料を、1つまたは複数の酵素、4つの標準ヌクレオチドタイプおよび3’−5’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼと接触させるステップをさらに含む。必要に応じて、試料を、1つまたは複数の酵素、4つの標準ヌクレオチドタイプおよび3’−5’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼと一緒に接触させる。必要に応じて、ステップ(b)は、ステップ(a)よりも高い温度で実施される。必要に応じて、ステップ(a)は、周囲温度で実施され、ステップ(b)は、60℃を超える温度で実施される。必要に応じて、1つまたは複数の酵素は、5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼである。必要に応じて、3’−5’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、方法は、ステップ(a)の後、試料の温度を上げて、5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼを不活化するステップをさらに含む。必要に応じて、方法は、(e)アダプターにライゲーションされた核酸を増幅するステップと;(f)核酸を分析するステップとをさらに含む。
対象とは、哺乳動物種(好ましくはヒト)もしくはトリ(例えば、鳥)種などの動物、または植物などの他の生物のことである。さらに具体的には、対象は脊椎動物、例えば、マウス、霊長類、サルまたはヒトなどの哺乳動物が可能である。動物は、家畜、スポーツ動物、およびペットを含む。対象は、健康な個体、疾患もしくは疾患の素因を有するもしくはこれを有すると疑われている個体、または治療を必要とするもしくは治療を必要とすると疑われている個体が可能である。
詳細な説明
1.概要
2.試料
3.試料核酸分子をアダプターに連結する
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(配列番号1)
5.タグ
先行する増幅を伴ってまたは伴わずに、アダプターに隣接する試料核酸をシーケンシングに付すことができる。シーケンシング方法として、例えば、サンガー(Sanger)シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、RNA−Seq(Illumina)、デジタル遺伝子発現(Helicos)、次世代シーケンシング(NGS)、合成による単一分子シーケンシング(SMSS)(Helicos)、大量並列シーケンシング、クローナル単一分子アレイ(Solexa)、ショットガンシーケンシング、Ion Torrent、Oxford Nanopore、Roche Genia、マキシム−ギルバート(Maxim−Gilbert)シーケンシング、プライマーウォーキング、PacBioを使用するシーケンシング、SOLiD、Ion TorrentまたはNanoporeプラットフォームが挙げられる。シーケンシング反応は、複数のレーン、複数のチャネル、複数のウェルまたは複数の試料セットを実質的に同時に処理するその他の手段であり得る種々の試料処理ユニットで実施できる。試料処理ユニットはまた、複数の実施を同時に処理可能にする複数の試料チャンバーを含み得る。
本方法を使用して、状態を特徴付ける(例えば、がんをステージ分類する、またはがんの不均一性を決定する)ため、状態の処置に対する応答をモニタリングするため、状態を発生する、または状態のその後の経過の有効な予後リスクのために、対象における状態、特に、がんの存在を診断できる。
本開示は、上記方法のいずれかの実行のためのキットも提供する。例示的キットは、それぞれTおよびC単一ヌクレオチド3’尾部を有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの対を含む。好ましくは、対合したオリゴヌクレオチドは、TおよびC尾部を除いて同一である。必要に応じて、キットは、AおよびG単一ヌクレオチド3’尾部を有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターがない。好ましくは、アダプターは、配列番号1および2、ならびに3および2のオリゴヌクレオチドを含むアダプターなどのY型である。キットは、T4ポリメラーゼもしくはクレノウ大断片、および/またはTaqポリメラーゼなどの方法の実行のための酵素、ならびに必要に応じて、4つの標準ヌクレオチドタイプも含むことが可能である。キットは、特許請求される方法の実行のための説明書を提供するパッケージング、リーフレット、またはCDなども含むことが可能である。
Claims (42)
- 分析のために核酸を調製する方法であって、
(a)5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を提供する1つまたは複数の酵素ならびに4つの標準ヌクレオチドタイプの作用により試料中の一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を平滑末端とするステップであって、5’末端を有する一本鎖オーバーハングが、前記ポリメラーゼ活性による相補鎖の伸長のための鋳型として働き、3’末端を有する一本鎖オーバーハングが、前記プルーフリーディング活性により消化されて平滑末端化核酸を生じる、ステップと、
(b)前記平滑末端化核酸を前記試料の他の成分から分離せずに、3’−5’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼの作用により前記平滑末端化核酸の末端に尾部を付加するステップであって、これにより平滑末端化核酸の3’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加が実施され、Aが優先的に、次にGが優先的に、次にCまたはTが付加される、ステップと;
(c)ステップ(c)の前記核酸を3’末端に単一ヌクレオチドTまたはCオーバーハングを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターにアニールするステップと;
(d)前記核酸を前記アダプターにライゲーションするステップと
を含む、方法。 - ステップ(a)の後、前記1つまたは複数の酵素を変性させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料を、前記1つまたは複数の酵素、前記4つの標準ヌクレオチドタイプおよび3’−5’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼと接触させるステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試料を、前記1つまたは複数の酵素、前記4つの標準ヌクレオチドタイプおよび3’−5’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼと一緒に接触させる、請求項3に記載の方法。
- ステップ(b)が、ステップ(a)よりも高い温度で実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップ(a)が、周囲温度で実施され、ステップ(b)が、60℃を超える温度で実施される、請求項5に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の酵素が、5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 3’−5’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼであり、前記方法が、ステップ(a)の後、前記試料の温度を上げるステップであって、5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を有する前記ポリメラーゼを不活化するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- (e)前記アダプターにライゲーションされた前記核酸を増幅するステップと;(f)前記核酸を分析するステップとをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記試料を、前記ライゲーションするステップでの前記3’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加を受けなかった平滑末端化二本鎖核酸とライゲーションする少なくとも部分的に二本鎖の平滑末端化アダプターと接触させるステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 5’−3’ポリメラーゼ活性および3’−5’プルーフリーディング活性を有する前記ポリメラーゼが、T4ポリメラーゼまたはクレノウ大断片である、請求項7に記載の方法。
- 3’−5’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくともステップ(a)〜(d)が、単一チューブで実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくともステップ(a)〜(d)では、前記試料から成分が除去されない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップ(a)〜(e)が、単一チューブで実施される、請求項9に記載の方法。
- 単一ヌクレオチドTを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの単一ヌクレオチドCを有するものに対するモル比が、4:1〜2:1である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 平滑末端化アダプターの尾部付加アダプターに対するモル比が、1:5〜1:500である、請求項16に記載の方法。
- 前記試料中の前記二本鎖核酸の少なくとも70%が、アダプターにつながっている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記試料中の利用可能な二本鎖核酸の少なくとも70%が分析される、請求項9に記載の方法。
- ステップ(f)が、前記アダプターにライゲーションされている前記核酸をシーケンシングすることを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記シーケンシングすることで、ステップ(c)または(d)においてオーバーハングを形成したヌクレオチドをシーケンシングする、請求項20に記載の方法。
- 二本鎖DNAをアダプタータグ付きDNAに変換する方法であって、
(a)二本鎖DNA分子の集団を少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの集団と接触させるステップであって、
(i)二本鎖DNA分子の前記集団が、単一ヌクレオチドAオーバーハングを含むDNA分子および単一ヌクレオチドGオーバーハングを含むDNA分子を含み、単一ヌクレオチドAオーバーハングは、前記集団中で単一ヌクレオチドGオーバーハングよりも豊富であり(例えば、10倍、100倍、1000倍)、
(ii)少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、単一ヌクレオチドTオーバーハングを含むアダプターおよび単一ヌクレオチドCオーバーハングを含むアダプターを含む、ステップと;
(b)前記アダプターを前記DNA分子にライゲーションするステップであって、これによりアダプタータグ付きDNAを生成するステップと
を含む、方法。 - (i)二本鎖DNA分子の前記集団が、単一ヌクレオチドCオーバーハングを含むDNA分子、単一ヌクレオチドTオーバーハングを含むDNA分子および平滑末端のうちの少なくとも1つをさらに含み、
(ii)少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、単一ヌクレオチドGオーバーハングを含むアダプター、単一ヌクレオチドAオーバーハングを含むアダプターおよび平滑末端のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項22に記載の方法。 - 前記少なくとも部分的に二本鎖のアダプターが、NGS(「次世代シーケンシング」)プライマー結合部位およびDNAバーコードを含む、請求項22または23に記載の方法。
- 前記少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、複数の異なるDNAバーコードを含む、請求項22から25のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖DNA分子の両末端に付着可能なバーコード組合せの数が、前記集団中で二本鎖DNA分子の数よりも少なく、例えば、5〜10,000の間の異なる組合せである、請求項25に記載の方法。
- 試料インデックスバーコードを含む増幅プライマーおよびフローセル支持体に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように適合されたヌクレオチド配列を使用して前記アダプタータグ付きDNAを増幅するステップ
をさらに含む、請求項24に記載の方法。 - 前記アダプターが、Y型アダプターである、請求項22から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、体液試料である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が、全血、血清、または血漿である、請求項29に記載の方法。
- 核酸集団が、無細胞核酸集団、好ましくは無細胞DNAである、請求項22から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、がんを有すると疑われる対象由来である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記分析するステップが、体細胞または生殖系列バリアントを検出する、請求項9に記載の方法。
- 前記分析するステップが、コピー数変異を検出する、請求項9に記載の方法。
- 前記分析するステップが、単一ヌクレオチド変異(SNV)を検出する、請求項9に記載の方法。
- 前記請求項のいずれかに記載の方法により生成される適合された核酸の集団であって、複数の核酸分子を含み、そのそれぞれが、核酸断片とアダプターの間にA/TまたはG/C塩基対を有するバーコードを含むアダプターが両側に隣接している前記核酸断片を含む、集団。
- 前記複数の核酸分子が、少なくとも100,000分子である、請求項36に記載の集団。
- A/T塩基対のG/C塩基対に対する比が、2:1〜4:1の間である、請求項36または37に記載の集団。
- 前記集団中の核酸分子の少なくとも99%が、異なるバーコードを有するアダプターが隣接している核酸断片を有する、請求項36から38のいずれか一項に記載の集団。
- それぞれTおよびC単一ヌクレオチド3’尾部を有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターであって、前記尾部を除いて互いに同一であるアダプターの対を含むキット。
- 前記アダプターが、配列番号1および2、ならびに3および2のオリゴヌクレオチドを含むY型アダプターである、請求項40に記載のキット。
- T4ポリメラーゼまたはクレノウ大断片、およびTaqポリメラーゼ、ならびに4つの標準ヌクレオチドタイプをさらに含む、請求項40または41に記載のキット。
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