CN113186291A - 基于多重pcr的引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种基于多重PCR的引物组和试剂盒。本发明所提供的引物组可以同时进行15种基因多重PCR捕获测序，共检测93种不同的突变，引物特异性高，对于组织样本，深度可达1000X以上，对于血液样本，深度可达10000X以上，平均覆盖度99％，模板起始量少，可以高效、快速、方便的检测肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃肠道间质瘤的突变，从而开发一种高度敏感的检测方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种基于多重PCR的引物组和试剂盒。
背景技术
目前，随着越来越多肿瘤靶向药物和免疫药物的获批上市，有些药物甚至纳入医保，对基因检测的需求也越多，基因检测已经逐渐成为肿瘤治疗的常规手段。使用传统Sanger法或目标区域杂交捕获测序价格昂贵。多重PCR扩增子测序是一种针对临床及确定疾病基因热点的快速检测模式，可以在保证扩增均一性的前提下，对SNV、InDel及基因融合等几千甚至上万个位点进行快速靶向线性扩增后，使用主流的测序平台进行大批量样本检测与深度分析的解决方案。和探针捕获建库相比，多重PCR扩增建库灵敏度高，需要的数据量少，富集效果好、稳定、需要模板量少、测序深度高，对肿瘤突变的检测准确性高，特别是在极端情况下不容易漏检，该方案使二代测序检测技术进入超快速精准医学时代。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种引物组，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～107所示的引物。
可选的，如上所述的引物组，所述上游引物和所述下游引物的5’端与接头序列相连。
可选的，如上所述的引物组，还包括测序引物，所述测序引物包括与所述接头序列相同的区段或者其互补区段，以及与测序通道附有的DNA引物配对的序列，以及任选地index序列。
可选的，如上所述的引物组，还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物。
可选的，如上所述的引物组，还包括针对内参基因的反转录引物和/或扩增引物。
本发明的第二方面涉及一种试剂盒，其含有如上所述的引物组。
可选的，如上所述的试剂盒，其还含有分子量marker、扩增反应液、dNTP、水、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶中的至少一种。
本发明的第三方面涉及如上所述的引物组在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
可选的，如上所述的应用，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃肠道间质瘤中的一种或多种。
本发明的第三方面涉及一种检测基因突变的非诊断目的方法，包括：
获取待检测样本的DNA和总RNA；
使用SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物对所述总RNA进行反转录以获得cDNA；
将所述cDNA与DNA混合，使用SEQ ID NO：1～107所示的引物对进行扩增，并对扩增产物进行测序。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的引物组可以同时进行15种基因多重PCR建库测序，共检测93种不同的突变，引物特异性高，对于组织样本，深度可达1000X以上，对于血液样本，深度可达10000X以上，平均覆盖度99％，模板起始量少，可以高效、快速、方便的检测肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃肠道间质瘤的突变，从而开发一种高度敏感的检测方法，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中多重PCR建库后的电泳图示；
图2为本发明一个实施例中针对EGFR-L858R的测序结果；第21号外显子的第2573位核苷酸T突变成G，第858位氨基酸L突变成R；该样本为组织样本，包含该位点野生型reads有38059条，突变型reads有14335条，即该位点的突变丰度14335/(14335+38059)＝27％，该位点的测序深度为52394；
图3为本发明一个实施例中针对EML4-ALK融合的测序结果；RNA反转录成cDNA，然后建库上机分析的结果；ALK断点位置chr2:29446387，EML4断点位置chr2:42522656；该样本为组织样本，图中的垂直虚线处代表断点融合的位置，融合的reads数有29354条；
图4为本发明一个实施例中针对KRAS G12V的测序结果；第2号外显子的第35位核苷酸G突变成T，第12位氨基酸G突变成V；该样本为组织样本，包含该位点野生型reads有13686条，突变型reads有7115条，即该位点的突变丰度7115/(7115+13686)＝34％，该位点的测序深度为20801；
图5为本发明一个实施例中BRAF V600E的测序结果；第15号外显子的第1799位核苷酸T突变成A,第600位氨基酸V突变成E；该样本为组织样本，包含该位点野生型reads有6841条，突变型reads有2246条，即该位点的突变丰度2246/(2246+6841)＝25％，该位点的测序深度为9087；
图6为本发明一个实施例中EGFR的测序结果；第19号外显子的第2236至2250位核苷酸缺失，第746至750位氨基酸缺失；该样本为血液样本，包含该位点野生型reads有11703条，突变型reads有12351条，即该位点的突变丰度12351/(12351+11703)＝51％，该位点的测序深度为24054；
图7为对EGFR-L858R测序结果的qPCR验证图；
图8为对EML4-ALK融合测序结果的qPCR验证图；
图9为对KRAS G12V测序结果的qPCR验证图；
图10为对BRAF V600E测序结果的qPCR验证图；
图11为对EGFR测序结果的qPCR验证图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的第一方面涉及一种引物组，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～107所示的引物。
本发明所提供的引物组可以同时进行15种基因多重PCR测序，共检测93种不同的突变，引物特异性高，对于组织样本，深度可达1000X以上，对于血液样本，深度可达10000X以上，平均覆盖度99％，模板起始量少，可以高效、快速、方便的检测肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃肠道间质瘤的突变，从而开发一种高度敏感的检测方法，具有广阔的应用前景。
在一些实施方式中，所述上游引物和所述下游引物的5’端与接头序列相连。
在一些实施方式中，所述的引物组还包括测序引物，所述测序引物包括与所述接头序列相同的区段或者其互补区段，以及与测序通道附有的DNA引物配对的序列，以及任选地index序列。
在一些实施方式中，所述的引物组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物。
另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物包括与SEQ ID NO：1～122所示的引物具有大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物修饰并且可根据标准技术制备。
术语“％同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，％同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST(Altschul etal.,1990、J Mol Biol 215:3,403-410；Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res25:17,3389-402)确定百分比同一性。
引物修饰可以采用公知的方法。这些引物序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述的引物组还包括针对内参基因的反转录引物和/或扩增引物。
本发明的第二方面涉及一种试剂盒，其含有如上所述的引物组。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述的试剂盒还含有分子量marker、扩增反应液、dNTP、水、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶中的至少一种。
各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、反转录酶以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。
如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7–pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。
在一些实施方式中，所述水为无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
在一些实施方式中，试剂盒中还含有阳性对照。
在一些实施方式中，试剂盒中还含有DNA提取试剂。
所述DNA提取试剂用于执行酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法。其中：
酚氯仿法通常是指通过酚氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。
NaOH法一般是强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放DNA，NaOH不破坏DNA一级结构。
树脂提取法常用Chelex100法，通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子，使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。
盐析法通常是将细胞破碎并离心后，用约6M的饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉淀，用TE溶解。
十六烷基三甲基溴化胺法通常是通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与DNA形成复合物，分离DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。
硅胶膜吸附法通常指通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA，并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。
FTA卡法通常指通过FTA卡裂解细胞释放DNA，从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。
硅珠法通常是指在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。
磁珠法通常是指在胍盐存在条件下，通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠，特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。
在一些实施方式中，试剂盒中还含有RNA提取试剂。
本发明的第三方面涉及如上所述的引物组在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃肠道间质瘤中的一种或多种。
本发明的第三方面涉及一种检测基因突变的方法，包括：
获取待检测样本的DNA和总RNA；
使用SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物对所述总RNA进行反转录以获得cDNA；
将所述cDNA与DNA混合，使用SEQ ID NO：1～107所示的引物对进行扩增，并对扩增产物进行测序。
在一些实施方式中，待检测样本的DNA为基因组DNA。
在一些实施方式中，所述基因突变包括表1中的位点：
表1
在本发明的一些实施方式中，所述测序法是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用于本发明的NGS的测序平台可以是商用可得的，包括但不限于Illumina MiniSeq、NextSeq 550等。
在一些实施方式中，所述待检测样品为血液、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织或组织裂解液。
在一些实施方式中，所述待检测样品来自动物，优选哺乳动物，优选灵长类动物，优选人。
在一些实施方式中，所述待检测样品来自组织或组织裂解液，组织可以选择例如羊水、绒毛、骨骼、肌肉或毛发等。本文使用的"组织裂解物"、"细胞裂解物"、"裂解物"、"裂解的样品"、"组织提取物"或"细胞提取物"表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语"裂解"包括。
该方法可以是非诊断目的的，例如遗传学研究、人种分布、人类进化学等领域的研究中进行应用(典型的如SNP的应用)，或者是脑胶质瘤相关疾病的细胞和动物模型的鉴定。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本实施例提供一种检测表1中基因突变的方法。
1.常规方法提取人组织样本中的总RNA和基因组DNA。
2.反转录
混匀下述的样品：12微升样本RNA，2微升5×buffer，2微升10×ACE buffer,1微升反转录引物(SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物以及内参引物混匀后一起加入的，每种引物浓度均为5uM)，1微升dNTP混合物，1微升反转录酶，1微升RNA酶抑制剂；
启动下述的PCR仪程序：55度15min；85度5s，10度hold。
反转录引物为表2所示。
表2
| *引物序列(5'--3') | *引物名称 | 对应基因 |
| AGTACTTGCGCTCAGGAGG | ACTBR | ACTB(对照) |
| CCTTCCCCATGGTGTCTGAG | GAPDHR | GAPDH(对照) |
| GTCTGCTCCCACAATGAAACA | RPLP0R | RPLP0(对照) |
| GCTCAGCTTGTACTCAGGGC | EA20R1 | ALK |
| GTTGGGGTTGTAGTCGGTCAT | EA20R2 | ALK |
| TCTTCAGCTTTCTCCCACTG | ROS32R | ROS |
| CCAGACAAAGGTCAGTGGGAT | ROS34R | ROS |
| GCCAACTCTTTGTCTTCGTTT | ROS35R | ROS |
| CACTTCTCCAAAGGCTCCAC | ROS36R | ROS |
| CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG | RET12R | RET |
| CAGAGGATACTGCACTTGTCG | metE14R-1 | MET |
| GCTGCCCATCCACAGAGAAGG | NTRK1R1 | NTRK1 |
| CCGAGACCCCAAAAGGTGTT | NTRK1R2 | NTRK1 |
| CACAAGGAGCAGCGTAGAAAGGA | NTRK1R3 | NTRK1 |
| GGAGTGTTACTCCCATTGGAGATG | NTRK2R1 | NTRK2 |
| CCGGTTTTATCAGTGACGTCTG | NTRK2R2 | NTRK2 |
| CCGTGGTTGATGTGGTGCAG | NTRK3R1 | NTRK3 |
| CCAAAGGCTCCCTCACCCAG | NTRK3R2 | NTRK3 |
3.第一轮多重PCR
混匀下述的样品：5微升样本DNA(包括RNA反转录后的cDNA及基因组DNA)，24.5ulNGS-15mix，0.5ul ACE TAQ酶。
95℃，10min，然后20(如果是血液样本，则为35)个循环(95℃ for 30s,55℃ for30s,72℃ for 30s)，然后72℃，5min。
在NGS-15mix中，有3对引物(E18F/R、ERBB2MF/R、PIKE21F/R)浓度1.5uM其余引物的浓度均为1uM。
第一轮多重PCR引物如下列表中所示，下划线部分为接头序列。
表3
| ＊引物序列(5'--3') | *引物名称 | 对应基因 |
| <u>ACGACGCTCTTCCGATCT</u>GCCTGCTGAAAATGACTGAA | K2F | KRAS |
| <u>CGTGTGCTCTTCCGATCT</u>CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATC | K2R | KRAS |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCCAGACTGTGTTTCTCCCTTC | K3F | KRAS |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCATGTACTGGTCCCTCATTGC | K3R | KRAS |
| ACGACGCTCTTCCGATCTGGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC | K4F | KRAS |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTTTTCAGTGTTACTTACCTGTCTTGTC | K4R | KRAS |
| ACGACGCTCTTCCGATCTGGTTTCCAACAGGTTCTTGC | N2F | NRAS |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTTTCATCTACAAAGTGGTTCTGGA | N2R | NRAS |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCACACCCCCAGGATTCTTAC | N3F | NRAS |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTTCGCCTGTCCTCATGTATTG | N3R | NRAS |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCCCGTTTTTAGGGAGCAGAT | N4F | NRAS |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCTTGCACAAATGCTGAAAGC | N4R | NRAS |
| ACGACGCTCTTCCGATCTTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCA | B15F | BRAF |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCCACAAAATGGATCCAGACA | B15R | BRAF |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCT | E18F | EGFR |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTGTGCCAGGGACCTTACCTTATACAC | E18R | EGFR |
| ACGACGCTCTTCCGATCTGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC | E19F | EGFR |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCC | E19R | EGFR |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCCTCCAGGAAGCCTACGTGATG | E20F | EGFR |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAG | E20R | EGFR |
| ACGACGCTCTTCCGATCTACACCGCAGCATGTCAAGATCAC | E21F | EGFR |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT | E21R | EGFR |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCCTCTCAGCGTACCCTTGTC | ERBB2MF | ERBB2 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTTCCCGGACATGGTCTAAGAG | ERBB2MR | ERBB2 |
表4
表5
表6
表7
| ACGACGCTCTTCCGATCTAGCCGGAGGTCATACTGCATC | ETV6-2F | ETV6 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGCCCATCCACAGAGAAGG | NTRK1R1 | NTRK1 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCCGAGACCCCAAAAGGTGTT | NTRK1R2 | NTRK1 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCACAAGGAGCAGCGTAGAAAGGA | NTRK1R3 | NTRK1 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTGGAGTGTTACTCCCATTGGAGATG | NTRK2R1 | NTRK2 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCCGGTTTTATCAGTGACGTCTG | NTRK2R2 | NTRK2 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTGGTTGATGTGGTGCAG | NTRK3R1 | NTRK3 |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCCAAAGGCTCCCTCACCCAG | NTRK3R2 | NTRK3 |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCCATGTACCCTGGCATTGC | NGS-ACTBF | ACTB(内参) |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTAGTACTTGCGCTCAGGAGG | NGS-ACTBR | ACTB(内参) |
| ACGACGCTCTTCCGATCTCTCTCTGCTCCTCCTGTTCG | NGS-GAPDHF | GAPDH(内参) |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTCCCCATGGTGTCTGAG | NGS-GAPDHR | GAPDH(内参) |
| ACGACGCTCTTCCGATCTTGATGCCCAGGGAAGACAG | NGS-RPLP0F | RPLP0(内参) |
| CGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTGCTCCCACAATGAAACA | NGS-RPLP0R | RPLP0(内参) |
4.第二轮多重PCR
用去离子水将第一轮PCR产物作为模板溶解进行第二轮多重PCR.
混匀下述的样品：5微升第一轮PCR产物，24.5ul mix，0.5ul ACE TAQ酶，引物0.5ul(每种引物浓度均为5uM)。
95℃ for 10min，然后20个循环(如果是血液样本，则为35)(95℃ for 30s,55℃for 30s,72℃ for 30s)，然后5min at 72℃。
第二轮多重PCR引物如表8中所示
表8
其中IIIIIII代表每个样本编号的index。
5.多重PCR建库后电泳图示如图1所示：
由设定的PCR引物位置可知，电泳条带大小在200-250bp之间。
6.建库后的纯化：
1)将磁珠提前半小时拿出平衡到室温。
2)吸取70ul无RNA酶水与30ul扩增产物中。
3)吸取80ul磁珠(bead2)于100ul上述扩增产物中，涡旋震荡混匀。
4)室温孵育5min(此时配80％乙醇)，短暂离心，放置于磁力架上。
5)待溶液澄清后，吸取165ul上清于新的PCR单管中，加入25ul磁珠，涡旋震荡混匀，室温孵育5min。
6)将PCR单管短暂离心并置于磁力架上，待溶液澄清后(约3min)，小心吸弃上清。
7)在上述PCR管中加入200ul新配80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，待溶液澄清后吸弃上清。
8)重复上述步骤一次(总共漂洗两次)。
9)将PCR单管始终置于磁力架中，干燥磁珠5-10min中至无乙醇残留(在干燥3min后吸弃PCR管底部残留液体)。
10)将PCR单管从磁力架上取出，加入30ul无RNA酶水，弹匀，室温放置5min，PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后吸取28ul上清液于1.5mlEP管中。
7.qubit定量后上机测序：
取597ul的qubit dsDNA HS buffer于1mlEP管中，在其中加入3ul的qubit dsDNAHS Reagent*200X，震荡混匀；取3个0.5mlEP管，在其中2个0.5ml EP管中加入190ul的上述混合液，在各分别加入10ul的qubit dsDNA HS StandardⅠ和qubit dsDNA HS StandardⅡ，在最后一个0.5ml EP管中加入198ul的混合液，在对应加入2ul纯化后的样本，写上对应样本编号，震荡混匀，静置2min，在qubit上测样本浓度。最低上机浓度为0.5ng/ul。
合格的DNA库与Illumina测序flow cell上的互补接头进行杂交。DNA库在Illumina Nextseq 500/550测序平台上进行高通量测序。测序数据分析使用Illumina分析流程。使用Illumina basecalling软件进行原始图像数据处理。部分测序结果如图2～图6所示；其相应的qPCR验证结果依次如图7～图11所示。其余位点也均经过测序和qPCR验证，对于组织样本，测序深度均能达1000X以上，对于血液样本，测序深度均能达10000X以上，且测序结果与qPCR验证结果一致率为100％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 嘉兴允英医学检验有限公司
<120> 基于多重PCR的引物组和试剂盒
<160> 122
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
gcctgctgaa aatgactgaa 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
caagatttac ctctattgtt ggatc 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ccagactgtg tttctccctt c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
catgtactgg tccctcattg c 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
ggactctgaa gatgtaccta tggtc 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
tttcagtgtt acttacctgt cttgtc 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
ggtttccaac aggttcttgc 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
ttcatctaca aagtggttct gga 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
cacaccccca ggattcttac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
tcgcctgtcc tcatgtattg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
cccgttttta gggagcagat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
cttgcacaaa tgctgaaagc 20
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 13
tgttttcctt tacttactac acctca 26
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 14
ccacaaaatg gatccagaca 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
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ctgaattcaa aaagatcaaa gtgct 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 16
gtgccaggga ccttacctta tacac 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 17
gaaagttaaa attcccgtcg ctatc 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 18
gcagaaactc acatcgagga tttcc 25
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 19
cctccaggaa gcctacgtga tg 22
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 20
gtgttcccgg acatagtcca ggag 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 21
acaccgcagc atgtcaagat cac 23
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 22
ttgcctcctt ctgcatggta ttct 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 23
cctctcagcg tacccttgtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 24
tcccggacat ggtctaagag 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 25
gacaaagaac agctcaaagc a 21
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 26
aaagaaaaag aaacagagaa tctcca 26
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 27
ctgagcaaga ggctttggag 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 28
ttttcagttc aatgcatgct g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 29
agccagggct tttgttttct 20
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<211> 20
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gaagtcttgc ccacatcgtt 20
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<211> 20
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ccccacagaa acccatgtat 20
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<211> 20
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gcccctgttt catactgacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 33
ccatttgaca gaacgggaag 20
<210> 34
<211> 20
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<213> artificial sequence
<400> 34
acggctttac ctccaatggt 20
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
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ggttttcttt tctcctccaa cc 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 36
tgcaggactg tcaagcagag 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
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aaattcgctg gagggtcatt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
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aaagggagtc ttgggaggtt 20
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ggccagatcc agtgaaaaac 20
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<211> 22
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<400> 40
ccacatgtgt ccagtgaaaa tc 22
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 41
agtgtgtcca ccgtgatctg 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 42
gaccagtgag ggaagtgagg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 43
cctccaggaa gcctacgtga tg 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 44
tgaggcagat gcccagcag 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 45
cctccaccgt gcagctcatc 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 46
gttcccggac atagtccagg ag 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
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tggaggaggg aaagacagaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 48
attccaaatg gctgcaaact 20
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 49
tctgaagatc atgtggcctc ag 22
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 50
actgtagagc ccacacctgg 20
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 51
aatgtctaac tcgggagact atga 24
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 52
acctgtgtgc taggatttca agt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 53
ctgcagacaa gcataaagat gtc 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 54
ttagtaggca catcacgaaa ctt 23
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 55
ggccatagga acgcactcag 20
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 56
acgggaatga acagctctct g 21
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 57
agtgaagaac tagtccagct tcg 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 58
tgagcaggca ctccttggag 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 59
ggctgcagga ctatgaggag 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 60
agctgtctgg ctctggagat 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 61
ttgagagaac ggaggtcctg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 62
tcttagtagc gccttccagc 20
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 63
aaggctcctg agacctttga t 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 64
tcacatcttc aggtgctgga t 21
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
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gccaagctgg aaaagacaat 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
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gcaaagacac aagtggggaa 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 67
ttggataagg aactggcagg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 68
ggtttttcct gtggctgaaa 20
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 69
agcaatttct tcaaccgtcc t 21
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 70
gctcagcttg tactcagggc 20
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 71
gttggggttg tagtcggtca t 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 72
ccagacaaag gtcagtggga t 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 73
tcttcagctt tctcccactg 20
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 74
gccaactctt tgtcttcgtt t 21
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 75
cacttctcca aaggctccac 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 76
gagcactgag gtcaatgtgg 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 77
ggcatgaacc gttctgagat 20
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 78
cagtgcatat tagtggacag cac 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 79
agctacagag acacaaccca ttg 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 80
aagacaattg atgacctgga ag 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 81
agatatgaag cctccaagct atg 23
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 82
tgtacacact gcagcccaag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
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gaagagggca ttctgcacag 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 84
gacatttcat ggggctccac 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 85
agcctcacca cgagctgcc 19
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 86
aagaagaaac cactggatgg ag 22
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 87
caggctggga aggagccag 19
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 88
actttgctgc cacctgtgtg 20
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 89
attggggcat aattgatccc cca 23
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 90
tggagggcga gctgcatgat ct 22
<210> 91
<211> 19
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<213> artificial sequence
<400> 91
cctgccgaca aggcatctg 19
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 92
gaggatggag atgacctgct cc 22
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 93
gagatcggta gccaagctgg 20
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 94
gtcagcgttt ggcttaacag atg 23
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<211> 25
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<213> artificial sequence
<400> 95
cagtagttgg aaatgtgtac agtcc 25
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<211> 23
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<213> artificial sequence
<400> 96
gtcagcgttt ggcttaacag atg 23
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<211> 23
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<213> artificial sequence
<400> 97
ggcaccagct acatcaatcc ttg 23
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 98
tggacagccg ggtcctgaac 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 99
agagcacgcc atgcccattg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
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agccggaggt catactgcat c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 101
gctgcccatc cacagagaag g 21
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 102
ccgagacccc aaaaggtgtt 20
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<211> 23
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<213> artificial sequence
<400> 103
cacaaggagc agcgtagaaa gga 23
<210> 104
<211> 24
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<213> artificial sequence
<400> 104
ggagtgttac tcccattgga gatg 24
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 105
ccggttttat cagtgacgtc tg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 106
ccgtggttga tgtggtgcag 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 107
ccaaaggctc cctcacccag 20
<210> 108
<211> 20
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<213> artificial sequence
<400> 108
gctcagcttg tactcagggc 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 109
gttggggttg tagtcggtca t 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 110
tcttcagctt tctcccactg 20
<210> 111
<211> 21
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<213> artificial sequence
<400> 111
ccagacaaag gtcagtggga t 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 112
gccaactctt tgtcttcgtt t 21
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 113
cacttctcca aaggctccac 20
<210> 114
<211> 22
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<213> artificial sequence
<400> 114
ccaaattcgc cttctcctag ag 22
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<211> 21
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<213> artificial sequence
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cagaggatac tgcacttgtc g 21
<210> 116
<211> 21
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<213> artificial sequence
<400> 116
gctgcccatc cacagagaag g 21
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 117
ccgagacccc aaaaggtgtt 20
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 118
cacaaggagc agcgtagaaa gga 23
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 119
ggagtgttac tcccattgga gatg 24
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 120
ccggttttat cagtgacgtc tg 22
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 121
ccgtggttga tgtggtgcag 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 122
ccaaaggctc cctcacccag 20
Claims (10)
1.引物组，其特征在于，其包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～107所示的引物。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的5’端与接头序列相连。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，还包括测序引物，所述测序引物包括与所述接头序列相同的区段或者其互补区段，以及与测序通道附有的DNA引物配对的序列，以及任选地index序列。
4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物。
5.根据权利要求1～4任一项所述的引物组，其特征在于，还包括针对内参基因的反转录引物和/或扩增引物。
6.试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～5任一项所述的引物组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有分子量marker、扩增反应液、dNTP、水、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶中的至少一种。
8.权利要求1～5任一项所述的引物组在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃肠道间质瘤中的一种或多种。
10.检测基因突变的非诊断目的方法，其特征在于，包括：
获取待检测样本的DNA和总RNA；
使用SEQ ID NO：108～122所示的反转录引物对所述总RNA进行反转录以获得cDNA；
将所述cDNA与DNA混合，使用SEQ ID NO：1～107所示的引物对进行扩增，并对扩增产物进行测序。
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