JP6974504B2 - 配列に基づく遺伝子試験のための対照を作製するための組成物及び方法 - Google Patents

配列に基づく遺伝子試験のための対照を作製するための組成物及び方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年４月２日に出願された米国仮出願第６２／６５１，４５３号の利益を主張する。
本開示は、とりわけ、陽性又は陰性対照として使用することができ、配列決定方法の検証を補助することができる核酸ライブラリーの作製、並びにライブラリー中の過剰及び過小発現配列を同定するための診断に関する。
出生前スクリーニング及び診断は、出産前ケアの日常的な部分である。遺伝的及び染色体状態の出生前診断のための侵襲的検査が存在するが、羊水穿刺又は絨毛膜絨毛サンプリングは、約１％の流産のリスクを有する。母体血液中の循環無細胞ＤＮＡの存在に基づく非侵襲的試験は、胎児染色体異常を決定するために母体末梢血サンプルからの胎児核酸を使用する。非侵襲的方法は、出生前診断のための胎児遺伝物質の代替的且つ安全な供給源を提供する。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術の改善は、シーケンシング速度及びデータ出力を大幅に増加させ、現在のシーケンシングプラットフォームの大量のサンプルスループットをもたらした。これらの改善は、臨床検査室における診断技術におけるＮＧＳの急速な進化をもたらした。比較的短時間で全ゲノムを配列決定することを可能にするＮＧＳ技術は、侵襲的サンプリング方法に関連するリスクなしに、１つの染色体に由来する遺伝物質を別の染色体に由来する遺伝物質と比較する機会を提供した。
ＮＧＳ技術の配列決定プラットフォームは、プラットフォームがその意図された使用の状況において信頼できる結果を生じることを確認するための検証から利益を得る。この検証は、陽性対照及び陰性対照の使用によって、各アッセイに含め、システムの設置を認定し、定期的な性能認定を行い、臨床アッセイの結果を認定することによって補助される。陰性対照として使用され得る生物学的サンプルは、比較的豊富であり、得ることが容易である。例えば、ダウン症候群についての出生前アッセイが行われる場合、陰性対照は、ダウン症候群を有さない胎児を保有する妊婦からの血液サンプルであり得る。陰性対照とは対照的に、陽性対照として使用され得る生物学的サンプルは、容易に入手することは、できない。
生物学的サンプルを模倣する合成陽性対照は、市販されているが、典型的には、１つ以上の欠損を有する。無細胞ＤＮＡを置換することが意図される合成陽性対照中のＤＮＡは、しばしばサイズが均一であるが、生物学的サンプル中の無細胞ＤＮＡは、サイズが均一ではない。合成陽性対照におけるＤＮＡは、しばしば、無細胞ＤＮＡを置換することが意図されるＤＮＡの供給源として使用されるゲノムの均一なカバレッジを有するが、生物学的サンプル中の無細胞ＤＮＡは、供給源のゲノムの均一なカバレッジを必ずしも有するわけではない。大量のＤＮＡを産生するための現在のアプローチは、無細胞ＤＮＡ断片長を模倣せず、プロセシングの後でさえ、カバレッジ及び長さの両方において実質的な偏差が存在する。合成陽性対照におけるこれらの欠点は、ＮＧＳ技術からのデータの統計分析に影響を与え、偏りを導入する。
本明細書には、多くの適用において陽性又は陰性対照として使用され得る、ライブラリーのような核酸断片のコレクションを作製及び使用するための方法が提供される。一実施形態では、本方法は、対象から得られた複数の二本鎖鋳型核酸を含むサンプルを提供することと、鋳型核酸の両端に汎用アダプターを連結して、汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含む複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することとを含む。一実施形態では、汎用アダプターは、二本鎖核酸の領域を含む。本方法は、さらに、第１の汎用プライマー及び第２の汎用プライマーを用いて複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を増幅して、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせることと、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子の両端から汎用アダプターの少なくとも一部を除去して、除去された汎用アダプター及び複数の再生された鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を生じさせることとを含むことができる。一実施形態では、サンプルは、血液、尿、痰、又は便を含む。
一実施形態では、対象は、細菌病原体又はウイルス病原体によって引き起こされる感染などの病原体感染を有することが疑われる。一実施形態では、サンプルは、ウイルスＤＮＡ又は細菌ＤＮＡを含む。
一実施形態では、二本鎖鋳型核酸は、ＤＮＡであり、いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含むことができる。一実施形態では、対象は、妊娠しているヒトであり、二本鎖鋳型核酸は、胎児及び母体核酸の混合物を含む。一実施形態では、胎児は、遺伝的状態を含まず、別の実施形態では、胎児は、遺伝的状態を含む。遺伝的状態の例は、トリソミーのような異数性である。トリソミーの例としては、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、９トリソミー、８トリソミー、２２トリソミー、ＸＸＸ、ＸＸＹ、又はＸＹＹが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、遺伝的状態は、ヌクレオチド配列の過小発現を含む。別の実施形態では、対象は、新生物を有することが疑われる。このような対象において、サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ及び無細胞正常ＤＮＡを含み得る。
一実施形態では、本方法は、連結の前に、複数の二本鎖鋳型核酸を処理して、末端を平滑末端に修飾することをさらに含むことができる。一実施形態では、本方法は、連結の前に、複数の二本鎖鋳型核酸を処理して、３’末端を修飾して３’突出構造として終結させることをさらに含み得る。汎用アダプターは、少なくとも１つの汎用プライマー結合部位を含む一本鎖非相補的核酸鎖の領域をさらに含むことができ、連結は、汎用アダプターの二本鎖核酸の領域を鋳型核酸の各末端に共有結合的に付着させる。
一実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの指数関数的増幅反応を含む。一実施形態では、増幅は、低いエラー率を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。
一実施形態では、汎用アダプターは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、除去することは、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を制限エンドヌクレアーゼに曝露すること、及びアダプター−鋳型−アダプター分子を切断して、除去された汎用アダプター及び複数のｒｅＤＮＡを生じさせることを含む。制限エンドヌクレアーゼの切断部位及び認識部位は、別々であってもよく、有用な制限エンドヌクレアーゼの例としては、ＳａｐＩ、ＭｌｙＩ、又はＢｐｕＥＩが挙げられる。一実施形態では、ｒｅＤＮＡは、鋳型の各末端に汎用アダプターの一部を保持し、別の実施形態では、ｒｅＤＮＡは、鋳型の各末端に汎用アダプターの一部を保持しない。一実施形態では、第１の汎用プライマー及び第２の汎用プライマーは、ビオチンなどの捕捉剤を含む。
汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む一実施形態では、除去することは、アダプター−鋳型−アダプター分子を、捕捉剤に結合して、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせる化合物を有する表面と接触させることと、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を切断して除去された汎用アダプター及び複数のｒｅＤＮＡを生じさせる制限エンドヌクレアーゼに曝露することとを含むことができ、ここで除去された汎用アダプターは、表面に結合される。別の実施形態では、分離することは、除去された汎用アダプター及びｒｅＤＮＡを含む混合物を、捕捉剤に結合する化合物と接触させることを含むことができ、ここで化合物は表面に付着され、除去された汎用アダプターは表面に結合される。表面の例は、ビーズである。本方法は、結合した除去された汎用アダプターを有する表面を除去して、除去された汎用アダプターをｒｅＤＮＡから分離することをさらに含むことができる。除去は、所定のサイズ範囲内に収まるｒｅＤＮＡの選択をさらに含むことができる。
一実施形態では、本方法は、対象から得られたサンプルに由来する複数のｒｅＤＮＡを提供することを含み、各ｒｅＤＮＡは、鋳型である。本方法は、汎用アダプターを鋳型核酸の両端に連結して、汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含む複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することを含むことができる。一実施形態では、汎用アダプターは、（ｉ）二本鎖核酸の領域、及び（ｉｉ）少なくとも１つの汎用プライマー結合部位を含む一本鎖非相補的核酸鎖の領域を含み、鋳型の少なくとも一部の配列を決定するための配列決定ライブラリーを生じさせる。
一実施形態では、一本鎖非相補的核酸鎖の領域は、少なくとも１つの汎用伸長プライマー結合部位をさらに含む。一実施形態では、一本鎖非相補的核酸鎖の領域の遠位の二本鎖核酸の領域は、平滑末端構造として終結する。一実施形態では、複数の鋳型は、平滑末端構造を含む。一実施形態では、一本鎖非相補的核酸鎖の領域の遠位の二本鎖核酸の領域は、３’突出構造として終結する。一実施形態では、３’突出構造は、例えば、１〜４ヌクレオチドの突出構造を含む。一実施形態では、３’突出構造は、Ｔヌクレオチドの突出を含む。一実施形態では、鋳型は、二本鎖核酸の領域の３’突出構造に相補的な３’突出構造を含む。
本方法は、複数の増幅部位を含む表面を提供することをさらに含むことができ、ここで、増幅部位は、遊離３’末端を有する付着した一本鎖核酸の少なくとも２つの集団を含み、増幅部位を有する表面を、個々のアダプター−鋳型−アダプター分子からのアンプリコンのクローン集団を各々含む複数の増幅部位を産生するのに適切な条件下で、複数のアダプター−鋳型−アダプター分子と接触させる。一実施形態では、複数のアダプター−鋳型−アダプター分子の数は増幅部位の数を超え、ここで、アダプター−鋳型−アダプター分子は、増幅部位への流体アクセスを有し、増幅部位の各々は、いくつかのアダプター−鋳型−アダプター分子のための容量を含む。一実施形態では、接触させることは、（ｉ）アダプター−鋳型−アダプター分子を平均輸送速度で増幅部位に輸送すること、及び（ｉｉ）増幅部位にあるアダプター−鋳型−アダプター分子を平均増幅速度で増幅することを同時に含み、平均増幅速度は、平均輸送速度を超える。
本明細書には、組成物も提供される。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるアダプター−鋳型−アダプター分子を含み、汎用アダプターは、ＳａｐＩ、ＭｌｙＩ、又はＢｐｕＥＩなどの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される方法によって生成された複数のｒｅＤＮＡを含み、さらに人工生物学的流体を含む。一実施形態では、人工生物学的流体は、人工血漿を含む。
本明細書には、核酸検出試験において対照を使用する方法がさらに提供される。本方法は、本明細書に記載される複数のｒｅＤＮＡを提供することと、試験サンプル及びｒｅＤＮＡに対して核酸検出試験を実施することと、ｒｅＤＮＡを対照として使用して核酸検出試験からの結果を分析することとを含むことができる。核酸検出試験は、例えば、配列決定又はマイクロアレイ分析を含み得る。一実施形態では、核酸検出試験は、酵素プロセスを含む。
本明細書には、本明細書に記載される方法を用いて得られた複数のｒｅＤＮＡに対して核酸検出試験を実施することを含む方法も提供される。ｒｅＤＮＡは、例えば、（ｉ）ライブラリー調製方法の品質のための対照、（ｉｉ）配列決定機器のための較正対照、（ｉｉｉ）アレイ機器のための較正対照、（ｉｖ）配列決定に基づく非侵襲性出生前試験又は配列決定に基づく腫瘍検出試験などのための核酸配列決定試験のための検証対照、又は（ｖ）配列決定に基づくコンパニオン診断試験のための検証対照であり得る。一実施形態では、コンパニオン診断試験を用いて、治療処置が処置レジメンにおいて適切であるかどうかを決定するために、サンプル中の目的の遺伝子改変体及び／又は配列の存在又は同一性を決定し得る。
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味をとると理解される。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、当技術分野におけるその使用と一致することが意図され、天然に存在する核酸又はその機能的類似体を含む。特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができ、又は特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体構造は、当技術分野で既知の種々の任意のものを含む、代替の骨格結合を有し得る。天然に存在する核酸は、一般に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中に見出される）又はリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）中に見出される）を有する。核酸は、当技術分野で既知のこれらの糖部分の様々な類似体のいずれかを含むことができる。核酸は、天然又は非天然塩基を含むことができる。この点に関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野で既知である。用語「鋳型」及び「標的」は、核酸に関して使用される場合、本明細書に記載される方法又は組成物の文脈における核酸の意味識別子として意図され、さもなければ明示的に示されるものを超えて核酸の構造又は機能を必ずしも限定しない。
本明細書で使用される場合、用語「鋳型断片」及び関連する用語（例えば、「鋳型核酸断片」、「鋳型分子」及び「鋳型核酸分子」）は、アレイ上などで最終的に配列決定すること、又は組成物を産生するために使用することが所望される核酸分子を指すために、互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「アダプター」及びその派生語（例えば、汎用アダプター）は、一般に、本明細書に記載される核酸分子に連結され得る任意の直鎖オリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、アダプターは、サンプル中に存在する任意の鋳型配列の３’末端又は５’末端に実質的に相補的ではない。いくつかの実施形態では、適切なアダプター長は、約１０〜１００ヌクレオチド、約１２〜６０ヌクレオチド及び約１５〜５０ヌクレオチド長の範囲である。一般に、アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、１つ以上の位置に１つ以上の切断可能な基を含むことができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、１つ以上の汎用配列を含み得る。別の実施形態では、アダプターは、プライマー、例えば汎用プライマーの少なくとも一部と実質的に同一又は実質的に相補的な配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、下流の誤り訂正、識別、又は順序付けを支援するために、本明細書ではバーコードとも呼ばれるインデックスを含むことができる。「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」及び「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」という用語は、互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「汎用配列」は、２つ以上の核酸分子、例えばアダプター−鋳型−アダプター分子に共通である配列の領域を指し、ここで、分子はまた、互いに異なる配列の領域を有する。分子のコレクションの異なるメンバーに存在する汎用配列は、汎用配列の一部、例えば、汎用伸長プライマー結合部位に相補的である汎用捕捉核酸の集団を使用して、複数の異なる核酸の捕捉を可能にすることができる。汎用伸長プライマー結合部位の非限定的な例には、Ｐ５及びＰ７プライマーと同一又は相補的な配列が含まれる。同様に、分子のコレクションの異なるメンバーに存在する汎用配列は、汎用配列の一部、例えば、汎用プライマー結合部位に相補的である汎用プライマーの集団を使用して、複数の異なる核酸の複製又は増幅を可能にし得る。従って、汎用捕捉核酸又は汎用プライマーは、汎用配列に特異的にハイブリダイズし得る配列を含む。鋳型核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるように、異なる鋳型配列の一方又は両方の末端において、汎用アダプター（本明細書では、アダプターとも呼ばれる）を付着させるように改変され得る。別の実施形態では、分子のコレクションの異なるメンバーに存在する汎用配列は、汎用アダプターの一部を、それが付着する鋳型分子から除去することを可能にし得る（例えば、汎用除去配列）。
用語「Ｐ５」及び「Ｐ７」は、増幅プライマー、例えば汎用プライマー伸長プライマーを指す場合に使用され得る。用語「Ｐ５’」（Ｐ５’プライマー）及び「Ｐ７’」（Ｐ７’プライマー）は、各々Ｐ５及びＰ７の相補体を指す。任意の適切な増幅プライマーが本明細書に提示される方法において使用され得ること、及びＰ５及びＰ７の使用は、例示的な実施形態のみであることが理解されるであろう。フローセル上でのＰ５及びＰ７のような増幅プライマーの使用は、国際公開第２００７／０１０２５１号パンフレット、国際公開第２００６／０６４１９９号パンフレット、国際公開第２００５／０６５８１４号パンフレット、国際公開第２０１５／１０６９４１号パンフレット、国際公開第１９９８／０４４１５１号パンフレット、及び国際公開第２０００／０１８９５７号パンフレットの開示によって例示されるように、当技術分野で既知である。例えば、任意の適切なフォワード増幅プライマーは、固定化されているか溶液中であるかにかかわらず、相補的配列へのハイブリダイゼーション及び配列の増幅のために本明細書に提示される方法において有用であり得る。同様に、任意の適切な逆増幅プライマーは、固定化されているか溶液中であるかにかかわらず、相補的配列へのハイブリダイゼーション及び配列の増幅のために本明細書に提示される方法において有用であり得る。当業者は、本明細書に提示されるような核酸の捕捉及び増幅に適切なプライマー配列を設計及び使用する方法を理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「増幅する」、「増幅」又は「増幅反応」及びそれらの派生語は、一般に、核酸分子の少なくとも一部が、少なくとも１つの追加の核酸分子に複製又はコピーされる、任意の作用又はプロセスを指す。追加の核酸分子は、場合により、標的核酸分子の少なくともいくつかの部分と実質的に同一又は実質的に相補的である配列を含む。標的核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得、追加の核酸分子は、独立して、一本鎖又は二本鎖であり得る。増幅は、場合により、核酸分子の線形又は指数関数的複製を含む。いくつかの実施形態では、そのような増幅は、等温条件を使用して行うことができ、別の実施形態では、そのような増幅は、熱サイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、増幅は、単一の増幅反応における複数の標的配列の同時増幅を含む多重増幅である。いくつかの実施形態では、「増幅」は、ＤＮＡ及びＲＮＡベースの核酸の少なくともいくつかの部分の単独又は組み合わせでの増幅を含む。増幅反応は、当業者に既知の増幅プロセスのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
本明細書で使用される場合、「増幅条件」及びその派生語は、一般に、１つ以上の核酸配列を増幅するために適切な条件を指す。このような増幅は、線形又は指数関数的であり得る。いくつかの実施形態では、増幅条件は等温条件を含むことができ、或いは、熱サイクル条件、又は等温条件と熱サイクル条件の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列を増幅するために適切な条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を含む。典型的には、増幅条件は、１つ以上の標的配列のような核酸を増幅するのに、又は１つ以上のアダプター、例えばアダプター連結増幅標的配列に連結された増幅標的配列を増幅するのに十分な反応混合物を指す。一般に、増幅条件は、増幅又は核酸合成のための触媒、例えば、ポリメラーゼ；増幅される核酸に対してある程度の相補性を有するプライマー；及び核酸にハイブリダイズした後にプライマーの伸長を促進するためのヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。増幅条件は、核酸へのプライマーのハイブリダイゼーション又はアニーリング、プライマーの伸長、及び伸長されたプライマーが増幅を受ける核酸配列から分離される変性工程を必要とし得る。典型的には、増幅条件は熱サイクルを含むことができるが、必ずしもその必要はなく、いくつかの実施形態では、増幅条件はアニーリング、伸長、及び分離の工程が繰り返される複数のサイクルを含む。典型的には、増幅状態は、Ｍｇ＋＋又はＭｎ＋＋などのカチオンを含み、イオン強度の様々な調整剤を含むこともできる。
本明細書で使用される場合、「再増幅」及びその派生語は、一般に、増幅された核酸分子の少なくとも一部が、任意の適切な増幅プロセス（いくつかの実施形態では、「二次」増幅と呼ばれる）を介してさらに増幅され、それによって、再増幅された核酸分子を産生する、任意のプロセスを指す。二次増幅は、増幅された核酸分子が産生された元の増幅プロセスと同一である必要はなく、増幅された核酸分子が増幅された核酸分子と完全に同一又は完全に相補的である必要もなく、必要なのは、再増幅された核酸分子が増幅された核酸分子又はその相補体の少なくとも一部を含むことだけである。例えば、再増幅は、一次増幅とは異なる標的特異的プライマーを含む、異なる増幅条件及び／又は異なるプライマーの使用を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書の方法を指し、これらは、クローニング又は精製なしにゲノムＤＮＡの混合物中の目的のポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する。目的のポリヌクレオチドを増幅するためのこのプロセスは、目的の所望のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ混合物に大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で一連の熱サイクルを行うことからなる。２つのプライマーは、目的の二本鎖ポリヌクレオチドの各々の鎖に相補的である。混合物は、最初に、より高い温度で変性され、次いでプライマーが、目的のポリヌクレオチド分子内の相補的配列にアニーリングされる。アニーリング後、プライマーをポリメラーゼで伸長させて、相補鎖の新しい対を形成する。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長の工程は、目的の所望のポリヌクレオチドの増幅セグメントの高濃度を得るために、何度も繰り返され得る（サーモサイクリングと呼ばれる）。目的の所望のポリヌクレオチドの増幅セグメント（アンプリコン）の長さは、互いに対するプライマーの相対位置によって決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメータである。このプロセスを繰り返すことにより、本方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」）と呼ばれる。目的のポリヌクレオチドの所望の増幅セグメントは、混合物中の（濃度に関して）優勢な核酸配列になるので、それらは、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。上記の方法に対する改変において、標的核酸分子は、複数の異なるプライマー対、場合によっては、目的の標的核酸分子あたり１つ以上のプライマー対を使用してＰＣＲ増幅され得、それによって、多重ＰＣＲ反応を形成する。
本明細書で定義されるように、「多重増幅」は、少なくとも１つの標的特異的プライマーを使用する、サンプル内の２つ以上の標的配列の選択的及び非ランダム増幅を指す。いくつかの実施形態では、多重増幅は、標的配列のいくつか又は全てが単一の反応容器内で増幅されるように行われる。所定の多重増幅の「プレキシ」又は「プレックス」は、一般に、その単一多重増幅の間に増幅される異なる標的特異的配列の数を指す。いくつかの実施形態では、プレキシは、約１２プレックス、２４プレックス、４８プレックス、９６プレックス、１９２プレックス、３８４プレックス、７６８プレックス、１５３６プレックス、３０７２プレックス、６１４４プレックス以上であり得る。いくつかの異なる方法論（例えば、ゲル電気泳動、続いてデンシトメトリー、バイオアナライザーによる定量、又は定量的ＰＣＲ、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み込み、続いてアビジン−酵素コンジュゲート検出；増幅された標的配列への３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の組み込み）によって、増幅された標的配列を検出することも可能である。
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」及びその派生語は、一般に、目的の標的配列にハイブリダイズし得る任意のポリヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは、ヌクレオチドがポリメラーゼによって重合され得る基質として機能するが、いくつかの実施形態では、プライマーは、合成された核酸鎖に組み込まれ、別のプライマーがハイブリダイズして合成核酸分子に相補的である新しい鎖をプライム合成し得る部位を提供し得る。プライマーは、ヌクレオチド又はその類似体の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、一本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。この用語は、等価物として、ＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ））、又はヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡのいずれかの類似体を含み、一本鎖（例えば、センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドに適用可能であると理解されるべきである。本明細書で使用される用語はまた、例えば逆転写酵素の作用によってＲＮＡ鋳型から産生される相補的又はコピーＤＮＡであるｃＤＮＡを包含する。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、三本鎖、二本鎖及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、並びに三本鎖、二本鎖及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。
本明細書で使用される場合、「無細胞ＤＮＡ」（「ｃｆＤＮＡ」）及び無細胞循環ＤＮＡ（「ｃｆｆＤＮＡ」）は、互換的に使用され、対象に存在する場合、細胞と関連しないＤＮＡを指す。ｃｆＤＮＡは、血液、血漿、血清、尿及び唾液のような生物学的流体を含むが、これらに限定されない、対象の種々の供給源に由来し得る。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト対象、及び哺乳動物のような非ヒト対象を指す。本明細書の例は、ヒトに関するものであり、言語は、主にヒトに関するものであるが、本開示の概念は、任意の動物由来のゲノムに適用可能であり、獣医学、動物科学、研究所などの分野で有用である。
本明細書で定義されるように、「サンプル」及びその派生語は、その最も広い意味で使用され、本明細書に記載される方法において有用な鋳型を含むことが疑われる任意の標本、培養物などを含む。サンプルは、１つ以上の核酸を含む任意の生物学的（例えば、臨床的又は外科的）サンプルを含み得る。一実施形態では、サンプルは、「液体生検」、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、洗浄液、脳脊髄液、精液、汗、涙、唾液、便などの生物学的流体の結果である。本明細書で使用される場合、用語「血液」、「血漿」及び「血清」は、その分率又は処理された部分を明確に包含する。同様に、サンプルが生検、綿棒、塗抹などから採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒、塗抹などに由来する処理された分率又は部分を明確に包含する。
「母体サンプル」という用語は、本明細書では、妊娠対象から得られた生物学的サンプルを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ライブラリー」及び「配列決定ライブラリー」は、それらの５’末端で共通の配列及びそれらの３’末端で共通の配列を共有する、コレクション又は複数の鋳型分子を指す。３’及び５’末端に既知の共通配列を含む鋳型分子のコレクションは、３’及び５’修飾ライブラリーとも呼ばれる。
本明細書の用語「目的の配列」は、本明細書に記載される状態（例えば、遺伝的状態又は新生物）を有する個体に対して、健康な個体における配列発現の差異に関連する核酸配列を指す。目的の配列は、状態において誤って発現される、すなわち過剰又は過小に表される（欠失を含む）染色体上の配列であり得る。目的の配列は、状態の発生及び／又は進行において役割を果たすことが知られているか又は疑われる配列であり得る。目的の配列はまた、染色体の一部、又は染色体であり得る。例えば、目的の配列は、異数性状態において過剰発現される染色体若しくはその部分、又は癌において過小発現される腫瘍抑制因子をコードする遺伝子若しくはその部分であり得る。目的の配列は、病原体ゲノムの一部、例えばウイルス又は微生物ゲノムであり得る。目的の配列は、遺伝子変異体（例えば、一塩基多型）であり得る。
「異数性」という用語は、本明細書では、染色体全体又は染色体の一部の喪失又は獲得によって引き起こされる遺伝物質の不均衡を指す。
「染色体異数性」という用語は、本明細書では、染色体全体の喪失又は獲得によって引き起こされる遺伝物質の不均衡を指し、生殖系列異数性及びモザイク異数性を含む。
「部分異数性」という用語は、本明細書では、染色体の一部の喪失又は獲得によって引き起こされる遺伝物質の不均衡（例えば、部分モノソミー及び部分トリソミー）を指し、転座、欠失、及び挿入から生じる不均衡を包含する。
本明細書で使用される「新生物」という用語は、組織の異常な成長を指し、それが塊を形成する場合、典型的には、腫瘍と呼ばれる。新生物は、悪性（癌）又は良性（癌ではない）であり得る。
本明細書で使用される場合、「増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子」及びその派生語は、一般に、標的特異的プライマー及び本明細書に提供される方法を使用して、増幅アダプター−鋳型−アダプター配列によって産生される核酸配列を指す。増幅されたアダプター−鋳型−アダプター配列は、鋳型配列に関して同じセンス（すなわち、プラス鎖）又はアンチセンス（すなわち、マイナス鎖）のいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「連結する」、「連結」及びそれらの派生語は、一般に、２つ以上の分子を一緒に共有結合的に連結するための、例えば、２つ以上の核酸分子を互いに共有結合的に連結するためのプロセスを指す。いくつかの実施形態では、連結は、核酸の隣接するヌクレオチド間のニックを連結することを含む。いくつかの実施形態では、連結は、第１の核酸分子の末端と第２の核酸分子の末端との間に共有結合を形成することを含む。いくつかの実施形態では、連結は、１つの核酸の５’リン酸基と第２の核酸の３’ヒドロキシル基との間に共有結合を形成し、それによって連結された核酸分子を形成することを含むことができる。一般に、本開示の目的のために、増幅された標的配列は、アダプターに連結されて、アダプター連結された増幅された標的配列を生成し得る。
本明細書で使用される場合、用語「平滑末端」及び「末端修復」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖が塩基対で終結する酵素プロセスを互換的に指し、平滑末端酵素から平滑末端生成物を精製することを含まない。
本明細書で使用される場合、用語「テーリング」は、ＤＮＡの３’末端に少なくとも１つのヌクレオチド（典型的には、アデニン）を付加する酵素プロセスを指し、テーリング酵素からテーリング生成物を精製することを含まない。
本明細書で使用される場合、「リガーゼ」及びその派生語は、一般に、２つの基質分子の連結を触媒することができる任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、リガーゼは、核酸の隣接するヌクレオチド間のニックの結合を触媒することができる酵素を含む。いくつかの実施形態では、リガーゼは、１つの核酸分子の５’リン酸と別の核酸分子の３’ヒドロキシルとの間の共有結合の形成を触媒し、それによって連結された核酸分子を形成することができる酵素を含む。適切なリガーゼとしては、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「連結条件」及びその派生語は、一般に、２つの分子を互いに連結するために適切な条件を指す。いくつかの実施形態では、連結条件は、核酸間のニック又はギャップを封止するのに適している。本明細書で使用されるように、ニック又はギャップという用語は、当技術分野におけるこの用語の使用と一致する。典型的には、ニック又はギャップは、酵素（例えば、リガーゼ）の存在下、適切な温度及びｐＨで連結され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約７０〜７２℃の温度で核酸間のニックに結合することができる。
本明細書で使用される「フローセル」という用語は、そこを横切って１つ以上の流体試薬を流すことができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用され得るフローセル並びに関連する流体システム及び検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３−５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号パンフレット；米国特許第７，０５７，０２６号パンフレット；国際公開第９１／０６６７８号パンフレット；国際公開第０７／１２３７４４号パンフレット；米国特許第７，３２９，４９２号明細書；米国特許第７，２１１，４１４号明細書；米国特許第７，３１５，０１９号明細書；米国特許第７，４０５，２８１号明細書；及び米国特許出願公開第２００８／０１０８２号明細書に記載されている。
本明細書で使用される「アンプリコン」という用語は、核酸に関して使用される場合、核酸をコピーする生成物を意味し、この生成物は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同じか又は相補的であるヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、例えば、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、連結伸長、又は連結連鎖反応を含む、核酸又はそのアンプリコンを鋳型として使用する種々の増幅方法のいずれかによって産生され得る。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列の単一コピー（例えば、ＰＣＲ産物）又はヌクレオチド配列の複数コピー（例えば、ＲＣＡのコンカテマー生成物）を有する核酸分子であり得る。標的核酸の第１のアンプリコンは、典型的には、相補的コピーである。後続のアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成後に、標的核酸から、又は第１のアンプリコンから作製されるコピーである。後続のアンプリコンは、標的核酸に実質的に相補的であるか、又は標的核酸に実質的に同一である配列を有することができる。
本明細書で使用される場合、用語「増幅部位」は、１つ以上のアンプリコンが生成され得るアレイ中又はアレイ上の部位を指す。増幅部位は、さらに、その部位で生成される少なくとも１つのアンプリコンを含む、保持する、又は付着させるように構成することができる。
本明細書で使用される場合、用語「アレイ」は、相対的位置に従って互いに区別され得る部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイ内の部位の位置に従って互いに区別することができる。アレイの個々の部位は、特定の型の１つ以上の分子を含み得る。例えば、部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含み得るか、又は部位は、同じ配列（及び／又はその相補的配列）を有するいくつかの核酸分子を含み得る。アレイの部位は、同じ基質上に配置された異なるフィーチャとすることができる。例示的なフィーチャとしては、基質内のウェル、基質内若しくは基質上のビーズ（又は他の粒子）、基質からの突起、基質上のリッジ、又は基質内のチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。アレイの部位は、各々が異なる分子を有する別個の基質であり得る。別個の基質に付着した異なる分子は、基質が関連した表面上の基質の位置に従って、又は液体若しくはゲル中の基質の位置に従って同定することができる。別個の基質が表面上に位置する例示的なアレイには、ウェル中にビーズを有するものが含まれるが、これに限定されない。
本明細書で使用される「容量」という用語は、部位及び核酸物質に関して使用される場合、部位を占めることができる核酸物質の最大量を意味する。例えば、この用語は、特定の状態において部位を占めることができる核酸分子の総数を指すことができる。例えば、特定の状態で部位を占めることができる核酸物質の総質量、又は特定のヌクレオチド配列のコピーの総数を含む、他の尺度も同様に使用することができる。典型的には、標的核酸に対する部位の容量は、標的核酸のアンプリコンに対する部位の容量と実質的に同等である。
本明細書で使用される場合、用語「捕捉剤」は、標的分子（例えば、標的核酸）に付着、保持、又は結合することができる材料、化学物質、分子、又はその部分を指す。例示的な捕捉剤には、標的核酸の少なくとも一部に相補的である捕捉核酸、標的核酸（又はそれに付着した結合部分）に結合することができる受容体−リガンド結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）、又は標的核酸（又はそれに付着した結合部分）と共有結合を形成することができる化学試薬が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「クローン集団」は、特定のヌクレオチド配列に関して均一である核酸の集団を指す。均一配列は、典型的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であるが、さらに長くてもよく、例えば少なくとも５０、１００、２５０、５００又は１０００ヌクレオチド長を含む。クローン集団は、単一の標的核酸又は鋳型核酸に由来し得る。典型的には、クローン集団中の核酸の全ては、同じヌクレオチド配列を有するであろう。クローン性から逸脱することなく、クローン集団において少数の突然変異（例えば、増幅アーチファクトに起因する）が生じ得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「輸送」は、流体を通る分子の移動を指す。この用語は、その濃度勾配に沿った分子の移動（例えば、受動拡散）のような受動輸送を含み得る。この用語はまた、分子がそれらの濃度勾配に沿って、又はそれらの濃度勾配に逆らって移動することができる能動輸送を含むことができる。従って、輸送は、１つ以上の分子を所望の方向に、又は増幅部位などの所望の位置に移動させるためにエネルギーを印加することを含むことができる。
本明細書で使用される場合、用語「各々」は、項目の集合体に関連して使用される場合、集合体内の個々の項目を識別することを意図するが、文脈が別段に明確に指示しない限り、必ずしも集合体内の全ての項目を指すわけではない。
本明細書で使用される場合、組成物、物品、核酸、又は核の文脈における「提供する」は、組成物、物品、核酸、若しくは核を作製すること、組成物、物品、核酸、若しくは核を購入すること、又はそれ以外で化合物、組成物、物品、物品、若しくは核を得ることを意味する。
「及び／又は」という用語は、列挙された要素のうちの１つ若しくは全て、又は列挙された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、特定の状況下で、特定の利益を与え得る本開示の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は別の状況下で、別の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、別の実施形態が有用ではないことを示唆しておらず、別の実施形態を本開示の範囲から除外することを意図していない。
用語「含む」及びその変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有さない。
「含む」又は「含んでいる」などの言葉で本明細書に記載される実施形態は、どこでも、「からなる」及び／又は「本質的にからなる」という用語で記載される他の点で類似の実施形態も提供されることが理解される。
別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１つ又は複数を意味する。
また、本明細書において、終点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、又は「いくつかの実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構成、組成、又は特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な箇所におけるこのような語句の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特徴、構成、組成、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
別個の工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、工程は、任意の実現可能な順序で行ってもよい。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に行ってもよい。
本開示の上記の発明の概要は、本開示の開示された各実施形態又は全ての実施を説明することを意図したものではない。以下の記載は、具体的な実施形態をより詳細に例示するものである。本出願全体のいくつかの場所において、例のリストによりガイダンスが提供され、これらの例は、様々な組み合わせで使用され得る。各場合において、列挙されたリストは、単に代表的なグループとしての役割を果たし、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
本開示の具体的な実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面と併せて読むと最もよく理解され得る。
本開示による一般的な例示的な方法の一般的なブロック図を示す。 図１の方法に概略的に示された、汎用アダプターを付加し、増幅し、アダプターを除去するための一実施形態のより詳細な図を示す。 本明細書に記載される種々の実施形態に従って産生され得るアダプター−鋳型−アダプター分子３０の概略図を示す。描写された分子３０は、二本鎖鋳型領域３１及び各末端に付着した汎用アダプター３２を含む。描写された実施形態において、汎用アダプター３２は、汎用除去配列３３及び汎用プライマー結合部位３４を含む。 本明細書に記載される種々の実施形態に従って産生され得るアダプター−鋳型−アダプター分子４０の概略図を示す。描写された分子４０は、二本鎖鋳型領域４１及び各末端に付着した汎用アダプター４２を含む。汎用アダプターは、一本鎖領域４３及び二本鎖領域４４を含み、描写された実施形態において、汎用アダプター４２は、汎用除去配列４５、汎用伸長プライマー結合部位４６、及びサンプル特異的インデックス４７を含む。 本明細書に記載される種々の実施形態に従って産生され得るアダプター−鋳型−アダプター分子５０の概略図を示す。描写された分子５０は、二本鎖鋳型領域５１及び各末端に付着した汎用アダプター５２を含む。描写された実施形態において、汎用アダプター５２は、汎用プライマー結合部位５３を含む。 本明細書に記載される種々の実施形態に従って産生され得るアダプター−鋳型−アダプター分子６０の概略図を示す。描写された分子６０は、二本鎖鋳型領域６１及び各末端に付着した汎用アダプター６２を含む。描写された実施形態では、汎用アダプター６２は、汎用プライマー結合部位６３を含む。汎用プライマー結合部位６３に結合する汎用プライマー６４も、描写された実施形態に示されている。描写された実施形態において、汎用プライマー６４は、サンプル特異的インデックス６５及び汎用伸長プライマー結合部位６６を含む。
概略図は必ずしも等尺ではない。図面で使用される同様の番号は、同様の構成要素を指すことがある。しかしながら、所定の図において構成要素を指すための番号の使用は、同じ番号で標識される別の図における構成要素を限定することを意図しないことが理解されるであろう。さらに、構成要素を指すための異なる番号の使用は、異なる番号の構成要素が他の番号の構成要素と同一又は類似であり得ないことを示すことを意図していない。
本明細書には、再現性を決定し、システム設置を適格とし、定期的な性能適格性を実施し、臨床アッセイの結果を適格とするなどのために陽性対照又は陰性対照として使用することができるライブラリーを作製するための方法が提供される。一実施形態では、本方法は、鋳型として使用され得る断片化核酸（図１、ブロック１０）を含む対照サンプルを提供する工程、及び核酸断片の各末端に汎用アダプターを付加する工程（図１、ブロック１１；図２、ブロック２１）を含む。付加された汎用アダプターの結果が図２のブロック２２に示されている。アダプターに隣接する断片を増幅して（図１、ブロック１２）、増幅産物（例えば、ＰＣＲ産物）（図２、ブロック２３）を生じるが、ライブラリー中の断片の配列を決定することに向けられた方法とは対照的に、アダプターは、続いて除去される（図１、ブロック１３；図２、ブロック２４）。結果は、対照サンプル中に元々存在する断片化核酸を含む核酸の増幅ライブラリーである（図２、ブロック２５）。増幅された断片のこの集団はまた、本明細書では、再生された鋳型核酸、再生されたＤＮＡ、又はｒｅＤＮＡと互換的に称される。この増幅されたライブラリーは、例えば、試験サンプルが異数性を含むかどうかを決定するための標準的な方法における対照として使用され得る。例えば、異数性の存在又は非存在についてアッセイされるべき試験サンプルが得られ得（図１、ブロック１４）、配列決定のために調製され得る（例えば、アダプターが付加される（図１、ブロック１５））。同じ方法において、対照はまた、アダプターが付加され（図１、ブロック１５）、試験サンプル及び対照サンプルの両方が固定化及び配列決定のために処理され得る（図１、ブロック１６）。アダプターの除去から生じるｒｅＤＮＡ断片、例えばｒｅＤＮＡライブラリー（図１、ブロック１３）は、元の生物学的サンプルにおいて観察されるサイズと類似又は同一のサイズの断片の集団、及び元の生物学的サンプルと類似又は同一のゲノムカバレッジを含む多くの利点を提供する。さらに有利なことは、断片の末端にアダプター（又はその一部）を付着させたままにしておくことができる他の処理方法とは異なり、本明細書に提示する方法は、材料を増幅するために使用されるプロセスのアダプター又は副産物の断片を残さないことである。
本明細書に提供されるライブラリーは、１つ以上の目的の配列の量が異なることが知られているか又は疑われる鋳型の混合物を含むサンプル（対照サンプル又は試験サンプル）中の任意の目的の配列のコピー数多型（ＣＮＶ）を決定するために使用され得る。目的の配列は、数十塩基、数百塩基、数十メガ塩基、及び状態に関連することが知られているか又は疑われる染色体全体にわたるゲノム配列を含む。
一実施形態では、本方法は、複数の二本鎖鋳型核酸の１つ以上（例えば、対照サンプル（図１、ブロック１０）、ｒｅＤＮＡ（アダプター除去の結果、図１、ブロック１３）、又は試験サンプル（図１、ブロック１４））を提供することを含む。鋳型核酸は、本質的に、既知又は未知の配列の任意の核酸であり得る。鋳型核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡの断片であってもよい。一実施形態では、鋳型核酸は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。一実施形態では、鋳型は、生物学的サンプルに由来し得る。一実施形態では、鋳型は、汎用配列（例えば、汎用アダプター中に存在する配列）を各鋳型断片の末端に配置することによって、増幅に適切であるように処理され得る。一実施形態では、鋳型断片を、決定される配列を有するように処理することができ、配列決定により、鋳型の全体又は一部の配列を決定することができる。鋳型はまた、ｃＤＮＡへの逆転写によってＲＮＡサンプルから得ることもできる。
鋳型は、サンプルからの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ｃｆＤＮＡ、ＰＣＲ及び増幅産物など）に由来し得るか、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡとしてサンプルからの一本鎖形態に由来し得、ｄｓＤＮＡ形態に変換され得る。いくつかの実施形態（例えば、鋳型が対照として使用される実施形態（例えば、図１、ブロック１０））では、核酸サンプル由来のポリヌクレオチド分子の配列は、既知であり得る。鋳型が試験サンプル由来である実施形態のような別の実施形態では、核酸サンプル由来のポリヌクレオチド分子の配列は、既知でなくてもよい（例えば、図１、ブロック１４）。
一実施形態では、サンプル由来の鋳型は、ＲＮＡ分子である。この実施形態の一態様では、サンプルから単離されたＲＮＡは、最初に、当技術分野で知られている技法を使用して二本鎖ＤＮＡに変換される。
一実施形態では、サンプル由来の鋳型は、ＤＮＡ分子である。一実施形態では、鋳型は、生物の遺伝子相補体全体を表し、イントロン及びエキソン配列の両方、並びにプロモーター及びエンハンサー配列などの非コード調節配列を含むゲノムＤＮＡ分子である。一実施形態では、鋳型は、例えば、特定の染色体又はｃｆＤＮＡなどのポリヌクレオチド配列の特定のサブセットを表す。さらにより具体的には、鋳型は、ヒトゲノムＤＮＡ分子、ヒト染色体、又はヒトｃｆＤＮＡなどのヒトである。鋳型は、任意のランダム断片化プロセスの前又は後、及び汎用アダプター配列の連結の前又は後のいずれかで、化学的又は酵素的に処理され得る。
一実施形態では、サンプルは、単一の個体由来であり得る。単一の個体の例は、妊婦である。女性によって保有される胎児は、目的の配列（例えば、遺伝的状態）を有するか又は有さない胎児であり得る。女性によって保有される胎児が遺伝的状態を有するかどうかを決定するための方法は、本明細書に開示される方法、並びに羊水穿刺及び配列決定方法を含む当業者に既知の方法を使用して決定され得る（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００９／０１３４９６号パンフレット；Ｑｕａｋｅ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００７／０９２４７３号パンフレット；Ｒａｖａ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２０１２／０２７０７３９号明細書）。単一の個体の別の例は、遺伝的状態、遺伝性遺伝障害、遺伝的突然変異、新生物、自己免疫疾患、又は移植などの条件を有することが知られているか、又は有することが疑われる人であるが、これらに限定されない。単一の供給源からのサンプルは、２つ以上の異なる形態の遺伝物質（例えば、母親対象から得られた母親核酸及び胎児核酸、又は例えば新生物を有する対象から得られた正常核酸及び新生物核酸）を含み得る。さらに、単一の供給源からのサンプルは、双生児、三つ子などを妊娠している対象、又は複数の異なる新生物を有する対象などの、複数の異なる形態の遺伝物質を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝物質の複数の異なる形態は、対象及び侵襲性生物（例えば、寄生虫、細菌又はウイルス感染など）由来であり得る。
一実施形態では、サンプルは、対照サンプルとして使用することができる。対照サンプルは、ｒｅＤＮＡ断片の集団、例えば、対照として使用され得るｒｅＤＮＡライブラリー（例えば、アダプター除去の結果、図１、ブロック１３）を生じるように処理されるサンプルである。サンプルからライブラリーを調製するための方法は既知である（例えば、Ｇｏｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，７４１，４６３号明細書；Ｒａｖａ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２０１２／０２７０７３９号明細書を参照されたい）。典型的には、増幅されたライブラリー中の目的の配列のコピー数多型は既知であるか、又はサンプルが対照として使用され得るように決定される。例えば、サンプルが妊婦由来である場合、胎児の目的の配列のコピー数多型を決定することができる。胎児が異数性などの特定の状態を有する場合、サンプルは、陽性対照として使用することができる。或いは、胎児が異数性を有さない場合、サンプルは、陰性対照として使用され得る。本明細書に記載され、図１に概略的に示されるように（ブロック１０〜１３を参照されたい）、対照サンプルは、増幅されたライブラリーを生じるように処理される。
別の実施形態では、サンプルは、試験サンプルである（例えば、図１のブロック１４）。一実施形態では、試験サンプルは、試験サンプル中の目的の配列のコピー数多型を決定するのに十分な数のヌクレオチドの配列を決定するために処理されるサンプルである。これは、健康な個体又は本明細書に記載される遺伝的状態を有する個体を示し得る。一実施形態では、試験サンプルは、目的の病原体配列の存在を決定するのに十分な数のヌクレオチドの配列を決定するために処理されるサンプルであり、これは例えばウイルス又は微生物感染を示すことができる。一実施形態では、試験サンプルは、対立遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、再配列、又は特異的突然変異などの、目的の１つ以上の遺伝子変異体又は配列の存在を決定するのに十分な数のヌクレオチドの配列を決定するために処理されるサンプルである。遺伝子変異体（例えば、ＳＮＰ又は変異）の同定は、特定の個体に対する治療の適用性を決定するためのコンパニオン診断試験として使用され得る。
目的の配列の例には、異数性などの遺伝的状態が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、異数性は、完全な染色体トリソミー若しくはモノソミー、又は部分的なトリソミー若しくはモノソミーである。部分異数性は、染色体の一部の喪失又は獲得によって引き起こされ、不均衡な転座、不均衡な逆位、欠失及び挿入から生じる染色体不均衡を包含する。生命に適合する最も一般的な既知の異数性は、２１番染色体の一部又は全部の存在によって引き起こされる２１トリソミー、すなわちダウン症候群（ＤＳ）である。まれに、ＤＳは、遺伝性又は散発性の欠損によって引き起こされることがあり、それによって、染色体２１の全部又は一部の余分なコピーが別の染色体（通常は、１４番染色体）に付着して、単一の異常染色体を形成する。ＤＳは、知的障害、重度の学習困難、及び心疾患などの長期の健康問題によって引き起こされる過剰な死亡率に関連する。臨床的意義が知られている他の異数性には、エドワード症候群（ｌＳトリソミー）及びパタウ症候群（Ｐａｔａｕ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（１３トリソミー）が含まれ、これらは、生後数ヶ月以内にしばしば致死的である。性染色体の数に関連する異常も知られており、これには、モノソミーＸ、例えば、女性出生におけるターナー症候群（ＸＯ）及びトリプルＸ症候群（ＸＸＸ）、並びに男性出生におけるクラインフェルター症候群（ＸＸＹ）及びＸＹＹ症候群が含まれ、これらは、全て、不妊及び知的能力の低下を含む種々の表現型に関連する。
トリソミーは、２１トリソミー（Ｔ２１；ダウン症候群）、ｌＳトリソミー（ＴＩＳ；エドワード症候群）、１６トリソミー（Ｔ１６）、２２トリソミー（Ｔ２２；キャットアイ症候群）、１５トリソミー（Ｔ１５；プラダー・ウィリー症候群）、１３トリソミー（Ｔ１３；パトー症候群）、Ｓトリソミー（ＴＳ；ワルカニー（Ｗａｒｋａｎｙ）症候群）、及びＸＸＹ（クラインフェルター症候群）、ＸＹＹ、又はＸＸＸトリソミーであり得る。種々の他のトリソミー及び部分トリソミーが、単一の個体由来のサンプル中に存在し得ることが理解される。これらには、部分トリソミー１ ｑ３２−４４、トリソミーを伴うトリソミー９ｐ、トリソミー４モザイク、トリソミー１７ｐ、部分トリソミー４ｑ２６−ｑｔｅｒ、トリソミー９、部分２ｐトリソミー、部分トリソミーｌｑ、及び／又は部分トリソミー６ｐ／モノソミー６ｑが含まれるが、これらに限定されない。
単一個体由来のサンプル中に存在し得る他の遺伝的状態には、染色体モノソミーＸ、並びに妊娠流産に関与することが知られている１３モノソミー、１５モノソミー、１６モノソミー、２１モノソミー、及び２２モノソミーのような部分モノソミーが含まれるが、これらに限定されない。モノソミー１ Ｓｐは、染色体１ Ｓの短腕（ｐ）の全部又は一部が欠失している（モノソミー）まれな染色体障害である。この障害は、典型的には、低身長、様々な程度の精神遅滞、発話遅延、頭蓋及び顔面（頭蓋顔面）領域の奇形、並びに／又はさらなる身体的異常を特徴とする。関連する頭蓋顔面欠損は、症例ごとに範囲及び重篤度が大きく異なり得る。１５番染色体の構造又はコピー数の変化によって引き起こされる状態には、アンジェルマン症候群及びプラダー・ウィリー症候群が含まれ、これは、１５番染色体の同じ部分、１５ｑ １１−ｑ １３領域における遺伝子活性の喪失を伴う。いくつかの転座及び微小欠失は、キャリア親において無症候性であり得るが、子孫において主要な遺伝的疾患を引き起こし得ることが理解される。例えば、１５ｑ １１−ｑ １３の微小欠失を有する健康な母親は、重篤な神経変性障害であるアンジェルマン症候群の子供を出産する場合がある。従って、本開示は、胎児におけるこのような欠失を同定するために使用され得る。部分モノソミー１３ｑは、１３番染色体の長腕（ｑ）の一部が欠損している（モノソミー）場合に生じるまれな染色体障害である。部分モノソミー１３ｑで生まれた乳児は、低出生体重、頭部及び顔面の奇形（頭蓋顔面領域）、骨格異常（特に手及び足の）、並びに他の身体的異常を示し得る。精神遅滞は、この状態の特徴である。乳児期の死亡率は、この疾患で生まれた個体の間で高い。部分モノソミー１３ｑのほとんど全ての症例は、明らかな理由がなく（散発性）ランダムに発生する。２２ｑ １１．２欠失症候群（ディ・ジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群としても知られる）は、２２番染色体の小片の欠失によって引き起こされる症候群である。欠失（２２ｑ １１．２）は、染色体対の一方の長腕上の染色体の中央付近で起こる。この症候群の特徴は、同じ家族のメンバーの間でさえも、幅広く変化し、身体の多くの部分に影響を及ぼす。特徴的な徴候及び症状には、先天性心疾患、最も一般には、閉鎖に伴う神経筋の問題（ベラ咽頭不全）に関連する口蓋の欠損、学習障害、顔面の特徴の軽度の差異、及び再発性感染症などの先天異常が含まれ得る。染色体領域２２ｑ １１．２における微小欠失は、統合失調症のリスクの２０〜３０倍の増加と関連する。一実施形態では、部分モノソミーは、モノソミー１８ｐ、１５番染色体の部分モノソミー（１５ｑｌｌ−ｑ１３）、部分モノソミー１３ｑ、及び２２番染色体の部分モノソミーであり得る。
一実施形態では、異数性を有する単一の個体は、胎児である。一実施形態では、異数性を有する単一の個体は、母親である。母親に存在し得る異数性の例としては、小さい過剰マーカー染色体（ＳＭＣ）；ｔ（ｌ１；１４）（ｐ１５；ｐ１３）転座；不均衡転座ｔ（８；１１）（ｐ２３．２；ｐ５．５）；１ ｌｑ２３微小欠失；スミス・マギニス症候群１７ｐｌ １．２欠失；２２ｑ１３．３欠失：Ｘｐ２２．３欠失；１０ｐ１４欠失；２０ｐ微小欠失；ディ・ジョージ症候群［ｄｅｌ（２２）（ｑｌｌ．２ｑｌｌ．２３）］；ウィリアムズ症候群（７ｑｌｌ．２３及び７ｑ３６欠失）；ｌｐ３６欠失；２ｐ微小欠失；神経線維腫症１型（１７ｑｌ １．２微小欠失）；Ｙｑ欠失；ウォルフ・ヒルシュホーン症候群（ＷＨＳ、４ｐ１６．３微小欠失）；ｌｐ３６．２微小欠失；ｌｌｑ１４欠失；１９ｑ１３．２微小欠失；ルビンスタイン・テイビ症候群（１６ ｐ１３．３微小欠失）；７ｐ２１微小欠失；ミラー・ディカー症候群（１７ｐ１３．３）、１７ｐｌ １．２欠失；及び２ｑ３７微小欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
先天性欠損の早期決定に加えて、本明細書に記載される方法は、ゲノム内の遺伝子配列の発現における任意の異常の決定に適用され得る。癌患者由来の血漿及び血清ＤＮＡは、測定可能な量の腫瘍ＤＮＡを含み、これは回収され、腫瘍ＤＮＡの代理供給源として使用され得ることが示されている。腫瘍は、異数性、又は不適切な数の遺伝子配列、又はさらには染色体全体によって特徴付けられる。従って、個体由来のサンプルにおける、所定の配列（すなわち、目的の配列）の量の差の決定は、医学的状態（例えば、新生物）の診断において使用され得る。新生物の例としては、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍及び芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の癌には、肺癌、乳癌、及び前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。癌患者における循環ｃｆＤＮＡにおいて決定され得る癌に関連するゲノム不安定性の同定は、潜在的な診断及び予後ツールである。目的の配列は、新生物の発生及び／又は進行において役割を果たすことが知られているか又は疑われる配列を含む。目的の配列の例には、本明細書に記載されるように、癌性細胞において増幅又は欠失される核酸配列が含まれる。
乳癌などの多くの固形腫瘍は、いくつかの遺伝的異常の蓄積を介して開始から転移に進行すると考えられている。［Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５０：７１８４−７１８９［１９９０］；Ｊｏｎｇｓｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ：Ｍｏｌ Ｐａｔｈ ５５：３０５−３０９［２００２］）］。このような遺伝的異常は、それらが蓄積するにつれて、増殖性の利点、遺伝的不安定性、及びそれに付随する薬剤耐性を迅速に進化させる能力、並びに増強された血管新生、タンパク質分解及び転移を付与し得る。遺伝的異常は、劣性の「腫瘍抑制遺伝子」又は優性に作用する癌遺伝子のいずれかに影響を及ぼし得る。ヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失を導く欠失及び組換えは、変異した腫瘍抑制対立遺伝子を明らかにすることによって、腫瘍進行において主要な役割を果たすと考えられる。
ｃｆＤＮＡは、肺癌（Ｐａｔｈａｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２：１８３３−１８４２［２００６］）、前立腺癌（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：１０３２−８［２００９］）、及び乳癌（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．ｂｒｅａｓｔ−ｃａｎｃｅｒ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１１／５／Ｒ７１［２００９］にてオンラインで入手可能）を含むがこれらに限定されない悪性腫瘍と診断された患者の循環において見出されている。癌患者における循環ｃｆＤＮＡにおいて決定され得る癌に関連するゲノム不安定性の同定は、潜在的な診断及び予後ツールである。一実施形態では、本開示の方法は、癌（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍及び芽腫）を有することが疑われるか、又は有することが知られている対象に由来する鋳型の混合物を含むサンプル中の目的の配列のＣＮＶを評価する。一実施形態では、サンプルは、末梢血に由来し（処理され）、正常細胞及び癌性細胞に由来するｃｆＤＮＡの混合物を含む血漿サンプルである。別の実施形態では、ＣＮＶが存在するかどうかを決定するために必要とされる生物学的サンプルは、血清、汗、涙、尿、痰、耳の流れ、リンパ、唾液、脳脊髄液、損傷、骨髄懸濁液、膣の流れ、経頸部洗浄液、脳液、腹水、乳汁、呼吸器、腸管及び尿生殖管の分泌物、並びに白血球除去サンプルを含むがこれらに限定されない他の生物学的流体由来の癌性細胞及び非癌性細胞に由来する鋳型の混合物、又は組織生検、綿棒若しくは塗抹に由来する。
ヒト固形腫瘍に関連する優性に作用する遺伝子は、典型的には、過剰発現又は変化した発現によってその効果を発揮する。遺伝子増幅は、遺伝子発現のアップレギュレーションを導く一般的なメカニズムである。細胞遺伝学的研究からの証拠は、有意な増幅がヒト乳癌の５０％を超えて生じることを示す。最も顕著には、１７番染色体上に位置する癌原遺伝子ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）（１７（１７ｑ２１−ｑ２２））の増幅は、細胞表面上のＨＥＲ２受容体の過剰発現をもたらし、これは乳癌及び他の悪性腫瘍において過剰且つ調節不全のシグナル伝達をもたらす（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ８：３９２−４０１［２００８］）。種々の癌遺伝子が、他のヒト悪性腫瘍において増幅されることが見出されている。ヒト腫瘍における細胞癌遺伝子の増幅の例としては、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０及び小細胞肺癌細胞株におけるｃ−ｍｙｃ、原発性神経芽細胞腫（ＩＩＩ期及びＩＶ期）、神経芽細胞腫細胞株、網膜芽細胞腫細胞株及び原発性腫瘍、並びに小細胞肺癌細胞株及び腫瘍におけるＮ−ｍｙｃ、小細胞肺癌細胞株及び腫瘍におけるＬ−ｍｙｃ、急性骨髄性白血病及び結腸癌細胞株におけるｃ−ｍｙｂ、類表皮癌細胞及び原発性神経膠腫におけるｃ−ｅｒｂｂ、肺、結腸、膀胱及び直腸の原発癌におけるｃ−Ｋ−ｒａｓ−２、乳癌細胞株におけるＮ−ｒａｓの増幅が挙げられる（Ｖａｒｍｕｓ Ｈ．、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：５５３−６１２（１９８４））［Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９８７）にて引用］。
腫瘍抑制遺伝子を含む染色体欠失は、固形腫瘍の発生及び進行において重要な役割を果たし得る。網膜芽細胞腫腫瘍抑制遺伝子（Ｒｂ−１）は、染色体１３ｑ１４に位置し、最も広範に特徴付けられた腫瘍抑制遺伝子である。Ｒｂ−１遺伝子産物、１０５ｋＤａの核リンタンパク質は、明らかに細胞周期調節において重要な役割を果たす（Ｈｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８７：５８８３−５８８７［１９９０］）。Ｒｂタンパク質の発現の変化又は喪失は、点突然変異又は染色体欠失のいずれかによる両方の遺伝子対立遺伝子の不活性化によって引き起こされる。Ｒｂ−ｉ遺伝子改変は、網膜芽細胞腫だけでなく、骨肉腫、小細胞肺癌（Ｒｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：５３１２−５３１７［１９９０］）及び乳癌などの他の悪性腫瘍にも存在することが見出されている。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）研究は、このような腫瘍型が１３ｑでヘテロ接合性を頻繁に失ったことを示し、これは、Ｒｂ−１遺伝子対立遺伝子の１つが、全体的な染色体欠失のために失われたことを示唆する（Ｂｏｗｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、４６：１２［１９９０］）。第６染色体及び他のパートナー染色体を含む重複、欠失及び不均衡転座を含む第１染色体異常は、第１染色体の領域、特にｌｑ２１−ｌｑ３２及びｌｐｌ １− １３が骨髄増殖性新生物の慢性期及び進行期の両方に病理学的に関連する癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子を保有し得ることを示す（Ｃａｒａｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ８４：１９１−２００［２０１０］）。骨髄増殖性新生物はまた、５番染色体の欠失に関連する。５番染色体の完全な欠失又は中間部欠失は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）における最も一般的な核型異常である。分離ｄｅｌ（５ｑ）／５ｑ−ＭＤＳ患者は、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）及び急性骨髄性白血病を発症する傾向があるさらなる核型欠損を有する患者よりも予後が良好である。不均衡な５番染色体欠失の頻度は、Ｓｑが造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ／ＨＰＣ）の増殖制御において基本的な役割を有する１つ以上の腫瘍抑制遺伝子を保有するという考えに導いた。５ｑ３１及び５ｑ３２を中心とする共通欠失領域（ＣＤＲ）の細胞遺伝学的マッピングにより、リボソームサブユニットＲＰＳ１４、転写因子Ｅｇｒｌ／ Ｋｒｏｘ２０及び細胞骨格リモデリングタンパク質α−カテニンを含む候補腫瘍抑制遺伝子が同定された（Ｅｉｓｅｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２８：３４２９−３４４１［２００９］）。新鮮な腫瘍及び腫瘍細胞株の細胞遺伝学的及び対立遺伝子型決定研究は、３ｐ２５、３ｐ２１−２２、３ｐ２１．３、３ｐｌ２−１３及び３ｐ１４を含む染色体３ｐ上のいくつかの別個の領域からの対立遺伝子喪失が肺、乳房、腎臓、頭頸部、卵巣、子宮頸部、結腸、膵臓、食道、膀胱及び他の器官の広範な主要上皮癌に関与する最も早期且つ最も頻繁なゲノム異常であることを示した。いくつかの腫瘍抑制遺伝子が染色体３ｐ領域にマッピングされており、中間部欠失又はプロモーター高メチル化が、癌腫の発生において３ｐ又は３番染色体全体の喪失に先行すると考えられている（Ａｎｇｅｌｏｎｉ Ｄ．、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６：１９−３９［２００７］）。
ダウン症候群（ＤＳ）の新生児及び小児は、しばしば先天性一過性白血病を呈し、急性骨髄性白血病及び急性リンパ芽球性白血病のリスクが高い。約３００個の遺伝子を有する２１番染色体は、白血病、リンパ腫、及び固形腫瘍において、多数の構造異常（例えば、転座、欠失、及び増幅）に関与し得る。さらに、腫瘍形成において重要な役割を果たす、第２１染色体上に位置する遺伝子が同定されている。体細胞数及び構造染色体２１異常は、白血病に関連し、２１ｑに位置するＲＵＮＸｌ、ＴＭＰＲＳＳ２及びＴＦＦを含む特異的遺伝子は、腫瘍形成において役割を果たす（Ｆｏｎａｔｓｃｈ Ｃ Ｇｅｎｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４９：４９７−５０８［２０１０］）。
目的の配列の他の例には、病原体配列が含まれる。病原体は、原核生物病原体、真核生物病原体、又はウイルス病原体であり得る。原核生物病原体の例には、グラム陰性病原体及びグラム陽性病原体が含まれる。真核生物病原体の例には、真菌、酵母、及び原生動物病原体が含まれる。多くの病原体のゲノムは既知であり、病原体の存在の同定に使用するための目的の配列としての特定の配列の選択は、当業者にとって日常的である。
目的の配列の例にはまた、遺伝子変異体（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子の挿入、欠失、再配置、又は特異的突然変異）が含まれる。このような目的の配列の存在又は非存在の同定は、例えば、治療が特定の個体に有益であるかどうかを予測するために、治療の有効投薬量を予測するために、治療をモニター及び／又は調整するために、並びに特定の個体に治療を適合させるために、コンパニオン診断試験において使用され得る。
サンプルは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などの高分子量材料を含むことができる。サンプルは、ｃｆＤＮＡなどの低分子量材料を含むことができる。別の実施形態では、低分子量材料は、酵素的又は機械的に断片化されたＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、数百塩基対の長さなどの使用可能な長さに断片化する。別の実施形態では、ｃｆＤＮＡが鋳型として使用され、ｃｆＤＮＡが短い断片として存在するので、断片化は、典型的には必要とされない。例えば、胎児ｃｆＤＮＡは、＜３００ｂｐの断片として血流中を循環し、母体ｃｆＤＮＡは、約５００〜１，０００ｂｐの断片として循環すると推定されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、５０：１００２−１０１１）。ランダム断片化とは、酵素的、化学的又は機械的手段による、非秩序様式でのサンプルからのポリヌクレオチド分子の断片化を指す。このような断片化方法は、当技術分野で既知であり、標準的な方法を使用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。一実施形態では、断片化は、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２０１６／１３０７０４号パンフレット）に開示されている方法を使用する。明確にするために、このようなより小さい断片の特異的ＰＣＲ増幅を介して、核酸のより大きい部分のより小さい断片を生成することは、核酸配列のより大きい部分が無傷のままである（すなわち、ＰＣＲ増幅によって断片化されない）ので、核酸のより大きい部分を断片化することと同等ではない。さらに、ランダム断片化は、切断を含む及び／又は取り囲むヌクレオチドの配列同一性又は位置にかかわらず、断片を産生するように設計される。より具体的には、無作為断片化は噴霧又は超音波処理などの機械的手段によるものであり、長さ約５０塩基対〜長さ約１５００塩基対、さらにより具体的には、長さ５０〜７００塩基対、さらにより具体的には、長さ５０〜４００塩基対の断片を生成する。最も具体的には、本方法は、長さ５０〜１５０塩基対のより小さい断片を生成するために使用される
機械的手段（例えば、噴霧、超音波処理、及び／又はハイドロシェア）によるポリヌクレオチド分子の断片化は、５’リン酸を欠く末端を含む、平滑末端並びに３’及び５’突出末端の不均一な混合物を有する断片を生じる。さらに、ｃｆＤＮＡはまた、平滑末端並びに３’及び５’突出末端の不均一な混合物を含む。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用される鋳型の末端を末端修復によって修復することが望ましい。末端修復は、例えば、クローニングベクターの平滑部位への挿入に最適な末端を生成するために当技術分野で既知の方法又はキットを使用して達成され得る。一実施形態では、核酸の集団の断片末端は、平滑末端であり、場合により断片末端はまたリン酸化される。リン酸部分は、例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを用いた酵素処理によって導入することができる。
一実施形態では、鋳型は、テーリングによって、単一の突出ヌクレオチドを用いて調製される。テーリングは、例えば、単一のデオキシヌクレオチド（例えば、デオキシアデノシン（Ａ））をＤＮＡ分子（例えば、ＰＣＲ産物）の３’末端に付加する非鋳型依存性末端トランスフェラーゼ活性を有する、Ｔａｑポリメラーゼ又はＫｌｅｎｏｗエキソマイナスポリメラーゼのような特定のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用して達成され得る。このような酵素は、二本鎖標的断片の各鎖の平滑末端３’末端に単一ヌクレオチド「Ａ」を付加するために使用され得る。従って、「Ａ」は、Ｔａｑ又はＫｌｅｎｏｗエキソマイナスポリメラーゼとの反応によって、二本鎖標的断片の各末端修復鎖の３’末端に付加され得、一方、汎用アダプターは、汎用アダプターの二本鎖核酸の各領域の３’末端に存在する適合性の「Ｔ」突出を有するＴ構築物であり得る。この末端修飾はまた、連結したアダプター−鋳型−アダプター分子の形成に対する偏りがあるように、自己連結を妨げる。
本明細書に記載される鋳型は、各末端に汎用アダプターを含み得、このような分子は、本明細書では、アダプター−鋳型−アダプター分子と呼ばれる。アダプター−鋳型−アダプター分子を作製するための方法は、汎用アダプターを二本鎖鋳型分子の各末端に付着させることを含む。二本鎖鋳型分子は、対照サンプル（図１、ブロック１０）、試験サンプル（図１、ブロック１４）、又はｒｅＤＮＡ断片の集団（例えば、ライブラリー）（図１、ブロック１３）由来であり得る。この付着は、連結を使用する標準的なライブラリー調製技術によるものであり得る。
一実施形態では、二本鎖鋳型核酸は、最初に同一の汎用アダプター分子を連結してアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することによって処理される。汎用アダプター分子は、二本鎖核酸の領域を含む。一実施形態では、汎用アダプターはまた、一本鎖非相補的核酸鎖の領域を含む。二本鎖及び一本鎖領域を有する汎用アダプターは、「ミスマッチアダプター」とも呼ばれ、その一般的特徴は、以下に定義され、Ｇｏｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許第７，７４１，４６３号明細書）及びＢｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，０５３，１９２号明細書）にさらに記載されている。
汎用アダプターの二本鎖領域は、短い二本鎖領域であり、典型的には、５以上の連続した塩基対を含む。この用語は、ニ本鎖がアニールされている核酸の二本鎖領域を指し、いかなる特定の構造的コンホメーションも意味しない。本明細書で使用される「二本鎖」という用語は、核酸分子に関して使用される場合、核酸分子中の実質的に全てのヌクレオチドが相補的ヌクレオチドに水素結合していることを意味する。２つの鎖が標準的な連結条件下で安定な二重鎖を形成することができるならば、１つ以上のヌクレオチドミスマッチが二本鎖領域内で許容され得ることが理解される。部分的二本鎖核酸は、相補的ヌクレオチドに水素結合したそのヌクレオチドの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を有することができる。一実施形態では、汎用アダプターの２つの鎖は、二本鎖領域において１００％相補的である。
一般に、二本鎖領域は、機能を失うことなくできるだけ短いことが有利である。この文脈において、「機能」とは、当業者に既知の酵素触媒核酸連結反応のための標準的な反応条件（例えば、酵素に適切な連結緩衝液中、４℃〜２５℃の範囲の温度でのインキュベーション）下で安定な二重鎖を形成する二本鎖領域の能力を指し、その結果、汎用アダプターを形成する２つの鎖は、鋳型分子への汎用アダプターの連結の間、部分的にアニーリングされたままである。二本鎖領域は、プライマー伸長又はＰＣＲ反応のアニーリング工程において典型的に使用される条件下で安定である必要はない。
同一の汎用アダプターが各標的分子の両端に連結されているので、各アダプター−鋳型−アダプター分子中の鋳型配列は、汎用アダプターの二本鎖領域に由来する相補的配列に隣接する。アダプター−鋳型−アダプター構築物中の二本鎖領域、従ってそれに由来する相補的配列が長ければ長いほど、アダプター−鋳型−アダプター構築物がプライマー伸長及び／又はＰＣＲにおいて使用されるアニーリング条件下で、内部自己相補性のこれらの領域において折り返し、それ自体に塩基対を形成することができる可能性が高くなる。従って、この効果を減少させるために、二本鎖領域は、長さが２０塩基対以下、１５塩基対以下、又は１０塩基対以下であることが一般に好ましい。いくつかの実施形態では、二本鎖領域の安定性は、標準的なワトソン−クリック塩基対よりも強い塩基対を示す非天然ヌクレオチドを含めることによって増加され得、従って、その長さは潜在的に減少され得る。
本明細書で使用するための汎用アダプターは、一般に、アダプターの「連結可能な」末端、すなわち連結反応において二本鎖標的断片に連結される末端を形成する二本鎖領域を含む。汎用アダプターの連結可能な末端は、平滑であり得るか、又は別の実施形態では、連結を容易にする／促進するために１つ以上のヌクレオチドの短い５’又は３’突出が存在し得る。汎用アダプターの連結可能な末端の５’末端ヌクレオチドは、典型的にはリン酸化されて、標的ポリヌクレオチド上の３’ヒドロキシル基へのホスホジエステル結合を可能にする。
汎用アダプターの二本鎖領域は、典型的には、汎用除去配列及び汎用プライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、汎用除去配列を汎用プライマー結合部位として使用することができる。場合により、汎用伸長プライマー結合部位のような１つ以上の他の汎用配列が存在し得る。
除去配列とも呼ばれる汎用除去配列は、それが結合する鋳型から汎用アダプターを除去するために使用することができるヌクレオチド配列であり、例えば、除去配列の使用は、アダプター−鋳型−アダプター分子を３つの別個の分子：鋳型及び２つの汎用アダプターに変換するのを助けることができる。汎用アダプターを除去するための他の方法は、非天然ヌクレオチド、及び非天然骨格結合の使用を含む。汎用アダプターは、場合によりホスホジエステル及び非ホスホジエステル骨格結合の混合物によって連結されてもよい天然及び非天然ヌクレオチドの混合物を含んでもよい。アダプター−鋳型−アダプター分子からの汎用アダプターの切断を容易にするために、他の非ヌクレオチド修飾を含めてもよい。このような非天然ヌクレオチド及び結合は、本明細書に詳細に記載されるように、アダプター−鋳型−アダプター分子の増幅の間に汎用アダプターに導入され得る。
一実施形態では、除去配列は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、制限エンドヌクレアーゼが結合することができるヌクレオチド配列である。任意の制限エンドヌクレアーゼを使用することができ、任意の有用な制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、当業者に知られている。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型、ＩＩＩ型、又はＩＶ型酵素である。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、認識部位で二本鎖ＤＮＡを切断するものである。別の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、認識部位から特定の距離で二本鎖ＤＮＡを切断するものである。例えば、いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、残りの断片から認識部位を切除するものである。認識部位の近くで二本鎖ＤＮＡを切断する有用な制限エンドヌクレアーゼの例としては、ＭｌｙＩ、ＳａｐＩ及びＢｐｕＥＩが挙げられるが、これらに限定されない。
当業者は、認識部位から特定の距離で切断する制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、除去後の最終生成物（すなわち、鋳型及び汎用アダプター）の組成の制御が可能になることを認識する。除去配列が認識部位から特定の距離で切断するエンドヌクレアーゼの認識部位である一実施形態では、認識部位を二本鎖領域に配置して、全ての汎用アダプター配列の除去をもたらすことができる（例えば、汎用アダプターの除去後に生じる鋳型分子は、アダプター−鋳型−アダプター分子を生成するために使用された鋳型と同一である）。除去配列が認識部位から特定の距離で切断するエンドヌクレアーゼの認識部位である別の実施形態では、認識部位は、二本鎖領域に配置されて、いくつかの汎用アダプター配列の除去をもたらすことができる（例えば、汎用アダプターの除去後に生じる鋳型分子は、鋳型と、アダプター−鋳型−アダプター分子を生成するために使用された汎用アダプターの一部である）。除去配列が認識部位から特定の距離で切断するエンドヌクレアーゼの認識部位であるさらに別の実施形態では、認識部位を二本鎖領域に配置して、全ての汎用アダプター配列と、汎用アダプターの各末端に位置し、且つ汎用アダプターに隣接する鋳型配列のいくつかを除去することができる（例えば、汎用アダプターの除去後に生じる鋳型分子は、アダプター−鋳型−アダプター分子を生成するために使用された鋳型の、天然に存在しないより短いバージョンである）。
一実施形態では、汎用アダプターはまた、一本鎖非相補的核酸鎖の領域を含む。「非対応領域」とも呼ばれるこの領域は、汎用アダプターを形成する２つのポリヌクレオチド鎖の配列がプライマー伸長又はＰＣＲ反応のための標準的なアニーリング条件下で２つの鎖が互いに完全にアニーリングすることができないような非相補性の程度を示す領域を指す。非対応領域は、増幅反応におけるアニーリング条件下で２つの鎖が一本鎖形態に戻るという条件で、酵素触媒連結反応のための標準的な反応条件下である程度のアニーリングを示し得る。一実施形態では、試験サンプルからのｒｅＤＮＡ及び断片化核酸へのアダプターの付加（図１、ブロック１５）は、二本鎖領域及び一本鎖領域の両方を有する汎用アダプターの付加を生じる。この付加は、１つの工程（例えば、二本鎖領域及び一本鎖領域の両方を有する汎用アダプターの連結）又は２つ以上の工程（例えば、二本鎖領域を有する汎用アダプターの連結、続いて一本鎖領域を付加するための増幅）であり得る。
非対応領域におけるミスマッチは、一方の鎖に一本鎖領域が存在するように、一方の鎖が他方の鎖よりも長い形態をとることができ、又は２本の鎖がハイブリダイズせず、従って両方の鎖に一本鎖領域を形成するように選択された配列をとることができる。ミスマッチはまた、汎用アダプター構築物の両端が互いにハイブリダイズし、二重鎖を形成することができるが、中央領域は、そうではない「バブル」の形態をとり得る。非対応領域を形成する鎖の部分は、同じ２つの鎖の他の部分がアニールされて１つ以上の二本鎖領域を形成する条件下では、アニールされない。疑いを避けるために、後に連結を受けるポリヌクレオチド二重鎖の３’末端の一本鎖又は一塩基突出は、本開示の文脈において「非対応領域」を構成しないことが理解されるべきである。
一本鎖非相補的核酸鎖の領域は、典型的には、少なくとも１つの汎用伸長プライマー結合部位を含む。汎用プライマー伸長結合部位は、汎用プライマー伸長結合部位に相補的である汎用捕捉核酸の集団を使用して、複数の異なる核酸、例えば複数の異なるアダプター−鋳型−アダプター分子を捕捉するために使用され得る。
場合により、１つ以上の他の汎用配列が存在することができる。一実施形態では、一本鎖非相補的核酸鎖の領域はまた、少なくとも１つのサンプル特異的インデックスを含む。サンプル特異的インデックスは、アレイ上の特定の鋳型の供給源のマーカー特性として使用され得る。一般に、サンプル特異的インデックスは、ライブラリー調製工程の一部として鋳型に付加される汎用アダプターの一部であるヌクレオチドの合成配列である。従って、サンプル特異的インデックスは、特定のサンプルの鋳型分子の各々に付着される核酸配列であり、その存在は、鋳型分子が単離されたサンプルを示すか、又は同定するために使用される。
好ましくは、サンプル特異的インデックスは、長さが２０ヌクレオチドまで、より好ましくは１〜１０ヌクレオチド、最も好ましくは４〜６ヌクレオチドであり得る。４ヌクレオチドインデックスは、同じアレイ上で２５６個のサンプルを多重化する可能性を与え、６塩基タグは、４０９６個のサンプルが同じアレイ上で処理されることを可能にする。
非対応領域の長さの下限は、典型的には、機能、例えば、ｉ）プライマー伸長、ＰＣＲ及び／又は配列決定のためのプライマーの結合（例えば、汎用プライマー結合部位へのプライマーの結合）、又はｉｉ）表面へのアダプター−鋳型−アダプターの固定化のための汎用捕捉核酸の結合（例えば、汎用プライマー伸長結合部位への汎用捕捉核酸の結合）のための適切な配列を提供する必要性によって決定されるであろう。理論的には、一般に、例えば、連結工程後のアダプター−鋳型−アダプター構築物からの非結合汎用アダプターの分離を容易にするために、汎用アダプターの全長を最小限にすることが有利であることを除いて、非対応領域の長さに上限はない。従って、非対応領域は、５０未満、又は４０未満、又は３０未満、又は２５未満の連続ヌクレオチド長であるべきであることが一般に好ましい。
汎用アダプターの正確なヌクレオチド配列は、一般に本開示に限定されないが、非対応領域における個々の鎖の配列は、いずれの個々の鎖も、標準的なアニーリング条件下で自己アニーリング、ヘアピン構造の形成などをもたらし得るいかなる内部自己相補性も示さないようなものであるべきである。非対応領域における鎖の自己アニーリングは、この鎖へのプライマーの特異的結合を防止又は減少させ得るので、回避されるべきである。
一実施形態では、汎用アダプターは、アダプター−鋳型−アダプター分子からのアダプターのその後の除去に必要な全ての配列を含む（図１、ブロック１３）。一実施形態では、汎用アダプターは、その後の増幅及び／又は配列決定のために、アレイ上にアダプター−鋳型−アダプター分子を固定化するために必要な全ての配列を含む（図１、ブロック１６）。別の実施形態では、増幅工程は、固定化及び配列決定の前に、各アダプター−鋳型−アダプター分子中に存在する汎用アダプターをさらに改変するために使用される（図１、ブロック１６）。例えば、鋳型の一部のヌクレオチド配列を決定する実施形態では、初期プライマー伸長反応は、個々の各アダプター−鋳型−アダプター分子の両方の鎖に相補的な伸長産物が形成され、汎用伸長プライマー部位を付加する汎用プライマー結合部位を使用して実施することができる。得られたプライマー伸長産物、及び場合によりその増幅されたコピーは、集合的に、固定化され、次いで配列決定され得る鋳型ポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
連結方法を使用して、汎用アダプターを鋳型に結合することができる。本明細書で有用な連結方法は、当技術分野で既知であり、標準的な方法を使用する。このような方法は、共有結合が形成されるように、この場合、汎用アダプター及び二本鎖鋳型の２つのポリヌクレオチド鎖の末端の結合をもたらすか又は触媒するために、ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼ酵素を使用する。汎用アダプターは、鋳型上に存在する３’−ＯＨへの連結を容易にするために、５’−リン酸部分を含み得る。二本鎖鋳型は、残留するか又は酵素処理工程を用いて付加された５’−リン酸部分を含み、末端修復され、場合により、突出する塩基（単数又は複数）によって伸長されて、連結に適切な３’−ＯＨを与える。この文脈において、結合は、以前に共有結合されていなかったポリヌクレオチド鎖の共有結合を意味する。本開示の特定の態様では、このような結合は、２つのポリヌクレオチド鎖間のホスホジエステル結合の形成によって起こるが、他の共有結合の手段（例えば、非ホスホジエステル骨格結合）も使用され得る。
本明細書で議論されるように、一実施形態では、連結に使用される汎用アダプターは、完全である。例えば、汎用アダプターがｒｅＤＮＡライブラリーを産生するために付加される場合（図１、ブロック１１）、汎用アダプターは、二本鎖領域及び汎用プライマー結合部位、汎用除去配列、又はそれらの組み合わせ（図３）のような汎用配列を含み得る。汎用アダプターが試験サンプルからのｒｅＤＮＡ断片又は断片化核酸の集団に付加される場合（図１、ブロック１５）、汎用アダプターは、例えば、汎用除去配列、汎用プライマー結合部位、汎用伸長プライマー結合部位、サンプル特異的インデックス、又はそれらの組み合わせを含む二本鎖及び一本鎖領域を含み得る（図４）。当業者は、断片の各集団について異なるインデックスを使用することにより、配列決定後の後の鋳型分子の供給源の同定が可能になるので、ｒｅＤＮＡ及び試験サンプルＤＮＡへの付加のために異なる汎用アダプターを使用する利点を容易に理解するであろう。複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を使用して、配列決定のための固定化サンプルを調製することができる（図１、ブロック１６）。
また、本明細書で議論されるように、一実施形態では、連結において使用される汎用アダプターは、汎用プライマー結合部位（図５）のような、汎用配列を有し得る二本鎖領域を含む。得られた複数のアダプター−鋳型−アダプター分子（図１、ブロック１５）をさらに改変して、汎用伸長プライマー結合部位及びサンプル特異的インデックス（図６）などのさらなる汎用配列を含むことができる。二本鎖標的断片に連結される汎用プライマーへの、汎用伸長プライマー結合部位などの特異的配列の付加方法は、ＰＣＲに基づく方法を含み、当技術分野で既知であり、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，０５３，１９２号明細書）及びＧｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２０１６／１３０７０４号パンフレット）に記載されている。
汎用アダプターが、さらなる汎用配列を含むように改変される実施形態において、増幅反応が調製される。増幅反応の内容物は、当業者に既知であり、適切な基質（例えば、ｄＮＴＰ）、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、及び増幅反応に必要な緩衝成分を含む。一般に、増幅反応は、増幅反応の各サイクルのプライマーアニーリング工程で遭遇する条件下で、増幅されるべきポリヌクレオチド配列の一部に特異的にアニーリングすることができる、しばしば「フォワード」プライマー及び「リバース」プライマー（プライマーオリゴヌクレオチド）と呼ばれる、少なくとも２つの増幅プライマーを必要とする。特定の実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、同一であり得る。従って、汎用プライマーは、アニーリング工程の間に増幅されるべきポリヌクレオチド分子（又は鋳型が一本鎖と見なされる場合には、その相補体）における汎用プライマー結合部位のような汎用配列にアニーリングすることができるヌクレオチドの配列である「汎用プライマー結合部位特異的部分」を含む。
本開示の実施形態に応じて、汎用プライマーは、全てのサンプルについて汎用であり得るか、又はフォワードプライマー若しくはリバースプライマーの１つは、サンプル供給源をコードするインデックス配列を保有し得る。汎用プライマーは、連結されたアダプターのインデックス領域を横切ってハイブリダイズし得、この場合、各サンプル核酸について独特のプライマーを使用することが有利である。増幅反応は、３つ以上の汎用プライマーを使用して行うことができる。連結されたアダプター−アダプターダイマーの増幅を防止するために、汎用プライマーは、連結されたアダプターの全体にわたって、連結された鋳型（又はその３’末端に付着したｄＮＴＰ）にハイブリダイズするヌクレオチドを含むように改変され得る。この第１の汎用プライマーは、鎖のエキソヌクレアーゼ消化を防止するのを助けるために改変及び処理することができ、従って、インデックスされたプライマーの各々を別々に改変及び処理するよりもむしろ、全てのサンプルを増幅することができる第１の汎用プライマーを有することが有利であり得る。インデックスされたプライマーは、増幅反応においてサンプル特異的な第３のプライマーとして導入され得るが、エキソヌクレアーゼ消化を減少させるために特別に改変及び処理される必要はない。この実施形態の場合、インデックスを有する第３の汎用プライマーは、第１の汎用プライマーの伸長から生じる二重鎖を増幅するために使用することができるように、第１の汎用プライマーの少なくとも一部と同じ配列を含むことができる。
本開示の文脈において、「増幅されるべきポリヌクレオチド分子」という用語は、増幅反応に添加される元の又は出発のアダプター−鋳型−アダプター配列を指す。フォワード及びリバース汎用プライマーにおける「汎用プライマー結合部位特異的部分」は、増幅反応の開始時に存在する元の又は初期のアダプター−鋳型−アダプターにアニールすることができる配列を指し、「汎用プライマー結合部位特異的部分」の長さへの言及は、開始アダプター−鋳型−アダプター分子にアニールするプライマーにおける配列の長さに関連する。プライマーが第１の増幅サイクルにおいて開始アダプター−鋳型−アダプター分子にアニールしない任意のヌクレオチド配列を含む場合、この配列は、増幅産物にコピーされ得ることが理解される。従って、増幅の最初のサイクル及びその後のサイクルで産生される増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子は、開始アダプター−鋳型−アダプター分子よりも長くてもよい。
ミスマッチアダプターは異なる長さであり得るので、各鎖の３’末端及び５’末端に付加されるアダプター配列の長さは、異なり得る。汎用プライマーはまた、互いに異なる長さであり得、異なる長さのアダプターにハイブリダイズし得、従って、各鎖の末端に付加される長さは、制御され得る。ネステッドＰＣＲの場合、３つ以上の汎用プライマーは、以前のアンプリコンを増幅するために使用されるプライマーよりも長くなるように設計され得、その結果、付加されるヌクレオチドの長さは完全に制御可能であり、所望される場合、数百の塩基対であり得る。一実施形態では、第１の汎用プライマーは、連結されたアダプターに１３塩基を付加し、第３の汎用プライマーは、アンプリコンの一端がアダプター標的構築物の短いアームよりも４０塩基長くなるように、さらなる２７塩基を付加する。アダプターの短いアームは、２０塩基長であり、これは、調製された鋳型が鋳型＋末端に６０の付加塩基を含むことを意味する。第２の汎用プライマーは、アダプターの長いアームよりも２５塩基長く、これは、３２塩基長＋サンプルに付加されたｄＡＴＰヌクレオシドを横切ってハイブリダイズする追加のＴである。従って、調製された鋳型は、ゲノム断片＋付加されたｄＡＴＰ＋５７の既知の塩基を含む。従って、完全には、各鋳型二重鎖の１つの鎖は、５’末端から：６０の既知の塩基、Ｔ、ゲノム断片、Ａ、５７の既知の塩基−３’末端を含む。この鎖は、配列：５’−５７の既知塩基、Ｔ、ゲノム断片、Ａ、６０の既知塩基−３’末端に完全に相補的である。長さ５７及び６０は任意であり、明確にするために示されており、限定するものと見なされるべきではない。付加される配列の長さは、所望の実験設計に応じて２０〜１００塩基以上であってもよい。
フォワードプライマー及びリバースプライマーは、アダプター配列の全体及び標的配列の少なくとも１つの塩基（又は標的鎖に３’−突出として付加されたヌクレオチドｄＮＴＰ）にハイブリダイズするのに十分な長さであり得る。フォワードプライマー及びリバースプライマーはまた、アダプター構築物を越えて延びる領域を含み得、従って、汎用プライマーは、少なくとも２０〜１００塩基長であり得る。フォワード及びリバースプライマーは、有意に異なる長さであり得；例えば、一方は、２０〜４０塩基であり得、他方は、４０〜１００塩基長であり得る。フォワードプライマー及びリバースプライマーの汎用アダプター特異的部分のヌクレオチド配列は、存在する任意の他の標的配列への非特異的ハイブリダイゼーションを最小限にしながら、増幅反応のアニーリング工程の条件下で増幅されるべきアダプター−鋳型−アダプター分子への特異的ハイブリダイゼーションを達成するように選択される。
完全に満たない相補性の配列で十分なレベルの特異的アニーリングを達成することができるので、汎用アダプター特異的部分が１００％相補的であることは、厳密には必要とされないことを当業者は理解するであろう。特に、汎用アダプター特異的部分における１つ又は２つのミスマッチは、通常、特異性に悪影響を及ぼすことなく許容され得る。従って、「汎用プライマー結合部位特異的部分」という用語は、アダプター−鋳型−アダプター分子の汎用アダプターと１００％の相補性を必要とすると解釈されるべきではない。しかしながら、プライマーが、各々のプライマー結合配列以外のアダプター−鋳型−アダプターの領域に非特異的にアニーリングしないという要件が満たされなければならない。
汎用プライマーは、一般に、一本鎖ポリヌクレオチド構造である。これらはまた、天然及び非天然の塩基の混合物、並びに天然及び非天然の骨格結合を含み得るが、ただし、任意の非天然の修飾は、増幅反応の条件の間にポリヌクレオチド鎖にアニールし、新規相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点として作用する能力であるプライマーとしての機能を排除しない。
本明細書で議論されるように、本開示の方法は、アダプター−鋳型−アダプター分子からの汎用アダプターの除去を含み得る（図１、ブロック１３）。一実施形態では、汎用アダプターは、汎用除去配列を使用することによって除去することができる。別の実施形態では、脱塩基部位の切断、リボヌクレオチドの切断、光化学的切断、ヘミメチル化ＤＮＡの切断、リンカー（例えば、ペプチドリンカー、ｐＨ感受性リンカー、熱感受性リンカー）の切断、メチル化、又は物理的な力を含むがこれらに限定されない化学的切断方法を使用して、アダプター−鋳型−アダプター分子から汎用アダプターを除去することができる。これらの他の方法は、典型的には、非天然ヌクレオチド、非天然骨格結合、又はそれらの組み合わせの使用を含む。従って、一実施形態では、汎用プライマーは、アダプター−鋳型−アダプター分子からの汎用アダプターの切断を容易にするために、天然及び非天然ヌクレオチドの混合物、ホスホジエステル及び非ホスホジエステル骨格結合の混合物、他の非ヌクレオチド修飾、又はそれらの組み合わせを含み得る。このような代替ヌクレオチド、連結、及び／又は修飾を含む汎用プライマーの使用は、代替ヌクレオチド、連結、及び／又は修飾を含むアダプター−鋳型−アダプター分子を生じる。
用語「化学的切断」は、二本鎖アダプター−鋳型−アダプター分子の一方又は両方の鎖の切断を促進／達成するために、非核酸及び／又は非酵素化学試薬を使用する任意の方法を包含する。必要に応じて、アダプター−鋳型−アダプター分子の一方又は両方の鎖は、所定の切断部位での化学的切断反応を可能にするために、１つ以上の非ヌクレオチド化学部分及び／又は非天然ヌクレオチド及び／又は非天然骨格結合を含み得る。典型的には、化学的切断に適した部位がその部位を含む汎用プライマーを用いてアダプター−鋳型−アダプター分子に導入される。
一実施形態では、アダプター−鋳型−アダプター分子の１つの鎖は、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）での処理による切断を可能にするジオール結合（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２７０７３９号明細書を参照されたい）を含み得る。ジオール結合は、所定の切断部位に配置され得、その正確な位置は、使用者によって選択され得る。２つ以上のジオールが切断部位に含まれ得ることが理解されるであろう。
ポリヌクレオチド鎖への組み込みに適したホスホラミダイト化学に基づくジオールリンカー単位は、商業的に入手可能である（例えば、Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ、ＵＳＡから）。１つ以上のジオール単位は、自動化学ＤＮＡ合成のための標準的な方法を使用して、プライマーとして使用するためのポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
ジオールリンカーは、ジオールの切断を促進する任意の物質であり得る「切断剤」での処理によって切断される。好ましい切断剤は、過ヨウ素酸塩、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（ＮａＩＯ４）である。切断剤（例えば、過ヨウ素酸塩）で処理してジオールを切断した後、切断反応で生成した反応種を中和するために、切断生成物を「キャッピング剤」で処理することができる。この目的に適したキャッピング剤には、アミン、例えばエタノールアミンが含まれる。有利には、キャッピング剤（例えば、エタノールアミン）は、切断剤（例えば、過ヨウ素酸塩）との混合物中に含まれ得、その結果、反応種は、それらが形成されるとすぐにキャッピングされる。
「脱塩基部位」は、塩基成分が除去されたポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオシド位置として定義される。脱塩基部位は、ヌクレオシド残基の加水分解による生理学的条件下でＤＮＡ中に天然に存在し得るが、人工条件下で化学的に、又は酵素の作用によっても形成され得る。一旦形成されると、脱塩基部位は切断され得（例えば、エンドヌクレアーゼ又は他の一本鎖切断酵素での処理、熱又はアルカリへの曝露によって）、ポリヌクレオチド鎖の部位特異的切断のための手段を提供する。
好ましいが非限定的な実施形態では、アダプター−鋳型−アダプター分子の汎用アダプターの所定の位置に脱塩基部位を作製することができる。所定の切断部位にデオキシウリジン（Ｕ）を含む汎用プライマーを使用する。次いで、酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用して、増幅されたｒｅＤＮＡライブラリーのメンバーからウラシル塩基を除去し、１本鎖上に脱塩基部位を生成することができる。次いで、脱塩基部位を含むポリヌクレオチド鎖は、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼ、ＡＰリアーゼ、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ、ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ）、熱、又はアルカリでの処理によって、脱塩基部位で切断され得る。
脱塩基部位はまた、デオキシウリジン以外の非天然／修飾デオキシリボヌクレオチドで生成され得、エンドヌクレアーゼ、熱、又はアルカリでの処理によって類似の様式で切断され得る。例えば、汎用プライマーは、８−オキソ−グアニン又はデオキシイノシンを含むことができる。８−オキソ−グアニンは、ＦＰＧグリコシラーゼに暴露することによって、脱塩基部位に変換することができる。デオキシイノシンは、ＡｌｋＡグリコシラーゼに暴露することによって、脱塩基部位に変換することができる。次いで、このようにして生成された脱塩基部位は、典型的には、適切なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＥｎｄｏＩＶ、ＡＰリアーゼ）での処理によって切断され得る。
一実施形態では、切断されるべき二本鎖核酸分子は、適切なグリコシラーゼ（脱塩基部位を生成するため）及び１つ以上の適切なエンドヌクレアーゼ（続いて切断するため）を含む混合物に曝露され得る。このような混合物において、グリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼは、典型的には、少なくとも約２：１の活性比で存在するであろう。特定の実施形態では、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なＵＳＥＲ試薬（ＮＥＢ ＃Ｍ５５０５Ｓ）は、ウラシル塩基における単一ヌクレオチドギャップの作製のために使用される。
一実施形態では、１つ以上のリボヌクレオチドを含む汎用プライマーを使用することができる。そうでない場合にデオキシリボヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド鎖（追加の非ヌクレオチド化学部分、非天然塩基、又は非天然骨格結合を有するか又は有さない）への１つ以上のリボヌクレオチドの組み込みは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合を選択的に切断することができる化学剤を使用するか、又はリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を使用する、切断のための所定の部位を提供することができる。一実施形態では、切断されるべき鎖は、化学的切断のための所定の部位を提供するために、単一のリボヌクレオチドを含む。
デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合を選択的に切断することができる適切な化学的切断剤には、金属イオン、例えば希土類金属イオン（とりわけＬａ＋、特にＴｍ＋、Ｙｂ＋又はＬｕ＋（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００２、３２：５１８−５２０；Ｋｏｍｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９、１４４３−１４５１））、Ｆｅ（３）若しくはＣｕ（３）、又は高ｐＨへの曝露、例えば水酸化ナトリウムなどの塩基での処理が含まれる。「デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合の選択的切断」とは、化学的切断剤が同じ条件下で２つのデオキシリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することができないことを意味する。
リボヌクレオチドの塩基組成は、一般に重要ではないが、化学的（又は酵素的）切断を最適化するように選択することができる。例として、ｒＵＭＰ又はｒＣＭＰは、金属イオン、特に希土類金属イオンに暴露することによって切断を行う場合に一般に好ましい。
リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの間、又は２つのリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、ＲＮａｓｅによっても切断することができる。適切な基質特異性の任意のエンドサイトーシスリボヌクレアーゼをこの目的のために使用することができる。リボヌクレアーゼによる切断のためには、２つ以上の連続したリボヌクレオチド、好ましくは、２〜１０又は５〜１０の連続したリボヌクレオチドを含むことが好ましい。リボヌクレオチドの正確な配列は、一般に、特定のＲＮａｓｅが特定の残基後の切断に対して特異性を有することを除いて、重要ではない。適切なＲＮａｓｅには、例えば、Ｃ及びＵ残基後に切断するＲＮａｓｅＡが含まれる。従って、ＲＮａｓｅＡで切断する場合、切断部位は、Ｃ又はＵである少なくとも１つのリボヌクレオチドを含まなければならない。
１つ以上のリボヌクレオチドを組み込む汎用プライマーは、適切なリボヌクレオチド前駆体を用いたオリゴヌクレオチド化学合成のための標準的な技術を使用して容易に合成され得る。
用語「光化学的切断」は、二本鎖核酸分子の一方又は両方の鎖の切断を達成するために光エネルギーを利用する任意の方法を包含する。
光化学的切断のための所定の部位は、二本鎖分子の鎖の１つにおける非ヌクレオチド化学的スペーサー単位によって提供され得る。適切な光化学的切断可能スペーサーには、以下の構造を有する、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ、ＵＳＡ（カタログ番号１０−４９１３−ＸＸ）により供給されるＰＣスペーサーホスホアミダイト（４−（４，４’−ジメトキシトリチロキシ）ブチルアミドメチル）−１−（２−ニトロフェニル）−エチル］−２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト）が含まれる：
Figure 0006974504
スペーサー単位は、ＵＶ光源に暴露することによって切断され得る。
このスペーサー単位は、オリゴヌクレオチドの化学合成のための標準的な技術を使用して、固体表面への付着を可能にするチオリン酸基と共に、ポリヌクレオチドの５’末端に付着され得る。好都合には、このスペーサー単位は、固相増幅による光切断可能な二本鎖核酸分子の合成のために使用されるフォワード又はリバース増幅プライマーに組み込まれ得る。
二本鎖核酸分子の１つの鎖の部位特異的切断はまた、１つ以上のメチル化ヌクレオチドを組み込む汎用プライマーを使用し、次いで、増幅されたｒｅＤＮＡライブラリーのメンバーを、メチル化ヌクレオチドを含む認識配列に特異的なエンドヌクレアーゼ酵素で切断することによって達成され得る。
メチル化ヌクレオチドは、典型的には、相補鎖上に非メチル化デオキシリボヌクレオチドの相補的ストレッチを有する二本鎖アダプター−鋳型−アダプター分子の１つの鎖の領域に組み込まれ、その結果、２つの鎖のアニーリングは、ヘミメチル化二重鎖構造を生成するであろう。次いで、ヘミメチル化二重鎖は、適切なエンドヌクレアーゼの作用によって切断され得る。
１つ又はメチル化ヌクレオチドを組み込む汎用プライマーは、適切にメチル化されたヌクレオチド前駆体を使用して、自動ＤＮＡ合成のための標準的な技術を使用して調製され得る。
プライマーは、非ヌクレオチド化学修飾、例えば、エキソヌクレアーゼ耐性を増加させるための骨格修飾を有するホスホロチオエートをさらに含んでもよく、この場合も、修飾がプライマー機能を妨げないことを条件とする。修飾は、例えば、固体支持体、例えばビオチン部分へのプライマーの付着を容易にすることができる。特定の修飾は、それ自体、プライマーとしての分子の機能を改善し得るか、又はプライマー（又はそれに由来する伸長ポリヌクレオチド鎖）が固体支持体から切断されることを可能にするための切断部位を提供するなど、いくつかの他の有用な機能性を提供し得る（例えば、米国特許第９，０８５，８０２号明細書を参照されたい）。
インデックスが汎用アダプターに付着される実施形態において、増幅は、プールされたサンプル又はプールされていないサンプルのいずれかで実施され得る。一実施形態では、インデックスは汎用プライマーの一部であり、従って、各サンプルは、プール前に独立して増幅される。次いで、プールされた核酸サンプルは、配列決定のために処理され得る。
アダプター−鋳型−アダプター分子からアダプターを除去して（図１、ブロック１３）、ｒｅＤＮＡを得た後、サンプルを、除去されたアダプターを鋳型分子から分離する条件に暴露することができる。除去されたアダプターからの所望のｒｅＤＮＡの分離は、捕捉剤の使用によって補助され得る。一実施形態では、捕捉剤は、アダプター−鋳型−アダプター分子の増幅の間にアダプター−鋳型−アダプター分子に添加される（図１、ブロック１２）。例えば、アダプター−鋳型−アダプター分子を増幅するために使用される汎用プライマーは、受容体−リガンド結合対のメンバーなどの捕捉剤を含むことができる。有用な受容体−リガンド結合対の例としては、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、及び抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子は、リガンドである捕捉剤を含む。増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子は、アダプターを除去する条件（例えば、汎用除去配列が制限エンドヌクレアーゼ部位である場合、制限エンドヌクレアーゼへの暴露）に暴露される。一実施形態では、次いで、ｒｅＤＮＡと除去された（付着していない）アダプターとの混合物を、リガンドと受容体との結合に適した条件下でリガンドの受容体に暴露し、受容体に結合した除去されたアダプターをｒｅＤＮＡから分離する。一実施形態では、受容体は、表面に結合されるか、又は付着したアダプターを分離するために使用され得る第２のリガンドをさらに含む。別の実施形態では、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子は、リガンドの受容体を含む表面と接触し、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子は、分子の一端又は両端で表面に結合するようになる。結合した増幅アダプター−鋳型−アダプター分子を、アダプターを除去する条件（例えば、汎用除去配列が制限エンドヌクレアーゼ部位である場合、制限エンドヌクレアーゼへの曝露）に引き続いて曝露すると、除去されたアダプターが表面及び遊離鋳型、すなわちｒｅＤＮＡに結合する。表面は、任意の適切な形状（スライドのような平坦な、又はビーズのような湾曲した）の不活性基質又はマトリックス（例えば、プラスチック、ガラス）であり得る。
別の実施形態では、除去されたアダプターを鋳型分子から分離するために有用な条件は、所定のサイズ範囲（例えば、長さ１５０〜４００ヌクレオチド、又は１５０〜３００ヌクレオチド）について選択する条件を含む。所定のサイズ範囲を選択する方法としては、ゲル電気泳動が挙げられるが、これに限定されない。電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーなどの任意の適切なプロセスを使用することができる。いくつかの実施形態では、固相可逆的固定化常磁性ビーズを使用して、所望のＤＮＡ分子を付着していないアダプターから分離し、サイズに基づいてｒｅＤＮＡを選択することができる。固相可逆的固定化常磁性ビーズは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ａｇｅｎｃｏｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（ＭａｇＪｅｔ）、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｋ（Ｍａｇ−Ｂｉｎｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅａｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｋａｐａ Ｐｕｒｅ Ｂｅａｄｓ）から市販されている。
アダプターの除去の前又は後に、多くの化合物及び組成物が生じ得る。例えば、複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を含む化合物又は組成物であって、アダプターが制限エンドヌクレアーゼ部位を含む化合物又は組成物が提供される。本明細書で提供される別の組成物は、ｒｅＤＮＡ断片の集団、例えばｒｅＤＮＡライブラリーである。一実施形態では、組成物は、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、又は５０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度のｒｅＤＮＡ断片の集団を含むことができる。一実施形態では、組成物は、１５０〜４００ヌクレオチド長、又は１５０〜３００ヌクレオチド長のサイズ範囲を有するｒｅＤＮＡ断片の集団を含むことができる。いくつかの実施形態では、集団は、長さが４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ヌクレオチドから２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０又は４００ヌクレオチドまでの範囲である。
本明細書で提供されるさらに別の組成物は、人工生物学的流体中に存在するｒｅＤＮＡ断片の集団、例えばｒｅＤＮＡライブラリーである。いかなる理論によっても限定されることを意図するものではないが、人工生物学的流体中のｒｅＤＮＡ断片の集団の使用は、天然の試験サンプルを模倣する合成陽性及び陰性対照を提供する。合成対照中のｒｅＤＮＡは、天然の試験サンプル中に見出されるサイズ分布を有し、合成対照中のｒｅＤＮＡのゲノムカバレッジもまた、天然の試験サンプル中に見出されるものと同様である。人工生物学的流体は、天然試験サンプルと合成陽性及び陰性対照との間にさらなるレベルの類似性を付加する。
人工生物学的流体は、天然生物学的流体を模倣する流体である。一般に、天然生物学的流体は、断片化された核酸を対象から得ることができる流体であり得る。例としては、全血、血漿、血清、尿、唾液、痰、洗浄液、脳脊髄液、精液、汗、涙、唾液、便などが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、人工生物学的流体は、水性流体及び天然流体の他の成分を含み、従って、人工流体は、天然流体を模倣する。例えば、人工血漿は、電解質、アルブミン、フィブリノーゲン、凝固因子、緩衝液、及び／又は他の成分を含む天然血漿の成分のいくつかを含み得る。血漿は、しばしば、ＣａＣｌ２、クエン酸塩、又はそれらの組み合わせなどの成分で全血を処理することによって生成され、従って、いくつかの実施形態では、人工血漿は、ＣａＣｌ２、クエン酸塩、又はそれらの組み合わせを含む。全血、血漿、血清、尿、唾液、痰、洗浄液、脳脊髄液、精液、汗、涙、唾液、便などの生物学的流体の成分は既知であり、当業者によって容易に再現され得る。或いは、人工血漿は市販されている（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）。人工生物学的流体はまた、抗菌剤、安定剤などの成分を含むことができるが、これらに限定されない。
ｒｅＤＮＡ断片の集団、例えばｒｅＤＮＡライブラリーは、天然生物学的サンプル中の断片化核酸の濃度を模倣する濃度で人工生物学的流体に添加され得る。例えば、試験サンプルが妊婦由来の血漿サンプルである実施形態において、合成対照は、適切なｒｅＤＮＡライブラリーを、試験サンプル中のｃｆＤＮＡの濃度に類似する濃度で、血漿サンプルに基づく人工生物学的流体に添加することによって生成され得る。一実施形態では、人工生物学的流体は、１ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）〜１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、又は５０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度のｒｅＤＮＡライブラリーを含むことができる。
本明細書のいくつかの実施形態では、１つ以上の供給源由来の複数のアダプター−鋳型−アダプター分子は、次いで、配列決定の前に固定化され、増幅される（図１、ブロック１６）。１つ以上の供給源由来のアダプター−鋳型−アダプター分子を基質に付着させるための方法は、当技術分野で既知である。同様に、固定化されたアダプター−鋳型−アダプター分子を増幅するための方法は、架橋増幅及び動力学排除増幅を含むが、これらに限定されない。配列決定の前に固定化及び増幅するための方法は、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，０５３，１９２号明細書）、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２０１６／１３０７０４号パンフレット）、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，８９５，２４９号明細書）、及びＰｉｐｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（米国特許第９，３０９，５０２号明細書）に記載される。
次いで、プールされたサンプルを含むサンプルは、配列決定のための調製において固定化され得る。配列決定は、単一分子のアレイとして行うことができ、又は配列決定の前に増幅することができる。増幅は、１つ以上の固定化プライマーを使用して行うことができる。固定化されたプライマーは、平坦な表面上のローン、又はビーズのプール上のローンであり得る。ビーズのプールは、エマルジョンの各「区画」において単一のビーズを有するエマルジョンに分離することができる。「区画」当たり１つの鋳型のみの濃度で、単一の鋳型のみが各ビーズ上で増幅される。
本明細書で使用される「固相増幅」という用語は、増幅産物の全部又は一部がそれらが形成されるにつれて固体支持体上に固定化されるように、固体支持体上で、又は固体支持体と関連して実施される任意の核酸増幅反応を指す。特に、この用語は、固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）及び固相等温増幅を包含し、これらは、フォワード及びリバース増幅プライマーの一方又は両方が固体支持体上に固定化されることを除いて、標準溶液相増幅に類似する反応である。固相ＰＣＲは、一方のプライマーがビーズに固定され、他方が遊離溶液中にあるエマルジョン、及び一方のプライマーが表面に固定され、一方が遊離溶液中にある固相ゲルマトリックス中のコロニー形成などのシステムを包含する。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、パターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出した層の中又は上の異なる領域の配置を指す。例えば、１つ以上の領域は、１つ以上の汎用プライマーが存在するフィーチャであり得る。フィーチャは、汎用プライマーが存在しない間隙領域によって分離することができる。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にあるフィーチャのｘ−ｙフォーマットとすることができる。いくつかの実施形態では、パターンは、フィーチャ及び／又は間隙領域の繰り返し配列とすることができる。いくつかの実施形態では、パターンは、フィーチャ及び／又は間隙領域のランダムな配置とすることができる。本明細書に記載される方法及び組成物において使用することができる例示的なパターン化表面は、米国特許第８，７７８，８４８号明細書、同第８，７７８，８４９号明細書、及び同第９，０７９，１４８号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェル又は窪みのアレイを含む。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技法、成形技法、及びマイクロエッチング技法を含むがこれらに限定されない、様々な技法を使用して、当技術分野で一般に知られているように製造することができる。当業者によって理解されるように、使用される技法は、アレイ基質の組成及び形状に依存するであろう。
パターン化された表面のフィーチャは、パターン化された共有結合ゲル（例えば、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ、例えば、米国特許出願公開第２０１３／１８４７９６号明細書、国際公開第２０１６／０６６５８６号パンフレット、及び国際公開第２０１５／００２８１３号パンフレットを参照されたい）を有する、ガラス、シリコン、プラスチック、又は他の適切な固体支持体上のウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）のアレイ中のウェルであり得る。このプロセスは、配列決定のために使用されるゲルパッドを作製し、このゲルパッドは、多数のサイクルを有する配列決定ランにわたって安定であり得る。ウェルへのポリマーの共有結合は、様々な使用の間、構造化基質の寿命を通して構造化フィーチャ内にゲルを維持するのに役立つ。しかしながら、多くの実施形態では、ゲルは、ウェルに共有結合される必要はない。例えば、いくつかの条件において、構造化基質のいずれの部分にも共有結合していないシランを含まないアクリルアミド（ＳＦＡ、例えば米国特許第８，５６３，４７７号明細書を参照されたい）が、ゲル材料として使用され得る。
特定の実施形態では、構造化基質は、固体支持体材料をウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）でパターン化し、パターン化支持体をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、又はＳＦＡのアジド化（ａｚｉｄｏｌｙｚｅｄ）バージョン（アジド−ＳＦＡ）などのその化学修飾異形）でコーティングし、ゲルコーティングされた支持体を、例えば、化学研磨又は機械研磨によって研磨し、それによって、ウェル内にゲルを保持するが、ウェル間の構造化基質の表面上の間隙領域から実質的に全てのゲルを除去又は不活性化することによって作製することができる。プライマー核酸は、ゲル材料に付着させることができる。次いで、標的核酸（例えば、ｃｆＤＮＡ）の溶液を、個々の標的核酸がゲル材料に付着したプライマーとの相互作用を介して個々のウェルに播種されるように、研磨された基質と接触させることができるが、標的核酸は、ゲル材料の非存在又は不活性のために、間隙領域を占有しないであろう。標的核酸の増幅は、間質領域におけるゲルの非存在又は不活性が増殖する核酸コロニーの外側への移動を妨げるので、ウェルに限定される。このプロセスは、好都合に製造可能であり、スケーラブルであり、従来のマイクロ又はナノ製造方法を利用する。
本開示は、１つの増幅プライマーのみが固定化される（他のプライマーは通常、遊離溶液中に存在する）「固相」増幅方法を包含するが、固体支持体には、固定化されたフォワードプライマー及びリバースプライマーの両方が提供されることが好ましい。実際には、増幅プロセスは増幅を維持するために過剰のプライマーを必要とするので、固体支持体上に固定化された「複数の」同一のフォワードプライマー及び／又は「複数の」同一のリバースプライマーが存在するであろう。本明細書におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーへの言及は、文脈が特に示さない限り、そのようなプライマーの「複数」を包含するものとして解釈されるべきである。
当業者に理解されるように、任意の所定の増幅反応は、増幅される鋳型に特異的な少なくとも１つのタイプのフォワードプライマー及び少なくとも１つのタイプのリバースプライマーを必要とする。しかしながら、特定の実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、同一配列の鋳型特異的部分を含み得、完全に同一のヌクレオチド配列及び構造（任意の非ヌクレオチド修飾を含む）を有し得る。言い換えれば、１つのタイプのプライマーのみを使用して固相増幅を行うことが可能であり、このような単一プライマー法は、本開示の範囲内に包含される。別の実施形態は、同一の鋳型特異的配列を含むが、いくつかの他の構造的特徴において異なるフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し得る。例えば、１つのタイプのプライマーは、他に存在しない非ヌクレオチド修飾を含み得る。
本開示の全ての実施形態において、固相増幅のためのプライマーは、好ましくは、プライマーの５’末端又はその近くで固体支持体への一点共有結合によって固定化され、プライマーの鋳型特異的部分は、その同族鋳型にアニールするように遊離のままであり、３’ヒドロキシル基は、プライマー伸長のために遊離である。当技術分野で既知の任意の適切な共有結合手段を、このために使用することができる。選択される付着化学は、固体支持体の性質、及びそれに適用される任意の誘導体化又は官能化に依存するであろう。プライマー自体は、付着を容易にするために、非ヌクレオチド化学修飾であり得る部分を含み得る。特定の実施形態では、プライマーは、５’末端に、ホスホロチオエート又はチオホスフェートなどの硫黄含有求核試薬を含み得る。固体支持ポリアクリルアミドヒドロゲルの場合、この求核試薬は、ヒドロゲル中に存在するブロモアセトアミド基に結合することができる。プライマー及び鋳型を固体支持体に付着させるより具体的な手段は、国際公開第０５／０６５８１４号パンフレットに完全に記載されているように、重合アクリルアミド及びＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）からなるヒドロゲルへの５’ホスホロチオエート付着を介するものである。
本開示の特定の実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応性基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって「官能化」された不活性基質又はマトリックス（例えば、スライドガラス、ポリマービーズなど）からなる固体支持体を利用してもよい。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基質上に支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。そのような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有結合されてもよいが、中間材料自体は、基質又はマトリックス（例えば、ガラス基質）に非共有結合されてもよい。用語「固体支持体への共有結合」は、従って、このタイプの配置を包含するものとして解釈されるべきである。
プールされたサンプルは、各ビーズがフォワード及びリバース汎用プライマーを含むビーズ上で増幅され得る。特定の実施形態では、本開示の第１、第２、又は第３の態様に従って調製された鋳型のライブラリーは、固相増幅、より具体的には固相等温増幅により、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、米国特許第７，１１５，４００号明細書、国際公開第００／１８９５７号パンフレット及び国際公開第９８／４４１５１号パンフレットに記載されているものに類似する核酸コロニーのクラスター化アレイを調製するために使用される。用語「クラスター」及び「コロニー」は、本明細書では、複数の同一の固定化核酸鎖及び複数の同一の固定化相補的核酸鎖からなる固体支持体上の別個の部位を指すために、互換的に使用される。用語「クラスター化アレイ」は、このようなクラスター又はコロニーから形成されるアレイを指す。この文脈において、用語「アレイ」は、クラスターの順序付けられた配置を必要とするものとして理解されるべきではない。
用語「固相」又は「表面」は、プライマーが平坦な表面（例えば、ガラス、シリカ又はプラスチック顕微鏡スライド又は類似のフローセルデバイス）に付着される平面アレイ；１つ又は２つのプライマーがビーズに付着され、ビーズが増幅されるビーズ；又はビーズが増幅された後の表面上のビーズのアレイのいずれかを意味するために使用される。
クラスター化アレイは、国際公開第９８／４４１５１号パンフレットに記載されているようなサーモサイクリングのプロセス、又は温度が一定に維持され、伸長及び変性のサイクルが試薬の変更を用いて行われるプロセスのいずれかを用いて調製することができる。このような等温増幅法は、特許出願番号、国際公開第０２／４６４５６号パンフレット及び米国特許出願公開第２００８／０００９４２０号パンフレットに記載されている。等温プロセスにおいて必要とされるより低い温度のために、これは特に好ましい。
本明細書に記載されるか、又は当技術分野で一般に知られている増幅方法論のいずれも、固定化されたＤＮＡ断片を増幅するために、汎用プライマー又は標的特異的プライマーと共に使用することができることを理解するであろう。増幅のための適切な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及び米国特許第８，００３，３５４号明細書に記載されるような核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の増幅方法は、目的の１つ以上の核酸を増幅するために使用され得る。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを用いて、固定化ＤＮＡ断片を増幅することができる。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドに特異的に指向されるプライマーは、増幅反応に含まれる。
ポリヌクレオチドの増幅のための他の適切な方法は、オリゴヌクレオチド伸長及び連結、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８））及びオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）（一般に、米国特許第７，５８２，４２０号明細書、同第５，１８５，２４３号明細書、同第５，６７９，５２４号明細書及び同第５，５７３，９０７号明細書；欧州特許第０ ３２０ ３０８ Ｂ１号明細書；欧州特許第０ ３３６ ７３１ Ｂ１号明細書；欧州特許第０ ４３９ １８２ Ｂ１号明細書；国際公開第９０／０１０６９号パンフレット；国際公開第８９／１２６９６号パンフレット；並びに国際公開第８９／０９８３５号パンフレットを参照されたい）技術を含み得る。これらの増幅方法論は、固定化ＤＮＡ断片を増幅するように設計され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に指向されるプライマーを含む連結プローブ増幅又はオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に指向されるプライマーを含むプライマー伸長−連結反応を含み得る。目的の核酸を増幅するために特異的に設計され得るプライマー伸長及び連結プライマーの非限定的な例として、増幅は、米国特許第７，５８２，４２０号明細書及び同第７，６１１，８６９号明細書によって例示されるように、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のために使用されるプライマーを含み得る。
本開示の方法において使用され得る例示的な等温増幅方法は、例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）によって例示されるような多重置換増幅（ＭＤＡ）、又は、例えば米国特許第６，２１４，５８７号明細書によって例示される等温鎖置換核酸増幅を含むが、これらに限定されない。本開示において使用され得る他の非ＰＣＲベースの方法は、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９５；米国特許第５，４５５，１６６号明細書、及び同第５，１３０，２３８号明細書、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）に記載される鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又は、例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １３：２９４−３０７（２００３）に記載される超分岐鎖置換増幅を含む。等温増幅法は、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のための５’−＞３’エキソと共に使用され得る。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い反応促進性及び鎖置換活性を利用する。高い反応促進性は、ポリメラーゼが長さ１０〜２０ｋｂの断片を産生するようにする。上記のように、より小さい断片は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼのような低い反応促進性及び鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下で産生され得る。増幅反応、条件及び成分のさらなる説明は、米国特許第７，６７０，８１０号明細書の開示に詳細に記載されている。
本開示において有用な別のポリヌクレオチド増幅方法は、例えば、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１−２（１９９３）に記載されるように、定常５’領域、続いてランダム３’領域を有する２ドメインプライマーの集団を使用するＴａｇｇｅｄ ＰＣＲである。第一ラウンドの増幅を行って、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性ＤＮＡについての開始の多重度を可能とする。３’領域の性質により、開始部位は、ゲノム全体にわたってランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマーを除去することができ、定常５’領域に相補的なプライマーを使用してさらなる複製を行うことができる。
いくつかの実施形態では、等温増幅は、排除増幅（ＥｘＡｍｐ）とも呼ばれる動力学排除増幅（ＫＥＡ）を用いて行うことができる。本開示の核酸ライブラリーは、増幅試薬を反応させて、各々が、部位を播種した個々の標的核酸からのアンプリコンの実質的にクローン性の集団を含む複数の増幅部位を産生する工程を含む方法を用いて作製され得る。いくつかの実施形態では、増幅反応は、各々の増幅部位の容量を満たすのに十分な数のアンプリコンが生成されるまで進行する。このようにして、既に播種された部位を容量まで満たすことは、標的核酸がその部位に着地し増幅し、それによってその部位にアンプリコンのクローン集団を生成することを阻害する。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸が部位に到達する前に、増幅部位が容量まで満たされていなくても、見かけのクローン性を達成することができる。いくつかの条件下では、第１の標的核酸の増幅は、部位に輸送される第２の標的核酸からのコピーの産生を効果的に上回るか、又は圧倒するのに十分な数のコピーが作製される点まで進行し得る。例えば、直径５００ｎｍ未満の円形フィーチャ上で架橋増幅プロセスを用いる実施形態において、第１の標的核酸についての１４サイクルの指数関数的増幅の後、同じ部位での第２の標的核酸からの汚染は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォーム上での合成分析による配列決定に悪影響を及ぼすには、不十分な数の汚染アンプリコンを生成することが決定された。
アレイ中の増幅部位は、特定の実施形態では、完全にクローン性であり得るが、その必要はない。むしろ、いくつかの適用について、個々の増幅部位は、第１の標的核酸由来のアンプリコンで主に集団化され得、また、第２の標的核酸由来の低レベルの混入アンプリコンを有し得る。アレイは、汚染レベルがアレイのその後の使用に許容できない影響を及ぼさない限り、低レベルの汚染アンプリコンを有する１つ以上の増幅部位を有することができる。例えば、アレイが検出用途で使用される場合、許容され得る汚染のレベルは、許容できない方法で検出技術の信号対雑音又は分解能に影響を与えないレベルである。従って、見かけのクローン性は、一般に、本明細書に記載される方法によって作製されるアレイの特定の使用又は適用に関連する。特定の適用のために個々の増幅部位で許容され得る汚染の例示的なレベルには、多くとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％又は２５％の汚染アンプリコンが含まれるが、これらに限定されない。アレイは、これらの例示的なレベルの汚染アンプリコンを有する１つ以上の増幅部位を含むことができる。例えば、アレイ中の増幅部位の５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又はさらには１００％までが、いくつかの汚染アンプリコンを有し得る。部位のアレイ又は他のコレクションにおいて、少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上の部位がクローン性であり得るか、又は明らかにクローン性であり得ることが理解される。
いくつかの実施形態では、動力学排除は、プロセスが別の事象又はプロセスが起こるのを効果的に排除するのに十分に迅速な速度で起こる場合に起こり得る。例えば、アレイの部位が溶液からの標的核酸でランダムに播種され、標的核酸のコピーが増幅プロセスにおいて生成されて、播種された部位の各々を容量まで満たす核酸アレイの作製を考える。本開示の動力学排除方法によれば、播種及び増幅プロセスは、増幅速度が播種速度を超える条件下で同時に進行し得る。このようにして、コピーが第１の標的核酸によって播種された部位で作製される比較的迅速な速度は、増幅のために部位を播種することから第２の核酸を効果的に排除する。動力学排除増幅法は、米国特許出願公開第２０１３／０３３８０４２号明細書の開示に詳細に記載されているように実施することができる。
動力学排除は、増幅を開始するための比較的遅い速度（例えば、標的核酸の第１のコピーを作製する遅い速度）、対、標的核酸（又は標的核酸の第１のコピー）のその後のコピーを作製するための比較的速い速度を利用し得る。例示的な一実施形態において、動力学排除は、標的核酸播種の比較的遅い速度（例えば、比較的遅い拡散又は輸送）、対、核酸シードのコピーで部位を満たすために増幅が生じる比較的速い速度に起因して生じる。別の例示的な実施形態では、動力学排除は、部位に播種されている標的核酸の第１のコピーの形成の遅延（例えば、遅延又は遅い活性化）、対、後続のコピーが作製されて部位を満たす比較的迅速な速度に起因して生じ得る。この例では、いくつかの異なる標的核酸が個々の部位に播種されている可能性がある（例えば、増幅前にいくつかの標的核酸が各部位に存在する可能性がある）。しかしながら、任意の所定の標的核酸についての第１のコピー形成は、第１のコピー形成の平均速度が後続のコピーが生成される速度と比較して比較的遅いように、ランダムに活性化され得る。この場合、個々の部位にいくつかの異なる標的核酸が播種されている可能性があるが、動力学排除により、これらの標的核酸のうちの１つのみが増幅できるであろう。より具体的には、一旦第１の標的核酸が増幅のために活性化されると、その部位はそのコピーで容量を急速に満たし、それによって第２の標的核酸のコピーがその部位で作製されることを防止するであろう。
増幅試薬は、アンプリコン形成を促進し、場合によっては、アンプリコン形成の速度を増加させるさらなる成分を含むことができる。例は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼは、繰り返しの侵入／伸長を可能にすることによって、アンプリコン形成を容易にし得る。より具体的には、リコンビナーゼは、ポリメラーゼによる標的核酸の侵入、及びアンプリコン形成のための鋳型として標的核酸を使用するポリメラーゼによるプライマーの伸長を容易にすることができる。このプロセスは、各ラウンドの侵入／伸長から産生されたアンプリコンが次のラウンドにおいて鋳型として役立つ連鎖反応として反復され得る。変性サイクル（例えば、加熱又は化学的変性を介する）は必要とされないので、このプロセスは標準的なＰＣＲよりも迅速に行われ得る。そのようなものとして、リコンビナーゼ促進増幅は、等温的に行うことができる。増幅を容易にするために、リコンビナーゼ促進増幅試薬中にＡＴＰ、又は他のヌクレオチド（又は場合によっては、その非加水分解性類似体）を含めることが一般に望ましい。リコンビナーゼ及び一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢが増幅をさらに促進し得るので、特に有用である。リコンビナーゼ促進増幅のための例示的な製剤は、ＴｗｉｓｔＤｘ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によってＴｗｉｓｔＡｍｐキットとして商業的に販売されているものを含む。リコンビナーゼ促進増幅試薬の有用な成分及び反応条件は、米国特許第５，２２３，４１４号明細書及び米国特許第７，３９９，５９０号明細書に記載されている。
アンプリコン形成を促進し、場合によっては、アンプリコン形成速度を増加させるために増幅試薬に含まれ得る成分の別の例は、ヘリカーゼである。ヘリカーゼは、アンプリコン形成の連鎖反応を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。変性サイクル（例えば、加熱又は化学的変性を介する）は必要とされないので、このプロセスは標準的なＰＣＲよりも迅速に行われ得る。そのようなものとして、ヘリカーゼ促進増幅は、等温的に行うことができる。ヘリカーゼ及び一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢが増幅をさらに促進し得るので、特に有用である。ヘリカーゼ促進増幅のための例示的な製剤は、Ｂｉｏｈｅｌｉｘ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からＩｓｏＡｍｐキットとして商業的に販売されているものを含む。さらに、ヘリカーゼタンパク質を含む有用な製剤の例は、米国特許第７，３９９，５９０号明細書及び米国特許第７，８２９，２８４号明細書に記載されている。
アンプリコン形成を促進し、場合によっては、アンプリコン形成速度を増加させるために増幅試薬中に含まれ得る成分のさらに別の例は、起源結合タンパク質である。
アダプター−鋳型−アダプター分子の表面への付着に続いて、固定化され増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子の少なくとも一部の配列が決定される。配列決定は、任意の適切な配列決定技術を使用して実施することができ、鎖再合成を含む、固定化及び増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子の配列を決定するための方法は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，０５３，１９２号明細書）、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２０１６／１３０７０４号パンフレット）、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，８９５，２４９号明細書）、及びＰｉｐｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（米国特許第９，３０９，５０２号明細書）に記載される。
本明細書に記載される方法は、核酸検出試験とも呼ばれる様々な核酸配列決定技術と併せて使用することができる。特に適用可能な技術は、核酸がそれらの相対的な位置が変化しないように、アレイ中の固定された位置に付着され、アレイが繰り返し画像化される技術である。画像が例えば、１つのヌクレオチド塩基型を別のヌクレオチド塩基型と区別するために使用される異なる標識と一致する、異なる色チャネルで得られる実施形態が、特に適用可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスは、自動化プロセスであり得る。好ましい実施形態は、合成による配列決定（「ＳＢＳ」）技術を含む。核酸配列決定技術はまた、マイクロアレイ分析のために使用され得る。
ＳＢＳ技術は、一般に、鋳型鎖に対するヌクレオチドの反復的付加を介する新生核酸鎖の酵素的伸長を含む。ＳＢＳの伝統的な方法において、単一ヌクレオチドモノマーは、各供給においてポリメラーゼの存在下で標的ヌクレオチドに提供され得る。しかしながら、本明細書に記載される方法では、一送達においてポリメラーゼの存在下で、２種類以上のヌクレオチドモノマーが標的核酸に提供され得る。
ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマー、又はターミネーター部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用することができる。ターミネーターを欠くヌクレオチドモノマーを利用する方法としては、例えば、本明細書にさらに詳細に記載されるように、γ−リン酸標識ヌクレオチドを使用するパイロシークエンシング及び配列決定が挙げられる。ターミネーターを欠くヌクレオチドモノマーを使用する方法において、各サイクルにおいて付加されるヌクレオチドの数は、一般に可変であり、鋳型配列及びヌクレオチド送達の様式に依存する。ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマーを使用するＳＢＳ技術について、ターミネーターは、ジデオキシヌクレオチドを使用する従来のＳａｎｇｅｒ配列決定の場合のように、使用される配列決定条件下で効果的に不可逆であり得るか、又はターミネーターは、Ｓｏｌｅｘａ（現在、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）によって開発された配列決定方法の場合のように、可逆であり得る。
ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチドモノマー、又は標識部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用することができる。従って、取り込み事象は、標識の特徴（例えば、標識の蛍光）；ヌクレオチドモノマーの特徴（例えば、分子量又は電荷）；ヌクレオチドの取り込みの副産物（例えば、ピロリン酸の放出）などに基づいて検出され得る。２つ以上の異なるヌクレオチドが配列決定試薬中に存在する実施形態において、異なるヌクレオチドは、互いに区別可能であり得るか、又は代わりに、２つ以上の異なる標識は、使用される検出技術の下で区別不可能であり得る。例えば、配列決定試薬中に存在する異なるヌクレオチドは、異なる標識を有し得、それらは、Ｓｏｌｅｘａ（現在、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）によって開発された配列決定方法によって例示されるように、適切な光学を使用して区別され得る。
好ましい実施形態は、パイロシークエンシング技術を含む。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれる際の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ．、Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ、Ｓ．、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｂ．、Ｕｈｌｅｎ、Ｍ．ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ．、Ｐ（１９９６）「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ．」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）、８４−９；Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ．（２００１）「Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｅｄｓ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１）、３−１１；Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ．、Ｕｈｌｅｎ、Ｍ．ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ、Ｐ．（１９９８）「Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）、３６３；米国特許第６，２１０，８９１号明細書；同第６，２５８，５６８号明細書及び同第６，２７４，３２０号明細書）。パイロシークエンシングにおいて、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルファターゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることによって検出され得、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出される。配列決定されるべき核酸は、アレイ中のフィーチャに付着され得、アレイは、アレイのフィーチャにおけるヌクレオチドの取り込みに起因して生成される化学発光シグナルを捕捉するために画像化され得る。アレイを特定のヌクレオチド型（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）で処理した後、画像を得ることができる。各ヌクレオチド型の添加後に得られる画像は、アレイ中のどのフィーチャが検出されるかに関して異なるであろう。画像におけるこれらの差は、アレイ上のフィーチャの異なる配列内容を反映する。しかしながら、各フィーチャの相対的な位置は、画像において変化しないままである。画像は、本明細書に記載される方法を用いて保存され、処理され、分析され得る。例えば、異なる各ヌクレオチド型でアレイを処理した後に得られた画像は、可逆的ターミネーターに基づく配列決定法のための異なる検出チャネルから得られた画像について本明細書に例示されるのと同じ方法で取り扱うことができる。
ＳＢＳの別の例示的な型において、サイクル配列決定は、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号パンフレット及び米国特許第７，０５７，０２６号明細書に記載されるように、例えば、切断可能又は光漂白可能な色素標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的添加によって達成される。このアプローチは、Ｓｏｌｅｘａ（現在、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）によって商業化されており、国際公開第９１／０６６７８号パンフレット及び国際公開第０７／１２３，７４４号パンフレットにも記載されている。終結を逆転させることができ、蛍光標識を切断することができる蛍光標識ターミネーターの利用可能性は、効率的な循環可逆的終結（ｃｙｃｌｉｃ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＣＲＴ）配列決定を容易にする。ポリメラーゼも、これらの改変ヌクレオチドを効率的に組み込み、これらから伸長するように同時操作され得る。
好ましくは、可逆的ターミネーターに基づく配列決定の実施形態において、標識は、ＳＢＳ反応条件下での伸長を実質的に阻害しない。しかし、検出標識は、例えば、切断又は分解によって除去可能であり得る。画像は、配列された核酸フィーチャへの標識の組み込み後に捕捉され得る。特定の実施形態では、各サイクルは、アレイへの４つの異なるヌクレオチド型の同時送達を含み、各ヌクレオチド型は、スペクトル的に異なる標識を有する。次に、４つの異なる標識のうちの１つに対して選択的な検出チャネルを各々使用して、４つの画像を取得することができる。或いは、異なるヌクレオチド型を連続的に添加することができ、アレイの画像を各添加工程の間に得ることができる。このような実施形態において、各画像は、特定の型のヌクレオチドが組み込まれた核酸フィーチャを示すであろう。異なるフィーチャは、各フィーチャの異なる配列内容のために、異なる画像に存在するか又は存在しない。しかしながら、フィーチャの相対的な位置は、画像において変化しないままであろう。このような可逆的ターミネーター−ＳＢＳ法から得られた画像は、本明細書に記載されるように、保存され、処理され、分析され得る。画像捕捉段階に続いて、標識を除去することができ、可逆的ターミネーター部分を、ヌクレオチド付加及び検出のその後のサイクルのために除去することができる。標識が特定のサイクルで検出された後、後続のサイクルの前に標識を除去することは、バックグラウンド信号及びサイクル間のクロストークを低減するという利点を提供することができる。有用な標識及び除去方法の例は、本明細書に記載されている。
特定の実施形態では、ヌクレオチドモノマーのいくつか又は全ては、可逆的ターミネーターを含むことができる。このような実施形態において、可逆的ターミネーター／切断可能フルオロフォアは、３’エステル結合を介してリボース部分に結合されたフルオロフォアを含み得る（Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１５：１７６７−１７７６（２００５））。別のアプローチは、蛍光標識の切断からターミネーター化学を分離している（Ｒｕｐａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：５９３２−７（２００５））。Ｒｕｐａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．は、伸長をブロックするために小さな３’アリル基を使用した可逆的ターミネーターの開発を記載したが、パラジウム触媒による短時間の処理によって容易に脱ブロックすることができた。フルオロフォアを、長波長ＵＶ光への３０秒の暴露によって容易に切断され得る光切断可能なリンカーを介して塩基に付着させた。従って、ジスルフィド還元又は光切断のいずれかを切断可能なリンカーとして使用することができる。可逆的終結に対する別のアプローチは、ｄＮＴＰ上に嵩高い色素を配置した後に起こる自然終結の使用である。ｄＮＴＰ上の帯電した嵩高い色素の存在は、立体障害及び／又は静電障害を通して有効なターミネーターとして作用することができる。１つの取り込み事象の存在は、色素が除去されない限り、さらなる取り込みを妨げる。色素の切断は、フルオロフォアを除去し、終結を効果的に逆転させる。修飾ヌクレオチドの例はまた、米国特許第７，４２７，６７３号明細書及び同第７，０５７，０２６号明細書に記載されている。
本明細書に記載される方法及びシステムと共に使用することができる追加の例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号明細書、同第２００６／０１８８９０１号明細書、同第２００６／０２４０４３９号明細書、同第２００６／０２８１１０９号明細書、同第２０１２／０２７０３０５号明細書、及び同第２０１３／０２６０３７２号明細書、米国特許第７，０５７，０２６号明細書、ＰＣＴ国際公開第０５／０６５８１４号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、及びＰＣＴ国際公開第０６／０６４１９９号パンフレット及び国際公開第０７／０１０，２５１号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態は、４未満の異なる標識を使用して、４つの異なるヌクレオチドの検出を使用し得る。例えば、ＳＢＳは、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書の組み込まれた材料に記載されている方法及びシステムを利用して実施することができる。第１の例として、ヌクレオチド型の対は、同じ波長で検出されるが、対の一方のメンバーについての強度の他方と比較した差異に基づいて、又は対の他方のメンバーについて検出されたシグナルと比較して見かけのシグナルを出現若しくは消失させる対の一方のメンバーへの変化（例えば、化学修飾、光化学修飾又は物理修飾を介する）に基づいて区別され得る。第２の例として、４つの異なるヌクレオチド型のうちの３つは、特定の条件下で検出され得、一方、第４のヌクレオチド型は、それらの条件下で検出可能であるか、又はそれらの条件下で最小限に検出される標識を欠く（例えば、バックグラウンド蛍光による最小限の検出など）。核酸への最初の３つのヌクレオチド型の組み込みは、それらの各々のシグナルの存在に基づいて決定され得、核酸への第４のヌクレオチド型の組み込みは、任意のシグナルの非存在又は最小限の検出に基づいて決定され得る。第３の例として、１つのヌクレオチド型は、２つの異なるチャネルにおいて検出される標識を含み得るが、他のヌクレオチド型は、チャネルのうちの１つ以下において検出される。上記３つの例示的な構成は、互いに排他的なものではなく、種々の組み合わせで用いることができる。全ての３つの例を組み合わせる例示的な実施形態は、第１のチャネルにおいて検出される第１のヌクレオチド型（例えば、第１の励起波長によって励起されたときに第１のチャネルにおいて検出される標識を有するｄＡＴＰ）、第２のチャネルにおいて検出される第２のヌクレオチド型（例えば、第２の励起波長によって励起されたときに第２のチャネルにおいて検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１及び第２のチャネルの両方において検出される第３のヌクレオチド型（例えば、第１及び／又は第２の励起波長によって励起されたときに両方のチャネルにおいて検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ）、並びにいずれかのチャネルにおいて検出されないか又は最小限に検出される標識を欠く第４のヌクレオチド型（例えば、標識を有さないｄＧＴＰ）を使用する蛍光ベースのＳＢＳ方法である。
さらに、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書の組み込まれた材料に記載されているように、配列決定データは、単一チャネルを使用して得ることができる。このようないわゆる１色素配列決定アプローチでは、第１のヌクレオチド型は標識されるが、標識は、第１の画像が生成された後に除去され、第２のヌクレオチド型は、第１の画像が生成された後にのみ標識される。第３のヌクレオチド型は、第１及び第２の画像の両方においてその標識を保持し、第４のヌクレオチド型は、両方の画像において標識されないままである。
いくつかの実施形態は、連結技術による配列決定を使用することができる。このような技術は、ＤＮＡリガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドを組み込み、このようなオリゴヌクレオチドの組み込みを同定する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列中の特定のヌクレオチドの同一性と相関する異なる標識を有する。他のＳＢＳ方法と同様に、画像は、標識された配列決定試薬で核酸フィーチャのアレイを処理した後に得ることができる。各画像は、特定の型の標識が組み込まれた核酸フィーチャを示すであろう。異なるフィーチャは、各フィーチャの異なる配列内容のために、異なる画像に存在するか、又は存在しないが、フィーチャの相対的な位置は、画像において変化しないままであろう。連結に基づく配列決定方法から得られた画像は、本明細書に記載されるように、保存、処理及び分析され得る。本明細書に記載される方法及びシステムと共に使用することができる例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許第６，９６９，４８８号明細書、同第６，１７２，２１８号明細書、及び同第６，３０６，５９７号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態は、ナノポア配列決定（Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．＆ Ａｋｅｓｏｎ、Ｍ．「Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒｕＬｔｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、１４７−１５１（２０００）；Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．ａｎｄ Ｄ．Ｂｒａｎｔｏｎ、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７−８２５（２００２）；Ｌｉ、Ｊ．、Ｍ．Ｇｅｒｓｈｏｗ、Ｄ．Ｓｔｅｉｎ、Ｅ．Ｂｒａｎｄｉｎ、ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ、「ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１−６１５（２００３））。このような実施形態では、標的核酸は、ナノポアを通過する。ナノポアは、合成細孔又はα−溶血素のような生物学的膜タンパク質であり得る。標的核酸がナノポアを通過するとき、各塩基対は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって同定され得る（米国特許第７，００１，７９２号明細書；Ｓｏｎｉ、Ｇ．Ｖ．＆ Ｍｅｌｌｅｒ、「Ａ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄｕＬｔｒａｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３、１９９６−２００１（２００７）；Ｈｅａｌｙ、Ｋ．「Ｎａｎｏｐｏｒｅ−ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ｎａｎｏｍｅｄ．２、４５９−４８１（２００７）；Ｃｏｃｋｒｏｆｔ、Ｓ．Ｌ．、Ｃｈｕ、Ｊ．、Ａｍｏｒｉｎ、Ｍ．＆ Ｇｈａｄｉｒｉ、Ｍ．Ｒ．「Ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｄｅｖｉｃｅ ｄｅｔｅｃｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０、８１８−８２０（２００８））。ナノポア配列決定から得られたデータは、本明細書に記載されるように、保存、処理及び分析することができる。特に、データは、本明細書に記載される光学画像及び他の画像の例示的な処理に従って、画像として扱うことができる。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を使用し得る。ヌクレオチドの取り込みは、例えば、米国特許第７，３２９，４９２号明細書及び同第７，２１１，４１４号明細書に記載されているように、フルオロフォアを有するポリメラーゼとγ−リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用によって検出することができ、又はヌクレオチド取り込みは、例えば、米国特許第７，３１５，０１９号明細書に記載されるようにゼロモード導波路を用いて、例えば、米国特許第７，４０５，２８１号明細書及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書に記載されているような蛍光ヌクレオチド類似体及び操作されたポリメラーゼを使用して検出され得る。照射は、蛍光標識されたヌクレオチドの取り込みが低いバックグラウンドで観察され得るように、表面繋留ポリメラーゼの周りのゼプトリットルスケールの体積に制限され得る（Ｌｅｖｅｎｅ、Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、「Ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９、６８２−６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ、Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、「Ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．」Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３、１０２６−１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｎａｎｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５、１１７６−１１８１（２００８））。このような方法から得られた画像は、本明細書に記載されるように、保存、処理及び分析され得る。
いくつかのＳＢＳの実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込みに際して放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書；同第２００９／０１２７５８９号明細書、同第２０１０／０１３７１４３号明細書、及び同第２０１０／０２８２６１７号明細書に記載されている配列決定方法及びシステムを使用することができる。動力学排除を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載される方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用され得る。より具体的には、本明細書に記載される方法は、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を産生するために使用され得る。
上記のＳＢＳ方法は、有利には、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるような多重フォーマットで実施することができる。特定の実施形態では、異なる標的核酸は、共通の反応容器中で、又は特定の基質の表面上で処理され得る。これは、配列決定試薬の簡便な送達、未反応試薬の除去、及び多重様式での取り込み事象の検出を可能にする。表面結合標的核酸を使用する実施形態において、標的核酸は、アレイ形式であり得る。アレイ形式において、標的核酸は、典型的には、空間的に区別可能な様式で表面に結合され得る。標的核酸は、直接共有結合、ビーズ若しくは他の粒子への付着、又は表面に付着したポリメラーゼ又は他の分子への結合によって結合することができる。アレイは、各部位（フィーチャとも呼ばれる）に標的核酸の単一コピーを含むことができ、又は同じ配列を有する複数コピーが各部位若しくはフィーチャに存在することができる。複数のコピーは、以下にさらに詳細に記載されるように、増幅方法（例えば、架橋増幅又はエマルジョンＰＣＲ）によって産生され得る。
本明細書に記載される方法は、例えば、少なくとも約１０フィーチャ／ｃｍ２、１００フィーチャ／ｃｍ２、５００フィーチャ／ｃｍ２、１，０００フィーチャ／ｃｍ２、５，０００フィーチャ／ｃｍ２、１０，０００フィーチャ／ｃｍ２、５０，０００フィーチャ／ｃｍ２、１００，０００フィーチャ／ｃｍ２、１，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、５，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２以上を含む様々な密度のいずれかでフィーチャを有するアレイを使用することができる。
本明細書に記載される方法の利点は、複数の標的核酸の迅速且つ効率的な並行検出を提供することである。従って、本開示は、上記に例示したような当技術分野で既知の技術を用いて核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。従って、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又は配列決定試薬を１つ以上の固定化ＤＮＡ断片に送達することができる流体構成要素を含むことができ、このシステムは、ポンプ、バルブ、リザーバ、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、標的核酸の検出のための統合システムにおいて構成及び／又は使用され得る。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号明細書及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号明細書に記載されている。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体構成要素のうちの１つ以上は、増幅方法及び検出方法のために使用され得る。核酸配列決定の実施形態を例にとると、統合システムの１つ以上の流体構成要素は、本明細書に記載される増幅方法のために、及び上記に例示されるような配列決定方法における配列決定試薬の送達のために使用され得る。或いは、統合システムは、増幅方法を実施し、検出方法を実施するための別個の流体システムを含むことができる。増幅された核酸を生成し、また核酸の配列を決定することができる統合配列決定システムの例には、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号明細書に記載されるデバイスが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるｒｅＤＮＡは、種々の適用における対照として有用である。例えば、ｒｅＤＮＡは、当技術分野で既知の任意の適切な配列決定技術を使用して配列決定され得る。ｒｅＤＮＡの組成物は、既知の染色体コピー数、既知のＧ／Ｃ含有量、染色体及び／若しくはゲノムにわたる配列の既知の分布、又は他の既知の特性など、任意の数の既知の特徴を有することができ、従って、本明細書に提示される組成物は、実験条件の変化を説明するために、配列決定方法における対照として使用することができる。一例として、ｒｅＤＮＡライブラリーが特定のＧ／Ｃ含有量を有することが知られている場合、ライブラリーを多重配列決定ランに含めて、任意の配列決定分析が予想されるＧ／Ｃ含有量からの任意の逸脱を生じるかどうかを同定することができる。
いくつかの実施形態では、ｒｅＤＮＡ組成物は、ライブラリー調製方法の品質のための対照であり得る。例えば、配列決定ライブラリーの調製は、ＤＮＡ末端修復、Ａテーリング、アダプターの連結、及び／又は増幅工程を含む種々の工程を含み得る。これらの工程のいずれかが、ゲノム又は染色体にわたる分布、配列の型、Ｇ／Ｃ含有量、断片の長さなどの任意の特徴に対する偏りを生じる場合、偏りは、配列決定分析などの下流分析において検出され得る。
いくつかの実施形態では、ｒｅＤＮＡ組成物は、配列決定機器のための対照であり得る。同様に、ｒｅＤＮＡ組成物は、アレイ機器のための対照であり得る。例えば、配列決定機器又はアレイ機器は、洗浄のための流体移動、ヌクレオチド取り込み、増幅、走査、切断反応などの化学工程、固相増幅、加熱／冷却、励起光の生成、蛍光発光シグナルの検出、カメラ及びステージの移動、並びに固体支持体上の微視的フィーチャの走査を含む、種々の機能を実施し得る。これらの工程のいずれかが、ゲノム又は染色体にわたる分布、配列の型、Ｇ／Ｃ含有量、断片の長さなどの任意の特徴に対する偏りを生じる場合、偏りは、配列決定分析又はアレイ分析などの下流分析において検出され得る。器具は、偏り又は誤動作を引き起こしている任意のプロセス、状態、又は構成要素を調整又は補正するように較正することができる。
いくつかの実施形態では、ｒｅＤＮＡ組成物は、核酸配列決定試験のための検証対照であり得る。例えば、配列決定に基づく試験は、ＳＮＰ変異体、異数性、挿入、欠失、反復拡大、再配列などのような１つ以上の遺伝子異常を検出し得る。いくつかの実施形態では、ｒｅＤＮＡ組成物は、配列決定に基づく非侵襲性出生前試験のための検証対照として使用される。いくつかの実施形態では、ｒｅＤＮＡ組成物は、配列決定に基づく腫瘍検出試験のための検証対照として使用される。このような実施形態の一例では、まれな異常について試験が開発されている場合、試験の感度及び／又は特異性を保証するために多数の検証試験を実施するのに十分な生物学的サンプルを得ることは困難であり得る。従って、例えば、まれな異常を有する個体から得られたｃｆＤＮＡに由来するｒｅＤＮＡ組成物は、検証研究の間の試験の多くの、又は無制限の反復実行を可能にするのに十分な量で作製され得るため、有用であり得る。
いくつかの実施形態では、ｒｅＤＮＡ組成物は、配列決定に基づくコンパニオン診断試験のための検証対照として使用される。コンパニオン診断試験は、個体が治療処置のための候補として個体を適格とする遺伝的特徴を有するかどうかを決定するために有用である。いくつかの実施形態では、コンパニオン診断試験は、治療処置が処置レジメンにおいて適切であるかどうかを決定するために、サンプル中の遺伝子改変体の存在又は同一性を決定する。このような実施形態では、診断試験は、試験が反復可能であり、所望の感度及び／又は特異性を有することを確実にするために、何回も検証される必要があり得る。従って、例えば、遺伝的特徴を有する個体から得られたｃｆＤＮＡに由来するｒｅＤＮＡ組成物は、検証研究中の試験の多くの、又は無制限の反復実行を可能にするのに十分な量で作製することができるため、有用であり得る。
例示的な実施形態
実施形態１．対象から得られた複数の二本鎖鋳型核酸のサンプルを提供することと；
鋳型核酸の両端に汎用アダプターを連結して、複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することであって、
複数のアダプター−鋳型−アダプター分子の各々は、汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含み、
汎用アダプターは、二本鎖核酸の領域を含む、形成することと；
第１の汎用プライマー及び第２の汎用プライマーで複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を増幅して、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせることと；
増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子の両端から汎用アダプターを除去して、付着していない汎用アダプター及び複数の再生された鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を生じさせることと：
を含む方法。
実施形態２．二本鎖鋳型核酸がＤＮＡである、実施形態１の方法。
実施形態３．二本鎖鋳型核酸が無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である、実施形態１又は２の方法。
実施形態４．対象が妊娠しているヒトであり、二本鎖鋳型核酸が胎児及び母体核酸の混合物を含む、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
実施形態５．サンプルがｃｆＤＮＡを含む、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
実施形態６．胎児が遺伝的状態を含まない、実施形態１〜５のいずれか１つの方法。
実施形態７．胎児が遺伝的状態を含む、実施形態１〜６のいずれか１つの方法。
実施形態８．遺伝的状態が異数性である、実施形態１〜７のいずれか１つの方法。
実施形態９．異数性がトリソミーである、実施形態１〜８のいずれか１つの方法。
実施形態１０．トリソミーが、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、９トリソミー、８トリソミー、２２トリソミー、ＸＸＸ、ＸＸＹ、又はＸＹＹである、実施形態１〜９のいずれか１つの方法。
実施形態１１．遺伝子状態がヌクレオチド配列の過小発現を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つの方法。
実施形態１２．対象が新生物を有することが疑われる、実施形態１〜１１のいずれか１つの方法。
実施形態１３．サンプルが循環腫瘍ＤＮＡ及び無細胞正常ＤＮＡを含む、実施形態１〜１２のいずれか１つの方法。
実施形態１４．サンプルが、血液、尿、痰、又は便を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つの方法。
実施形態１５．連結の前に、複数の二本鎖鋳型核酸を処理して平滑末端になるように末端を修飾することをさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか１つの方法。
実施形態１６．連結の前に、複数の二本鎖鋳型核酸を処理して、３’末端を修飾して３’突出構造として終結させることをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれか１つの方法。
実施形態１７．汎用アダプターが少なくとも１つの汎用プライマー結合部位を含む一本鎖非相補的核酸鎖の領域をさらに含み、連結が、汎用アダプターの二本鎖核酸の領域を鋳型核酸の各末端に共有結合的に付着させる、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法。
実施形態１８．増幅が指数関数的増幅反応を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つの方法。
実施形態１９．指数関数的増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、実施形態１〜１８のいずれか１つの方法。
実施形態２０．増幅が、低いエラー率を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つの方法。
実施形態２１．汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、除去することが、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を制限エンドヌクレアーゼに曝露すること、及びアダプター−鋳型−アダプター分子を切断して、除去された汎用アダプター及び複数のｒｅＤＮＡを生じさせることを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法。
実施形態２２．制限エンドヌクレアーゼの切断部位及び認識部位が別々である、実施形態１〜２１のいずれか１つの方法。
実施形態２３．制限エンドヌクレアーゼがＳａｐＩ、ＭｌｙＩ、又はＢｐｕＥＩである、実施形態１〜２２のいずれか１つの方法。
実施形態２４．ｒｅＤＮＡが、鋳型の各末端に汎用アダプターの一部を保持する、本実施形態１〜２３のいずれか１つの方法。
実施形態２５．第１の汎用プライマー及び第２の汎用プライマーが捕捉剤を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
実施形態２６．捕捉剤がビオチンを含む、実施形態１〜２５のいずれか１つの方法。
実施形態２７．汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、除去することが、アダプター−鋳型−アダプター分子を、リガンドに結合して、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせる化合物を含む表面と接触させることと、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を切断して除去された汎用アダプター及び複数のｒｅＤＮＡを生じさせる制限エンドヌクレアーゼに曝露することとを含み、除去された汎用アダプターが前記表面に結合される、実施形態１〜２６のいずれか１つの方法。
実施形態２８．除去することが、除去された汎用アダプターをｒｅＤＮＡから分離することをさらに含む、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法。
実施形態２９．分離することが、除去された汎用アダプター及びｒｅＤＮＡを含む混合物を、リガンドに結合する化合物と接触させることを含み、化合物が表面に付着され、除去された汎用アダプターが表面に結合される、実施形態１〜２８のいずれか１つの方法。
実施形態３０．表面がビーズを含む、実施形態１〜２９のいずれか１つの方法。
実施形態３１．結合された除去された汎用アダプターを含む表面を除去して、除去された汎用アダプターをｒｅＤＮＡから分離することをさらに含む、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法。
実施形態３２．除去することが、所定のサイズ範囲内に入るｒｅＤＮＡの選択を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つの方法。
実施形態３３．１つの対象から得られたサンプルに由来する複数の再生鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を提供することとであって、
各ｒｅＤＮＡは鋳型である、提供することと；
鋳型核酸の両端に汎用アダプターを連結して、複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することであって、
複数のアダプター−鋳型−アダプター分子の各々は、汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含み、
汎用アダプターは、（ｉ）二本鎖核酸の領域、及び（ｉｉ）少なくとも１つの汎用プライマー結合部位を含む一本鎖非相補的核酸鎖の領域を含み、
それによって、鋳型の少なくとも一部の配列を決定するための配列決定ライブラリーを生成する、形成することと
を含む方法。
実施形態３４．一本鎖非相補的核酸鎖の領域が、少なくとも１つの汎用伸長プライマー結合部位をさらに含む、実施形態３３の方法。
実施形態３５．一本鎖非相補的核酸鎖の領域の遠位の二本鎖核酸の領域が平滑末端構造として終結する、実施形態３３又は３４の方法。
実施形態３６．前記複数の鋳型が平滑末端構造を含む、実施形態３３〜３５のいずれか１つの方法。
実施形態３７．一本鎖非相補的核酸鎖の領域の遠位の二本鎖核酸の領域が、３’突出構造として終結する、実施形態３３〜３６のいずれか１つの方法。
実施形態３８．３’突出構造が、１〜４ヌクレオチドの突出構造を含む、実施形態３３〜３７のいずれか１つの方法。
実施形態３９．３’突出構造がＴヌクレオチドの突出を含む、実施形態３３〜３８のいずれか１つの方法。
実施形態４０．鋳型が、二本鎖核酸の領域の３’突出構造に相補的な３’突出構造を含む、実施形態３３〜３９のいずれか１つの方法。
実施形態４１．複数の増幅部位を含む表面を提供することであって、
増幅部位は、遊離３’末端を有する付着した一本鎖核酸の少なくとも２つの集団を含む、提供することと、
増幅部位を含む表面を、個々のアダプター−鋳型−アダプター分子からのアンプリコンのクローン集団を各々含む複数の増幅部位を産生するのに適した条件下で、複数のアダプター−鋳型−アダプター分子と接触させることと：
をさらに含む、実施形態３３〜４０のいずれか１つの方法。
実施形態４２．複数のアダプター−鋳型−アダプター分子の数が増幅部位の数を超え、アダプター−鋳型−アダプター分子が増幅部位への流体アクセスを有し、増幅部位の各々がいくつかのアダプター−鋳型−アダプター分子のための容量を含む、実施形態３３〜４１のいずれか１つの方法。
実施形態４３．接触させることが、（ｉ）アダプター−鋳型−アダプター分子を平均輸送速度で増幅部位に輸送すること、及び（ｉｉ）増幅部位にあるアダプター−鋳型−アダプター分子を平均増幅速度で増幅することを同時に含み、平均増幅速度が平均輸送速度を超える、実施形態３３〜４２のいずれか１つの方法。
実施形態４４．汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、実施形態１のアダプター−鋳型−アダプター分子を含む組成物。
実施形態４５．制限エンドヌクレアーゼがＳａｐＩ、ＭｌｙＩ、又はＢｐｕＥＩである、実施形態４４の組成物。
実施形態４６．実施形態１の方法によって生成された複数のｒｅＤＮＡを含む組成物であって、人工生物学的流体をさらに含む、組成物。
実施形態４７．人工生物学的流体が人工血漿を含む、実施形態４６の組成物。
実施形態４８．対象が細菌又はウイルス感染を有することが疑われる、実施形態１〜３２のいずれか１つの方法。
実施形態４９．サンプルがウイルスＤＮＡ又は細菌ＤＮＡを含む、実施形態１〜３２又は４８のいずれか１つの方法。
実施形態５０．サンプルが血液、尿、痰、又は便を含む、実施形態１〜３２又は４８〜４９のいずれか１つの方法。
実施形態５１．核酸検出試験において対照を使用する方法であって：
ａ．実施形態１の方法を用いて、複数の再生された鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を提供することと；
ｂ．試験サンプル及び工程（ａ）で得られたｒｅＤＮＡに対して核酸検出試験を行うことと；
ｃ．対照としてｒｅＤＮＡを用いた核酸検出試験の結果を分析することと
を含む、方法。
実施形態５２．核酸検出試験が配列決定を含む、実施形態５１の方法。
実施形態５３．核酸検出試験がマイクロアレイ分析を含む、実施形態５１〜５２のいずれかの方法。
実施形態５４．核酸検出試験が酵素プロセスを含む、実施形態５１〜５３のいずれかの方法。
実施形態５５．実施形態１の方法を用いて得られた複数の再生鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）に対して核酸検出試験を行うことを含む方法。
実施形態５６．ｒｅＤＮＡが、ライブラリー調製方法の品質のための対照である、実施形態５５の方法。
実施形態５７．ｒｅＤＮＡが、配列決定機器のための較正対照である、実施形態５５又は５６の方法。
実施形態５８．ｒｅＤＮＡが、アレイ機器のための較正対照である、実施形態５５〜５７のいずれかの方法。
実施形態５９．ｒｅＤＮＡが、核酸配列決定試験のための検証対照である、実施形態５５〜５８のいずれかの方法。
実施形態６０．ｒｅＤＮＡが、配列決定に基づく非侵襲性出生前試験のための検証対照である、実施形態５５〜５９のいずれかの方法。
実施形態６１．ｒｅＤＮＡが、配列決定に基づく腫瘍検出試験のための検証対照である、実施形態５５〜６０のいずれかの方法。
実施形態６２．ｒｅＤＮＡが、配列決定に基づくコンパニオン診断試験のための検証対照である、実施形態５５〜６１のいずれかの方法。
実施形態６３．コンパニオン診断試験が、処置レジメンにおいて治療処置が適切であるかどうかを決定するために、サンプル中の遺伝子変異体の存在又は同一性を決定する、実施形態５５〜６２のいずれかの方法。
本開示は、以下の実施例によって例示される。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載される開示の範囲及び趣旨に従って広く解釈されるべきであることを理解するべきである。
実施例１
目的
この実施例は、ヒト血漿を使用する代わりに実験で使用することができる血漿対照材料の作製を記載する。本明細書に記載されるように、このプロセスの間に単離及び精製されるｃｆＤＮＡ入力（ｒｅＤＮＡ）は、数十のプレートに相当する材料を送達するのに十分に濃縮され、長期間にわたって使用され得る遺伝的に類似したｃｆＤＮＡの大きなストックを提供する。さらに、使用者は、この調製されたＤＮＡサンプルを血漿希釈物中にスパイクし、ヒト血漿に定量的に類似した代替物を生成し得る。この代替の血漿希釈物は、ｃｆＤＮＡが必要とされる実験においてヒト血漿の品質を模倣するために使用され得、必要とされるより重要な実験のためにヒト血漿を保存する。
表１は、この実施例で使用される用語を定義する。
Figure 0006974504
材料及び装置
このワークフローは、ヒト血漿から抽出されたｃｆＤＮＡ（無細胞ＤＮＡ）と共に使用するために設計された。ｃｆＤＮＡは、１６０〜１７０ｂｐの中央値サイズを有すると予想された。
使用した装置を表２に記載する。使用した参照及び標準プロトコルを表３に記載する。使用した試薬を表４に記載する。使用したプライマーを表５に記載する。
Figure 0006974504
Figure 0006974504
Figure 0006974504
Figure 0006974504
鋳型ＤＮＡの増幅
試薬の調製と取り扱い
ライブラリーは、記載されるように（米国特許第９，３２３，８８８号明細書）調製したが、ＶｅｒｉＳｅｑ ＮＩＰＴアダプタープレートをカスタムＹアダプターで置き換え、プレートをＰＣＲ混合物で溶出した。
ＳａｐＩアダプターを表６に従って希釈緩衝液中で１：１００に希釈し、ボルテックスミキサーを使用して１０秒間混合した。カスタムアダプターミックス（３０ｕＬ）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓｋｉｒｔｅｄ Ｔｗｉｎ−Ｔｅｃ ９６ウェルプレートに移した。
Figure 0006974504
ＳＰＲＩビーズを４℃貯蔵から取り出し、回転台上に置き、室温で約３０分間回転させた。９６ウェルフルスカートｃｆＤＮＡサンプルプレートを４℃又は−２０℃貯蔵から取り出し、必要ならば完全に解凍し、ボルテックスミキサーを使用して２０秒間混合し、１０００ｇで２０秒間遠心分離した。
増強ＰＣＲミックス、ビオチン化プライマー、及び再懸濁緩衝液を使用して、ビーズ溶出のためにＰＣＲミックスを調製した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ １０００アッセイキットの試薬を解凍した。
修飾ＶｅｒｉＳｅｑ ＮＩＰＴ ４８ライブラリー
Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒ Ｒｕｎ Ｃｏｎｔｒｏｌを開き、Ｖｅｒｉｓｅｑ ＮＩＰＴ Ｍｅｔｈｏｄ（バージョン１．４以降）を、製造者の説明書を使用して実行した。液体検出チェックの後、トラック４７上の担体の位置５に溶出緩衝液又はＨＴ１を含む２０ｍＬリザーバを除去した。
ビーズ乾燥工程の後、方法がＨＴ１又は溶出緩衝液をプレートアウトする前に、トラック１９〜２４上に見出される３×２マルチフレックス担体の位置５のＳＰＲＩビーズプレートを除去した。或いは、試薬を含む２０ｍＬリザーバが除去された場合、Ｈａｍｉｌｔｏｎは、ＨＴ１又は溶出緩衝液をプレートアウトしないので、本方法を終了させることができる。
ウェル当たり５０ｕＬのＰＣＲミックスでビーズを溶出するために、プレートをホイルシールで覆い、ボルテックスで混合し、遠心分離機上でスピンダウンし、プレート磁石上に最低２分間、溶液が透明になるまで置いた。上清（５０ｕＬ）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆフルスカートＴｗｉｎ−ｔｅｃ ９６ウェルプレートに移した。
ＰＣＲ増幅
サンプルプレートをサーモサイクラー上に置き、ＥＰＭ１４プログラムを選択した。ＥＰＭ １４プログラムの概要を表７に示す。ＥＰＭ１４の完了後、プレートをサーモサイクラーから取り出した。ＰＣＲのさらなるサイクルがない場合、次のセクション：「ストレプトアビジン結合、消化、及び精製」に進む。
Figure 0006974504
定量及び希釈（２回目のＰＣＲのみ）
ＰＣＲ産物（５０μＬ）を、１．５ｍＬ又は２ｍＬチューブ中で９５０μＬの再懸濁緩衝液（ＲＢ）と１：２０希釈で合わせ、合計１ｍｌとした。ボルテックスミキサーを使用して溶液を混合し、スピンダウンした。
Ｑｕｂｉｔ Ｒｅａｄｅｒを、製造業者によって推奨されるように使用した。Ｑｕｂｉｔ読み取りは、サンプル当たり１０μＬのサンプル入力を有する２つの別個のチューブを使用して行い、得られた読み取りを平均した。６０ｐｇ／μＬに希釈した後、所望の体積の１：２０ ＥＰＭ １４生成物を、体積の適切なチューブ（５ｍＬ、１５ｍＬ、又は５０ｍＬポリプロピレンチューブ）中で、示された体積の再懸濁緩衝液と合わせた。最終希釈物を混合し、スピンダウンし、残りの１：２０希釈ストックを将来の使用のために−２０℃で保持した。
２回目のＰＣＲ増幅
ＥＰＭ １４生成物（６０ｐｇ／μＬの２５ｕＬ）を新規９６ウェルプレートに添加した。ＰＣＲミックス（２５ｕＬ）をこの溶液に総体積５０ｕＬで添加し、混合した。プレートをサーモサイクラー上に置き、表８に概説したＥＰＭ １３プログラムを選択した。
Figure 0006974504
ＰＣＲを行った後、プレートをサーモサイクラーから取り出した。サンプル複製物を適切なサイズのチューブ（５ｍＬ、１５ｍＬ、又は５０ｍＬポリプロピレン）にプールし、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００チップを実行してＰＣＲ増幅を検証した。５マイクロリットルのサンプルを１５μＬの再懸濁緩衝液で希釈して、１：４希釈液を作り出した後、バイオアナライザーにかけた。増幅されたライブラリーのピークサイズは、２６０〜２７０ｂｐ付近を中心とした。
出力及び保存
このプレートは、後日の使用のために、密封され、２℃〜８℃で保存され得るか、又は密封され、−２０℃〜−１５℃で保存され得るか、又は一晩以上保存され得る。
ストレプトアビジン結合、消化及び精製
試薬の準備と取り扱い
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１を、室温で最大３０分間、ロチッセリー上に置いた。反応は、ディープウェルプレート又は容量の適切なポリプロピレンチューブ中で起こり得る。各消化反応について、十分な消化ミックスを作製するために表９に従う。十分なミックスを作製するのに必要な全反応を体積に乗じる。必要になるまで、ＳａｐＩ消化ミックスを氷上又は４℃に保つ。ＤＮＡ １０００バイオアナライザー試薬を、暗所内で室温で少なくとも３０分間インキュベートする。
Figure 0006974504
ストレプトアビジンビーズ洗浄
消化されるべき各サンプルについて、表１０のストレプトアビジンビーズの体積を反応容器に分配した。
Figure 0006974504
等体積の１×ビーズ洗浄液を、ストレプトアビジンビーズと共に各チューブに添加し、混合した。１ｘビーズ洗浄液は、等体積の蒸留水及びＭｙＯＮＥ Ｔ１ビーズ洗浄液であった。ＭｙＯＮＥ Ｔ１ビーズ洗浄は、事前に行うことができ、２℃〜８℃で保存することができる。ＭｙＯＮＥ Ｔ１ビーズ洗浄は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２Ｍ ＮａＣｌを合わせることによって行うことができる。溶液が透明になるまで（最低１分間）、混合物を磁石上に置いた。上清の半分（１／２）を除去し、容器を磁石から取り出した。これをさらに２回繰り返し、合計３回洗浄した。洗浄したビーズの容器を磁石から取り出した。
制限消化
洗浄したビーズを有する反応容器を、溶液が透明になるまで（最低１分間）磁石上に置いた。ビーズのみが容器中に残るように、全ての上清を除去した。表１０に示すＰＣＲ産物の体積を乾燥ビーズに添加し、混合してビーズを再懸濁した。結合ミックスをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上で１５００ ＲＰＭ及び２０℃で２０分間混合した。容器を短時間回転させた後、溶液が透明になるまで（最低１分間）、容器を磁石上に置いた。チューブが磁石上にある間に、全ての上清を除去した。表１０に示す消化ミックスの体積を容器に添加し、容器をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上に１５００ ＲＰＭ及び３７℃で１時間置いた。インキュベーション後、表１０の適切な体積のＥＤＴＡを反応容器に添加し、混合し、スピンダウンし、溶液が透明になるまで（最低２分間）容器を磁石上に置いた。
上清サンプル（ここでは、ｒｅＤＮＡと呼ぶ）を、新しい容積の適切なポリプロピレン容器に注意深く移した。精製したサンプルプール（５μＬのサンプルを５μＬの再懸濁緩衝液で希釈して１：２にした後、泳動させた）を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｅチップ上で泳動させて、消化を確認した。ｃｆＤＮＡのピークサイズは、１６５〜１７０ｂｐ付近を中心とした。異常なバイオアナライザープロファイルを有するサンプルは、再テスト及び／又は廃棄された。ＱＣ要件を満たした同じサンプルの消化物を、容積の適切なポリプロピレンチューブにプールした。サンプルを−２０℃で長期間保存した。
対照材料の作製
試薬の準備と取り扱い
解凍後、１０μＬのｒｅＤＮＡを１０μＬの再懸濁緩衝液と合わせることによって、１：２のサンプル希釈のｒｅＤＮＡサンプルのアリコートを作製した。Ｑｕｂｉｔ試薬及びＱｕｂｉｔ緩衝液を使用して、１：２００希釈の色素を作製した。
不活性化ＤＮＡ（ｄｅＤＮＡ）の作製
脱活性化ＤＮＡ（ｄｅＤＮＡ）は、任意の酵素活性（連結を含む）を妨げる５’逆方向ｄｄｔ修飾を有する非ヒト１７０ｂｐ配列由来の増幅ＤＮＡである。
逆方向ｄｄｔ ＰＣＲプライマーカクテルのためのプライマーミックスを、３００ｕＬの溶出緩衝液と、５０ｕＬの各リバースプライマー及びフォワードプライマー（合計１００ｕＬについて）とを合わせることによって作製した。鋳型ＤＮＡを５０ｐｇ／ｕＬに希釈した。鋳型は、以前に増幅されたｄｅＤＮＡ又は新たに配列された人工１７０ｂｐのいずれかであり得る。２５マイクロリットルの基質ＤＮＡを、２５ｕＬの逆方向ｄｄｔ ＰＣＲプライマーカクテルと合わせ、サーモサイクラー上に置き、ＥＰＭ １４を用いて実行した。完了後、全ての反応物をプールした。ｄｅＤＮＡは、−２０℃で保存することができる。
Ｑｕｂｉｔ定量
１：２サンプル希釈で、ｒｅＤＮＡ及びｄｅＤＮＡサンプル当たり２つの別々のチューブ、１０μＬ（高）サンプル入力を有する１つのチューブ、及び５μＬ（低）入力を有する１つのチューブを使用して、Ｑｕｂｉｔ読み取りを行った。
最終濃度は、高濃度チューブのＱｕｂｉｔ測定値（ｎｇ／ｍＬ）に４０を掛け、低濃度チューブのＱｕｂｉｔ測定値（ｎｇ／ｍＬ）に８０を掛けることによって決定した。高読み取り値と低読み取り値との差が２つの濃度読み取り値のうち低い方の３０％を超えた場合、Ｑｕｂｉｔ定量を再度行い、高読み取り値と低読み取り値の最終濃度を平均して最終濃度（ここでは、ｐｇ／μＬ）とした。Ｑｕｂｉｔ定量は、ｒｅＤＮＡストックを−２０℃保存から解凍したときはいつでも行った。
人工血漿の作製
生成された各９００μＬの人工血漿は、５０％血漿希釈剤（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮａｃ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３．５ｎｇ ｒｅＤＮＡ、３．５ｎｇ ｄｅＤＮＡ、及び充填されるｄＰＢＳを含んでいた。
容積の適切なポリプロピレン容器に、適切な体積の血漿希釈剤を添加し、実質的な体積が作製された場合、撹拌棒を使用して混合した。容積の適切な容器中で、必要な総ｄＰＢＳを測定した。２つの容積の適切なポリプロピレン容器（少なくとも４×ｄｅＤＮＡ及びｒｅＤＮＡ体積）において：容器を、測定されたリザーブからのｄＰＢＳで５０％まで満たし、適切な体積のｒｅＤＮＡ及びｄｅＤＮＡを添加し（チューブ当たり１つ）、適切な体積のＥＤＴＡをｒｅＤＮＡチューブに添加し、リザーブからの残りのｄＰＢＳを、血漿希釈剤とともに混合容器に添加し、撹拌棒又は反転を使用して混合した。ｄｅＤＮＡ及びｒｅＤＮＡチューブを密封し、激しくボルテックス混合した。ｄｅＤＮＡチューブ内容物を混合容器に添加し、５分間混合し、次いで、ｒｅＤＮＡチューブ内容物を混合容器に添加し、最低３０分間混合した。
人工血漿は、正常なヒト母体血漿として使用されるまで、−８０℃のフリーザーで長期間保存するためにスクリュートップチューブにアリコートすることができる。
実施例２
ｒｅＤＮＡのキャラクタリゼーション
この試験の目的は、ｒｅＤＮＡ又はｒｅＤＮＡ断片が由来する対応するｃｆＤＮＡのいずれかに対して行われた非侵襲性出生前試験のメトリックを比較することであった。ｒｅＤＮＡは、健康な妊娠から得られた全血に由来する血漿から抽出されたｃｆＤＮＡから、実施例１に記載されるように生成した。血液は、健康な男女の胎児の混合物を含む４８の妊娠から得た。適切な同意を得て患者から血液を採取した。
配列決定に基づく非侵襲性出生前試験を、元のｃｆＤＮＡ及びｃｆＤＮＡ由来のｒｅＤＮＡに対して行った。試験は、米国特許第１０，０９５，８３１号明細書に記載されているように行われ、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。試験からの配列決定メトリック及び他のＮＩＰＴ試験メトリックは、断片のサイズ及び／又はカバレッジに基づく胎児分率、ｔ統計及び対数尤度比（ＬＬＲ）を含むＮＩＰＴ試験結果統計を含んだ。
以下の表に要約される主要なＮＩＰＴメトリックは、ｒｅＤＮＡが一致した血漿サンプルと一貫して且つ比例的に等価であったことを示す。ｒｅＤＮＡにおけるいかなる偏りも再現性があり、一貫していた。例えば、ＣｈｒＸにおける短い読み取りと長い読み取りとの間の関係は、血漿サンプル及びｒｅＤＮＡサンプルにおいて維持された。結果は、ｒｅＤＮＡがＮＩＰＴ試験検証のための対照として有用であり得ることを示す。
Figure 0006974504
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物、及び電子的に利用可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。刊行物で参照される補足資料（補足表、補足図、補足材料及び方法、並びに／又は補足実験データなど）も同様に、それらの全体が参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示との間に何らかの不一致が存在する場合、本出願の開示が適用されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられたものである。不必要な限定は、それらから理解されるべきではない。本開示は、図示され、説明された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形例が特許請求の範囲によって定義される開示内に含まれる。
特に断らない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、特に断らない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に均等論を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数字を考慮して、通常の四捨五入技法を適用することによって解釈されるべきである。
本開示の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、全ての数値は、本質的に、各々の試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる範囲を含む。
全ての見出しは読者の便宜のためであり、そのように指定されない限り、見出しに続く文章の意味を限定するために使用されるべきではない。

Claims (69)

  1. 対象から得られたサンプルに由来する複数の二本鎖鋳型核酸を提供することと；
    前記鋳型核酸の両端に汎用アダプターを連結して、前記汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含む複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することであって、
    前記汎用アダプターは、二本鎖核酸の領域を含む、形成することと；
    第１の汎用プライマー及び第２の汎用プライマーで前記複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を増幅して、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせることと；
    前記増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子の両端から前記汎用アダプターの少なくとも一部を除去して、除去された汎用アダプター及び複数の再生された鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を生じさせることと：
    を含み、
    ｒｅＤＮＡが、対象において観察されるサイズと類似又は同一のサイズの鋳型分子の集団を含む、方法。
  2. 前記二本鎖鋳型核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二本鎖鋳型核酸が無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記対象が妊娠しているヒトであり、前記二本鎖鋳型核酸が胎児及び母体核酸の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記複数の二本鎖鋳型核酸がｃｆＤＮＡを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記胎児が遺伝的状態を含まない、請求項４に記載の方法。
  7. 前記胎児が遺伝的状態を含む、請求項４に記載の方法。
  8. 前記遺伝的状態が異数性である、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記異数性がトリソミーである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記トリソミーが、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、９トリソミー、８トリソミー、２２トリソミー、ＸＸＸ、ＸＸＹ、又はＸＹＹである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記遺伝的状態がヌクレオチド配列の過小発現を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 前記対象が新生物を有することが疑われる、請求項１に記載の方法。
  13. 前記複数の二本鎖鋳型核酸が、循環腫瘍ＤＮＡ及び無細胞正常ＤＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記複数の二本鎖鋳型核酸が、血液、尿、痰、又は便に含まれる、請求項１に記載の方法。
  15. 前記連結の前に、前記複数の二本鎖鋳型核酸を処理して、平滑末端になるように末端を修飾することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記連結の前に、前記複数の二本鎖鋳型核酸を処理して、３’末端を修飾して３’突出構造として終結させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記汎用アダプターが少なくとも１つの汎用プライマー結合部位を含む一本鎖非相補的核酸鎖の領域をさらに含み、前記連結が、前記汎用アダプターの二本鎖核酸の前記領域を前記鋳型核酸の各末端に共有結合的に付着させる、請求項１に記載の方法。
  18. 前記増幅が指数関数的増幅反応を含む、請求項１に記載の方法。
  19. 前記指数関数的増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記増幅が、低いエラー率を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、前記除去することが、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を制限エンドヌクレアーゼに曝露すること、及び前記アダプター−鋳型−アダプター分子を切断して、除去された汎用アダプター及び複数のｒｅＤＮＡを生じさせることを含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記制限エンドヌクレアーゼの前記切断部位及び前記認識部位が別々である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記制限エンドヌクレアーゼがＳａｐＩ、ＭｌｙＩ、又はＢｐｕＥＩである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ｒｅＤＮＡが、前記鋳型の各末端に前記汎用アダプターの一部を保持する、請求項１に記載の方法。
  25. 前記ｒｅＤＮＡが、前記鋳型の各末端に前記汎用アダプターの一部を保持しない、請求項１に記載の方法。
  26. 前記第１の汎用プライマー及び前記第２の汎用プライマーが捕捉剤を含む、請求項１に記載の方法。
  27. 前記捕捉剤がビオチンを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、前記除去することが、前記アダプター−鋳型−アダプター分子を、前記捕捉剤に結合して、結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせる化合物を含む表面と接触させることと、前記結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を、前記結合された増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を切断して除去された汎用アダプター及び複数のｒｅＤＮＡを生じさせる制限エンドヌクレアーゼに曝露することとを含み、前記除去された汎用アダプターが前記表面に結合される、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記除去することが、前記除去された汎用アダプターを前記ｒｅＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記分離することが、前記除去された汎用アダプター及び前記ｒｅＤＮＡを含む混合物を、前記捕捉剤に結合する化合物と接触させることを含み、前記化合物が表面に付着され、前記除去された汎用アダプターが前記表面に結合される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記表面がビーズを含む、請求項２８又は３０に記載の方法。
  32. 前記除去された汎用アダプターを含む前記表面を除去して、前記除去された汎用アダプターを前記ｒｅＤＮＡから分離することをさらに含む、請求項２８又は３０に記載の方法。
  33. 前記除去することが、所定のサイズ範囲内に入るｒｅＤＮＡの選択を含む、請求項１に記載の方法。
  34. 対象から得られたサンプルに由来する複数の再生鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を提供することであって、
    各ｒｅＤＮＡは増幅された鋳型であり、前記ｒｅＤＮＡは、対象から得られたサンプルにおいて観察されるサイズと類似した又は同一のサイズの鋳型分子の集団を含む、提供することと；
    前記鋳型核酸の両端に汎用アダプターを連結して、前記汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含む複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することであって、
    前記汎用アダプターは、（ｉ）二本鎖核酸の領域、及び（ｉｉ）少なくとも１つの汎用プライマー結合部位を含む一本鎖非相補的核酸鎖の領域を含み、
    それによって、鋳型の少なくとも一部の配列を決定するための配列決定ライブラリーを生成する、形成することと
    を含む、方法。
  35. 一本鎖非相補的核酸鎖の前記領域が、少なくとも１つの汎用伸長プライマー結合部位をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 一本鎖非相補的核酸鎖の前記領域に対して遠位の二本鎖核酸の前記領域が平滑末端構造として終結する、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記複数の鋳型が平滑末端構造を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 一本鎖非相補的核酸鎖の前記領域に対して遠位の二本鎖核酸の前記領域が、３’突出構造として終結する、請求項３４に記載の方法。
  39. 前記３’突出構造が、１〜４ヌクレオチドの突出構造を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記３’突出構造がＴヌクレオチドの突出を含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記鋳型が、二本鎖核酸の前記領域の前記３’突出構造に相補的な３’突出構造を含む、請求項３８に記載の方法。
  42. 複数の増幅部位を含む表面を提供することであって、
    前記増幅部位は、遊離３’末端を有する付着した一本鎖核酸の少なくとも２つの集団を含む、提供することと、
    増幅部位を含む前記表面を、個々のアダプター−鋳型−アダプター分子からのアンプリコンのクローン集団を各々含む複数の増幅部位を産生するのに適した条件下で、前記複数のアダプター−鋳型−アダプター分子と接触させることと、
    をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  43. 前記複数のアダプター−鋳型−アダプター分子の数が増幅部位の数を超え、前記アダプター−鋳型−アダプター分子が前記増幅部位への流体アクセスを有し、前記増幅部位の各々がいくつかのアダプター−鋳型−アダプター分子のための容量を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記接触させることが、（ｉ）前記アダプター−鋳型−アダプター分子を平均輸送速度で前記増幅部位に輸送すること、及び（ｉｉ）前記増幅部位にある前記アダプター−鋳型−アダプター分子を平均増幅速度で増幅することを同時に含み、前記平均増幅速度が前記平均輸送速度を超える、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記汎用アダプターが制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項１に記載のアダプター−鋳型−アダプター分子を含む組成物。
  46. 前記制限エンドヌクレアーゼがＳａｐＩ、ＭｌｙＩ、又はＢｐｕＥＩである、請求項４５に記載の組成物。
  47. 人工生物学的流体をさらに含む、請求項１に記載の方法によって生成された前記複数のｒｅＤＮＡを含む組成物。
  48. 前記人工生物学的流体が人工血漿を含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記対象が病原体感染を有することが疑われる、請求項１に記載の方法。
  50. 前記病原体が細菌病原体又はウイルス病原体である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記サンプルがウイルスＤＮＡ又は細菌ＤＮＡを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記サンプルが、血液、尿、痰、又は便を含む、請求項５０に記載の方法。
  53. 核酸検出試験において対照を使用する方法であって：
    ａ．請求項１に記載の方法を用いて、複数の再生された鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を提供することと；
    ｂ．試験サンプル及び工程（ａ）で得られた前記ｒｅＤＮＡに対して核酸検出試験を行うことと；
    ｃ．対照として前記ｒｅＤＮＡを用いた前記核酸検出試験の結果を分析することと
    を含む、方法。
  54. 前記核酸検出試験が配列決定を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記核酸検出試験がマイクロアレイ分析を含む、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記核酸検出試験が酵素プロセスを含む、請求項５３に記載の方法。
  57. 請求項１に記載の方法を用いて得られた複数の再生鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）に対して核酸検出試験を実施することを含む方法。
  58. 前記ｒｅＤＮＡが、ライブラリー調製方法の品質のための対照である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ｒｅＤＮＡが、配列決定器具のための較正対照である、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記ｒｅＤＮＡが、アレイ機器のための較正対照である、請求項５７に記載の方法。
  61. 前記ｒｅＤＮＡが、核酸配列決定試験のための検証対照である、請求項５７に記載の方法。
  62. 前記ｒｅＤＮＡが、配列決定に基づく非侵襲性出生前試験のための検証対照である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ｒｅＤＮＡが、配列決定に基づく腫瘍検出試験のための検証対照である、請求項６１に記載の方法。
  64. 前記ｒｅＤＮＡが、配列決定に基づくコンパニオン診断試験のための検証対照である、請求項６１に記載の方法。
  65. 前記コンパニオン診断試験が、処置レジメンにおいて治療処置が適切であるかどうかを決定するために、サンプル中の遺伝子変異体の存在又は同一性を決定する、請求項６４に記載の方法。
  66. ｒｅＤＮＡは請求項１に記載の方法により提供される、請求項３４に記載の方法。
  67. 対象から得られたサンプルに由来する複数の二本鎖鋳型核酸を提供することであって、前記対象が妊娠しているヒトであり、前記二本鎖鋳型核酸が胎児及び母体核酸の混合物を含む、提供することと；
    前記鋳型核酸の両端に汎用アダプターを連結して、前記汎用アダプターに隣接する鋳型核酸を含む複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を形成することであって、
    前記汎用アダプターは、二本鎖核酸の領域を含む、形成することと；
    第１の汎用プライマー及び第２の汎用プライマーで前記複数のアダプター−鋳型−アダプター分子を増幅して、増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子を生じさせることと；
    前記増幅されたアダプター−鋳型−アダプター分子の両端から前記汎用アダプターの少なくとも一部を除去して、除去された汎用アダプター及び複数の再生された鋳型核酸（ｒｅＤＮＡ）を生じさせることと：
    を含み、
    ｒｅＤＮＡが、対象に由来するサンプルにおいて見出されるサイズ分布と類似又は同一のサイズ分布を有する鋳型分子の集団を含む、方法。
  68. 前記増幅が指数関数的増幅を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記指数関数的増幅がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項６８に記載の方法。
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