CN108004301A - 基因目标区域富集方法及建库试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因目标区域富集方法及建库试剂盒。本发明的方法通过单引物线性扩增的方式，利用高保真DNA聚合酶的保真性，实现对基因目标区域的富集。本发明的方法可以高效、准确地富集目的基因，显著地减低文库构建时产生的测序错误。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，本发明涉及一种主要用于二代测序的基因目标区域富集方法及建库试剂盒。
背景技术
2016年《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)发表的中国国家癌症中心公布的2015年癌症数据显示，2015年中国新发癌症数量约为429万，癌症已成为中国首要杀手。20世纪前，临床上对于肿瘤患者除了手术、化疗、放疗外没有其他有效的治疗手段，随着人类基因组计划的完成，科技工作者们对肿瘤的研究进入到了基因序列层面，并首先在肺癌这一肿瘤类型中发现了治疗的靶点——EGFR(肿瘤表皮生长因子受体)突变，并开发出了靶向药物易瑞沙，开创一种新的靶向治疗模式。靶向治疗的前提是需要对患者进行基因状态的筛查，以前的检测手段包括实时荧光定量PCR、一代测序等，这些手段在一定程度上解决了临床上的需求，但是随着科学的发展，我们意识到在肿瘤组织本身即是个小的生态系统，其组织内部存在异质性，并且EGFR靶向药物对于携带有KRAS基因突变的患者的疗效就很差，因此对于单基因的检测并不能满足临床上的需要。21世纪初二代测序技术逐渐成熟，成本已降低至1000美元完成一个基因组的测序，加上其在检测通量上优势，二代测序技术越来越多的被用于临床检测中。
尽管全基因组测序成本在不断降低，但是对于某些检测到的突变位点，在临床上仍无法判断该突变是否与肿瘤相关、是否可以指导用药。目标区域测序又被称为靶向测序，是目前临床上通常使用的策略，这种方法通常聚焦于先前已知的某些与肿瘤发生发展或用药指导相关的基因进行测序，在降低测序成本的同时，提高了临床应用的便利性。目标区域测序的核心是将感兴趣的基因进行富集并测序，已有的两种富集方法包括多重PCR法和杂交捕获法。多重PCR法以Life Technologies公司的Ampliseq方法为代表，针对每个位点设计一对PCR引物，利用多重PCR的方法对感兴趣的基因或位点进行富集。该方法对起始DNA样本量要求低，操作相对简单，但是对于长度较短的DNA(例如血浆游离DNA、FFPE组织样本DNA等)来说，其在引物设计上有很大困难，且该方法在PCR扩增不同基因时容易出现偏好性。杂交捕获的方法通常是针对目标基因设计约120个碱基长度的探针，在固相载体上或液相中对感兴趣的基因进行杂交富集，该方法可以在DNA层面检测常见的点突变、插入突变、微缺失突变以及已知和未知的融合突变。为了有效富集，杂交捕获法需要大量的长链探针和较长的杂交周期(通常大于24小时)，由于杂交效率低，所以需要大量的DNA模板。
因此，本领域还需要改进方法，以更便捷的方法实现更高效的基因目标区域富集。
发明内容
本发明的目的在于提供基因目标区域富集方法及建库试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种进行目标区域富集的方法，所述方法包括：
(1)在包含待富集目标区域的DNA片段上连接测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA，获得连接产物；
(2)在(1)的连接产物中加入特异性探针，并加入DNA聚合酶，在探针与连接产物构成互补的基础上进行序列延伸，获得延伸产物；其中，所述的特异性探针包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；
(3)以DNA聚合酶对(2)的延伸产物进行PCR扩增，获得含有富集目标区域的DNA的扩增产物。
在一个优选例中，所述的目标区域富集的方法应用于高通量测序中。
在另一优选例中，所述的目标区域包括：序列发生变异的位点，例如：SNP突变位点区域，碱基缺失位点区域，碱基插入位点区域和融合突变位点区域等。
在另一优选例中，所述的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。
在另一优选例中，所述的方法应用于高通量检测，在一次检测中，所述的包含待富集目标区域的DNA片段为1条或多条(2～1000条，如5，10，15，20，30，50，80，100，200，500，800条)，从而对应测序探针也为1条或多条。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的能形成部分双链结构的DNA可形成一种“茎环”结构、“双环”结构或“Y型”结构，或为包含回文序列的普通双链DNA；步骤1的接头连接方法为单链连接，通过双链连接酶连接于经磷酸化的包含待富集目标区域的DNA片段的5’端；较佳地，所述双链连接酶包括：T4DNA连接酶。
在另一优选例中，所述的能形成部分双链结构的DNA包括：能被测序系统识别的序列、样本标签序列；较佳地，还包括：分子标签序列。
在另一优选例中，所述的能被测序系统识别的序列、样本标签序列和/或分子标签序列存在于所述的能形成部分双链结构的DNA中不能构成双链的部分(如“茎环”结构的“环”中)。
在另一优选例中，在步骤(1)、(2)和(3)中，分别还包括对连接产物、扩增产物和延伸产物进行纯化的步骤。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述的测序接头2的一端与所述包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列连接，另一端连接纯化标签；或在进行序列延伸时以“纯化标签标记的dNTP”进行延伸；较佳地，所述的纯化标签是能进行固相纯化的标签，应用固相纯化系统进行固相纯化；
步骤(1)、(2)或(3)中，纯化分离标记有样本标签的样品。
在另一优选例中，所述的测序接头2位于特异性探针的5’端，所述的与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列位于特异性探针的3’端。
在另一优选例中，所述的测序接头2的5’端，连接纯化标签。
在另一优选例中，所述的纯化标签是生物素，进行固相纯化的固相纯化系统为亲和素包被的磁珠或者链霉亲和素包被的磁珠。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述的延伸包括：单轮或多轮循环的变性、退火、延伸步骤；较佳地，进行多轮循环的变性、退火、延伸步骤(例如，进行2～45个，如5，10，15，20，25，30，35个循环数的线性扩增)。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述的PCR扩增为指数PCR扩增(例如，进行10～20个循环数的PCR扩增)。
在另一优选例中，步骤(3)中，采用正向引物与反向引物进行PCR扩增，所述的反向引物与所述被测序系统识别的序列相同或互补；所述的正向引物与所述测序接头2序列相同或互补。
在另一优选例中，采用Ion Torrent测序系统进行测序，所述的测序接头2的序列为Ion Torrent P1序列；所述的能被测序系统识别的序列为Ion Torrent A序列。
在另一优选例中，步骤(3)之后，还包括：识别步骤(3)获得的扩增产物中的测序接头1(特别是其中能被测序系统识别的序列(如A序列))以及测序接头2，进行测序，获得目标区域的测序结果。
在另一优选例中，所述的测序接头1和测序接头2的部分或全部碱基经修饰，或未经修饰；较佳地，所述的修饰包括(但不限于)：脱氧脲嘧啶(dU)修饰、硫代修饰。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的包含待富集目标区域的DNA片段为双链DNA，包括但不限于基因组DNA、互补DNA(complementary DNA，cDNA)。
在本发明的另一方面，提供一种应用于进行目标区域富集的试剂盒，所述试剂盒中包括：
测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA；
特异性探针，其包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；
正向引物和反向引物，它们具有与测序接头1(特别是其中能被测序系统识别的序列(如A序列))和测序接头2中的序列互补的序列。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括选自一下的一种或多种试剂：DNA聚合酶，双链连接酶，dNTPs。
在另一优选例中，所述的目标区域为EGFR exon 18 G719X(A/S/C)突变、EGFR19Del、EGFR exon 20 T790M、EGFR exon 21 L858R、BRAF V600E、KRAS G12D、KRAS Q61H和/或ALK intron 19 fusion突变，所述的测序接头1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、6、7、8、9、10、11、22或23所示，所述的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、3、12～21和/或24～39的一条或多条所示，
所述的正向引物与反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、文库构建流程图。
图2、实施例1测序读长分布图。
图3、实施例1EGFR基因19外显子测序碱基深度图。
图4、实施例1EGFR基因21外显子测序碱基深度图。
图5、实施例3根据本发明检测出H2228细胞株及一例肺癌病人融合突变数据。
图6A-B、实施例3中H2228细胞株EML4-ALK融合断点的IGV查看图。
图7、实施例3中H2228细胞株EML4-ALK融合用一代测序验证结果。
图8、实施例3中肺癌病人EML4-ALK融合用一代测序验证结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，提出了一种新型的基因目标区域富集方法，该方法适用于高通量测序中。本发明的方法通过单引物线性扩增的方式，利用高保真DNA聚合酶的保真性，实现对基因目标区域的富集。本发明的方法可以高效、准确地富集目的基因，显著地减低文库构建时产生的测序错误。
术语
如本文所用，所述的“包含待富集目标区域的DNA片段”是指一段双链DNA序列，包括但不限于基因组DNA、互补DNA(complementary DNA，cDNA)等，其中包含有感兴趣的“目标区域”。其中，该“目标区域”包括：序列发生变异的位点，例如：SNP突变位点区域，碱基缺失位点区域，碱基插入位点区域和融合突变位点区域等。该“目标区域”可以是与疾病的发生密切相关的区域，也可以是本领域技术人员以其它研究为目的而感兴趣的区域。例如：人EGFR基因第21外显子的L858R突变、人EGFR基因第19外显子E746_A750 DEL-1缺失突变、人EGFR基因第20外显子的A763_Y764insFQEA插入突变和人EML4-ALK基因融合突变等。
如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构是指一种单链核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。
如本文所用，“双环”结构是指一种双链核苷酸分子，其中的两端为互补核苷酸分子，形成结构中的双链区域；中间包含一段非互补核苷酸分子，形成结构中的单链“环状”结构。
如本文所用，“Y型”结构是指一种双链核苷酸分子，其中的一端为互补核苷酸分子，形成结构中的双链区域；另一端为非互补核苷酸分子，形成结构中的单链“分叉”区域。
目标区域富集方法
本发明提供了一种进行目标区域富集的方法，所述方法包括：(1)在包含待富集目标区域的DNA片段上连接测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA，获得连接产物；(2)在(1)的连接产物中加入特异性探针，并加入高保真DNA聚合酶，在探针与连接产物构成互补的基础上进行序列延伸，获得延伸产物；其中，所述的特异性探针包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；(3)以高保真DNA聚合酶对(2)的延伸产物进行PCR扩增，获得含有富集目标区域的DNA的扩增产物。
步骤(1)中，所述的能形成部分双链结构的DNA可形成一种“茎环”结构、“双环”结构或“Y型”结构，或为包含回文序列的普通双链DNA。在优选的方式中，步骤1的接头连接方法为单链连接，通过双链连接酶连接于经磷酸化的包含待富集目标区域的DNA片段的5’端。利用这种能形成部分双链结构的DNA作为接头，有利于获得序列连接方向单一的连接产物，避免产生不同方向的连接而导致的干扰。
在优选的方式中，除了构成双链的部分序列之外，所述的能形成部分双链结构的DNA还包括：能被测序系统识别的序列(如，相应于Ion Torrent测序系统，该序列为A序列)、样本标签序列，以及可选地还包括：分子标签序列。所述的能被测序系统识别的序列、样本标签序列和/或分子标签序列存在于所述的能形成部分双链结构的DNA的“茎环”结构的“环”中(即不能构成双链的部分)。样本标签序列的应用，可以有利于后续的生信分析中对不同样本的序列进行区别，从而实现在单次反应中同时进行多个样本的测序。能被测序系统识别的序列的应用，可以有利于后续被高通量测序系统捕捉、测序。
在步骤(1)、(2)和(3)中分别还包括对连接产物、扩增产物和延伸产物进行纯化的步骤，纯化分离标记有样本标签的样品。在优选的方式中，步骤(2)中，所述的测序接头2的一端与所述包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列连接，另一端连接纯化标签；或在进行序列延伸时以“纯化标签标记的dNTP”进行延伸；较佳地，所述的纯化标签是能进行固相纯化的标签，应用固相纯化系统进行固相纯化。在更优选的方式中，所述的纯化标签是生物素，进行固相纯化的固相纯化系统为亲和素包被的磁珠或者链霉亲和素包被的磁珠。
步骤(2)中，所述的延伸包括：单轮或多轮循环的变性、退火、延伸步骤。在本发明的优选方式中，进行多轮循环的变性、退火、延伸步骤。例如，进行2～45个循环数的线性扩增。
步骤(3)中，所述的PCR扩增为指数PCR扩增。例如，进行10～20个循环数的PCR扩增。采用正向引物与反向引物进行PCR扩增。
在完成步骤(3)之后，还包括：识别步骤(3)获得的扩增产物中的测序接头1(特别是其中能被测序系统识别的序列(如A序列))以及测序接头2，进行测序，获得目标区域的测序结果。
本发明应用的测序接头可以是未经修饰的，也可以是采用如基于核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的接头，所述的修饰基本不改变寡核苷酸分子结合特性；优选那些能够提高寡核苷酸分子稳定性的修饰。例如，所述的修饰为dU修饰，硫代修饰，或在核糖的2’位置进行烷基修饰。应理解，任何能够保持所述寡核苷酸分子结合特性的修饰都包含在本发明中。
寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，该方法是将DNA骨架上磷酸键上的氧原子用硫原子替代，所述的硫代可以是全部磷酸键上的硫代或是部分磷酸键上的硫代。硫代的修饰能够大大增强所述寡核苷酸分子的稳定性，从而有利于获得准确的检测结果。脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。
本发明的上述方法，首先通过接头连接将DNA片段连接上测序接头，该测序接头可以包含能被测序系统识别的序列、样本标签序列、分子标签序列等。然后将连接产物与探针混合并加入热稳定、高保真DNA聚合酶，经过高温变性、退火、延伸步骤，探针与目标DNA分子退火形成双链，并在DNA聚合酶的作用下，特异性的掺入dNTP并延伸，通过多轮变性、退火、延伸步骤的循环，可以实现对目的基因的高效富集，结合链霉亲和素-生物素纯化系统实现对目标区域的高效富集与纯化。
本发明可针对任意已经连接上测序接头的DNA片段进行富集，其中接头序列可以是Ion Torrent测序平台的接头，也可以是Illumina测序平台的接头。根据本发明的原理，本领域技术人员了解本发明的方法也可适用于其它的测序平台。
本发明的方法针对每个位点只设计一条寡核苷酸探针即可实现有效富集，克服了PCR方法在针对短的核酸片段设计上的困难，可以有效地富集短的核酸片段(例如血浆游离DNA、FFPE组织样本DNA等)。本发明的另一优势之处在于，通过特异性的探针延伸的方式实现目标区域的富集，可缩短时间(例如在富集EGFR突变位点区域的实施例中，过程只需要1个小时左右的时间)，相对于探针杂交捕获的方式，时间节省很多。
另一方面，通过本发明方法或试剂盒进行文库构建后，文库在结构上依次包含以下序列部分：5’端的测序接头、基因特异性探针、富集到的目标区域、样本标签、分子标签(可含有)、3’端的测序接头(图1)。其中富集到的目标区域包含基因的突变信息，该部分序列的特点是5’端序列在基因组上的位置是固定的(由基因特异性探针决定)，而3’端不固定(图3、图4)，由建库初始的DNA片段化状态决定，因此在分析数据时，该序列3’端在基因组上的位置可以起到分子标签的作用，可以有效降低背景噪声。另外，结合分子标签更可大大降低背景噪声，提高检测的灵敏度与准确性。
试剂盒
基于本发明的前述方法，本发明还提供了一种应用于进行目标区域富集的试剂盒，所述试剂盒中包括：测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA；特异性探针，其包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；正向引物和反向引物，它们具有与测序接头1(特别是其中能被测序系统识别的序列(如A序列))和测序接头2中的序列互补的序列。
所述的试剂盒中还可包括：高保真DNA聚合酶，双链连接酶，dNTPs等。所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中描述了本发明的进行DNA无缝组装的方法，以便于本领域技术人员应用。
本发明的主要优点在于：
1.高效、准确富集目的基因，减低文库构建时产生的测序错误；
2.只需设计一条引物(探针)即可，克服短片段如ctDNA设计PCR引物的困难；
3.接头单链连接，可避免接头的反向连接，提高连接效率；
4.多重线性扩增法，只需1小时即可完成富集，较杂交捕获法快；
5.目标区域3’端和分子标签可在分析时降低背景噪音，提高检测准确性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、点突变、插入缺失检测
本实施例中所用寡核苷酸序列如表1所示。
表1、寡核苷酸序列
注：①接头1中包含测序接头1，此处为Ion Torrent测序系统中的A序列；下划线部分序列为样本标签序列；“N”部分为分子标签序列(其中，NNNNNN为随机序列，用以标记区别同一样本中的不同片段；GATCGC为Barcode adapter序列，用于质控)；
②探针1和探针2中包含测序接头2(即斜体标示的碱基，此处为Ion Torrent测序系统中的P1序列，且5’端有生物素修饰；下划线部分为目标区域特异性序列。其中，探针1针对EGFR基因21外显子L858R突变，探针2针对EGFR基因19外显子缺失突变。
步骤1：样本准备
采用商用试剂盒抽提样本基因组DNA样本，样本包括健康人口腔脱落细胞、NCI-H1975细胞株(该细胞株为EGFR基因21外显子L858R突变)、NCI-H1650细胞株(该细胞株为EGFR基因19外显子缺失突变)，通过分光亮度计对DNA样本定量，将NCI-H1975细胞株DNA、NCI-H1650细胞株DNA按照1％的比例掺入到健康人口腔脱落细胞DNA中，采用Covaris超声波DNA破碎仪将DNA打断至约200bp备用。
步骤2：末端修复
按表2配制末端修复反应体系。
表2
| DNA样本 | 60ul |
| 10×T4多核苷酸激酶缓冲液 | 10ul |
| dNTP(每种10mM) | 2ul |
| T4 DNA聚合酶 | 2ul |
| T4多核苷酸激酶 | 2ul |
| Klenow片段 | 2ul |
| ddH2O | 22ul |
| 总体积 | 100ul |
充分混匀后，20℃孵育30分钟，在65℃孵育30分钟。然后对产物进行硅胶柱纯化，60ul洗脱缓冲液洗脱。
步骤3：接头连接
按表3配制连接反应体系。
表3
充分混匀后，20℃孵育30分钟。取150ul Agencourt AMPure磁珠对连接产物进行纯化，纯化产物溶于50ul洗脱缓冲液洗脱中，至此得到标记有样本标签的DNA文库。
步骤4：探针延伸
按表4配制探针延伸反应体系。
表4
| 连接纯化产物 | 40ul |
| 5×Q5Buffer | 20ul |
| dNTP(10mM each) | 2ul |
| Q5高保真DNA聚合酶(2U/μL) | 1ul |
| 探针1(10μM) | 1ul |
| 探针2(10μM) | 1ul |
| ddH2O | 35ul |
| 总体积 | 100ul |
充分混匀并离心后，将反应管置于PCR仪中，按表5设置程序并运行：
表5
反应结束后，用链霉亲和素包被的磁珠纯化反应产物，并最终溶解于40ul洗脱缓冲液中。
步骤5：文库扩增
按表6配制文库扩增反应体系。
表6
| 上一步纯化产物 | 30ul |
| 5×Q5 Buffer | 10ul |
| dNTP(10mM each) | 1ul |
| Q5高保真DNA聚合酶(2U/μL) | 1ul |
| 引物F(10μM) | 1.5ul |
| 引物R(10μM) | 1.5ul |
| ddH2O | 5ul |
| 总体积 | 50ul |
充分混匀并离心后，将反应管置于PCR仪中，按表7设置程序并运行：
表7
反应结束后，取80ul Agencourt AMPure磁珠对PCR产物进行纯化，纯化产物溶于30ul洗脱缓冲液洗脱中，至此得到待上机测序的文库。
步骤6：测序
将制备好的文库，在Ion Proton上进行测序，包括油包水PCR、文库富集、芯片加样、上机测序，具体操作流程详见Ion PITMHi- QTMOT2 200 Kit说明书、Ion PITMHi-QTMSequencing 200 Kit说明书。
步骤7：数据分析
分析内容包括总reads数、比对到hg19上的reads数、比对率、目标区域reads数、目标区域比例、突变信息等，见表8、表9。
表8
| 总reads数 | 315060 |
| 比对到hg19上的reads数 | 296944 |
| 比对率 | 94.25％ |
| 目标区域reads数 | 160349 |
| 目标区域reads比例 | 54％ |
表9
上述进行ARMS定量PCR检测的试剂盒：格诺思博生物科技南通有限公司生产的人类EGFR基因突变定量检测试剂盒(实时荧光PCR法)，对样本中EGFR基因的突变进行定量检测。
由表8和表9的结果可见，本方法测序得到的突变比例显著高于ARMS定量PCR检测突变比例，可以更为精确地获得突变结果。
实施例2、接头修饰
本实施例中所用寡核苷酸序列如表10所示。
表10
表10中，接头1和接头2为非修饰的接头；接头3和接头4序列中部分“T”碱基被“U”碱基替代；接头5和接头6为硫代修饰。
样本准备：与实施例1相似，采用商用试剂盒抽提健康人口腔脱落细胞基因组DNA样本，通过分光亮度计对DNA样本定量，采用Covaris超声波DNA破碎仪将DNA打断至约200bp备用。
建库及测序流程同实施例1。在进行实验时，接头1和接头2分别配合探针1～12及引物F和引物R进行一次建库和测序；接头3和接头4分别配合探针1～12及引物F和引物R进行一次建库和测序；接头5和接头6分别配合探针1～12及引物F和引物R进行一次建库和测序。
测序结果见表11。
表11
表11结果显示，非修饰接头、dU修饰接头、硫代修饰接头在Align Rate、Uniformity、On Target Rate方面没有差别，都有较好的效果。
实施例3、EML4-ALK融合检测
本实施例中所用寡核苷酸序列如表12。
表12
步骤1：样本准备
采用商用试剂盒抽提样本基因组DNA样本，样本1为H2228细胞株(已知为EML4-ALK3型融合突变)、样本2为某肺癌病人血浆，通过分光亮度计对DNA样本定量，采用Covaris超声波DNA破碎仪将由样本抽提得到的DNA打断至约200bp备用，样本2抽提得到的血浆游离DNA无需打断。
建库步骤1至步骤7与实施例1相同，NGS统计结果见图5，图6A和图6B示出了用本发明检测到的H2228细胞株融合断点用IGV查看的结果，Sanger测序验证结果见图7和图8。
根据本发明检测到H2228细胞株存在EML4与ALK基因的融合，ALK基因在内含子19处与EML4基因内含子6处发生融合，为3型融合突变，结果与现有技术报导一致(Choi YL,Takeuchi K,Soda M et al.Identification of novel isoforms of the EML4‐ALKtransforming gene in non‐small cell lung cancer.Cancer Res2008；68:4971-4976)。在另外一例血浆样本中，本发明发现其融合方式为EML4基因在内含子20处与ALK基因的内含子17处融合在一起，这是一种尚未报道过的融合(E20:A18)。而采用商业试剂盒(RT-PCR方法)对该例病人的病理组织样本的检测结果是E20：A20，深入分析可知，ALK基因18外显子长度为153bp，ALK基因19外显子长度为105bp，商业试剂盒只针对E13：A20、E20：A20和E6：A20设计了检测引物，针对E20：A20的检测引物也可以检测出此例中的E20：A18融合类型，所以将此融合类型误判为E20：A20。这也体现了本发明检测的准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 格诺思博生物科技南通有限公司
上海格诺生物科技有限公司
<120> 基因目标区域富集方法及建库试剂盒
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(84)
<223> 接头1
<400> 1
aggaatgagg tctactccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagctaa ggtaacgatc 60
gcnnnnnnag tagacctcat tcct 84
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(65)
<223> 探针1 EGFR 19Del
<400> 2
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat agaaggtgag aaagttaaaa ttcccgtcgc 60
tatca 65
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 探针2 L858R
<400> 3
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat cctggcagcc aggaacgtac tggtgaaaac 60
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物F
<400> 4
gtctcagcct ctctatgggc agtcggtgat 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 引物R
<400> 5
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(78)
<223> 接头1
<400> 6
aggaatgagg tctactccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagcgag gttatcgatc 60
gcagtagacc tcattcct 78
<210> 7
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(78)
<223> 接头2
<400> 7
aggaatgagg tctactccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagtcca agctgcgatc 60
gcagtagacc tcattcct 78
<210> 8
<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(76)
<223> 接头3
<400> 8
aggaagaggc tacccatctc atccctgcgt gtctccgact cagtcgcatc gttcgatcgc 60
agtagacctc attcct 76
<210> 9
<211> 79
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(79)
<223> 接头4
<400> 9
aggaaugagg uctacuccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagaagg aatcgtcgat 60
cgcagtagac ctcattcct 79
<210> 10
<211> 79
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(79)
<223> 接头5
<400> 10
aggaatgagg tctactccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagtaac aatcggcgat 60
cgcagtagac ctcattcct 79
<210> 11
<211> 79
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(79)
<223> 接头6
<400> 11
aggaatgagg tctactccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagctga cataatcgat 60
cgcagtagac ctcattcct 79
<210> 12
<211> 60
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 探针1 EGFR exon 18 G719X (A/S/C)
<400> 12
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat accttacctt atacaccgtg ccgaacgcac 60
<210> 13
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(64)
<223> 探针3 EGFR exon 20 T790M
<400> 13
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat ccaatattgt ctttgtgttc ccggacatag 60
tcca 64
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<223> 探针5 BRAF V600E
<400> 14
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gttcaaactg atgggaccca ctccatcgag 60
a 61
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(66)
<223> 探针6 KRAS G12D
<400> 15
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gattctgaat tagctgtatc gtcaaggcac 60
tcttgc 66
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(63)
<223> 探针7 KRAS Q61H
<400> 16
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gtcctcatgt actggtccct cattgcactg 60
tac 63
<210> 17
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(67)
<223> 探针8 ALK intron 19 fusion
<400> 17
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat atatagggca gagtcatgtt agtctggttc 60
ctccaag 67
<210> 18
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(65)
<223> 探针9 ALK intron 19 fusion
<400> 18
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gagcacgtag taaccatgca acaagtgtta 60
gctcc 65
<210> 19
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<223> 探针10 ALK intron 19 fusion
<400> 19
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat ttgggaccac actgagttct ctgtgacctg 60
c 61
<210> 20
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(62)
<223> 探针11 ALK intron 19 fusion
<400> 20
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gcccttgaag cactacacag gccacttcct 60
ac 62
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 探针12 ALK intron 19 fusion
<400> 21
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat tcgtgatgga cactgaagga gctccccacc 60
<210> 23
<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(76)
<223> 接头1
<400> 23
aggaagaggc tacccatctc atccctgcgt gtctccgact cagctgacat aatcgatcgc 60
agtagacctc attcct 76
<210> 23
<211> 79
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(79)
<223> 探针1 ALK intron 19 fusion
<400> 23
aggaaugagg uctacuccat ctcatccctg cgtgtctccg actcagttcc acttcgcgat 60
cgcagtagac ctcattcct 79
<210> 24
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 探针1 ALK intron 19 fusion
<400> 24
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat cggagcttgc tcagcttgta ctcaggg 57
<210> 25
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(56)
<223> 探针2 ALK intron 19 fusion
<400> 25
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat tggcccttga agcactacac aggcca 56
<210> 26
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(65)
<223> 探针3 ALK intron 19 fusion
<400> 26
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat taattgaagc atgatttaaa gtaaatgcaa 60
agcta 65
<210> 27
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(65)
<223> 探针4 ALK intron 19 fusion
<400> 27
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gtctgcagat tttattagaa gaaatgccca 60
tgaga 65
<210> 28
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(56)
<223> 探针5 ALK intron 19 fusion
<400> 28
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gagggaaggt tgggtggaag caccct 56
<210> 29
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(56)
<223> 探针6 ALK intron 19 fusion
<400> 29
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gctgtgctca gccattgggt agggca 56
<210> 30
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<223> 探针7 ALK intron 19 fusion
<400> 30
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat tgccaagcca cagagttgga gaagagcca 59
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 探针8 ALK intron 19 fusion
<400> 31
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gtttccctct ctgtaggcag ggatggtaac 60
<210> 32
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(67)
<223> 探针9 ALK intron 19 fusion
<400> 32
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat ggttttgaaa aatcctaaag agctctacca 60
atgtgag 67
<210> 33
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(55)
<223> 探针10 ALK intron 19 fusion
<400> 33
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gcccagcccc ccaacacatg ggcca 55
<210> 34
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(65)
<223> 探针11 ALK intron 19 fusion
<400> 34
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat attgaaatgt gtaaattgcc gagcacgtag 60
taacc 65
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(55)
<223> 探针12 ALK intron 19 fusion
<400> 35
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat ccttctaccg gcagatccct ttgcc 55
<210> 36
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(56)
<223> 探针13 ALK intron 19 fusion
<400> 36
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat gctggttggg accacactga gttctc 56
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 探针14 ALK intron 19 fusion
<400> 37
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat tggtttgggg aagagtgggc tagtgcatta 60
<210> 38
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<223> 探针15 ALK intron 19 fusion
<400> 38
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat ccccacccaa ttccagggac tagcataac 59
<210> 39
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 探针16 ALK intron 19 fusion
<400> 39
ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat aaggagctcc ccaccccctg atcagcc 57
Claims (15)
1.一种进行目标区域富集的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在包含待富集目标区域的DNA片段上连接测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA，获得连接产物；
(2)在(1)的连接产物中加入特异性探针，并加入DNA聚合酶，在探针与连接产物构成互补的基础上进行序列延伸，获得延伸产物；其中，所述的特异性探针包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；
(3)以DNA聚合酶对(2)的延伸产物进行PCR扩增，获得含有富集目标区域的DNA的扩增产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的能形成部分双链结构的DNA可形成一种“茎环”结构、“双环”结构或“Y型”结构，或为包含回文序列的普通双链DNA；步骤1的接头连接方法为单链连接，通过双链连接酶连接于经磷酸化的包含待富集目标区域的DNA片段的5’端；较佳地，所述双链连接酶包括：T4DNA连接酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的能形成部分双链结构的DNA包括：能被测序系统识别的序列、样本标签序列；较佳地，还包括：分子标签序列。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的能被测序系统识别的序列、样本标签序列和/或分子标签序列存在于所述的能形成部分双链结构中不能构成双链的部分。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)、(2)或(3)中，分别还包括对连接产物、扩增产物和延伸产物进行纯化的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的测序接头2的一端与所述包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列连接，另一端连接纯化标签；或在进行序列延伸时以“纯化标签标记的dNTP”进行延伸；较佳地，所述的纯化标签是能进行固相纯化的标签，应用固相纯化系统进行固相纯化；
步骤(1)、(2)或(3)中，纯化分离标记有样本标签的样品。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化标签是生物素，进行固相纯化的固相纯化系统为亲和素包被的磁珠或者链霉亲和素包被的磁珠。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的延伸包括：单轮或多轮循环的变性、退火、延伸步骤；较佳地，进行多轮循环的变性、退火、延伸步骤。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的PCR扩增为指数PCR扩增。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后，还包括：识别步骤(3)获得的扩增产物中的测序接头1以及测序接头2，进行测序，获得目标区域的测序结果。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的测序接头1和测序接头2的部分或全部碱基经修饰，或未经修饰；较佳地，所述的修饰包括：脱氧脲嘧啶修饰、硫代修饰。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的包含待富集目标区域的DNA片段为双链DNA，包括但不限于基因组DNA、互补DNA。
13.一种应用于进行目标区域富集的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
测序接头1，其是能形成部分双链结构的DNA；
特异性探针，其包括测序接头2以及与包含待富集目标区域的DNA片段互补的序列；
正向引物和反向引物，它们具有与测序接头1和测序接头2中的序列互补的序列。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括选自一下的一种或多种试剂：DNA聚合酶，双链连接酶，dNTPs。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的目标区域为EGFR exon 18 G719X(A/S/C)突变、EGFR 19Del、EGFR exon 20 T790M、EGFR exon 21 L858R、BRAF V600E、KRASG12D、KRAS Q61H和/或ALK intron 19 fusion突变，所述的测序接头1的核苷酸序列如SEQID NO:1、6、7、8、9、10、11、22或23所示，所述的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、3、12～21和/或24～39的一条或多条所示，
所述的正向引物与反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
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