JP2020505045A - ロングレンジ配列決定のためのバーコードを付けられたｄｎａ - Google Patents

ロングレンジ配列決定のためのバーコードを付けられたｄｎａ Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸配列アセンブリを促進するための方法およびキットに関し、該方法は、それから多数の完全な、または部分的な相補的コピーが合成され、続いて配列決定された鋳型核酸の同一性をコードするバーコードの作製を含む。【選択図】図３

Description

本発明は、ＤＮＡ配列決定、特に配列アセンブリおよびフェーズド（ｐｈａｓｅｄ）配列決定を促進するための方法の分野に属する。
本発明は、核酸配列アセンブリを促進するための方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む：ａ）一本鎖鋳型核酸を含む核酸試料を提供し；ｂ）それぞれの鋳型核酸に１以上のバーコード開始プライマーをプライミングさせてアニーリングした核酸会合体を作製し、ここで、それぞれのバーコード開始プライマーは、３’鋳型ハイブリダイゼーション部分および５’バーコード開始部分を含み；ｃ）ポリメラーゼ伸長を実施して相補鎖を作製し、それは、鋳型核酸にアニーリングしたままであり；ｄ）２ラウンド以上のオリゴヌクレオチドコード単位“アッセイ可能なポリマーサブユニット”（ＡＰＳ）をカップリングさせるスプリットプール合成（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を実施して、バーコード領域、プライマー領域および標的核酸に相補的な標的特異的領域を含む相補鎖のそれぞれにおけるオリゴヌクレオチドバーコード配列を組み立て；ｅ）バーコードを付けられた相補鎖を配列決定し；そしてｆ）バーコード配列を用いて、同じ鋳型核酸から生じたバーコードを付けられた相補鎖を同定し、そしてバーコードを付けられた相補鎖の標的特異的領域から鋳型核酸配列を組み立てる。
ある態様において、その方法は、さらに工程（ｂ）の前に一本鎖鋳型核酸を３’末端において親和性タグで末端標識することを含む。ある態様において、親和性タグは、工程（ｅ）を実施する前に工程（ｅ）のバーコードを付けられた鎖を精製するために用いられる。ある態様において、親和性タグは、ビオチンである。ある態様において、核酸は、ＤＮＡである。ある態様において、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはエキソームＤＮＡである。ある態様において、バーコード開始プライマー分子の第１配列領域は、ランダムプライマー配列領域を含む。ある態様において、ランダムプライマー配列領域は、約４ヌクレオチド長〜約１０ヌクレオチド長である。ある態様において、バーコード開始プライマー分子の第１配列領域は、準ランダム（ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ）プライマー配列領域を含む。ある態様において、準ランダムプライマー配列領域は、約４ヌクレオチド長〜約１０ヌクレオチド長である。ある態様において、バーコード開始プライマー分子は、さらに増幅プライマー結合配列、配列決定プライマー結合配列または両方を含む。ある態様において、バーコード開始プライマーは、鋳型核酸に平均で５０〜１，０００塩基対ごとに結合する。ある態様において、ポリメラーゼ伸長反応は、さらに、合成停止を導入し、それによりポリメラーゼ分子のアニーリングした核酸会合体からの置換を防ぐ、または最小限にするためのジデオキシヌクレオチドの使用を含む。ある態様において、ＡＰＳは、２〜２００の独特のＡＰＳのプールから選択される。ある態様において、ＡＰＳは、オリゴヌクレオチドである。ある態様において、ＡＰＳは、さらにエラーチェック用サブコード(ｓｕｂ−ｃｏｄｅｓ)を含む。ある態様において、それぞれのＡＰＳは、さらにランダムまたは準ランダムタグ配列を含む。ある態様において、ランダムまたは準ランダムタグ配列は、２〜８ヌクレオチド長である。ある態様において、鋳型核酸フラグメントのそれぞれの個々のバーコードを付けられた相補的核酸コピーと関係するランダムまたは準ランダムタグ配列は、独特の分子カウンター配列として機能する。ある態様において、鋳型核酸バーコード配列と関係する異なる分子カウンター配列の数は、所与の鋳型ＤＮＡ核酸に由来していた相補的ＤＮＡコピーの初期数を数えるために、または所与の鋳型ＤＮＡ核酸内のリピート配列を検出するために用いられる。ある態様において、分子カウンター配列は、鋳型核酸配列バリアントが増幅反応の間のポリメラーゼエラーに由来していた可能性を決定するために用いられる。ある態様において、ＡＰＳは、２ラウンド以上のスプリットプール合成の間に、スプリント分子をアニーリングさせることにより組み立てられる。ある態様において、ＡＰＳは、２ラウンド以上のスプリットプール合成の間に、ライゲーションまたはクリック化学を用いて組み立てられる。ある態様において、その方法は、ロングレンジＤＮＡ配列アセンブリのために用いられる。ある態様において、その方法は、配列フェージング（ｐｈａｓｉｎｇ）のために用いられる。ある態様において、その方法は、ハプロタイピングのために用いられる。ある態様において、その方法は、欠失、挿入、重複、転座および逆位からなる群から選択されるゲノムＤＮＡ構造バリエーションの決定のために用いられる。
システムも、開示され、ここで、そのシステムは、添付された特許請求の範囲において記載される方法を実施するように設計されている。
本発明は、さらに、バーコード開始プライマーのセット、１以上のポリメラーゼ、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、アッセイ可能なポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセット、鋳型分子（スプリント）、ライゲーション試薬、クリック化学カップリング試薬、増幅プライマーおよび配列決定プライマーからなる構成要素を含むキットを提供する。
ある態様において、バーコード開始プライマーは、ランダムプライマー配列領域を含む。ある態様において、バーコード開始プライマーは、準ランダムプライマー配列領域を含む。ある態様において、ＡＰＳのセットは、２〜２０の独特のＡＰＳを含む。ある態様において、ＡＰＳは、オリゴヌクレオチドである。
本発明の新規の特徴は、添付された特許請求の範囲において詳細に述べられている。本発明の特徴および利点のよりよい理解が、本発明の原理が利用されている説明的な態様を述べる以下の詳細な記載およびその添付の図面への参照により得られるであろう：
図１Ａ〜Ｃは、それにより複数のバーコードを付けられたＤＮＡ核酸が試料中のそれぞれの個々の鋳型ＤＮＡ核酸に関して生成される本明細書で開示される方法の一態様を説明している。 図２は、複数のプライマー伸長反応由来の相補的ＤＮＡ配列のそれぞれにバーコードを付加するためのスプリットプール合成アプローチの一態様を図説しており、ここで、バーコードは、それから相補的ＤＮＡのそれぞれの個々の鎖が合成された個々の鋳型ＤＮＡ核酸の同一性をコードしている。 図３は、共通リンカー配列を含む“スプリント”分子を用いて相補的共通リンカー配列を含む一連のコード単位（ＡＰＳ）を組み立てる、鋳型核酸バーコードを組み立てて合成するための１つの限定的でない方法の概略的図説を提供する。それぞれが各ラウンド中の各試料プールに関する異なるコード単位のアニーリングおよびライゲーションを含む数ラウンドのスプリットプール合成が、鋳型核酸バーコードを作製するために用いられることができる。 図４は、バーコード開始プライマー、スプリント分子および４個の（さらにサブコードであるＳＣＩ〜ＳＣ４を含む）ＡＰＳコード単位を含む鋳型ＤＮＡ核酸バーコードを含む分子複合体の一態様の概略的図説を示している。それぞれのＡＰＳコードは、それ自体がバーコード開始プライマーの相補的領域にアニーリングしているスプリントオリゴヌクレオチドに相補的であるアニーリング配列（共通リンカー配列）により両方の末端において隣接されているサブコード領域を含む。スプリントオリゴヌクレオチドへのアニーリングによる鋳型ＤＮＡ核酸バーコードのコンビナトリアルアセンブリの後、ＡＰＳサブユニットは、（矢印により示される位置で）ライゲーションされて単一の共有結合した分子複合体を形成する。 図５は、共通リンカー配列を含む“スプリント”分子を用いて相補的ループを形成する共通リンカー配列を含む一連のコード単位（ＡＰＳ）を組み立てる、鋳型核酸バーコードを組み立てて合成するための１つの限定的でない方法の概略的図説を提供する。それぞれが各ラウンド中の各試料プールに関する異なるコード単位のアニーリングおよびライゲーションを含む数ラウンドのスプリットプール合成が、鋳型核酸バーコードを作製するために用いられることができる。
ＤＮＡ配列アセンブリおよびフェーズド配列決定の促進における使用のための鋳型ＤＮＡバーコード付けを実施するための方法、キットおよびシステムが、本明細書で開示される。ある場合には、その方法は、試料から抽出されたＤＮＡを断片化し；鋳型ＤＮＡの少なくとも第１末端に親和性タグを付加し；少なくとも第１バーコード開始プライマーをタグ付けされた鋳型ＤＮＡ核酸にハイブリダイズさせ、ここで、少なくとも第１バーコード開始プライマーは、少なくとも鋳型ＤＮＡ核酸にハイブリダイズする第１配列領域およびさらにバーコード開始部位、例えばバーコード開始因子配列、バーコード開始因子部分または“スプリント”分子にハイブリダイズするための共通のリンカー配列を含む第２配列領域を含み；ポリメラーゼ伸長反応を実施して少なくとも鋳型ＤＮＡ核酸の全部または一部にアニーリングする相補的ＤＮＡの第１鎖を作製し、続いてスプリットプール合成の連続的なラウンドを実施して２以上のコード単位を相補的ＤＮＡのそれぞれのアニーリングした鎖に付加して独特のバーコードを作製し、それは、少なくとも相補的ＤＮＡの第１鎖がそれから合成された個々の鋳型ＤＮＡフラグメントを同定するために役立つ（図１Ａ〜Ｃ）。好都合には、開示されるＤＮＡにバーコードを付ける方法は、バーコード付け、増幅および配列決定前の個々の鋳型ＤＮＡ核酸の個々の区画中への分配を必要としない。本明細書において、ＤＮＡにバーコードを付ける方法を実施するために必要とされる試薬およびＤＮＡにバーコードを付ける方法を実施するように設計されたシステムを含むキットも、開示される。
ある場合には、開示される方法は、配列アセンブリ、例えばゲノムＤＮＡ配列アセンブリを促進するために用いられることができる。例えば、ある場合には、複数のバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列（または複数のバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列の“セット”）が、それぞれの個々の鋳型ＤＮＡ核酸から、鋳型ＤＮＡ核酸に沿って多数の部位においてプライミングし、アニーリングしたプライマーのそれぞれに関してポリメラーゼ伸長反応を実施して鋳型ＤＮＡ核酸の少なくとも一部に相補的であるＤＮＡを合成し、続いてスプリットプール合成アプローチを用いて２以上のコード単位をアニーリングしたプライマーに相補的な配列のそれぞれに付加して、バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列のそれぞれのセットがそれから調製された個々の鋳型ＤＮＡ核酸の同一性をコードする独特のバーコードを作製することにより調製されることができる。バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列の増幅および配列決定後、それぞれの配列に関するバーコード配列領域は、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸に関する相補的ＤＮＡ配列のセットを同定およびアラインメントするために用いられることができ、それにより現代的な高スループット配列決定技術に関する典型的な読みの長さよりはるかに大きいＤＮＡ核酸に関する効率的なロングレンジ配列アセンブリおよび配列決定を可能にする。
ある場合には、開示される方法は、フェーズド配列決定、反復配列を含有する長いＤＮＡ鎖のアセンブリ、染色体の逆位、欠失または挿入の解明、短い配列の読みの限界の克服およびハプロタイプの同定を促進するために用いられることができる。例えば、短い配列の読みは、癌における重要な染色体の違い、例えば逆位、転座または重複を解明することができない。これらに関して、重複した領域または逆位／転座に及ぶ長い配列の読みが、ＤＮＡをその正確な染色体位置の文脈中に正確に“配置する”ために必要とされる。ハプロタイプ決定に関して、全ゲノム配列決定は、典型的には、異なる相同染色体、例えば母系および父系の遺伝系統由来の相同染色体上に存在する配列バリアント、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失および／または変異を識別することなく単一のコンセンサス配列を生成する。フェーズド配列決定は、どの遺伝的バリアントが同じまたは異なる染色体上に見られ、従って一緒にまたは別々に受け継がれるかを決定することにより、この限界に取り組む。遺伝的バリエーションのパターン、例えばハプロタイプ（すなわち切れ目のない（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ブロックとして受け継がれる配列バリアントの群）に関する情報は、遺伝的に受け継がれる形質および遺伝病の理解において重要であり、特定の遺伝子のコピー数に関する情報も、重要である。フェーズド配列決定は、ハプロタイプを決定する、ならびに新規の変異の存在を同定するためのアプローチを提供し、従って集団遺伝学および遺伝病の研究において適用を有する。
ある場合には、開示される方法を用いて作製されるバーコード配列は、増幅および配列決定反応を実施する前に個々のＤＮＡ鎖または染色体を別々の区画中に分配する必要なく同じＤＮＡ鎖および／または同じ染色体と関係しているＤＮＡ配列（またはその相補配列）を同定するために用いられることができる。ある場合には、バーコード情報は、増幅および配列決定反応を実施する前に個々のＤＮＡ鎖または染色体を別々の区画中に分配する必要なく同じＤＮＡ鎖および／または同じ染色体と関係しているＤＮＡ配列（またはその相補配列）を同定するために１以上の既知のマーカー遺伝子配列と合わせて用いられることができる。ある場合には、次いで特定の遺伝子バリアントのフェージングに関する結論が引き出されることができる。そのような情報は、ハプロタイプ、すなわち同じ核酸鎖上または異なる核酸鎖上に存在する遺伝的バリアントの特定されたセットを同定するために有用である可能性がある。ある場合には、１以上の特定された既知の遺伝子配列と関係する独特のバーコードの数の決定が、それらの遺伝子に関するコピー数のバリエーションを同定するために用いられることができる。
定義：別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語は、本開示が属する分野における当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書および添付された特許請求の範囲において用いられる際、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数への言及を含む。本明細書における“または”へのあらゆる言及は、別途記載されない限り“および／または”を包含することが意図されている。
試料：本明細書で開示される方法、キットおよびシステムは、血液、細胞、細胞懸濁液、細胞内小器官、組織試料等を含むがそれらに限定されない様々な試料のいずれから抽出されたＤＮＡ（または他の核酸分子）の分析に関しても用いられることができる。
核酸：用語“核酸”は、ヌクレオチドポリマーまたはそのフラグメントを指し、別途限定されない限り、天然存在ヌクレオチドと類似の様式で機能する（例えばハイブリダイズする）ことができる天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む。例えば、本明細書で開示される方法、キットおよびシステムは、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはＲＮＡ、ｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡの逆転写により合成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等を含むがそれらに限定されないＤＮＡまたはＤＮＡ以外の核酸分子の分析に関して用いられることができる。
ＤＮＡ抽出および断片化：様々な生物学的試料からのＤＮＡ抽出は、当業者に既知のあらゆる数の技法を用いて実施されることができる。典型的なＤＮＡ抽出手順は、以下の工程を含む：（ｉ）ＤＮＡが抽出されるべき細胞試料または組織試料の収集、（ｉｉ）ＤＮＡおよび他の細胞質性構成要素を放出させるための細胞膜の破壊（すなわち細胞溶解）、（ｉｉｉ）タンパク質、脂質およびＲＮＡを沈殿させるための溶解した試料の濃縮塩溶液による処理、続いて沈殿したタンパク質、脂質およびＲＮＡを分離するための遠心分離、ならびに（ｉｖ）洗浄剤、タンパク質、塩類または細胞膜溶解工程の間に用いられた他の試薬を除去するための上清からのＤＮＡの精製。
細胞膜の破壊は、様々な機械的剪断（例えばフレンチプレスまたは微細な針を通過させることによる）または超音波破壊技術を用いて実施されることができる。細胞溶解工程は、しばしば脂質、細胞膜および核膜を溶解させるための洗浄剤および界面活性剤の使用を含む。ある場合には、溶解（１ｙｓｉｓ）工程は、さらに試料中のタンパク質を分解するためのプロテアーゼの使用および／またはＲＮＡの消化のためのＲＮアーゼの使用を含むことができる。
ＤＮＡ精製に関する適切な技法の例は、以下の技法が含まれるが、それらに限定されない：（ｉ）氷冷エタノールまたはイソプロパノール中での沈殿、続いて遠心分離（ＤＮＡの沈殿は、イオン強度を増大させることにより、例えば酢酸ナトリウムの添加により増進されることができる）、（ｉｉ）フェノール−クロロホルム抽出、続いて核酸を含有する水相を変性したタンパク質を含有する有機相から分離するための遠心分離、ならびに（ｉｉｉ）固相クロマトグラフィー、ここで、核酸は、緩衝液のｐＨおよび塩濃度に依存して固相（例えばシリカ等）に吸着する。
ある場合には、ＤＮＡに結合した細胞性タンパク質およびヒストンタンパク質は、プロテアーゼを添加することによるかまたはタンパク質を酢酸ナトリウムもしくはアンモニウムで沈殿させることによるかまたはＤＮＡ沈殿工程の前のフェノール−クロロホルム混合物による抽出によるかのいずれかで除去されることができる。
ある場合には、ＤＮＡは、様々な適切な商業的ＤＮＡ抽出および精製キットのいずれか用いて抽出されることができる。例は、Ｑｉａｇｅｎ（メリーランド州ジャーマンタウン）からのＱＩＡａｍｐ（ヒト試料からのゲノムＤＮＡの単離に関する）ならびにＤＮＡｅａｓｙ（動物または植物試料からのゲノムＤＮＡの単離に関する）キットまたはＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）からのＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）およびＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）シリーズのキットを含むが、それらに限定されない。
単離後、ＤＮＡは、典型的にはわずかにアルカリ性の緩衝液、例えばトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中または超純水中で溶解させられる。必要である場合、追加のＤＮＡ断片化が、機械的断片化（例えば超音波処理、針剪断、噴霧、ポイントシンク（ｐｏｉｎｔ−ｓｉｎｋ）剪断または圧力セルの通過を用いる）または酵素消化技法（例えば制限酵素またはエンドヌクレアーゼの使用による）を用いて実施されることができる。
開示されるＤＮＡにバーコードを付ける方法における使用に適した鋳型ＤＮＡ核酸またはフラグメントは、現行の高スループット配列決定技術により典型的に用いられる鋳型ＤＮＡ核酸またはフラグメントよりも実質的に長いことができる。ある場合には、鋳型ＤＮＡ核酸の平均の長さは、約２５塩基（一本鎖ＤＮＡに関してはヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡに関しては塩基対）〜約１００キロ塩基の範囲であることができる。ある場合には、鋳型ＤＮＡ核酸の平均の長さは、少なくとも２５塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも７５塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも２５０塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも７５０塩基、少なくとも１，０００塩基、少なくとも１０キロ塩基、少なくとも２０キロ塩基、少なくとも３０キロ塩基、少なくとも４０キロ塩基、少なくとも５０キロ塩基、少なくとも６０キロ塩基、少なくとも７０キロ塩基、少なくとも８０キロ塩基、少なくとも９０キロ塩基または少なくとも１００キロ塩基であることができる。ある場合には、鋳型ＤＮＡフラグメントの平均の長さは、最大でｌ００キロ塩基、最大で９０キロ塩基、最大で８０キロ塩基、最大で７０キロ塩基、最大で６０キロ塩基、最大で５０キロ塩基、最大で４０キロ塩基、最大で３０キロ塩基、最大で２０キロ塩基、最大で１０キロ塩基、最大で１，０００塩基、最大で７５０塩基、最大で５００塩基、最大で２５０塩基、最大で１００塩基、最大で７５塩基、最大で５０塩基または最大で２５塩基であることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、鋳型ＤＮＡフラグメントの平均の長さは、約７５０塩基〜約２０キロ塩基の範囲であることができる。当業者は、鋳型ＤＮＡフラグメントの平均の長さはこの範囲内のあらゆる値、例えば約４．５キロ塩基を有することができることを認識しているであろう。
鋳型ＤＮＡフラグメントおよび会合した相補鎖の精製のための親和性タグ：ある場合には、鋳型ＤＮＡ核酸は、その後の分離および精製工程を容易にするために親和性タグで標識されることができる。当業者に既知の様々な親和性タグのいずれも用いられることができる。例えば、ある場合には、変性した（一本鎖）鋳型ＤＮＡの３’末端が、アビジンまたはストレプトアビジン捕捉技法を用いる分離および精製工程を容易にするためにビオチン部分で標識されることができる。変性した（一本鎖）ＤＮＡの３’標識は、当業者に既知の様々な技法を用いて成し遂げられることができる。例は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴまたは“ターミナルトランスフェラーゼ”）による一本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端における鋳型に方向付けられないヌクレオチド組み込みを含むが、それに限定されない。ＴｄＴは、一本鎖ＤＮＡに強い選好性を示すが、３’オーバーハングを有する二重鎖ＤＮＡおよび平滑二重鎖もより低い効率で標識するであろう。ＴｄＴは、一本鎖ＤＮＡの３’末端における修飾ヌクレオチド、例えばビオチン化ヌクレオチドの組み込みに有用である。一本鎖ＤＮＡ核酸の３’末端におけるビオチンによる標識は、商業的なキット、例えばＰｉｅｒｃｅ−ビオチン３’末端ＤＮＡ標識キット、カタログ番号８９８１８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて実施されることができる。
ビオチン化された分子、例えばビオチン化ＤＮＡ核酸は、当業者に既知のいくつかの技法のいずれかを用いて親和性精製されることができる。典型的には、ビオチン化された種は、固定されたアビジンもしくはストレプトアビジンタンパク質またはそれらのサブドメインを含む樹脂またはビーズベースのマトリックス上を通過させられ、ビオチン部分およびアビジンもしくはストレプトアビジン結合ポケットの間の強い非共有結合的相互作用が、ビオチン化された種の反応混合物の他の構成要素からの分離を可能にする。一部のビオチン類似体、例えばデスチオビオチンは、アビジン様タンパク質に可逆的に結合し、より厳しくない溶離条件を用いるアビジン様タンパク質からのビオチン化された分子の溶離を可能にする。
ビオチン化またはデスチオビオチン化されたタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の分子の精製のための親和性精製樹脂および他の親和性ベースの捕捉製品は、典型的にはアビジン、ストレプトアビジン、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）もしくはＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ（商標）タンパク質またはそれらのサブドメインを含み、ビーズベースの樹脂、コートされた磁性ビーズ、スピンカラム、コートされたマイクロプレートおよびリガンド特異的キットを含むがそれらに限定されない様々な形式で入手可能である。ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ｃ２１ ３８６）は、そのビオチン結合部位中にニトロ化チロシンを含有するビオチン結合タンパク質である。この化学修飾は、従来のアビジン−ビオチン複合体よりも穏やかな条件下でのアビジン−ビオチン複合体の解離も可能にする。
相補的ＤＮＡ鎖の合成のためのバーコード開始プライマー：鋳型ＤＮＡフラグメントの全部または一部に対して相補的な配列を含む相補的ＤＮＡ鎖は、プライマー伸長反応を実施することにより合成されることができる。ある場合には、複数のバーコード開始プライマーを適切なハイブリダイゼーション条件下でそれぞれの鋳型ＤＮＡに（すなわち鋳型ＤＮＡに沿った多数の部位において）ハイブリダイズさせることができ、複数のバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列または鎖（またはバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列もしくは鎖の“セット”）が、アニーリングしたプライマーのそれぞれに関してポリメラーゼ伸長反応を実施して鋳型ＤＮＡ核酸の全部または一部に相補的であるＤＮＡを合成することにより調製されることができる（図１Ａ〜Ｃ）。
ある場合には、適切なアニーリング条件下でそれぞれの鋳型ＤＮＡ核酸に結合したバーコード開始プライマーの平均数は、必要に応じて変動することができる。ある場合には、バーコード開始プライマーは、鋳型ＤＮＡ核酸に平均で５０塩基対ごと〜１０，０００塩基対ごとに結合することができる。より高頻度な結合は、ゲノムのより完全な配列決定カバー度を促進する。ある場合には、バーコード開始プライマーは、鋳型ＤＮＡ核酸に平均で少なくとも５０塩基対ごと、少なくとも１００塩基対ごと、少なくとも５００塩基対ごと、少なくとも１，０００塩基対ごと、少なくとも２，０００塩基対ごと、少なくとも３，０００塩基対ごと、少なくとも４，０００塩基対ごと、少なくとも５，０００塩基対ごと、少なくとも６，０００塩基対ごと、少なくとも７，０００塩基対ごと、少なくとも８，０００塩基対ごと、少なくとも９，０００塩基対ごと、または少なくとも１０，０００塩基対ごとに結合することができる。ある場合には、バーコード開始プライマーは、鋳型ＤＮＡ核酸に平均で最大で１０，０００塩基対ごと、最大で９，０００塩基対ごと、最大で８，０００塩基対ごと、最大で７，０００塩基対ごと、最大で６，０００塩基対ごと、最大で５，０００塩基対ごと、最大で４，０００塩基対ごと、最大で３，０００塩基対ごと、最大で２，０００塩基対ごと、最大で１，０００塩基対ごと、最大で５００塩基対ごと、最大で１００塩基対ごと、または最大で５０塩基対ごとに結合することができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれかが組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、バーコード開始プライマーは、鋳型ＤＮＡ核酸配列に平均で５００塩基対ごと〜４，０００塩基対ごとに結合することができる。当業者は、バーコード開始プライマーがこの範囲内のあらゆる値を有する頻度で、例えば平均で約５，２５０塩基対ごとに鋳型ＤＮＡ核酸に結合することができることを認識しているであろう。
ある場合には、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸に結合したバーコード開始プライマーの平均数は、少なくともｌ、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５または少なくとも５０であることができる。ある場合には、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸に結合したバーコード開始プライマーの平均数は、最大で５０、最大で４５、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２５、最大で２０、最大で１５、最大で１０、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２または最大で１であることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれかが組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸に結合したバーコード開始プライマーの平均数は、約５〜約３０の範囲であることができる。当業者は、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸に結合したバーコード開始プライマー核酸の平均数はこの範囲内のあらゆる値、例えば約１２を有することができることを認識しているであろう。
一般に、開示されるＤＮＡにバーコードを付ける方法において用いられるバーコード開始プライマーは、鋳型ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズすることができる第１配列領域およびバーコード開始部位、例えばバーコード開始因子配列、バーコード開始因子部分または“スプリント”分子にハイブリダイズするための共通のリンカー配列を含む第２配列領域を含むことができる。ある場合には、第１配列領域は、鋳型ＤＮＡ核酸にハイブリダイズすることができるランダム、準ランダムまたは標的特異的配列を含むことができる。ある場合には、開示されるＤＮＡにバーコードを付ける方法において用いられるバーコード開始プライマーは、さらに少なくとも第３配列領域を含むことができ、ここで、少なくとも第３配列領域は、検出可能な標識を取り付けるためのリンカー配列、第１配列領域および第２配列領域を分離するために用いられるスペーサー配列、増幅プライマー結合部位、配列決定プライマー結合部位またはそれらのあらゆる組み合わせを含むことができる。
ランダムプライミング：ある場合には、一本鎖鋳型ＤＮＡの相補鎖を合成するためのポリメラーゼ伸長反応は、ランダムプライミングアプローチを用いて、例えばバーコード開始プライマーの第１配列領域に関するランダム配列の短いオリゴヌクレオチド領域（すなわち“ランダムバーコード開始プライマー”）を用いて実施されることができ、それは、鋳型ＤＮＡを任意の位置で認識し、結合してそれにより適切なＤＮＡポリメラーゼ（例えばクレノウポリメラーゼ）がアニーリングしたランダムプライマーの３’−ＯＨ末端においてヌクレオチドを組み込むことを可能にする。ある場合には、ランダムプライマー配列領域の長さは、約４ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドの範囲であることができ、すなわち、そのアニーリング温度における安定なハイブリダイゼーションを提供するために十分に長く、かつそのプライマーが多数の部位において鋳型ＤＮＡを認識して結合するであろうように十分に短い。ある場合には、ランダムプライマー配列領域の長さは、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも１２ヌクレオチドであることができる。ある場合には、ランダムプライマー配列領域の長さは、最大で１２ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチド、最大で８ヌクレオチド、最大で６ヌクレオチドまたは最大で４ヌクレオチドであることができる。用いられる、または必要とされるヌクレオチドの数は、アニーリングの温度および／またはアニーリングした生成物の融解温度に影響を及ぼす溶媒条件により変動し得る。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、ランダムプライマー配列領域の長さは、約４ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドの範囲であることができる。当業者は、ランダムプライマー配列領域の長さはこの範囲内のあらゆる値、例えば約７ヌクレオチドを有することができることを認識しているであろう。
ある場合には、ランダムバーコード開始プライマーは、分子の３’末端付近に配置されたランダム第１配列領域（例えば“ＮＮＮＮＮＮ”）を含むことができ、ここで、ＮＮＮＮＮＮは、ランダムな６ヌクレオチド配列である。ある場合には、ランダムバーコード開始プライマーは、分子の５’末端付近に配置された増幅プライマー結合部位および／または配列決定プライマー領域（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー配列）を含むことができる。上記で示されたように、ランダムプライマーは、さらに分子の５’末端付近に配置された第２配列領域を含むことができ、それは、さらにバーコード開始部位、例えばバーコード開始因子配列、バーコード開始因子部分または“スプリント”分子にハイブリダイズするための共通リンカー配列を含む。ある場合には、ランダム第１配列領域、増幅および／もしくは配列決定プライマー結合領域ならびに／または第２配列領域は、１以上のスペーサー配列により隔てられていることができる。
準ランダムプライミング：ある場合には、一本鎖鋳型ＤＮＡの相補鎖を合成するためのポリメラーゼ伸長反応は、準ランダムプライミングアプローチを用いて、例えばバーコード開始プライマーの第１配列領域に関して準ランダム配列を含む短いオリゴヌクレオチド（すなわち“準ランダムバーコード開始プライマー”）を用いて実施されることができ、それは、鋳型ＤＮＡを準任意の（ｓｅｍｉ−ａｒｂｉｔｒａｒｙ）位置において調節可能な頻度で認識して結合し、それにより適切なＤＮＡポリメラーゼ（例えばクレノウポリメラーゼ）がアニーリングした準ランダムプライマーの３’−ＯＨ末端においてヌクレオチドを組み込むことを可能にする。ある場合には、準ランダムプライマー配列領域の長さは、約４ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドの範囲であることができ、すなわち、そのアニーリング温度における安定なハイブリダイゼーションを提供するために十分に長く、かつそのプライマーが多数の部位において鋳型ＤＮＡを認識して結合するであろうように十分に短い。ある場合には、準ランダムプライマー配列領域の長さは、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも１２ヌクレオチドであることができる。ある場合には、準ランダムプライマー配列領域の長さは、最大で１２ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチド、最大で８ヌクレオチド、最大で６ヌクレオチドまたは最大で４ヌクレオチドであることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、準ランダムプライマー配列領域の長さは、約４ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドの範囲であることができる。当業者は、準ランダムプライマー配列領域の長さはこの範囲内のあらゆる値、例えば約７ヌクレオチドを有することができることを認識しているであろう。
ある場合には、準ランダムプライマー配列の非ランダム部分は、約２〜約４ヌクレオチド長の範囲であることができる。用いられる非ランダムヌクレオチド配列の選択は、平均でどれくらいの頻度で準ランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合することができるかを決定するであろう。例えば、配列ＸＸＸＣＣＣ（ここで、Ｘは、ランダムヌクレオチドである）は、鋳型ＤＮＡのＧＣ含量に依存して平均で６４塩基対ごとに１回結合するであろう。
ある場合には、準ランダムバーコード開始プライマーは、分子の３’末端付近に配置された準ランダム第１配列領域（例えば“ＮＮＮＧＡＧ”を含むことができ、ここで、ＮＮＮは、ランダムな３ヌクレオチド配列である。ある場合には、準ランダムバーコード開始プライマーは、分子の５’末端付近に配置された増幅プライマー結合部位および／または配列決定プライマー領域（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー配列）を含むことができる。上記で示されたように、準ランダムバーコード開始プライマーは、さらに分子の５’末端付近に配置された第２配列領域を含むことができ、それは、さらにバーコード開始部位、例えばバーコード開始因子配列、バーコード開始因子部分または“スプリント”分子にハイブリダイズするための共通リンカー配列を含む。ある場合には、準ランダム第１配列領域、増幅および／もしくは配列決定プライマー結合領域ならびに／または第２配列領域は、１以上のスペーサー配列により隔てられていることができる。
ある場合には、準ランダム配列領域は、（Ｍ）ｉ（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋの形態のものであることができ、ここで、（Ｍ）ｉおよび（Ｎ）ｋは、それぞれ長さｉおよびｋのあらゆるランダムヌクレオチド配列であり、かつここで、（Ｘ）ｊは、一連の指定された部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）位置（単数または複数）において鋳型ＤＮＡ核酸配列を補う（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）ように選択された長さｊの特定のオリゴヌクレオチド配列である。典型的には、ｉおよびｋの値は、０〜６の範囲であることができ、ｊの値は、３〜６の範囲であることができる。ある場合には、準ランダム配列領域は、既知または部分的に既知の鋳型ＤＮＡ核酸配列の３’末端に関して指定された位置において指定された鋳型ＤＮＡ核酸配列に相補的であるように設計されることができ、それによりおおよそＺヌクレオチド長である増幅産物を生成し、ここで、Ｚの値は、典型的には５０〜１０００の範囲であることができる。
バーコード開始配列領域：上記で示されたように、ある場合には、複数のバーコード開始プライマーを適切なハイブリダイゼーション条件下でそれぞれの鋳型ＤＮＡフラグメントに（すなわち鋳型ＤＮＡ核酸に沿った多数の部位において）ハイブリダイズさせることができ、続いて複数のバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列（またはバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列の“セット”）が、まずアニーリングしたプライマーのそれぞれにおいてポリメラーゼ伸長反応を実施し、次いで多数ラウンドのスプリットプール合成を実施してバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列のセットがそれから生じた個々の鋳型ＤＮＡ核酸を同定するバーコードを作製することにより合成されることができる（図１Ａ〜Ｃおよび２）。バーコードの作製は、複数のバーコード開始プライマーが、さらにバーコード開始部位、例えばバーコード開始因子配列、バーコード開始因子部分または“スプリント”分子にハイブリダイズするための共通リンカー配列を含む第２配列領域を含むことを必要とする。当業者に既知の様々なバーコード合成開始技法が、用いられることができる。ある場合には、例えば、バーコード開始因子配列は、その後３’アルキン末端オリゴヌクレオチドコード単位および鋳型または非鋳型クリック化学(El-Sagheer, et al. (2011), “Biocompatible Artificial DNA Linker That is Read Through by DNA Polymerases and is Functional in Escherichia coli”, PNAS 108(28):11338-11343)と共に使用してＤＮＡ核酸バーコードを組み立てるための５’アジド末端ヌクレオチドを含むことができる。ある場合には、バーコード開始因子部分は、例えば第一級アミン、カルボキシル基、チオール基等で官能化されている修飾ヌクレオチドを含むことができ、それは、ＤＮＡ核酸バーコードを組み立てるためのその後のアミノ酸またはペプチドコード単位の共有結合的コンジュゲーションのための開始部位の役目を果たす。ある場合には、プライマーの第２配列領域は、やはりオリゴヌクレオチドコード単位に結合した共通リンカー（ｌｉｎｅｒ）配列に相補的である“スプリント”分子（例えば短いオリゴヌクレオチド配列）へのプライマーのアニーリングを可能にする共通リンカー配列を含むことができる。次いで、プライマー、スプリントおよびコード単位オリゴのアニーリングは、プライマーおよびコード単位オリゴを、それらがライゲーションにより連結されることができるように配置し、そしてアニーリング、ライゲーションおよび変性の繰り返されるサイクルが、ＤＮＡ核酸バーコードを組み立てるために用いられることができる。細胞由来オリゴヌクレオチドバーコード配列を組み立てるためのスプリント（または“鋳型”）の使用が、同時係属中のＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１０６３８５号において記載されている。
プライマー結合部位：ある場合には、増幅および／または配列決定プライマー結合部位領域は、約１８〜約３０ヌクレオチド長、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長の範囲であることができ、６５℃〜７５℃の融点（Ｔｍ）を有する。より大きいＧＣ含量またはより長い長さを有する配列の使用は、Ｔｍをより高い温度にシフトさせるであろう。典型的には、プライマー配列のＧＣ含量は、４０％〜６０％であり、プライマーの３’末端は、結合を促進するためにＣまたはＧで終わるであろう。ある場合には、配列決定プライマー結合部位は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマーに相補的である配列を含むことができる。
スペーサーまたはリンカー配列：ある場合には、開示されるＤＮＡにバーコードを付ける方法において用いられるバーコード開始プライマーは、さらに第１および第２配列領域を隔てるために、または検出可能な標識の取り付けのために用いられるスペーサー配列またはリンカー配列を含むことができる。一般に、スペーサーおよび／またはリンカー配列の長さは、約２ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの範囲であることができる。ある場合には、スペーサーおよび／またはリンカー配列の長さは、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくともｌ４ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチドであることができる。ある場合には、スペーサー配列および／またはリンカー配列の長さは、最大で２０ヌクレオチド、最大で１８ヌクレオチド、最大で１６ヌクレオチド、最大で１４ヌクレオチド、最大で１２ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチド、最大で８ヌクレオチド、最大で６ヌクレオチド、最大で４ヌクレオチドまたは最大で２ヌクレオチドであることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、スペーサー配列および／またはリンカー配列の長さは、約４ヌクレオチド〜約１６ヌクレオチドの範囲であることができる。当業者は、スペーサーおよび／またはリンカー配列の長さはこの範囲内のあらゆる値、例えば約７ヌクレオチドを有することができることを認識しているであろう。
バーコード開始プライマーの全体の長さ：ランダム、準ランダムまたは標的化されたバーコード開始プライマーは、標的（例えば鋳型ＤＮＡ）に相補的である領域の長さおよび共通リンカー配列、ランダム配列領域、増幅または配列決定プライマー結合配列等を組み込むために用いられる追加の配列領域の長さを含む。ある場合には、開示されるＤＮＡにバーコードを付ける方法において用いられるランダム、準ランダムまたは標的化されたバーコード開始プライマー分子の全体の長さは、約５ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチドの範囲であることができる。ある場合には、バーコード開始プライマーの長さは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも６５ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチドまたは少なくとも８０ヌクレオチドであることができる。ある場合には、バーコード開始プライマーの長さは、最大で８０ヌクレオチド、最大で７５ヌクレオチド、最大で７０ヌクレオチド、最大で６５ヌクレオチド、最大で６０ヌクレオチド、最大で５５ヌクレオチド、最大で５０ヌクレオチド、最大で４５ヌクレオチド、最大で４０ヌクレオチド、最大で３５ヌクレオチド、最大で３０ヌクレオチド、最大で２５ヌクレオチド、最大で２０ヌクレオチド、最大で１５ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチドまたは最大で５ヌクレオチドであることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、バーコード開始プライマーの長さは、約１０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドの範囲であることができる。当業者は、バーコード開始プライマーの長さはこの範囲内のあらゆる値、例えば約２８ヌクレオチドを有することができることを認識しているであろう。
相補的ＤＮＡ鎖の合成：上記で特筆されたように、鋳型ＤＮＡ核酸の全部または一部に対する相補的配列を含む相補的ＤＮＡ鎖は、プライマー伸長反応を実施することにより、すなわち鋳型ＤＮＡにアニーリングしたバーコード開始プライマー分子の３’−ＯＨ末端におけるヌクレオチドの組み込みにより合成されることができる。ある場合には、複数のバーコード開始プライマー分子を適切なハイブリダイゼーション条件下でそれぞれの鋳型ＤＮＡ核酸にハイブリダイズさせることができ、複数のバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列（またはバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列の“セット”）が、アニーリングしたバーコード開始プライマーのそれぞれに関してポリメラーゼ伸長反応を実施して鋳型ＤＮＡ核酸の全部または一部に相補的であるＤＮＡを合成することにより調製されることができる。プライマー伸長における使用のための適切なＤＮＡポリメラーゼの例は、ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼ１の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている）、Ｔａｑポリメラーゼ（その熱的安定性のため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法のために一般的に用いられる）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（やはりＴａｑポリメラーゼと比較したその優秀な熱安定性およびプルーフリーディング特性のためにＰＣＲのために用いられる）等またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。プライマー伸長反応は、安定なプライマー結合を維持し、用いられるポリメラーゼの活性を最適化する温度で実施され、例えばＴａｑポリメラーゼは、７５〜８０℃において最適活性を有し、約７２℃の反応温度がこの酵素に関して用いられる。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’方向で鋳型に相補的であるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を付加し、ｄＮＴＰの５’ホスフェート基を成長している相補的ＤＮＡ鎖の末端の３’ヒドロキシル基と縮合させることにより、鋳型ＤＮＡ核酸に相補的な新規のＤＮＡ鎖を合成する。伸長反応の時間は、用いられるＤＮＡポリメラーゼに応じて、そしてコピーされるべきＤＮＡ核酸の長さに応じて変動する（ＤＮＡポリメラーゼは、最適条件下で１分あたりおおよそ１０００塩基を組み込む）。鋳型ＤＮＡ核酸、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰに加えて、伸長反応混合物は、典型的には適切な緩衝剤、二価陽イオン、例えばマグネシウムおよび一価陽イオン、例えばカリウムイオンを含むであろう。ある場合には、伸長反応は、おおよそ０．２〜０．５ｍｌの体積を有する反応チューブ中でおおよそ１０〜２００μｌの小さい反応体積で実施されることができる。
ある場合には、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を反応混合物中に適切な濃度および／または時点で導入することにより、ランダムな位置における相補的ＤＮＡ鎖のさらなる伸長を（例えば同じ鋳型ＤＮＡフラグメント上で合成されている追加の相補鎖のポリメラーゼによる置換を回避するために）妨げることが望ましい可能性がある。例えば、ｄｄＣＴＰの導入は、遊離の３’−ＯＨ基の非存在により鋳型ＤＮＡ中の次のＧ残基の位置における相補的ＤＮＡ鎖のさらなる伸長を妨げ、それにより成長している相補的ＤＮＡ鎖を終結させるであろう。
ある場合には、例えば標的がＲＮＡである場合、逆転写酵素（ＲＴ）が、ＲＮＡ鋳型にアニーリングしたバーコード開始プライマーに関してプライマー伸長反応を実施するために用いられることができる。トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ、ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を含むがそれらに限定されない当業者に既知の数種類の適切な逆転写酵素のいずれが用いられることもできる。（やはりＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチからの）Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）は、低減したＲＮアーゼＨ活性および増大した熱安定性を有する組み換えＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素であり、野生型酵素よりも高い温度で第１鎖ｃＤＮＡを合成するために用いられることができる。操作されたＲＴの使用は、完全長産物の形成の効率を向上させ、それによりｍＲＮＡ転写産物の５’末端のコピーが完全であることを確実にし、ＲＮＡ鋳型配列の正確なｃＤＮＡコピーの合成および特性付けを可能にする。逆転写反応がより高い温度で実施されることができるより熱安定性のＲＴの使用は、高い量の二次構造を含有するＲＮＡの転写を促進する。
ＤＮＡバーコードのスプリットプール合成：本明細書で用いられる際、句“スプリットプール合成”は、コンビナトリアル合成プロセスの１つの限定的でない例を指し、ここで、反応混合物は、カップリング反応を実施する前にいくつかの異なる分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）に分けられ、ここで、それぞれの分割量は、カップリングされるべき異なる化学的単量体（すなわちアッセイ可能なポリマーサブユニット（ＡＰＳ）またはコードサブユニット）を与えられる。カップリング反応後、分割量は、組み合わせられ（プールされ）、混合され、そしてカップリングの次のラウンドを実施する前に新しい分割量のセットへと分けられる（分割される）。一般に、そのアプローチは、完全にもしくは部分的にランダムなアミノ酸配列のより長いペプチドを生成するためのアミノ酸（または短いペプチド）カップリング反応、完全にもしくは部分的にランダムな塩基配列のより長いＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成するためのデオキシリボヌクレオチド（または短いＤＮＡオリゴヌクレオチド）のカップリングまたは完全にもしくは部分的にランダムな塩基配列のより長いＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成するためのリボヌクレオチドのカップリングを含むがそれらに限定されない様々なカップリング反応およびコンジュゲーション化学に関して用いられることができる。従って、様々な化学的単量体、例えばアミノ酸、小分子、短いペプチド、短いオリゴヌクレオチド等のいずれも、独特のバーコードのアセンブリのための構築ブロックとして用いられることができる。好ましい態様において、スプリットプール合成の連続するラウンドにおいて用いられるＡＰＳは、独特に設計された核酸配列を含む。本明細書で開示される鋳型ＤＮＡ核酸バーコードアセンブリおよび合成法の利点は、個々の鋳型ＤＮＡ核酸がバーコードアセンブリおよび合成反応を実施する前に個々の反応区画中に分配される必要がないことである。
図２の上側部分は、独特の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードの作製へのスプリットプール合成経路の第１ラウンドを図説している。それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸にアニーリングした複数のバーコード開始プライマー分子を用いる複数の相補的ＤＮＡ鎖の合成の後、試料は、一連の分割量に分けられ、第１のアッセイ可能なポリマーサブユニット（ＡＰＳ）、例えば短いオリゴヌクレオチドコード単位が、試料分割量内のアニーリングした相補的ＤＮＡ／鋳型ＤＮＡ複合体のそれぞれにおけるバーコード合成開始部位にカップリングされ、ここで、それぞれの試料分割量は、異なるＡＰＳで処理される。
図２の下側部分は、独特の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードの作製へのスプリットプール合成経路のその後のラウンドを図説している。第１ＡＰＳ（またはコード単位）カップリングラウンドの後、試料分割量が、プールされ、混合され、新しい一連の分割量へと分配される。次いで、第２コード単位が、アニーリングした相補的ＤＮＡ／鋳型ＤＮＡ複合体のそれぞれにおける第１コード単位にカップリングされ、ここで、再度それぞれの試料分割量が、異なるＡＰＳ（またはコード単位）で処理される。従って、スプリットプール合成の数回の連続するラウンドの実施は、結果として、元の試料からの個々の鋳型ＤＮＡ核酸の同一性をコードする実質的に独特の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードのセットの作製をもたらす。
段階的なスプリットプールアセンブリおよび合成を実施することにより達成されることができる鋳型ＤＮＡバーコードライブラリーの多様性（すなわち理論的に可能である独特の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードの数）は、各ラウンドにおける使用に関して利用可能な独特のＡＰＳ（またはコード単位）の数および鋳型ＤＮＡ核酸バーコードを組み立てるために用いられるラウンドの総数に依存する。例えば、４ラウンドのアセンブリ／合成および１００の独特のＡＰＳを用いて作製される鋳型ＤＮＡバーコードに関して（すなわち４つのＡＰＳ位置を有する鋳型ＤＮＡバーコードに関して）、可能である独特の鋳型ＤＮＡバーコード配列の総数は、１００４＝１０８または１００，０００，０００である。あるいは、６ラウンドのアセンブリ／合成および１００の独特のＡＰＳを用いて作製される鋳型ＤＮＡバーコードに関して（すなわち６つのＡＰＳ位置を有する鋳型ＤＮＡバーコードに関して）、可能である独特の鋳型ＤＮＡバーコード配列の総数は、１００６＝１０１２または１，０００，０００，０００，０００である。一般に、利用可能な独特の配列の総数が標識されるべき個々の鋳型ＤＮＡ核酸の数より有意に大きいように鋳型ＤＮＡバーコードライブラリーを設計し、それによりいずれか２つの鋳型ＤＮＡ核酸が同じ鋳型ＤＮＡバーコードで標識される可能性が極めて低いことを確実にすることが望ましい。ある場合には、ゲノムの非冗長性および既知の配列アセンブリの使用があれば、より少ないバーコードを使用することができる可能性がある。
一般に、独特の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードを作製するために用いられるスプリットプール合成のラウンドの数は、約２〜約４０ラウンドの範囲であることができる。ある場合には、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０ラウンドのスプリットプール合成が、実施されることができる。ある場合には、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２５、最大で２０、最大で１８、最大で１６、最大で１４、最大で１２、最大で１０、最大で８、最大で６、最大で４または最大で２ラウンドのスプリットプール合成が、実施されることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、実施されるスプリットプール合成のラウンドの数は、約４〜約１２の範囲であることができる。当業者は、実施されるスプリットプール合成のラウンドの数はこの範囲内のあらゆる値、例えば約７ラウンドを有することができることを認識しているであろう。
一般に、スプリットプール合成の各ラウンドにおけるカップリングに関して用いられる独特のＡＰＳのプールは、約２〜約２００の独特のＡＰＳを含むことができる。ある場合には、プール中の独特のＡＰＳの数は、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０または少なくとも２００であることができる。ある場合には、プール中の独特のＡＰＳの数は、最大で２００、最大で１５０、最大で１００、最大で１００、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１０、最大で８、最大で６、最大で４または最大で２であることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、プール中の独特のＡＰＳの数は、約４ヌクレオチド〜約２０の範囲であることができる。当業者は、プール中の独特のＡＰＳの数はこの範囲内のあらゆる値、例えば約１２の独特のＡＰＳを有することができることを認識しているであろう。
上記で示されたように、ある場合には、鋳型ＤＮＡ核酸バーコードのＡＰＳ（またはバーコードを組み立てるために用いられるコード単位）は、成長しているバーコード分子の一方の末端に連続的な線状の様式で共有結合的または非共有結合的にカップリングされる。ある場合には、ＡＰＳ（またはコード単位）は、一緒に縫い合わせられ（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）、および／またはアニーリングプライマー（すなわち鋳型分子または“スプリント”）を用いて共通リンカー（ＣＬ）配列にアニーリングさせられる（図３）。ある場合には、アニーリングプライマーは、段階的合成の前のラウンドの間に付加されたＡＰＳに相補的である配列領域（すなわち第１相補的領域）を含むことができる。ある場合には、アニーリングプライマーは、現在のラウンドの間に付加されているＡＰＳに相補的である第２配列領域（すなわち第２相補的領域）を含むこともできる。従って、アニーリングプライマーは、連続的なラウンドの２以上のオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズすることができ、ある場合にはその後ライゲーション反応が行われ、それによりそれらを一緒に縫い合わせることができる。ある態様において、各ラウンドのアニーリングプライマーの第１相補的領域は、他のラウンドのアニーリングプライマーの第１相補的領域と異なる。ある場合には、各ラウンドのアニーリングプライマーの第２相補的領域は、他のラウンドのアニーリングプライマーの第２相補的領域と異なる。ある場合には、異なるラウンドのアニーリングプライマーの第１または第２相補的領域は、ラウンド間で共有されている。ある態様において、鋳型または“スプリント”（すなわち伸長されたＣＬ分子）が、ＡＰＳのアセンブリのために用いられ、ここで、スプリントは、個々のＡＰＳ（またはコードサブユニット）の段階的なハイブリダイゼーションおよびライゲーションが完成した鋳型ＤＮＡバーコードを作製することを可能にするように設計されたアニーリング領域（例えば共通リンカー配列）の多数のセットを含む。
ある場合には、ＣＬまたは“スプリント”オリゴヌクレオチドは、ループアニーリング領域の１以上の対を含む。これらの例において、ＡＰＳは、ＣＬまたはスプリントにハイブリダイズして、すなわちＡＰＳのそれぞれの末端においてＣＬループアニーリング領域にハイブリダイズすることによりループ幾何学を作り出すように設計されることができる（図５）。ある場合には、ループアニーリング領域は、付加およびハイブリダイゼーションの連続するラウンドがスプリントに沿ってＡＰＳの位置を配置する（ｐｏｐｕｌａｔｅ）ようにスプリットプール合成のラウンドに特異的であるように設計されることができる。次いで、ＡＰＳは、当該技術で既知の方法のいずれかを用いて、例えばライゲーションにより一緒に連結されることができる。ある場合には、ＡＰＳは、それらが他の合成ラウンドに特異的なループアニーリング領域においてスプリントに効率的にハイブリダイズしないことを確実にするように設計されることができる。結果的に、特定のラウンドからのＡＰＳが何らかの理由で欠けている場合、その後のラウンドにおいて付加されるＡＰＳは、正しくライゲーションされる可能性がより低く、従って下流の分析エラーの可能性を低減する。あるいは、鋳型ＤＮＡバーコードは、時々欠けているＡＰＳがある場合でさえも合成される可能性があり、その位置は、ループアニーリング領域の対により隣接される。次いで、結果として生じる鋳型ＤＮＡバーコードは、それに従って分析されることができ、破棄された、または回収された情報のどちらかが、代わりに処理されることができる。
ランダムまたは準ランダムタグ配列：ある場合には、複数のＡＰＳが、コード配列に加えてさらにランダムまたは準ランダムタグ配列を含むことができ、ここで、所与の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードと関係するそれぞれのＡＰＳに関するランダムまたは準ランダムタグ配列は、所与の鋳型ＤＮＡ核酸に由来するバーコードを付けられた相補的ＤＮＡの個々の鎖を同定するための独特の分子カウンター配列として機能する。ある場合には、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸バーコード配列と関係する異なる分子カウンター配列の数は、所与の鋳型ＤＮＡ核酸に由来していた相補的ＤＮＡコピーの初期数（すなわち、その後の増幅反応を実施する前に存在していた相補的ＤＮＡコピーの数）を数え上げる、もしくは確証するために、または所与の鋳型ＤＮＡ核酸内のリピート配列を検出するために用いられることができる。ある場合には、そのような分子カウンター配列は、鋳型核酸フラグメントの配列バリアントが増幅反応の間のポリメラーゼのエラー、例えば鎖のスイッチングに由来していた可能性を決定するために用いられることができる。ある場合には、ランダムまたは準ランダムタグ配列は、バーコード開始プライマー分子中に組み込まれることができる。
ある場合には、ランダムまたは準ランダムタグ配列は、約２〜約８ヌクレオチド長の範囲であることができる。ある場合には、ランダムまたは準ランダムタグ配列は、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６または少なくとも８ヌクレオチド長であることができる。ある場合には、ランダムまたは準ランダムタグ配列は、最大で８、最大で６、最大で４または最大で２ヌクレオチド長であることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれかが組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、ランダムまたは準ランダムタグ配列は、約４ヌクレオチド長〜約６ヌクレオチド長の範囲であることができる。当業者は、ランダムまたは準ランダムタグ配列の長さは、この範囲内のあらゆる値、例えば約７ヌクレオチドを有することができることを認識しているであろう。
エラーチェック：ある場合には、複数のＡＰＳが、１以上のサブコード（ＳＣ）領域を含む独特に設計された核酸配列のセットを含むことができ（図４）、ここで、サブコード配列は、複数のＡＰＳにおいてそれぞれの個々のＡＰＳ分子に独特である。ある場合には、ＳＣ領域または配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より長いヌクレオチド長である。ある場合には、サブコードは、定められた長さ、例えば７ヌクレオチドの核酸配列の独特のセットを含み、それは、エラー補正能力を提供するように設計されている。ある場合には、サブコードのセットは、セット中の配列のあらゆる対での組み合わせが定められた“遺伝的距離”またはミスマッチ塩基の数、例えば３の距離を示すように設計された７ヌクレオチド配列を含む。この場合、アッセイの最終工程において同定された鋳型ＤＮＡフラグメントバーコードのセット中のサブコードの再調査は、アッセイデータの最終分析を実施する前にハイブリダイゼーションまたは増幅エラーを検出することを可能にする。この場合、ランダム配列領域は、ＡＰＳコードに隣接して含まれ得るが、アニーリング領域の一部としては含まれない可能性がある。
増幅反応：開示されたＤＮＡにバーコードを付ける方法のある場合において、１回以上の核酸増幅反応が、鋳型ＤＮＡ核酸またはそのバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖の多数のコピーを作製するために実施されることができる。ある場合には、増幅は、多重化された様式で実施されることができ、ここで、多数の鋳型ＤＮＡ核酸配列またはバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖が、同時に増幅される。ある場合には、増幅反応は、核酸分子に配列決定アダプターを付加するために用いられることができる。増幅反応は、存在するならばバーコードの少なくとも一部の増幅を含むことができる。増幅反応は、複数の鋳型ＤＮＡ核酸またはバーコードを付けられたその相補的ＤＮＡ鎖の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の増幅を含むことができる。
ある場合には、特定のオリゴヌクレオチド配列の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施されることができる。本明細書で用いられる際、ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のインビトロ増幅のための反応を指すことができる。本明細書で用いられる際、ＰＣＲは、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲおよびアセンブリＰＣＲを含むがそれらに限定されない反応の派生形態を包含することができる。
ある場合には、特定のオリゴヌクレオチド配列の増幅は、ＰＣＲベースではない方法を含むことができる。ＰＣＲベースではない方法の例は、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写に媒介される増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅またはサークルトゥサークル増幅（ｃｉｒｃｌｅ−ｔｏ−ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むが、それらに限定されない。他のＰＣＲベースではない増幅法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するための多サイクルのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに駆動されるＲＮＡ転写増幅またはＲＮＡに方向付けられるＤＮＡ合成および転写の実施、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑレプリカーゼ（Ｑ）法、回文構造プローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを用いるオリゴヌクレオチドに駆動される増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズして結果として生じる二重鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅法、５’エンドヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼを用いる鎖置換増幅、ローリングサークル増幅ならびに分枝（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）伸長増幅（ＲＡＭ）を含む。
１回以上の増幅反応の実施は、１以上の増幅プライマーの使用を含むことができる。上記で示されたように、１以上の増幅プライマーは、約１０ヌクレオチド長〜約４０ヌクレオチド長の範囲であることができる。ある場合には、増幅プライマーの長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチドまたは少なくとも４０ヌクレオチドであることができる。ある場合には、増幅プライマーの長さは、最大で４０ヌクレオチド、最大で３５ヌクレオチド、最大で３０ヌクレオチド、最大で２５ヌクレオチド、最大で２０ヌクレオチド、最大で１５ヌクレオチドまたは最大で１０ヌクレオチドであることができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれかが組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、増幅プライマーの長さは、約１５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの範囲であることができる。当業者は、増幅プライマーの長さは、この範囲内のあらゆる値、例えば約２２ヌクレオチドを有することができることを認識しているであろう。
１以上の増幅プライマーは、複数のバーコードを付けられた核酸配列の少なくとも一部にアニーリングすることができる。１以上のプライマーは、複数のバーコードを付けられた核酸配列の３’末端またはその付近にアニーリングすることができる。１以上のプライマーは、複数のバーコードを付けられた核酸配列の５’末端により近い位置にアニーリングすることができる。１以上のプライマーは、複数のバーコードを付けられた核酸配列の内部領域にアニーリングすることができる。１以上の増幅プライマーは、プライマーの固定されたパネル（ｐａｎｅｌ）を含むことができる。１以上の増幅プライマーは、１以上のカスタムプライマーを含むことができる。１以上のカスタムプライマーは、１以上の標的核酸配列、例えば１以上の遺伝子配列にアニーリングするように設計されることができる。１以上の増幅プライマーは、１以上の対照プライマーを含むことができる。１以上の対照プライマーは、少なくとも１以上のハウスキーピング遺伝子プライマーを含むことができる。１以上の増幅プライマーは、ユニバーサルプライマーを含むことができる。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニーリングすることができる。１以上の増幅プライマーは、第１鋳型ＤＮＡ核酸バーコード、第２鋳型ＤＮＡ核酸バーコード、別の鋳型ＤＮＡ核酸バーコード、全ての鋳型ＤＮＡ核酸バーコード中に組み込まれている増幅またはユニバーサルプライマー結合部位、第１鋳型ＤＮＡ核酸配列、第２鋳型ＤＮＡ核酸配列、別の鋳型ＤＮＡ核酸配列等またはそれらの組み合わせにアニーリングすることができる。１以上の増幅プライマーは、ユニバーサルプライマーおよび１以上のカスタムプライマーを含むことができる。
ある側面において、異なるバーコードを付けられた鋳型ＤＮＡ核酸の数の決定は、バーコードを付けられた鋳型ＤＮＡ核酸またはそのあらゆる産物（例えばバーコードを付けられたアンプリコン）の配列の決定を含むことができる。バーコードを付けられた鋳型ＤＮＡ核酸またはそのあらゆる産物（例えばバーコードを付けられたアンプリコン）の配列の決定は、バーコードの少なくとも一部、バーコードを付けられた鋳型ＤＮＡ核酸配列の少なくとも一部、その相補配列、その逆相補配列、またはそれらのあらゆる組み合わせの配列を決定するための配列決定反応の実施を含むことができる。
配列決定：開示された方法のある側面において、２以上の指定された鋳型ＤＮＡ配列の間の空間的関係、例えば単一の鋳型ＤＮＡ核酸内のコロケーション（ｃｏ−ｌｏｃａｔｉｏｎ）により示されるようなゲノムの所与の区分内でのそれらの近接性の決定は、同じ相補的ＤＮＡ鎖バーコードと関係している鋳型配列の同定を含むことができる。開示された方法のある側面において、試料中の指定された鋳型ＤＮＡ配列、例えば特定の遺伝子配列に関するコピー数の決定は、その指定された鋳型ＤＮＡ配列と関係する独特の相補的ＤＮＡバーコード配列の数の決定を含むことができる。バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖またはそのあらゆる産物（例えばバーコードを付けられたアンプリコン）の配列の決定は、バーコードの少なくとも一部、バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖の少なくとも一部、その相補配列、その逆相補配列またはそれらのあらゆる組み合わせの配列を決定するための配列決定反応の実施を含むことができる。
核酸（例えばバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖またはそのバーコードを付けられたアンプリコン）の配列の決定は、合成による配列決定（ＳＢＳ）（例えばサンガー配列決定またはパイロシーケンシング法）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、環状アレイベースの配列決定、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定等を含むがそれらに限定されない様々な配列決定法のいずれかを用いて実施されることができる。
ある場合には、バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖またはそのあらゆる産物の配列の決定は、ペアエンド配列決定、ショットガン配列決定、高スループット配列決定、ナノポアベースの配列決定、ダイターミネーター配列決定、多重プライマーＤＮＡ配列決定、プライマーウォーキング、サンガージデオキシ配列決定、マクサム−ギルバート（Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）配列決定、パイロシーケンシング法、真の単分子配列決定またはそれらのあらゆる組み合わせの使用を含むことができる。あるいは、バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖またはそのあらゆる産物の配列は、ある場合には、マイクロアレイチップを用いて、電子顕微鏡法により、または化学感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを用いて決定されることができる。
Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢＩ−ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨｅｌｉｃｅｓまたはＰｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォームのようなプラットフォームを用いる高スループット配列決定法、例えば環状アレイ配列決定も、利用されることができる。ある場合には、配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定を含むことができる。
ある場合には、開示されたＤＮＡにバーコードを付ける方法により生成されたバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖の配列決定は、生物のゲノムの遺伝子の約０．０１％〜生物のゲノムの遺伝子の約１００％に相当する相補的ＤＮＡ配列を配列決定することを含むことができる。ある場合には、配列決定される相補的ＤＮＡは、生物のゲノムの少なくとも０．０１％、生物のゲノムの少なくとも０．１％、生物のゲノムの少なくとも１％、生物のゲノムの少なくとも５％、生物のゲノムの少なくとも１０％、生物のゲノムの少なくとも２０％、生物のゲノムの少なくとも３０％、生物のゲノムの少なくとも４０％、生物のゲノムの少なくとも５０％、生物のゲノムの少なくとも６０％、生物のゲノムの少なくとも７０％、生物のゲノムの少なくとも８０％、生物のゲノムの少なくとも９０％または生物のゲノムの少なくとも９５％を含むことができる。ある場合には、配列決定される相補的ＤＮＡは、生物のゲノムの最大で９５％、生物のゲノムの最大で９０％、生物のゲノムの最大で８０％、生物のゲノムの最大で７０％、生物のゲノムの最大で６０％、生物のゲノムの最大で５０％、生物のゲノムの最大で４０％、生物のゲノムの最大で３０％、生物のゲノムの最大で２０％、生物のゲノムの最大で１０％、生物のゲノムの最大で５％、生物のゲノムの最大で１％、生物のゲノムの最大で０．１％または生物のゲノムの最大で０．０１％を含むことができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれかが組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、配列決定される相補的ＤＮＡは、生物のゲノムの約５％〜約４０％を含むことができる。当業者は、配列決定される相補的ＤＮＡがこの範囲内のあらゆる値、例えば生物のゲノムの約６３％を含むことができることを認識しているであろう。
ある場合には、配列決定は、バーコードを付けられた核酸配列の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００またはより多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含むことができる。ある場合には、配列決定は、バーコードを付けられた核酸配列の少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１，０００またはより多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含むことができる。他の場合には、配列決定は、バーコードを付けられた核酸配列の少なくとも約１，５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００またはｌ０，０００またはより多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。
ある場合には、配列決定は、運転あたり少なくとも約１００、１，０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０またはより多くの配列決定の読みを含むことができる。ある場合には、配列決定は、運転あたり約１，０００，０００，０００以下の配列決定の読みを含むことができる。ある場合には、配列決定は、運転あたり約１００，０００，０００以下の読みを含むことができる。ある場合には、配列決定は、運転あたり約１０，０００，０００以下の読みを含むことができる。ある場合には、配列決定は、運転あたり約１，０００，０００以下の読みを含むことができる。ある場合には、配列決定は、運転あたり約１００，０００以下の読みを含むことができる。ある場合には、配列決定は、運転あたり約１０，０００以下の読みを含むことができる。
配列アセンブリ：比較的短い配列の読みからのより長いＤＮＡまたは他のオリゴヌクレオチド配列、例えばゲノムフラグメントまたは全ゲノムのアセンブリは、多数の短い配列の読みから重複している配列を同定して配列のより長い切れ目のない区分を組み立てることにより実施される。ある場合には、既知の参照配列または同じもしくは類似の生物からのコンセンサス配列に対する比較が、組み立てられた配列中のギャップまたはエラーを同定するために用いられることができる。当業者に既知の様々な生物情報学ソフトウェアプログラムのいずれかが、比較的短い配列の読みからより長い配列を組み立てるために用いられることができる。例は、ＤＢＧ２ＯＬＣ、ＳＰＡｄｅｓ、ＳｐａｒｓｅＡｓｓｅｍｂｌｅｒ、ＦｅｒｍｉおよびＳＧＡを含むが、それらに限定されない。本開示において、それぞれの短い鋳型ＤＮＡ配列の読みと関係するバーコード配列は、同じ鋳型ＤＮＡ核酸から生じたそれらの配列の同定を促進し、従って全ゲノムまたはその一部をマッピングするための鋳型配列アセンブリプロセスを促進する。
フェージングおよびハプロタイピング：全ゲノム配列決定は、典型的には、異なる相同染色体、例えば母系および父系の遺伝系統由来の相同染色体上に存在する配列バリアント、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失および／または変異を識別することなく単一のコンセンサス配列を生成する。フェーズド配列決定は、どの遺伝的バリアントが同じまたは異なる染色体上に見られ、従って一緒にまたは別々に受け継がれるかを決定することにより、この限界に取り組む。遺伝的バリエーションのパターン、例えばハプロタイプ（すなわち切れ目のないブロックとして受け継がれる配列バリアントの群）に関する情報は、遺伝的に受け継がれる形質および遺伝病の理解において重要であり、特定の遺伝子のコピー数に関する情報も、重要である。フェーズド配列決定は、ハプロタイプを決定する、ならびに新規の変異の存在を同定するためのアプローチを提供し、従って集団遺伝学および遺伝病の研究において適用を有する。
上記で特筆されたように、用語“ハプロタイプ”は、切れ目のないブロックにおいて一緒に受け継がれるＤＮＡ配列バリアントのセット（アレル）を指す。一般に、ヒトゲノムは、２コピーのそれぞれの遺伝子（母方のコピーおよび父方のコピー）を含有する。それぞれが２つの可能なアレル、例えば遺伝子アレル“Ａ”および“ａ”ならびに遺伝子アレル“Ｂ”および“ｂ”を有する遺伝子の対に関して、所与の個体のゲノムは、２つのハプロタイプ“ＡＢ／ａｂ”（ここで、ＡおよびＢアレルは、同じ染色体上に存在する（“シス”配置））または“Ａｂ／ａＢ”（ここで、ＡおよびＢアレルは、異なる染色体上に存在する（“トランス”配置））の一方を含むであろう。フェーズド配列決定法またはアッセイは、遺伝子アレルの指定されたセットが同じまたは異なる染色体上のどちらに存在するかを決定するために用いられることができる。ある場合には、ハプロタイプを定めるいくつかのリンクしたアレルは、特定の疾患の表現型と相関または関係している可能性があり；そのような場合、いずれか１つの特定の遺伝子バリアントよりもむしろハプロタイプが、患者がその疾患を示すであろうかどうかに関する最も決定的な因子であり得る。
多くの遺伝性疾患、特に癌は、染色体再編成、例えば欠失、挿入、重複、転座および逆位と関係している(Lee, et al. (2012), “Targeted Chromosomal Duplications and Inversions in the Human Genome Using Zinc Finger Nucleases”, Genome Research 22:539-548)。これらのゲノム構造バリエーション（ＳＶ）は、健康な個体でも疾患患者でも観察され、従って遺伝的多様性および疾患の発症の両方に寄与している。
遺伝子のコピー数も、一部の疾患表現型において役割を果たしている。ほとんどの遺伝子は、通常は２コピーで存在するが、“増幅した”遺伝子は、２より多くの機能するコピーで存在し、従って異常なレベルのｍＲＮＡの産生およびタンパク質発現をもたらし、癌性状態をもたらす可能性がある遺伝子である。癌および他の遺伝性障害は、しばしば染色体の異常な（すなわち増大または減少した）数（“異数性”）と相関している。細胞遺伝学的技法、例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーションまたは比較ゲノムハイブリダイゼーションが、典型的には異常な遺伝子または染色体のコピー数の存在を検出するために用いられる。
フェーズド配列決定のためのバーコードを付けられたＤＮＡフラグメントの使用。本明細書で開示される方法は、複数のバーコードを付けられたＤＮＡ分子を生成するための手段を提供し、ここで、それぞれのバーコードを付けられたＤＮＡ分子は、少なくとも第１配列領域、第２配列領域および第３配列領域を含む。第１配列領域は、上記のようにスプリットプール合成アプローチを用いて組み立てられたバーコード配列であり、ここで、バーコード配列は、そのＤＮＡ分子が由来する元の鋳型ＤＮＡ核酸に関する独特の識別子を提供する。第２配列領域は、ランダムもしくは準ランダムプライマー配列または標的特異的プライマー配列の相補配列であり、それは、元の鋳型ＤＮＡ核酸にプライミングするために用いられた。第３配列領域は、元の鋳型ＤＮＡ核酸の全部または一部に相補的である一続きのＤＮＡである。従って、バーコード配列は、単一の鋳型ＤＮＡ核酸から生じた複数の相補的ＤＮＡ分子を同定するために用いられることができる。従って、関係付けられた相補的ＤＮＡ配列のその後のアラインメントおよびアセンブリは、典型的な配列決定の読みの長さよりも実質的に長い元の鋳型ＤＮＡの一続きに関する配列を決定することを可能にする。ある場合には、ロングレンジ配列決定に関する開示されたＤＮＡにバーコードを付ける方法は、増幅および配列決定反応を実施する前に個々のＤＮＡ鎖または染色体を別々の区画中に分配する必要なく、同じＤＮＡ鎖および／または同じ染色体と関係しているＤＮＡ配列（またはその相補配列）を同定するために用いられることができる。ある場合には、バーコード情報は、やはり増幅および配列決定反応を実施する前に個々のＤＮＡ鎖または染色体を別々の区画中に分配する必要なく、同じＤＮＡ鎖および／または同じ染色体上の１以上の既知のマーカー遺伝子配列と関係しているＤＮＡ配列（またはその相補配列）を同定するために１以上の既知のマーカー遺伝子配列と合わせて用いられることができる。ある場合には、次いで特定の遺伝的バリアントのフェージングに関する結論が、引き出されることができる。そのような情報は、ハプロタイプ、すなわち同じ核酸鎖上または異なる核酸鎖上に存在する遺伝的バリアントの特定されたセットを同定するために有用である可能性がある。ある場合には、同じ核酸鎖上または異なる核酸鎖上に存在する遺伝的構造バリアント、例えば欠失、挿入、重複、転座および逆位の特定のセットの同定は、遺伝性疾患、例えば癌の診断のために用いられることができる。ある場合には、１以上の特定された既知の遺伝子配列と関係する独特のバーコード配列の数の決定は、それらの遺伝子に関するコピー数のバリエーションを同定するために用いられることができる。
開示された方法は、現行の核酸配列決定技術およびそれらの関連する試料調製法を超える重要な利点を提供する。短い配列決定の読みからのより長いＤＮＡ配列のアセンブリを促進することに加えて、本開示のバーコードを付ける方法は、上記で特筆されたように、ハプロタイプフェージングおよびコピー数バリエーションの決定に適用されることができる可能性がある。ハプロタイプフェージングおよびコピー数バリエーションのデータは、一般にゲノムＤＮＡを配列決定することによっては入手できず、これは、生物学的試料（例えば血液、細胞または組織試料）が、典型的には多数の細胞から遺伝物質を抽出し、それを所与の配列決定技術の入力要求に関して具体的に設計された配列決定ライブラリーに変換するためにまとめて処理されるためである。このまとめての試料採取および処理のアプローチの結果として、配列決定は、典型的には非フェーズド（ｎｏｎ−ｐｈａｓｅｄ）コンセンサス配列データを提供し、それに関して特定の遺伝的バリアントが同じ染色体上または異なる染色体上のどちらに存在するかを決定することはできない。最近、いくつかの刊行物が、バーコードを付けられたｃＤＮＡの作製ならびにフェージングおよびハロタイピングの実施に関する方法を開示してきた（例えば、米国特許第８，２６８，５６４号；国際公開第２０１４／１２４３３８号；国際公開第２０１４／２１０３５３号；国際公開第２０１５／２００８６９号；および国際公開第２０１５／２００８９３号参照）。一般に、後者の方法は、予め合成されたバーコードの使用ならびにその予め合成されたバーコードおよび細胞またはそれから単離された核酸の個々の反応区画、例えば油中水エマルジョンにより形成された液滴中への分配に頼っている。
いくつかの研究が、ヒトゲノムＤＮＡ配列および疾患を含む表現型の間の関係は相の情報が入手可能である場合により完全に理解されることができることを実証してきた(Tewhey, et al. (2011), “The Importance of Phase Information for Human Genomics”, Nat. Rev. Genet. 12(3):215-223)。フェーズド配列決定およびハプロタイピングは、遺伝子型の決定および遺伝子型エラーの検出、遺伝的バリエーション（例えば構造的バリエーション、例えば欠失、挿入、重複、転座および逆位）および疾患の相互影響の理解、以前は特性付けられていなかった遺伝的バリエーションの存在の推測、ヒトの人口統計学的歴史の推測、組み換えの点の推測、反復突然変異および選択のサインの検出、ならびに遺伝子発現のシス制御のモデル化を含む(Brown and Brown (2011), “Haplotype Phasing: Existing Methods and New Developments”, Nat. Rev. Genet. 12(10):703-714)。
キット：本発明は、さらにロングレンジ配列決定または配列アセンブリのための、そしてフェーズド配列決定およびハプロタイピングの実施のためのキットに関する。ある場合には、本開示のキットは、相補的ＤＮＡのバーコードを付けられたセットを合成するために用いられる１以上のバーコード開始プライマーのセットを含むことができ、ここで、単一の鋳型ＤＮＡ核酸から生じる相補鎖の全ては、同じ独特のバーコードを含み、かつここで、セットのそれぞれの鎖は、同じ鋳型ＤＮＡ核酸の全部または一部に相補的であるＤＮＡ配列を含む。ある場合には、セット中のバーコード開始プライマーの数は、約２〜約４０の範囲であることができる。ある場合には、セットは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも４０のバーコード開始プライマーを含むことができる。ある場合には、セットは、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１０、最大で８、最大で６、最大で４または最大で２のバーコード開始プライマーを含むことができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、セット中のバーコード開始プライマーの数は、約４〜約１６の範囲であることができる。当業者は、セット中のバーコード開始プライマーの数はこの範囲内のあらゆる値、例えば約９のバーコード開始プライマーを有することができることを認識しているであろう。
ある場合には、キットは、１種類以上のポリメラーゼ、ヌクレオチドおよびバーコード開始プライマーを用いてプライマー伸長反応を実施するための他の試薬も含むことができる。
ある場合には、キットは、独特の鋳型ＤＮＡ核酸バーコードの合成において鋳型分子（“スプリント”）および他の化学的カップリング（例えばクリック化学）またはライゲーション試薬と共に用いるための２以上のＡＰＳ（またはコード単位）のセットも含むことができる。ある場合には、セット中の独特のＡＰＳ（またはコード単位）の数は、約２〜約４０の範囲であることができる。ある場合には、セットは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも４０の独特のＡＰＳを含むことができる。ある場合には、セットは、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１０、最大で８、最大で６、最大で４または最大で２の独特のＡＰＳを含むことができる。この段落において記載された下限および上限値のいずれも、組み合わせられて本開示内に含まれる範囲を形成することができ、例えば、セット中の独特のＡＰＳの数は、約６〜約２０の範囲であることができる。当業者は、セット中の独特のＡＰＳの数はこの範囲内のあらゆる値、例えば約１２の独特のＡＰＳを有することができることを認識しているであろう。
ある場合には、本開示のキットは、１以上の増幅プライマー（例えばユニバーサルプライマーおよび／またはカスタムプライマー）のセット、１以上の配列決定プライマー（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー）のセット、配列決定ライブラリーの調製における使用のための他のアダプターおよび試薬等またはそれらのあらゆる組み合わせも含むことができる。
システム：記載されたＤＮＡバーコード付けおよびロングレンジ配列アセンブリ法を実施するためのシステムも、本明細書において開示される。ある場合には、本開示のシステムは、複数の反応容器（例えばチューブ、バイアル、マイクロウェルプレート）、流体取り扱いおよび分配構成要素（例えばポンプ、弁、管類、試薬ボトル、自動化されたピペッターまたは注射器等）および処理装置または制御装置を含むことができ、ここで、システムは、試薬を分配し、反応混合物を混合および分配し、鋳型ＤＮＡ核酸バーコードの自動化されたスプリットプール合成を実施するように設計されている。ある場合には、システムは、さらに温度制御装置を含むことができ、プライマー伸長および核酸増幅反応を実施するように設計されていることができる。ある場合には、処理装置または制御装置は、機器制御ソフトウェア、データ取得および分析ソフトウェアならびに／またはデータ可視化ソフトウェアを含む光学および／または磁気データ記憶媒体を含むことができる。ある場合には、システムは、複数のバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ配列に関して得られた鋳型配列データに基づくロングレンジ配列アセンブリを促進する統合型またはスタンドアローンのデータ分析ソフトウェアを含むことができる。ある場合には、システムは、エラー補正サブコードを含むＡＰＳのセットを用いて合成されたバーコードに関する配列データに基づいてエラーチェックおよび／またはエラー補正を実施する統合型またはスタンドアローンのデータ分析ソフトウェアを含むことができる。
実施例−バーコードを付けられた相補的ＤＮＡを用いるロングレンジ配列決定
本開示のＤＮＡにバーコードを付ける方法が、図１Ａ〜Ｃにおいて図説されている。断片化されたＤＮＡ試料、例えば断片化されたゲノム、エキソームまたは他のタイプのＤＮＡが、（すなわち一本鎖ＤＮＡを作り出すために）融解または変性させられ、後の精製のために３’末端においてビオチンで末端標識される（図１Ａ）。この工程は、おおよそ３０分間で完了されることができる。
ビオチン標識工程後、鋳型核酸フラグメントは、複数のバーコード開始プライマー、例えばランダムまたは準ランダム鋳型アニーリング領域およびバーコード開始部位または部分を含むプライマー分子を用いてプライミングされる（図１Ｂ）。１以上のバーコード開始プライマーのそれぞれの鋳型ＤＮＡ核酸フラグメントへのアニーリング後、鋳型ＤＮＡにアニーリングした相補的ＤＮＡ鎖の“セット”を作製するためにポリメラーゼ伸長反応が実施される。アニーリングおよびプライマー伸長反応は、全て単一のチューブまたは反応容器中で実施されることができる。ある場合には、ジデオキシヌクレオチド、例えばｄｄＣＴＰが、ポリメラーゼが同じ鋳型ＤＮＡ核酸に付着した他の相補的ＤＮＡ鎖を置換するのを防ぐランダムな停止を作り出すために反応混合物中に導入されることができる。この工程は、おおよそ３０分間で完了されることができる。
プライマー伸長工程後、相補的ＤＮＡ鎖のそれぞれのセットは、上記のようにＡＰＳ（またはコード単位）のセットを用いてスプリットプール合成またはアセンブリ反応を実施することによりバーコードを付けられる（図１Ｃおよび２）。スプリットプール合成のラウンドの数および合成の各ラウンドにおけるカップリングに利用可能な独特のＡＰＳの数は、あらゆる２つの鋳型ＤＮＡ核酸（または２つの鋳型ＤＮＡ核酸にアニーリングした相補的ＤＮＡ鎖のセット）が同じバーコードを有する確率が極めて小さいことを確実にするように選択される。従って、それぞれの鋳型ＤＮＡ核酸（またはそれぞれの鋳型ＤＮＡ核酸にアニーリングした相補的ＤＮＡ鎖のセット）は、実質的に独特のバーコードを有し、それは、続いて単一の鋳型ＤＮＡ核酸フラグメントから合成された相補的ＤＮＡ配列のセットを同定するために用いられることができる。鋳型ＤＮＡフラグメントバーコードのスプリットプール合成は、例えば単純な微小流体デバイス中または９６ウェルプレート中でマルチチャンネルピペッターを用いて実施されることができる。（試料のプールおよび再分割（ｒｅ−ａｌｉｑｕｏｔｉｎｇ）以外に）分離または遠心分離工程は必要とされず、個々の鋳型ＤＮＡ核酸を別々の反応容器または区画中に分配する必要はない。この工程は、おおよそ１時間で実施されることができる。
バーコードの合成後、鋳型ＤＮＡ核酸にアニーリングしたバーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖のセットは、様々なビオチン／アビジン精製スキームのいずれかを用いて親和性精製されることができ、バーコードを付けられた相補的ＤＮＡ鎖は、変性させられ、例えば相補鎖のＰＣＲおよび準ランダムプライミングを用いて増幅され、配列決定され、ロングレンジ配列が、バーコードを用いて単一の鋳型ＤＮＡ核酸から合成された相補配列のセットを同定することにより組み立てられることができる。

Claims (14)

  1. 核酸配列アセンブリを促進するための方法であって、該方法が、以下の工程：
    ａ）一本鎖鋳型核酸を含む核酸試料を提供すること；
    ｂ）それぞれの鋳型核酸に１以上のバーコード開始プライマーをプライミングさせてアニーリングした核酸会合体を作製すること、ここでそれぞれのバーコード開始プライマーは３’鋳型ハイブリダイゼーション部分および５’バーコード開始部分を含む；
    ｃ）ポリメラーゼ伸長を実施して相補鎖を作製すること、ここで該相補鎖は該鋳型核酸にアニーリングしたままである；
    ｄ）２ラウンド以上のオリゴヌクレオチドコード単位“アッセイ可能なポリマーサブユニット”（ＡＰＳ）をカップリングさせるスプリットプール合成を実施して、該バーコード領域、該プライマー領域および該標的核酸に相補的な標的特異的領域を含む該相補鎖のそれぞれにおけるオリゴヌクレオチドバーコード配列を組み立てること；
    ｅ）該バーコードを付けられた相補鎖を配列決定すること；ならびに
    ｆ）該バーコード配列を用いて、同じ鋳型核酸から生じた該バーコードを付けられた相補鎖を同定し、そして該バーコードを付けられた相補鎖の該標的特異的領域から該鋳型核酸配列を組み立てること；
    を含む、前記方法。
  2. さらに工程（ｂ）の前に該一本鎖鋳型核酸を該３’末端において親和性タグで末端標識することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 該親和性タグがビオチンである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 該３’バーコード開始部分が、ランダム配列を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
  5. 工程ｃ）における該ポリメラーゼ伸長が、ジデオキシヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
  6. 該ＡＰＳが約７ヌクレオチドの定められた配列を含むエラーチェック用サブコード(ＳＣ)を含み、それが該試料中の他のＳＣと少なくとも３ヌクレオチド異なる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
  7. それぞれのＡＰＳがランダム配列を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
  8. さらに同じ鋳型核酸から生じたバーコードを付けられた相補鎖を計数し、それにより該鋳型核酸の最初のコピー数を検出する工程を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
  9. 該ＡＰＳが、スプリント分子へのアニーリングによりカップリングされる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
  10. 該ＡＰＳが、クリック化学を用いてカップリングされる先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
  11. バーコード開始プライマーのセット、１以上のポリメラーゼ、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、アッセイ可能なポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセット、１以上の鋳型分子（スプリント）、ライゲーション試薬、クリック化学カップリング試薬、増幅プライマーおよび配列決定プライマーからなる構成要素を含むキット。
  12. 該バーコード開始プライマーが、ランダムプライマー配列領域を含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 該ＡＰＳのセットが、２〜２０の独特のＡＰＳを含む、請求項１１または１２に記載のキット。
  14. 該ＡＰＳがオリゴヌクレオチドである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
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