CN109134639B - 一种与结节性硬化症2型相关的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种与结节性硬化症2型相关的核酸及其应用。本申请与结节性硬化症2型相关的核酸，为野生型TSC2基因的编码区发生c.977delC突变而成。本申请的核酸是结节性硬化症2型的一种新的致病核酸，该核酸或致病突变位点的发现，进一步拓展和完善了结节性硬化症2型的检测和研究，为该疾病的诊断或治疗提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径。

Description

一种与结节性硬化症2型相关的核酸及其应用

技术领域

本申请涉及基因领域，特别是涉及一种与结节性硬化症2型相关的核酸及其应用。

背景技术

结节性硬化症2型(Tuberous Sclerosis 2)是一种常染色体显性遗传的多系统疾病，其主要影响脑、肾、心脏和皮肤等器官。其主要特点为错构瘤和错构组织，其中错构瘤在器官中常见的以良性增生为主的细胞或组织类型，错构组织即组织缔结异常。主要临床表现为癫痫、学习困难、行为异常和皮肤损伤。

遗传性结节性硬化症人群发病率约为1/5800。虽然目前已发现一些遗传性结节性硬化症的致病基因，但仍存在着相当一部分未知致病基因位点。

因而，目前对遗传性结节性硬化症的研究仍有待深入。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的与结节性硬化症2型相关的核酸及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种与结节性硬化症2型相关的核酸，该核酸为野生型TSC2基因的编码区发生c.977delC突变而成。

具体的，本申请的核酸的序列为Seq ID No.1所示序列。

需要说明的是，本申请在大量的研究和实践过程中发现了一种新的与结节性硬化症2型相关的核酸，该核酸是野生型TSC2基因的编码区发生c.977delC突变而成，即野生型TSC2基因的编码区中第977位的C碱基发生缺失突变。突变后的核酸，由于第977位C碱基缺失，使得蛋白翻译发生移码变异，使第327位甲硫氨酸变为色氨酸，并且在经过35个氨基酸后变为终止密码子；移码变异使氨基酸链变短，影响蛋白功能，进而导致结节性硬化症2型疾病。

本申请的另一面公开了一种与结节性硬化症2型相关的多肽，该多肽为野生型TSC2多肽第327位甲硫氨酸突变为色氨酸，并且从363-1808号氨基酸缺失而得到的多肽。

具体的，本申请的多肽为Seq ID No.2所示序列。

需要说明的是，本申请的多肽，实际上就是本申请的核酸编码的多肽，因此，该多肽的出现或存在是直接与结节性硬化症2型相关的。

本申请的另一方面公开了本申请的核酸或本申请的多肽在制备结节性硬化症2型检测试剂、试剂盒或设备中的应用。

可以理解，本申请的核酸作为一个新发现的结节性硬化症2型相关的致病核酸，本领域技术人员可以按照现有的核酸检测方法和技术，针对本申请的核酸序列设计检测试剂，形成试剂盒或专用检测设备，例如针对本申请的核酸序列按照常规方法设计相应的检测引物、荧光探针、基因杂交探针、锁式探针等，对结节性硬化症2型进行检测。同样的，本申请的多肽也是一种全新的物质，并且该多肽的存在与结节性硬化症2型直接相关，因此，本领域技术人员可以按照现有的蛋白质或多肽检测方法，针对本申请的多肽设计检测试剂，形成试剂盒或专用检测设备。

本申请的另一方面公开了一种含有本申请的核酸的重组载体。

本申请的另一方面公开了一种含有本申请的重组载体的重组细胞。

可以理解，为了研究方便，完全可以将本申请的核酸插入到载体中，制成重组载体，以方便后续的研究或检测。具体的载体类型，可以根据研究目的不同而选择，例如，作为结节性硬化症2型检测的阳性对照时，载体可以选择常规的pMD18-T或pMD19-T等；至于重组载体的制备方法可以参考现有技术。同样的，重组细胞也是为了方便后续的研究或检测，将插入有本申请的核酸的重组载体导入而成，具体宿主细胞类型可以根据研究目的不同而选择，此不做限定。

本申请的再一方面公开了一种检测结节性硬化症2型的试剂盒，该试剂盒中包括检测本申请的核酸的试剂，和/或检测本申请的多肽的试剂。

优选的，试剂盒中还包括本申请的重组载体。

优选的，试剂盒中还包括本申请的重组细胞。

优选的，本申请的试剂盒中，检测本申请的核酸的试剂包括一对扩增引物，该扩增引物的正向引物为Seq ID No.3所示序列，反向引物为Seq ID No.4所示序列，

Seq ID No.3：5’-ATCCTCTGCTCTTCCTGCTACC-3’

Seq ID No.4：5’-GCTCACCTACTGCATATTCCTGTC-3’。

需要说明的是，Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.4所示序列的引物，是针对TSC2基因的编码区c.977delC突变，这个靶标位点设计的，即引物的扩增片段中包含c.977delC突变；在本申请的一种实现方式中，采用Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.4所示序列的引物对提取的DNA进行扩增后，通过对扩增产物进行测序分析，确定是否存在c.977delC突变，因此，可以将Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.4所示序列的引物单独的作为检测结节性硬化症2型的试剂盒。

可以理解，检测本申请的核酸序列的试剂并不只限于Seq ID No.3所示序列和SeqID No.4所示序列的引物，针对本申请的c.977delC突变，还可以设计出更多的扩增引物，此处的扩增引物特指扩增片段包含c.977delC突变的引物，通过这些扩增引物对DNA进行扩增后，分析扩增片段中是否含有本申请的突变，由此确认是否存在本申请的核酸序列。此外，也可以根据c.977delC突变设计特异性引物或特异性探针，特异性探针例如实时荧光探针、基因杂交探针、锁式探针等；而对于c.977delC突变的确认方法也不仅限于测序，还可以通过特异性引物或特异性探针对c.977delC突变进行确认；当然，测序是最直接、有效且准确的方法。

本申请的有益效果在于：

本申请的核酸是结节性硬化症2型的一种新的相关的致病核酸，该核酸或致病突变位点的发现，进一步拓展和完善了结节性硬化症2型的检测和研究，为该疾病的诊断或治疗提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径。

附图说明

图1是本申请实施例中结节性硬化症2型患者的家系图；

图2是本申请实施例中结节性硬化症2型患者及其父母的TSC2基因测序结果中，位于c.977delC位点附近的Sanger测序峰图。

具体实施方式

目前虽然已经有一些遗传性结节性硬化症2型的相关致病基因研究和报道，但是，其致病基因或者基因位点突变仍然存在相当一部分的未知；因此，本申请在对结节性硬化症2型进行深入研究的基础上，发现了一种新的突变的基因，即野生型TSC2基因的编码区发生c.977delC突变产生的核酸，该基因突变在人群中发生率极低，目前暂无文献报道。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一

本例采集了一个遗传性结节性硬化症2型患者的DNA样本，并对其家系图进行了分析。对结节性硬化症2型患者的DNA进行测序和分析，得到一种新突变的基因，即野生型TSC2基因的编码区发生c.977delC突变产生的基因。详细如下：

一、样本收集

本例收集到一个遗传性结节性硬化症2型患者，其家系图如图1所示，图中，□表示正常男性即患者的父亲，○表示正常女性即患者的母亲，●表示女性患者及本例收集的患者。

二、全外显子组测序

本例用定制的NimbleGen SeqCap EZ Exome(10M)结合Illumina Hiseq 2500高通量测序技术对图1中结节性硬化症2型患者的外显子组序列进行测序。具体如下：

1.DNA提取

采集图1所示的结节性硬化症2型患者的外周血，利用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒，从其外周血样品中提取患者的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，本例所得基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度大于200ng/微升，总量大于30微克。

2.外显子捕获与测序

利用超声波仪CovarisS2,Massachusetts,USA，将各基因组DNA样本随机打断成200-300bp左右的片段。随后按照Illumina/Solexa标准建库说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库，其中Illumina/Solexa标准建库说明书可以在网站上获得：http://www.illumina.com。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(缩写LM-PCR)的线性扩增与Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后上机测序，获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序，测序平台为Illumina Hiseq 2500，读取长度为90bp，样本的平均测序深度为50×。

3.变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software 1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2比对到UCSC人类参考基因组，获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp确定靶区域的基因型。

其中，SOAPaligner/SOAP2比对参考Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；LiR,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967。

本例的人类参考基因组为hg19,build37.1，网址为http://genome.ucsc.edu/。

SOAPsnp参考Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massivelyparallel whole-genome resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132。

得到最终的测序结果之后，对非同义突变、剪接受体/供体位点突变、编码区插入和缺失突变这三类最有可能与病理相关的突变进行研究。随后通过四个公共数据库：dbSNP数据库、HapMap数据库、千人基因组数据库和炎黄数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

dbSNP数据库的网址为：

http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.

HapMap数据库网址为：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap

千人基因组数据库网址为：ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp

炎黄数据库网址为：http://yh.genomics.org.cn/

由此，得到患者在TSC2基因编码区存在突变c.977delC(即p.M327Wfs*36)，为杂合子。进一步，通过对患者家系进行疾病共分离和正常人SNP筛查，确认患者TSC2基因编码区上的c.977delC突变是其遗传性结节硬化症2型的致病位点，即确认出一种结节性硬化症2型相关的新的基因突变位点，根据测序结果，该突变基因的核酸序列为Seq ID No.1所示序列，其第977位C碱基缺失，使得蛋白翻译发生移码变异，使第327位甲硫氨酸变为色氨酸，并且在经过35个氨基酸后变为终止密码子，使得野生型多肽的第363至1808位氨基酸缺失，野生型多肽的总长度即1808个氨基酸；也就是说，移码变异使Seq ID No.1所示序列的基因翻译得到了一条新的氨基酸缺失的多肽，该多肽即Seq ID No.2所示序列。

Seq ID No.1：

5’-atggccaaaccaacaagcaaagattcaggcttgaaggagaagtttaagattctgttgggactgggaacaccgaggccaaatcccaggtctgcagagggtaaacagacggagtttatcatcaccgcggaaatactgagagaactgagcatggaatgtggcctcaacaatcgcatccggatgatagggcagatttgtgaagtcgcaaaaaccaagaaatttgaagagcacgcagtggaagcactctggaaggcggtcgcggatctgttgcagccggagcggccgctggaggcccggcacgcggtgctggctctgctgaaggccatcgtgcaggggcagggcgagcgtttgggggtcctcagagccctcttctttaaggtcatcaaggattacccttccaacgaagaccttcacgaaaggctggaggttttcaaggccctcacagacaatgggagacacatcacctacttggaggaagagctggctgactttgtcctgcagtggatggatgttggcttgtcctcggaattccttctggtgctggtgaacttggtcaaattcaatagctgttacctcgacgagtacatcgcaaggatggttcagatgatctgtctgctgtgcgtccggaccgcgtcctctgtggacatagaggtctccctgcaggtgctggacgccgtggtctgctacaactgcctgccggctgagagcctcccgctgttcatcgttaccctctgtcgcaccatcaacgtcaaggagctctgcgagccttgctggaagctgatgcggaacctccttggcacccacctgggccacagcgccatctacaacatgtgccacctcatggaggacagagcctacatggaggacgcgcccctgctgagaggagccgtgttttttgtgggcatggctctctggggagcccaccggctctattctctcaggaactcgccgacatctgtgttgccatcattttaccagg-catggcatgtccgaacgaggtggtgtcctatgagatcgtcctgtccatcaccaggctcatcaagaagtataggaaggagctccaggtggtggcgtgggacattctgctgaacatcatcgaacggctccttcagcagctccagaccttggacagcccggagctcaggaccatcgtccatgacctgttgaccacggtggaggagctgtgtgaccagaacgagttccacgggtctcaggagagatactttgaactggtggagagatgtgcggaccagaggcctgagtcctccctcctgaacctgatctcctatagagcgcagtccatccacccggccaaggacggctggattcagaacctgcaggcgctgatggagagattcttcaggagcgagtcccgaggcgccgtgcgcatcaaggtgctggacgtgctgtcctttgtgctgctcatcaacaggcagttctatgaggaggagctgattaactcagtggtcatctcgcagctctcccacatccccgaggataaagaccaccaggtccgaaagctggccacccagttgctggtggacctggcagagggctgccacacacaccacttcaacagcctgctggacatcatcgagaaggtgatggcccgctccctctccccacccccggagctggaagaaagggatgtggccgcatactcggcctccttggaggatgtgaagacagccgtcctggggcttctggtcatccttcagaccaagctgtacaccctgcctgcaagccacgccacgcgtgtgtatgagatgctggtcagccacattcagctccactacaagcacagctacaccctgccaatcgcgagcagcatccggctgcaggcctttgacttcctgttgctgctgcgggccgactcactgcaccgcctgggcctgcccaacaaggatggagtcgtgcggttcagcccctactgcgtctgcgactacatggagccagagagaggctctgagaagaagaccagcggccccctttctcctcccacagggcctcctggcccggcgcctgcaggccccgccgtgcggctggggtccgtgccctactccctgctcttccgcgtcctgctgcagtgcttgaagcaggagtctgactggaaggtgctgaagctggttctgggcaggctgcctgagtccctgcgctataaagtgctcatctttacttccccttgcagtgtggaccagctgtgctctgctctctgctccatgctttcaggcccaaagacactggagcggctccgaggcgccccagaaggcttctccagaactgacttgcacctggccgtggttccagtgctgacagcattaatctcttaccataactacctggacaaaaccaaacagcgcgagatggtctactgcctggagcagggcctcatccaccgctgtgccagccagtgcgtcgtggccttgtccatctgcagcgtggagatgcctgacatcatcatcaaggcgctgcctgttctggtggtgaagctcacgcacatctcagccacagccagcatggccgtcccactgctggagttcctgtccactctggccaggctgccgcacctctacaggaactttgccgcggagcagtatgccagtgtgttcgccatctccctgccgtacaccaacccctccaagtttaatcagtacatcgtgtgtctggcccatcacgtcatagccatgtggttcatcaggtgccgcctgcccttccggaaggattttgtccctttcatcactaagggcctgcggtccaatgtcctcttgtcttttgatgacacccccgagaaggacagcttcagggcccggagtactagtctcaacgagagacccaagagtctgaggatagccagaccccccaaacaaggcttgaataactctccacccgtgaaagaattcaaggagagctctgcagccgaggccttccggtgccgcagcatcagtgtgtctgaacatgtggtccgcagcaggatacagacgtccctcaccagtgccagcttggggtctgcagatgagaactccgtggcccaggctgacgatagcctgaaaaacctccacctggagctcacggaaacctgtctggacatgatggctcgatacgtcttctccaacttcacggctgtcccgaagaggtctcctgtgggcgagttcctcctagcgggtggcaggaccaaaacctggctggttgggaacaagcttgtcactgtgacgacaagcgtgggaaccgggacccggtcgttactaggcctggactcgggggagctgcagtccggcccggagtcgagctccagccccggggtgcatgtgagacagaccaaggaggcgccggccaagctggagtcccaggctgggcagcaggtgtcccgtggggcccgggatcgggtccgttccatgtcggggggccatggtcttcgagttggcgccctggacgtgccggcctcccagttcctgggcagtgccacttctccaggaccacggactgcaccagccgcgaaacctgagaaggcctcagctggcacccgggttcctgtgcaggagaagacgaacctggcggcctatgtgcccctgctgacccagggctgggcggagatcctggtccggaggcccacagggaacaccagctggctgatgagcctggagaacccgctcagccctttctcctcggacatcaacaacatgcccctgcaggagctgtctaacgccctcatggcggctgagcgcttcaaggagcaccgggacacagccctgtacaagtcactgtcggtgccggcagccagcacggccaaaccccctcctctgcctcgctccaacacagtggcctctttctcctccctgtaccagtccagctgccaaggacagctgcacaggagcgtttcctgggcagactccgccgtggtcatggaggagggaagtccgggcgaggttcctgtgctggtggagcccccagggttggaggacgttgaggcagcgctaggcatggacaggcgcacggatgcctacagcaggtcgtcctcagtctccagccaggaggagaagtcgctccacgcggaggagctggttggcaggggcatccccatcgagcgagtcgtctcctcggagggtggccggccctctgtggacctctccttccagccctcgcagcccctgagcaagtccagctcctctcccgagctgcagactctgcaggacatcctcggggaccctggggacaaggccgacgtgggccggctgagccctgaggttaaggcccggtcacagtcagggaccctggacggggaaagtgctgcctggtcggcctcgggcgaagacagtcggggccagcccgagggtcccttgccttccagctccccccgctcgcccagtggcctccggccccgaggttacaccatctccgactcggccccatcacgcaggggcaagagagtagagagggacgccttaaagagcagagccacagcctccaatgcagagaaagtgccaggcatcaaccccagtttcgtgttcctgcagctctaccattcccccttctttggcgacgagtcaaacaagccaatcctgctgcccaatgagtcacagtcctttgagcggtcggtgcagctcctcgaccagatcccatcatacgacacccacaagatcgccgtcctgtatgttggagaaggccagagcaacagcgagctcgccatcctgtccaatgagcatggctcctacaggtacacggagttcctgacgggcctgggccggctcatcgagctgaaggactgccagccggacaaggtgtacctgggaggcctggacgtgtgtggtgaggacggccagttcacctactgctggcacgatgacatcatgcaagccgtcttccacatcgccaccctgatgcccaccaaggacgtggacaagcaccgctgcgacaagaagcgccacctgggcaacgactttgtgtccattgtctacaatgactccggtgaggacttcaagcttggcaccatcaagggccagttcaactttgtccacgtgatcgtcaccccgctggactacgagtgcaacctggtgtccctgcagtgcaggaaagacatggagggccttgtggacaccagcgtggccaagatcgtgtctgaccgcaacctgcccttcgtggcccgccagatggccctgcacgcaaatatggcctcacaggtgcatcatagccgctccaaccccaccgatatctacccctccaagtggattgcccggctccgccacatcaagcggctccgccagcggatctgcgaggaagccgcctactccaaccccagcctacctctggtgcaccctccgtcccatagcaaagcccctgcacagactccagccgagcccacacctggctatgaggtgggccagcggaagcgcctcatctcctcggtggaggacttcaccgagtttgtgtga-3’。

Seq ID No.1所示序列中“-”即第977位缺失处。

Seq ID No.2：

MAKPTSKDSGLKEKFKILLGLGTPRPNPRSAEGKQTEFIITAEILRELSMECGLNNRIRMIGQICEVAKTKKFEEHAVEALWKAVADLLQPERPLEARHAVLALLKAIVQGQGERLGVLRALFFKVIKDYPSNEDLHERLEVFKALTDNGRHITYLEEELADFVLQWMDVGLSSEFLLVLVNLVKFNSCYLDEYIARMVQMICLLCVRTASSVDIEVSLQVLDAVVCYNCLPAESLPLFIVTLCRTINVKELCEPCWKLMRNLLGTHLGHSAIYNMCHLMEDRAYMEDAPLLRGAVFFVGMALWGAHRLYSLRNSPTSVLPSFYQAWHVRTRWCPMRSSCPSPGSSRSIGRSSRWWRGTFC。

实施例二

本例采用Sanger法测序验证所获得的基因突变，分别对实施例一的结节硬化症2型患者及其父母的TSC2基因进行检测：具体的，针对TSC2基因的c.977delC突变序列设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序，获得TSC2有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证TSC2基因的c.977delC突变与遗传性结节硬化症2型之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1.DNA提取

按照实施例一的提取DNA的方法，分别提取患者及其父母的外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2.引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计TSC2基因外显子特异性引物，引物如下所示：

正向引物：

Seq ID No.3：5’-ATCCTCTGCTCTTCCTGCTACC-3’

反向引物：

Seq ID No.4：5’-GCTCACCTACTGCATATTCCTGTC-3’

本例设计的引物包含了靶标检测位点c.977delC，扩增片段为760bp。

采用以上引物分别对提取的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为25μL，包括：5U/μL的LA Taq酶0.25μL、含Mg²⁺的2×GC BufferⅠ2.5μL、2mM dNTPs 2.5μL、100ng/μL的正向引物2μL、100ng/μL反向引物1μL、基因组DNA 1μL、补充dH₂O至25μL。

PCR扩增反应条件为：94℃变性5min；然后进入10个循环：94℃变性30s、65℃退火10s、72℃延伸60s，每个循环后退火温度降0.5℃；再进入35个循环：94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸60s；循环结束后，72℃延伸10min，4℃待机。

3.Sanger测序

对结节硬化症2型患者及其父母的PCR扩增产物进行Sanger测序。根据Sanger测序结果，对其进行TSC2基因编码序列比对；TSC2基因测序结果中，位于c.977delC位点附近的测序和比对结果如图2所示，图中第一行的Sanger测序峰图为患者的测序峰图，第二行为患者父亲的Sanger测序峰图，第三行为患者母亲的Sanger测序峰图。结果表明，遗传性结节硬化症2型患者父亲与母亲在TSC2基因上均未检出c.977delC变异，可见患者在TSC2基因上的c.977delC杂合变异属于新发突变，即本申请的基因突变位点为结节性硬化症2型的新突变位点。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北华大基因研究院

武汉华大医学检验所有限公司

<120> 一种与结节性硬化症 2 型相关的核酸及其应用

<130> 17I24427

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5423

<212> DNA

<213> TSC2突变致病基因

<400> 1

atggccaaac caacaagcaa agattcaggc ttgaaggaga agtttaagat tctgttggga 60

ctgggaacac cgaggccaaa tcccaggtct gcagagggta aacagacgga gtttatcatc 120

accgcggaaa tactgagaga actgagcatg gaatgtggcc tcaacaatcg catccggatg 180

atagggcaga tttgtgaagt cgcaaaaacc aagaaatttg aagagcacgc agtggaagca 240

ctctggaagg cggtcgcgga tctgttgcag ccggagcggc cgctggaggc ccggcacgcg 300

gtgctggctc tgctgaaggc catcgtgcag gggcagggcg agcgtttggg ggtcctcaga 360

gccctcttct ttaaggtcat caaggattac ccttccaacg aagaccttca cgaaaggctg 420

gaggttttca aggccctcac agacaatggg agacacatca cctacttgga ggaagagctg 480

gctgactttg tcctgcagtg gatggatgtt ggcttgtcct cggaattcct tctggtgctg 540

gtgaacttgg tcaaattcaa tagctgttac ctcgacgagt acatcgcaag gatggttcag 600

atgatctgtc tgctgtgcgt ccggaccgcg tcctctgtgg acatagaggt ctccctgcag 660

gtgctggacg ccgtggtctg ctacaactgc ctgccggctg agagcctccc gctgttcatc 720

gttaccctct gtcgcaccat caacgtcaag gagctctgcg agccttgctg gaagctgatg 780

cggaacctcc ttggcaccca cctgggccac agcgccatct acaacatgtg ccacctcatg 840

gaggacagag cctacatgga ggacgcgccc ctgctgagag gagccgtgtt ttttgtgggc 900

atggctctct ggggagccca ccggctctat tctctcagga actcgccgac atctgtgttg 960

ccatcatttt accaggcatg gcatgtccga acgaggtggt gtcctatgag atcgtcctgt 1020

ccatcaccag gctcatcaag aagtatagga aggagctcca ggtggtggcg tgggacattc 1080

tgctgaacat catcgaacgg ctccttcagc agctccagac cttggacagc ccggagctca 1140

ggaccatcgt ccatgacctg ttgaccacgg tggaggagct gtgtgaccag aacgagttcc 1200

acgggtctca ggagagatac tttgaactgg tggagagatg tgcggaccag aggcctgagt 1260

cctccctcct gaacctgatc tcctatagag cgcagtccat ccacccggcc aaggacggct 1320

ggattcagaa cctgcaggcg ctgatggaga gattcttcag gagcgagtcc cgaggcgccg 1380

tgcgcatcaa ggtgctggac gtgctgtcct ttgtgctgct catcaacagg cagttctatg 1440

aggaggagct gattaactca gtggtcatct cgcagctctc ccacatcccc gaggataaag 1500

accaccaggt ccgaaagctg gccacccagt tgctggtgga cctggcagag ggctgccaca 1560

cacaccactt caacagcctg ctggacatca tcgagaaggt gatggcccgc tccctctccc 1620

cacccccgga gctggaagaa agggatgtgg ccgcatactc ggcctccttg gaggatgtga 1680

agacagccgt cctggggctt ctggtcatcc ttcagaccaa gctgtacacc ctgcctgcaa 1740

gccacgccac gcgtgtgtat gagatgctgg tcagccacat tcagctccac tacaagcaca 1800

gctacaccct gccaatcgcg agcagcatcc ggctgcaggc ctttgacttc ctgttgctgc 1860

tgcgggccga ctcactgcac cgcctgggcc tgcccaacaa ggatggagtc gtgcggttca 1920

gcccctactg cgtctgcgac tacatggagc cagagagagg ctctgagaag aagaccagcg 1980

gccccctttc tcctcccaca gggcctcctg gcccggcgcc tgcaggcccc gccgtgcggc 2040

tggggtccgt gccctactcc ctgctcttcc gcgtcctgct gcagtgcttg aagcaggagt 2100

ctgactggaa ggtgctgaag ctggttctgg gcaggctgcc tgagtccctg cgctataaag 2160

tgctcatctt tacttcccct tgcagtgtgg accagctgtg ctctgctctc tgctccatgc 2220

tttcaggccc aaagacactg gagcggctcc gaggcgcccc agaaggcttc tccagaactg 2280

acttgcacct ggccgtggtt ccagtgctga cagcattaat ctcttaccat aactacctgg 2340

acaaaaccaa acagcgcgag atggtctact gcctggagca gggcctcatc caccgctgtg 2400

ccagccagtg cgtcgtggcc ttgtccatct gcagcgtgga gatgcctgac atcatcatca 2460

aggcgctgcc tgttctggtg gtgaagctca cgcacatctc agccacagcc agcatggccg 2520

tcccactgct ggagttcctg tccactctgg ccaggctgcc gcacctctac aggaactttg 2580

ccgcggagca gtatgccagt gtgttcgcca tctccctgcc gtacaccaac ccctccaagt 2640

ttaatcagta catcgtgtgt ctggcccatc acgtcatagc catgtggttc atcaggtgcc 2700

gcctgccctt ccggaaggat tttgtccctt tcatcactaa gggcctgcgg tccaatgtcc 2760

tcttgtcttt tgatgacacc cccgagaagg acagcttcag ggcccggagt actagtctca 2820

acgagagacc caagagtctg aggatagcca gaccccccaa acaaggcttg aataactctc 2880

cacccgtgaa agaattcaag gagagctctg cagccgaggc cttccggtgc cgcagcatca 2940

gtgtgtctga acatgtggtc cgcagcagga tacagacgtc cctcaccagt gccagcttgg 3000

ggtctgcaga tgagaactcc gtggcccagg ctgacgatag cctgaaaaac ctccacctgg 3060

agctcacgga aacctgtctg gacatgatgg ctcgatacgt cttctccaac ttcacggctg 3120

tcccgaagag gtctcctgtg ggcgagttcc tcctagcggg tggcaggacc aaaacctggc 3180

tggttgggaa caagcttgtc actgtgacga caagcgtggg aaccgggacc cggtcgttac 3240

taggcctgga ctcgggggag ctgcagtccg gcccggagtc gagctccagc cccggggtgc 3300

atgtgagaca gaccaaggag gcgccggcca agctggagtc ccaggctggg cagcaggtgt 3360

cccgtggggc ccgggatcgg gtccgttcca tgtcgggggg ccatggtctt cgagttggcg 3420

ccctggacgt gccggcctcc cagttcctgg gcagtgccac ttctccagga ccacggactg 3480

caccagccgc gaaacctgag aaggcctcag ctggcacccg ggttcctgtg caggagaaga 3540

cgaacctggc ggcctatgtg cccctgctga cccagggctg ggcggagatc ctggtccgga 3600

ggcccacagg gaacaccagc tggctgatga gcctggagaa cccgctcagc cctttctcct 3660

cggacatcaa caacatgccc ctgcaggagc tgtctaacgc cctcatggcg gctgagcgct 3720

tcaaggagca ccgggacaca gccctgtaca agtcactgtc ggtgccggca gccagcacgg 3780

ccaaaccccc tcctctgcct cgctccaaca cagtggcctc tttctcctcc ctgtaccagt 3840

ccagctgcca aggacagctg cacaggagcg tttcctgggc agactccgcc gtggtcatgg 3900

aggagggaag tccgggcgag gttcctgtgc tggtggagcc cccagggttg gaggacgttg 3960

aggcagcgct aggcatggac aggcgcacgg atgcctacag caggtcgtcc tcagtctcca 4020

gccaggagga gaagtcgctc cacgcggagg agctggttgg caggggcatc cccatcgagc 4080

gagtcgtctc ctcggagggt ggccggccct ctgtggacct ctccttccag ccctcgcagc 4140

ccctgagcaa gtccagctcc tctcccgagc tgcagactct gcaggacatc ctcggggacc 4200

ctggggacaa ggccgacgtg ggccggctga gccctgaggt taaggcccgg tcacagtcag 4260

ggaccctgga cggggaaagt gctgcctggt cggcctcggg cgaagacagt cggggccagc 4320

ccgagggtcc cttgccttcc agctcccccc gctcgcccag tggcctccgg ccccgaggtt 4380

acaccatctc cgactcggcc ccatcacgca ggggcaagag agtagagagg gacgccttaa 4440

agagcagagc cacagcctcc aatgcagaga aagtgccagg catcaacccc agtttcgtgt 4500

tcctgcagct ctaccattcc cccttctttg gcgacgagtc aaacaagcca atcctgctgc 4560

ccaatgagtc acagtccttt gagcggtcgg tgcagctcct cgaccagatc ccatcatacg 4620

acacccacaa gatcgccgtc ctgtatgttg gagaaggcca gagcaacagc gagctcgcca 4680

tcctgtccaa tgagcatggc tcctacaggt acacggagtt cctgacgggc ctgggccggc 4740

tcatcgagct gaaggactgc cagccggaca aggtgtacct gggaggcctg gacgtgtgtg 4800

gtgaggacgg ccagttcacc tactgctggc acgatgacat catgcaagcc gtcttccaca 4860

tcgccaccct gatgcccacc aaggacgtgg acaagcaccg ctgcgacaag aagcgccacc 4920

tgggcaacga ctttgtgtcc attgtctaca atgactccgg tgaggacttc aagcttggca 4980

ccatcaaggg ccagttcaac tttgtccacg tgatcgtcac cccgctggac tacgagtgca 5040

acctggtgtc cctgcagtgc aggaaagaca tggagggcct tgtggacacc agcgtggcca 5100

agatcgtgtc tgaccgcaac ctgcccttcg tggcccgcca gatggccctg cacgcaaata 5160

tggcctcaca ggtgcatcat agccgctcca accccaccga tatctacccc tccaagtgga 5220

ttgcccggct ccgccacatc aagcggctcc gccagcggat ctgcgaggaa gccgcctact 5280

ccaaccccag cctacctctg gtgcaccctc cgtcccatag caaagcccct gcacagactc 5340

cagccgagcc cacacctggc tatgaggtgg gccagcggaa gcgcctcatc tcctcggtgg 5400

aggacttcac cgagtttgtg tga 5423

<210> 2

<211> 361

<212> PRT

<213> TSC2突变致病基因编码多肽

<400> 2

Met Ala Lys Pro Thr Ser Lys Asp Ser Gly Leu Lys Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ile Leu Leu Gly Leu Gly Thr Pro Arg Pro Asn Pro Arg Ser Ala Glu

20 25 30

Gly Lys Gln Thr Glu Phe Ile Ile Thr Ala Glu Ile Leu Arg Glu Leu

35 40 45

Ser Met Glu Cys Gly Leu Asn Asn Arg Ile Arg Met Ile Gly Gln Ile

50 55 60

Cys Glu Val Ala Lys Thr Lys Lys Phe Glu Glu His Ala Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Trp Lys Ala Val Ala Asp Leu Leu Gln Pro Glu Arg Pro Leu Glu

85 90 95

Ala Arg His Ala Val Leu Ala Leu Leu Lys Ala Ile Val Gln Gly Gln

100 105 110

Gly Glu Arg Leu Gly Val Leu Arg Ala Leu Phe Phe Lys Val Ile Lys

115 120 125

Asp Tyr Pro Ser Asn Glu Asp Leu His Glu Arg Leu Glu Val Phe Lys

130 135 140

Ala Leu Thr Asp Asn Gly Arg His Ile Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu

145 150 155 160

Ala Asp Phe Val Leu Gln Trp Met Asp Val Gly Leu Ser Ser Glu Phe

165 170 175

Leu Leu Val Leu Val Asn Leu Val Lys Phe Asn Ser Cys Tyr Leu Asp

180 185 190

Glu Tyr Ile Ala Arg Met Val Gln Met Ile Cys Leu Leu Cys Val Arg

195 200 205

Thr Ala Ser Ser Val Asp Ile Glu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Ala

210 215 220

Val Val Cys Tyr Asn Cys Leu Pro Ala Glu Ser Leu Pro Leu Phe Ile

225 230 235 240

Val Thr Leu Cys Arg Thr Ile Asn Val Lys Glu Leu Cys Glu Pro Cys

245 250 255

Trp Lys Leu Met Arg Asn Leu Leu Gly Thr His Leu Gly His Ser Ala

260 265 270

Ile Tyr Asn Met Cys His Leu Met Glu Asp Arg Ala Tyr Met Glu Asp

275 280 285

Ala Pro Leu Leu Arg Gly Ala Val Phe Phe Val Gly Met Ala Leu Trp

290 295 300

Gly Ala His Arg Leu Tyr Ser Leu Arg Asn Ser Pro Thr Ser Val Leu

305 310 315 320

Pro Ser Phe Tyr Gln Ala Trp His Val Arg Thr Arg Trp Cys Pro Met

325 330 335

Arg Ser Ser Cys Pro Ser Pro Gly Ser Ser Arg Ser Ile Gly Arg Ser

340 345 350

Ser Arg Trp Trp Arg Gly Thr Phe Cys

355 360

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcctctgct cttcctgcta cc 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctcacctac tgcatattcc tgtc 24

Claims (6)

1.一种与结节性硬化症 2 型相关的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物为野生型TSC2基因的编码区发生c.977delC突变而成的核酸；所述核酸的序列为Seq ID No.1所示序列。

2.一种与结节性硬化症 2 型相关的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物为SeqID No.2所示序列的多肽。

3.根据权利要求1或2所述的分子标记物在制备结节性硬化症 2 型检测试剂、试剂盒或设备中的应用。

4.一种含有权利要求1所述的分子标记物的重组载体。

5.一种含有权利要求4所述的重组载体的重组细胞。

6.一种检测结节性硬化症 2 型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括检测权利要求1所述的分子标记物的试剂；

所述检测权利要求1所述的分子标记物的试剂为一对扩增引物，所述扩增引物的正向引物为Seq ID No.3所示序列，反向引物为Seq ID No.4所示序列，

Seq ID No.3：5’-ATCCTCTGCTCTTCCTGCTACC-3’

Seq ID No.4：5’-GCTCACCTACTGCATATTCCTGTC-3’，

所述试剂盒中还包括权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组细胞。

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