CN109825552B

CN109825552B - 一种用于对目标区域进行富集的引物及方法

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Publication number: CN109825552B
Application number: CN201910105264.6A
Authority: CN
Inventors: 康雅君; 葛会娟; 黄可君; 施佳卉; 张林华; 金保雷; 阮力; 郑立谋
Original assignee: Amoy Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xiawei Medical Laboratory Co ltd; Amoy Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2039-02-01
Also published as: CN109825552A

Abstract

本发明公开了一种用于对目标区域进行富集的引物及方法，所述方法包括如下步骤，步骤一：DNA的打断及标签序列1的连接与产物纯化；步骤二：目标区域的富集；目标区域的富集通过多重特异PCR扩增完成，即在高保真DNA聚合酶的作用下使用本发明引物进行线性扩增；目标区域富集所用的高保真DNA聚合酶具有切口平移，可以在适宜的反应条件下补平转座酶打断双链DNA片段产生的切口；步骤三：使用接头引物进行PCR扩增；扩增所用的2条接头引物结构相同，包含3个部分：与测序芯片上寡核苷酸结合的接头序列、用于区分不同来源样本的Index序列、上述标签序列1或标签序列2。

Description

一种用于对目标区域进行富集的引物及方法

技术领域

本发明涉及一种用于对目标区域进行富集的引物和方法。

背景技术

基因是负载特定遗传信息的DNA或RNA分子片段。基因突变是基因在其分子结构上发生的碱基对的组成或排列顺序的改变，包括点突变、移码突变、缺失突变和插入突变等。基因检测是一种检测人类血液、体液或组织细胞中基因序列信息的技术，可用于疾病的诊断或疾病风险的预测。众多研究发现：肿瘤发生的本质上是环境因素和遗传因素共同作用的结果，其病理进程中涉及各种基因的突变，肿瘤相关的基因通常容易被异常激活或异常失活或丢失而引起细胞的恶性转化，从而形成肿瘤，危害人类的生命。检测肿瘤组织中存在的突变类型不仅有助于了解肿瘤发生的机制，也可作为分子标记用于肿瘤易感性评估和诊断。

二代测序技术发展迅速，研究人员侧重于对目标基因组区域的单核苷酸多态性(SNPs)、点突变(SNVs)、短的插入缺失(InDel)、拷贝数变异(CNVs)和DNA重排状况进行整体分析。目前，目标富集策略主要有3种方法：多重PCR扩增技术、分子倒置探针技术、杂交捕获技术。

多重PCR扩增技术是根据目标区域设计特异性引物，在一个反应体系中多对特异性引物从相同的起始DNA同时产生多个扩增子，通过一步或二步PCR方法实现文库构建。一步PCR方法是在PCR后除去引物，进行接头连接；二步PCR方法则是第一步PCR富集目标区域，第二步PCR在目标产物两端加入测序接头。如起始模板为RNA，需先进行逆转录合成cDNA。多重PCR技术具备可拓展性，可构建各个目标区域范围的文库；同时操作简便，价格低廉，分析简单。但是，多重PCR容易受到PCR引物设计相关的化学因素的影响，例如目标区域GC含量、高度重复序列、引物之间交叉影响。

分子倒置探针技术本质上是以连接-PCR反应捕获的技术。其原理是设计一个口袋状探针，探针两端均为目标区域特异序列的互补序列，探针中部为构建文库所需的通用引物，也可以增加随机分子标签、酶切位点和保护碱基等序列。探针与目标区段退火后用DNA聚合酶和DNA连接酶将探针两端连接起来形成完整的环状探针。去除剩余探针和DNA序列后用通用引物进行扩增即为文库。该方法的优点是：样本需求量少、特异性好、操作流程简单，但是其缺点是捕获效率不高，部分区段难以设计探针和捕获。

杂交捕获技术一般包括文库构建和杂交捕获2个组成部分。其中文库构建首先是通过物理方法或酶切方法片段化DNA，然后进行末端修复和接头连接，使用的接头含有用于区分样本的Index序列；随后将连接有接头的文库进行PCR以产生足够量的DNA文库。杂交捕获是将样本文库与目标区域互补的、标记有生物素的单链探针进行杂交，没有杂交上的DNA不能被链霉亲和素磁珠捕获而被丢弃，最终链霉亲和素磁珠富集到的DNA样本进行PCR扩增、测序。杂交捕获的特点是拓展性好，能够对较大的目标区域进行捕获，但操作流程复杂、周期长、成本较高、需要依赖较多特殊的仪器设备。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种用于对目标区域进行富集的引物，从5’端到3’端包括：

1)接头序列，包括测序平台的完整标签序列；

2)分子标签序列：由数个随机碱基组成，用于区分原始模板，随机碱基的数量在5-20之间；

3)保护碱基序列：用于形成发夹结构，与1)的接头序列互补结合，互补的长度范围在10-20碱基之间；

4)特异引物序列：与目标区域的模板序列互补结合的一段序列，长度为15-40nt。

优选地，在接头序列1)中，完整标签序列的5’端还增加2到4个G，同时，保护碱基序列3)具有同该增加的G碱基互补的碱基序列，用于稳定发夹结构。

所述的测序平台，包含Illumina、Ion Torrent、BGISEQ和MGISEQ等测序平台

所述的完整标签序列，为这些测序平台所用的标签序列。例如用于Illumina平台，用的标签序列为GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。

本发明的再一目的，在于提供一种对目标区域进行富集的方法，包括如下步骤：

步骤一：DNA的打断及标签序列1的连接与产物纯化

利用转座酶打断基因组DNA，并在打断序列两端加上测序平台测序的标签序列1；

步骤二：目标区域的富集

目标区域的富集通过多重特异PCR扩增完成，即在高保真DNA聚合酶的作用下使用前述的用于对目标区域进行富集的引物进行线性扩增；线性扩增的循环数为1-5个；线性扩增的产物一端含有标签序列1，一端含有标签序列2，所述的标签序列2为权利要求1或2的引物带入而来；

步骤三：使用接头引物进行PCR扩增

扩增所用的2条接头引物结构相同，包含3个部分：与测序芯片上寡核苷酸结合的接头序列、用于区分不同来源样本的Index序列、上述标签序列1或标签序列2。

优选地，步骤一中，还包括对转座产物进行纯化的步骤。纯化，是为了去除转座产物中的酶、离子等杂质，优选采用Beckman公司的Agencourt AMPure XP Beads对转座产物进行纯化，也可使用其它公司的磁珠、柱纯化试剂盒进行纯化。

优选地，步骤三的PCR扩增循环数范围为8-12次。

步骤三中，两条接头引物使用的接头序列1和接头序列2分别来源于不同的Illumina文库构建体系。

优选地，步骤三中，如采用双Index测序，则2条接头引物均包含Index序列；如采用单Index测序，则仅需其中一端引物包含Index序列。

在一实施例中，步骤三所述的Index序列采用目前高通量测序中通用的标志(Index)序列。

在另外的实施例中，步骤三所述的Index序列，为自行设计的，能够区分样本且不干扰测序的序列组合，长度6-12碱基。

优选地，本发明方法，还包括步骤四：PCR扩增结束后，对扩增产物进行纯化。

优选地，本发明方法，还包括步骤五：文库质控和测序分析。

与常规富集目标区域的方法相比，本发明的主要有益效果有：

1、本发明引物中引入UID(Unique Identifier)作为随机分子标签序列，可对PCR扩增过程中引入的随机错误进行校正，同时去除由于PCR扩增得到的重复序列，消除不同区段扩增效率不同导致的定量误差，降低错误率，还原样本的真实突变频率和真实拷贝数，保证检测结果的准确性。

2、本发明引物中设计有保护碱基，可对UID和Illumina接头序列2进行保护，避免UID和Illumina接头序列2与模板DNA互补造成的非特异性扩增。

3、本发明引物设计发夹结构，有效保证线性扩增的准确性，避免引物中的非目标区域与基因组DNA中某些区域互补造成的非特异扩增。

4、本发明引物的序列中含有高通量测序引物序列，线性扩增产物的两端分别含有接头序列1和接头序列2，无需额外连接接头的操作，在接头引物扩增后引入Index序列可直接用于后续高通量测序。

5、本发明方法使用转座酶，可以将DNA片段化、末端修复、添加A尾巴、接头连接四步合一，DNA可以在片段化的同时加上接头序列，减少操作步骤，减少材料损失，缩短实验时间，提高工作效率。

6、本发明方法采用单端引物位置固定、另一端转座酶剪切位置随机的特点，与两端均确定的PCR类方法相比，可检出更多的结构变异，尤其只知道一端的位置，另一端未知的情况，不容易发生漏检。如ALK等基因，在DNA水平上发生的融合断点位置不确定，融合的另外一个基因也不确定，采用本方法，在ALK容易发生融合的位置设计引物，与其发生融合的另外一段序列可通过测序比对进行确定，理论上在该位置发生的融合均可检出。

7、目标区域富集过程使用高保真聚合酶、特异引物进行1-5个循环的线性扩增，每一个扩增循环均是以最原始的DNA作为模板，消除PCR扩增前几个循环中的扩增错误，与UID相结合进一步保证检测结果的准确性。

8、设计时使用的接头序列1和接头序列2分别来源于不同的Illumina文库构建体系，可以基本避免使用同一体系中的接头序列中互补部分产生的引物二聚体。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明设计的引物结构示意图。

图2为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

参见图1，本发明的引物结构如下：

引物从5’端到3’端可以分解成4个组成部分：

1)测序平台的标签序列2，其序列必须是完整的接头序列，其5’端可以增加2到4个G用于稳定发夹结构；

2)分子标签序列：由数个随机碱基组成的UID(Unique Identifier)区域，用于区分原始模板，随机碱基的个数可以在5-20之间；

3)用于形成发夹结构的保护碱基序列，与1)的部分接头序列2及其5’端G互补结合，长度可以在10～20之间；

4)与目标区域的模板序列互补结合的一段序列，长度为15～40碱基。

参见图2，本发明提供了一种基于高通量测序技术，对目标区域进行富集的方法，具体实施过程包括以下部分：

1、DNA的打断及标签序列1的连接与产物纯化

利用转座酶打断基因组DNA，并在打断序列两端加上测序平台测序的标签序列1。

2、目标区域的富集

目标区域的富集通过多重特异PCR扩增完成，即在高保真DNA聚合酶的作用下使用多条特异引物进行线性扩增。目标区域富集所用的高保真DNA聚合酶具有切口平移，可以在适宜的反应条件下补平转座酶打断双链DNA片段产生的切口。特异引物的条数取决于目标区域的长度，目标区域长，特异引物的条数需要增加。

利用高保真DNA聚合酶，使用上述特异引物在适宜的体系和程序下实现对目标区域的线性扩增，线性扩增的循环数一般为1-5个。线性扩增的产物一端含有标签序列1，一端含有标签序列2。

3、使用接头引物进行PCR扩增

此步为常规PCR扩增，放大文库，同时给不同样本加上识别码(Index)。

扩增所用的2条接头引物结构相同，主要包含3个部分：与测序芯片上寡核苷酸结合的接头序列、用于区分不同来源样本的Index序列、上述标签序列1或标签序列2。如计划采用双Index测序，则2条接头引物均应包含Index序列；如计划采用单Index测序，则仅需其中一端引物包含Index序列。

Index序列可以采用目前高通量测序中通用的标志(Index)序列，也可以是自行设计的，能够区分样本且不干扰测序的序列组合，长度一般是6-12nt。

4、文库纯化

PCR扩增结束后，产物中含有酶、dNTPs、离子、引物、引物二聚体等杂质，采用Beckman公司的Agencourt AMPure XP Beads对文库进行纯化，也可使用其它品牌的磁珠、柱纯化试剂盒、电泳后切胶回收等方式进行纯化。

5、文库质控和测序分析

纯化后的文库利用荧光染料法进行定量，同时使用毛细管电泳进行片段分布质控。质控合格的文库在高通量测序仪上进行测序。

本发明可适用于目前所有高通量测序平台，测序类型可以是单端测序也可以是双端测序，单端测序的测序读长和双端测序两端的测序总读长不少于插入片段、随机碱基和保护碱基的总和。

实施例1：

1、DNA的打断及标签序列1的连接及纯化

使用Tn5转座酶打断细胞系HCT15基因组DNA，并在打断序列两端加上测序平台测序的标签序列1。在本实施例中，所用的平台为Illumina平台，标签序列1就是连接有ME序列的接头的一部分。

此部分分为2个步骤，首先进行转座体的构建，准备如表1的反应体系(识别序列以ME为例)。

表1

名称	体积(μL)
		连接有ME序列的接头(10pmol/μL)	1.0～1.5
10×TPS缓冲液	2
		Rubust Tn5转座酶	1
TE缓冲液(100mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)	至20

其中，ME序列为5’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG

TCTACACATATTCTCTGTC-p-5'(ME19)

将上述反应物混匀，25℃反应30min。

反应后的转座体可立即进行后续的片段化反应管也可先于-20℃保存。

准备如下表2的片段化反应体系。

表2

名称	体积(μL)
		50ng/μL HCT15细胞系DNA	2
5×LM缓冲液	6
		转座体	4
H2O	18

将上述反应物混匀，37℃反应2h或56℃反应10～15min。反应结束后，使用AMPureXP Beads对上述反应产物就进行纯化，用20μL纯化水进行洗脱。

2、目标区域的富集

准备如下表3的体系：

表3

名称	体积(μL)
		步骤1的纯化产物	20
10×Stand Taq Reaction Buffer	2.5
		10mM dNTPs	0.5
Taq DNA Polymerase	0.125
		H2O	0.875
1μM特异性引物	1

所述的特异性引物即具有图1结构的引物，具体的，是以下的两条

茎环-W4013-R

茎环-W4015-R

双下划线：测序平台的标签序列2，其5’端增加了3个G用于稳定发夹结构；

无标识：分子标签序列：由数个随机碱基组成的UID(Unique Identifier)区域，用于区分原始模板；

曲线：用于形成发夹结构的保护碱基序列，与1)的部分接头序列2及其5’端G互补结合；

加粗斜体：与目标区域的模板序列互补结合的一段序列。

执行下表4中的程序：

表4

2、上述程序结束后，往体系中加入各1μL的10μM接头引物1和接头引物2。

其中，

p7端引物5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA[I7]GGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

p5端引物5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[I5]TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG

其中，[I7]、[I5]分别代表该引物上的index序列。

反应程序如下表5，循环过程中的PCR仪温度变化设置为0.2℃/s。

表5

4、扩增结束后使用Agencourt AMPure XP磁珠对文库进行纯化。然后对文库进行质控，Illumina测序仪上机测序。

测序分析结果如下表6：

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门艾德生物医药科技股份有限公司

<120> 一种用于对目标区域进行富集的引物及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtctacac atattctctg tc 52

<210> 2

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc cgatctnnnn nnnnnnataa ctccagtcac 60

ccgcaacctg aggtctataa acaaagtctt cc 92

<210> 3

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc cgatctnnnn nnnnnnataa ctccagtcac 60

ccaagaatag gctgaggagg aagtcttcta cc 92

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agagggtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatct 59

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag 62

Claims

1.一种用于对目标区域进行富集的引物，从5’端到3’端包括：

1)接头序列，包括测序平台的完整标签序列；

2)分子标签序列：由随机碱基组成，用于区分原始模板，随机碱基的数量在5-20之间；

3)保护碱基序列：用于形成发夹结构，与1)的接头序列的一部分互补结合，互补的长度范围在10-20碱基之间；

4)特异引物序列：与目标区域的模板序列互补结合的一段序列，长度为15-40碱基。

2.根据权利要求1所述的一种用于对目标区域进行富集的引物，其特征在于：在接头序列1)中，完整标签序列的5’端还增加2到4个G，同时，保护碱基序列3)具有同该增加的2-4个G碱基互补的碱基序列，用于稳定发夹结构。

3.一种对目标区域进行富集的方法，包括如下步骤：

步骤一：DNA的打断及标签序列1的连接与产物纯化

步骤二、目标区域的富集

目标区域的富集通过多重特异PCR扩增完成，即在高保真DNA聚合酶的作用下使用权利要求1或2所述的用于对目标区域进行富集的引物进行线性扩增；线性扩增的循环数为1-5个；线性扩增的产物一端含有标签序列1，一端含有标签序列2，所述的标签序列2为权利要求1或2的引物带入而来；

步骤三：使用接头引物进行PCR扩增

4.根据权利要求3所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：步骤一中，所述的纯化，采用Beckman公司的Agencourt AMPure XP Beads对转座产物进行纯化，或采用磁珠、柱纯化试剂盒进行纯化。

5.根据权利要求3所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：步骤三中，两条接头引物使用的接头序列1和接头序列2分别来源于不同的Illumina文库构建体系。

6.根据权利要求3所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：步骤三中，如采用双Index测序，则2条接头引物均包含Index序列；如采用单Index测序，则仅需其中一条引物包含Index序列。

7.根据权利要求3所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：步骤三所述的Index序列采用高通量测序中通用的标志Index序列。

8.根据权利要求3所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：步骤三所述的Index序列，为能够区分样本且不干扰测序的序列组合，长度6-12碱基。

9.根据权利要求3-8任一项所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：还包括步骤四：PCR扩增结束后，对扩增产物进行纯化。

10.根据权利要求9所述的一种对目标区域进行富集的方法，其特征在于：还包括步骤五：文库质控和测序分析。