JP2022036975A - ナノポア技術を用いた短いdna断片の迅速な配列決定 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、その開示がその全体において本明細書中に記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれる2015年11月12日提出の米国仮特許出願第62/254,579号明細書の優先権を主張する。
は、短断片ライブラリ調製のために使用され得ない。本明細書中に記載の開示は、迅速な短DNA配列決定を可能にするためのライブラリ調製およびデータ分析方法に関する。
最終産物の<5%となった(図1B、レーン2)。ライゲーション前にdA尾部付加DNAを精製することにより、2つのアダプターがライゲーションされる最終産物のパーセンテージが25%まで増加した(図1B、レーン3)。100μL~20μLの反応体積の縮小により、2つのアダプターがライゲーションされた最終産物のパーセンテージが48%までさらに増加した(図1B、レーン4)。10分RTおよび4℃で1~2時間の温置を組み合わせることにより、本発明者らは、予め連結されたE5タンパク質を放出することなく、アダプターが両末端にライゲーションされた断片のパーセンテージを61~63%まで増加させることができた(図1B、レーン5~7)。したがって、dA尾部付加DNAを精製し、次いで濃縮して反応体積を縮小し、4℃で2時間という長いライゲーションを導入することにより、本発明者らは、両末端にアダプターがライゲーションされた最終産物のパーセンテージを<5%から63%まで増加させ(図1B、レーン2対7)、下流His-Tagビーズ精製のための十分な材料がもたらされた(図3)。
した(図3)。MinIONを用いて本発明者らのプロトコールを使用して調製した短DNA断片ライブラリの配列決定を行ったところ、配列決定の最初の3分後に約500のユニークな読み取りデータが生成され、43~87Kの生読み取りデータおよび27~58Kの2D読み取りデータ(32~67%)が配列決定の4時間後に得られた(図2、図5)。これは、好都合には、36時間後の12,000個よりも少ない読み取りデータを配列決定した従来からのMinION配列決定プロトコールと匹敵する。本発明者らのプロトコールを使用して生成させた読み取りデータのうち、2D読み取りデータの40~70%がある位置にユニークにマッピングされ得た(図5)。
ライゲーション条件の開発
ライゲーション効率を評価するため、最初のライゲーション反応のために短DNA対照断片を使用した。Q5 High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NEB)を使用してpCR-Bluntベクターから434bp断片を増幅させるために、M13フォワードおよびリバースプライマーを用いたPCRを使用して断片を作製した。表1を参照のこと。
0.2pmol、52ng)を30μL NEB Next dA-Tailing Module(NEB)反応[4mLの対照断片、21μLのQiagen Buffer
EB、3μLの103 NEB Next dA尾部付加反応緩衝液および2μLのKlenow断片(3’→5’exo-)]に添加した。Bio-Rad C1000Touch Thermal Cyclerにおいて37℃で30分間、反応を行った。dA尾部付加反応全てを100μLの総体積[30μLのdA尾部付加反応、10μLの対照アダプター、10μLのヌクレアーゼ不含水、50μLのNEB Blunt/TA Ligase Master Mix(NEB)]に添加し、室温(23~25℃)で10分間温置した。
Buffer EB(2mM Tris-Cl、pH8;Qiagen)中で溶出し、0.05mM(13ng/mL)になるように希釈した。
DNAリガーゼ(NEB)を使用して16℃で一晩ライゲーション反応を行った結果、対照断片の約75%が両端にアダプターを有したが、これは、下流ステップに対する十分な最終産物とはならない。したがって、2つ組で反応を行い、合わせた。次に、MinIONキットで提供されるアダプターを保存するために、5:1の比率を使用した。
用いてImageJデンシトメトリー分析を使用して、ライゲーション産物の分量を推定した。
核酸操作
物質の最大限の回収を促進するために、別段の記載がない限り、1.5mLの低残留性微小遠心チューブおよび低残留性チップを使用した。サーマルサイクラー中で行った全ての反応について、0.2mL PCRチューブを使用した(Axygen)。スプライセレクトのペレット化およびAMPure XPビーズ関連精製のためにAgencourt SPRIStand Magnetic 6-チューブスタンド(Beckman Coulter)を使用し;His-タグビーズ単離のためにDynaMag-2磁石(Life Technologies)を使用した。
ゲノムDNA試料
MinIONによる短DNA断片ULCSを使用した細胞遺伝学的分析のために、核型が正常な男女および12トリソミー男性、21トリソミー男性およびモノソミーX女性からのゲノムDNA(gDNA)試料を使用した。Coriell Institute Cell Repositoriesから核型が正常なヒト男女試料からのB型血液のリンパ球(GM12877およびGM12878)を得て、Coriell Instituteにより提供されたプロトコールに従い培養した。製造者のマニュアルに従い、QIAamp Blood DNA Mini Kit(Qiagen)を用いて、第2継代の細胞培養物からgDNAを抽出した。21トリソミー男性からのgDNAは、Coriell Institute Cell Repositoriesにより提供された(NG05397)。12トリソミー男性およびモノソミーX女性からのDNA試料は、G-バンド核型分析を用いて細胞遺伝学的試験が行われた流産症例の妊娠産物から得た。gDNAは、絨毛膜絨毛の絨毛初代細胞培養物から、All Prep DNA/RNA/Protein Mini Kit(Qiagen)を使用して抽出した。gDNAの品質は、0.8%アガロースゲル上で調べ、NanoDrop 1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量した。DNAは必要になるまで-20℃で保存した。
ライブラリ調製
ライブラリ調製のために、micro-TUBE(Covaris)において、製造者の500bpの設定でCovaris S220フォーカストウルトラソニケーター(focused ultra-sonicator)を使用してTE緩衝液(pH8.0)中の120μLの25ng/mL gDNAを断片化した。サイズ選択のために、100μLの断片化gDNAを使用した。製造者のダブルサイズの選択プロトコールに従い、ライトサイド0.55倍、レフトサイド0.7倍の条件(Beckman Coulter)を用いて、スプライセレクト試薬を使用して、1.5mLのDNA LoBindチューブ(Eppendorf)中でサイズ選択を行った。1.5mL DNA LoBindチューブ中、40~50μLのBuffer EB中でDNAを溶出させた。次いで、断片サイズを確認するために、2%ゲル電気泳動に対して2μLのDNAを使用した。NanoDrop定量のために精製DNA(3μL)を保存した。サイズ選択したDNA断片は、約350~600bp長であった。
Module(NEB)を使用して、末端修復反応を行った。次に、5μLのDNA
CS(Oxford Nanopore,SQK-MAP004)、10μLの10×NEB Next End Repair Reaction Bufferおよび5μLのNEB Next End Repair Enzyme Mixをサイズ選択DNA断片に添加し、穏やかにピペッティングすることにより混合した。反応物を室温で25分間温置し、DNA LoBindチューブ中でスプライセレクト試薬プロトコールに従い、1.8倍AMPure XPビーズを使用して精製した。22μLのBuffer EB中で末端修復DNAを溶出させ、Qubit dsDNA HS AssayKit(Life Technologies)を使用してDNAを定量した。
MinION配列決定
次に、150mLのプライミングミックス(147μLのEP緩衝液および3μLの燃
料ミックス(fuel mix))をMinION Flow Cell(R7.3)に載せ、10分間温置した。プライミング工程を一度繰り返した。次に、150μLのMinION配列決定ライブラリ(12μLのプレ配列決定ミックス、135mLのEP緩衝液および3mLの燃料ミックス)を穏やかに混合し、MinION Flow Cellに載せた。MAP 48-hr gDNA配列決定プロトコールを使用し、十分なデータが回収されたときに配列決定反応を停止させた。
データ分析
ローカルfast5ファイルを移すためにMetrichor Agent V2.26を使用し、カレンシーをベースイベントに変換するために2D Base calling Rev1.14を使用した(Oxford Nanopore Technologies)。Fast5をfastQファイルに変換するために、Pore tools
v0.5.0を使用した。カットアダプト(cut adapt)v1.7.1を使用して、最初および最後の50塩基を各配列から除去し、除去後に少なくとも50塩基長であった配列を維持した。BLATを使用して、1Dおよび2D読み取りデータの両方をEnsembl GRCh37ヒト参照ゲノムに対してアラインした(図3)。
極低カバレッジ配列決定(ULCS)を使用したデジタル核型分析
極低カバレッジ配列決定(ULCS)は、細胞遺伝学的分析のための強力なツールである。概念実証として、本発明者らは、5つの試料において分析を行い、この実験に対して、改変したULCSストラテジーを使用した。以前の試験から、ULCSにおける変動係数(CV)(<0.01倍カバレッジ)が各常染色体において15%よりも低く、MiSeqとIon Protonプラットフォームとの間で常染色体性CVの有意な差がなかったことが示された。ULCS分析において、本発明者らは、各染色体におけるUA(添字i、i=1、2、…、22、X、Yとして表示)がポアソン分布にフィットすると仮定した。
UAi=niφi
式中、niは、染色体iをカバーするために必要とされる読み取りデータ数であり、φiは染色体iのカバレッジである。各染色体におけるUAのパーセンテージ(%UAi)は、同じカバレッジ下での各染色体の長さおよびコピー数により決定される。
として推定され得る。
染色体の増減に起因するカバレッジφの変化に対処するために、補正された正規化%UAiは、
に等しく、ここで、
は、Z-スコアにより決定される場合、正常な常染色体の平均Norm_%UAiである。未知の試料に対して、この試験において、既知の正常な常染色体により、正常な常染色体のNorm_%UAiの標準偏差(SD)(SD正常)を推定した(
内)(n=105、SD正常=0.0489)。各染色体に対してZ-スコアを計算した:
に等しい。
内部正規化
DNA配列決定またはマイクロアレイを使用したコピー数変動および/または異数性の判定のために、参照試料中のシグナル存在度と試験試料中のシグナル存在度を比較する。例えば、試験試料AからのDNAの「X」ngを配列決定する場合、100kのユニークな読み取りデータは21番染色体にマッピングする。同じ配列決定の実行において試験試料Bからの「X」ngのDNAを配列決定する場合、150kのユニークな読み取りデータは21番染色体にマッピングする。しかし、同じ配列決定の実行において「X」ngの参照、正常、DNA試料を配列決定する場合、100kのユニークな読み取りデータは21番染色体にマッピングされる。したがって、試料Aは参照試料と同じ21番染色体の存在度を有し、一方で試料Bでは50%多く、すなわち21トリソミーである。
Claims (29)
- a.複数の核酸をナノポア配列決定装置に置くステップ、
b.1つ以上のナノポアに前記核酸を通過させるステップ、
c.標識化核酸残基を検出するステップ、および
d.前記核酸の配列決定を行うステップ
を含み、前記複数の核酸が断片化核酸のプールを含む、方法。 - 前記配列決定がリアルタイムで行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記配列決定がオフィス環境で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記配列決定が現場環境で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記配列決定が臨床検査室で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記断片化核酸のプールが1000塩基対長未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記断片化核酸のプールが500塩基対長未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記断片化核酸のプールが100塩基対長未満である、請求項1に記載の方法。
- 核酸が1000ヌクレオチド長未満となるナノポアに基づく配列決定用の核酸ライブラリの調製のための方法であって、
a.核酸試料を断片化するステップ、
b.産物のdA尾部付加を行うステップ、
c.核酸断片にアダプターを連結するステップ、および
d.調製されたライブラリをナノポア配列決定装置に適用するステップ
を含む、方法。 - 核酸ライブラリの調製が核酸低残留性プラスチックを使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプターが核酸断片に対して5:1モル比で温置される、請求項1に記載の方法。
- 共有結合タンパク質を含有するアダプターが使用される、請求項1に記載の方法。
- 核酸ライブラリの調製が3時間未満で起こる、請求項1に記載の方法。
- 生体試料中の1つ以上のコピー数変動の存在を判定するための方法であって、
a.生体試料を受領すること、
b.生体試料からDNAを抽出すること、
c.少なくとも1000bp長の断片にDNAを断片化すること、
d.ナノポアに基づく配列決定のために断片を調製し、複数の生体試料の多重化が必要とされる場合、バーコード付き配列識別子を前記生体試料に付加すること、
e.ナノポアに基づく配列決定装置を使用して複数の核酸分子の配列決定を行うこと、
f.配列決定読み取りデータを蓄積すること、
g.前記核酸分子が由来した染色体および染色体位置を同定するために、前記配列決定読み取りデータを参照ゲノムに対してアラインすることであって、試料にバーコードが付
加されている場合に試料が最初に分離されるであろう、アラインすること、
h.各染色体または染色体領域に対してアラインされた読み取りデータ数を数えること、
i.参照と比較して、各染色体または染色体領域に対してアラインされた前記読み取りデータ数に基づき、コピー数変動が存在するか否かを判定すること、
j.コピー数変動の欠如があることを判定するための満足のいくレベルの確実性を達成するために十分な数の配列決定読み取りデータが得られる場合、配列決定反応を終結させること
を含む方法。 - 前記配列読み取りデータが内部参照と比較され、前記内部参照が1番染色体またはその一部である、請求項14に記載の方法。
- 前記配列読み取りデータが内部参照と比較され、前記内部参照が2番染色体またはその一部である、請求項14に記載の方法。
- 前記配列読み取りデータが内部参照と比較され、前記内部参照が所定の染色体または遺伝領域である、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が妊娠産物である、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が羊水である、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が絨毛膜絨毛生検である、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が母体血である、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が、卵割球または胚盤胞などの1個の細胞から抽出されるDNAである、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が卵割球または胚盤胞などの複数の細胞から抽出される、請求項14に記載の方法。
- 前記生体試料が組織試料である、請求項14に記載の方法。
- 核酸分子を含む生体試料中でのコピー数変動の判定を行うための操作を行うように計算システムを制御するための複数の命令でコードされるコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記操作が、
a.前記生体試料中に含有される複数の前記核酸分子のそれぞれの、ナノポアに基づく配列決定読み取りデータを受領すること、
b.配列決定前に核酸試料にバーコードが付された場合、バーコード識別子に基づいて前記配列読み取りデータを分離すること、
c.参照ゲノムに対して前記ナノポア配列決定読み取りデータをアラインすること、
d.各染色体または染色体領域に対してアラインしている配列決定読み取りデータ(UR)の数を数えること、
e.各染色体または染色体領域に対する配列決定読み取りデータの対応するパーセンテージを計算すること、
f.参照ゲノムとの比較により、コピー数変動が存在するか否かを判定すること
を含む、コンピュータプログラム製品。 - 微生物について迅速に陽性または陰性と同定するための方法であって、
a.生体試料を受領すること、
b.生体試料から核酸を抽出すること、
c.前記微生物を同定し得るゲノム情報を含有する前記核酸の領域を増幅させること、
d.ナノポアに基づく配列決定のために増幅核酸を調製すること、
e.ナノポアに基づく配列決定装置を稼働させること、
f.前記微生物について陽性または陰性と同定するために複数の配列が得られる場合、配列決定反応を終結させること
を含む、方法。 - DNAの定められた領域において突然変異について迅速に陽性または陰性と同定するための方法であって、
a.生体試料を受領すること、
b.生体試料から核酸を抽出すること、
c.関心のあるゲノム情報を含有する前記核酸の領域を増幅させること、
d.ナノポアに基づく配列決定のために増幅核酸を調製すること、
e.ナノポアに基づく配列決定装置を稼働させること、
f.関心のある前記突然変異について陽性または陰性と同定するために複数の配列が得られる場合、配列決定反応を終結させること
を含む、方法。 - 複数の生体試料を単回の配列決定反応へと多重化することを可能にするために、プライマーを使用して1つ以上の微生物が同定され得る、請求項26に記載の方法。
- 関心のある前記DNA領域に隣接する特異的プライマーを使用して、小さい(1000nt)DNA断片のPCRに基づく増幅からなる予め定められたゲノム配列決定に対する存在もしくは欠如または変化を探すために、標的領域のナノポア配列決定のためのポリヌクレオチドライブラリを調製するための方法。
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