TW202214874A - 用於人類個體中基因分型sting變體之快速方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種測定個體中「干擾素基因刺激因子」(Stimulator of Interferon Genes；STING)基因之遺傳多型性模式的方法。該方法包含擴增獲自個體的樣品中STING基因內包含單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism；SNP)的基因體DNA序列。該方法亦包含對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism；RFLP)模式分析，以測定樣品中STING基因的遺傳多型性模式。本發明亦提供用於辨別及偵測人類所表現之STING基因SNP (亦即，STING基因分型)及STING蛋白質變體的套組。

Description

用於人類個體中基因分型STING變體之快速方法
本發明係關於「干擾素基因刺激因子」(STING)基因，及STING基因的單核苷酸多型性(SNP)，以及由該等SNP產生的STING蛋白質及STING蛋白質變體。特定言之，本發明係關於用於辨別及偵測人類所表現之STING基因SNP (亦即，STING基因分型)及STING蛋白質變體的方法及套組。本發明亦關於該等方法及套組用作評估個體是否適於STING促效劑或拮抗劑療法之診斷工具的用途，以及使用STING促效劑或拮抗劑治療的方法。
STING，亦稱為跨膜蛋白173，係一種轉接蛋白，其結合環二核苷酸(CDN)或促效劑化合物，引起IκB激酶(IKK)及TANK結合激酶(TBK 1)活化，該等激酶當磷酸化時，分別將活化B細胞之核因子κ輕鏈增強子(NFκB)及干擾素調控因子3 (IRF 3)活化。此等活化蛋白質易位至核且誘導編碼I型干擾素(IFN)及發炎細胞介素的基因轉錄，以促進針對病原體或贅瘤的先天性免疫反應[1]。
癌症免疫療法調控且利用宿主的免疫系統治療癌症，且在過去十年內，癌症治療領域已有顯著進展。已研究出誘發或增強抗癌先天性免疫及/或後天性免疫的多種方式。最近，使用STING促效劑活化STING已顯示增強抗腫瘤免疫的巨大潛力，此活化係經由誘導多種促炎細胞介素及趨化因子，包括I型IFN。已發現且開發出多種天然及合成STING促效劑，且在臨床前模型中、在臨床中作為多種疾病(諸如癌症及感染性疾病)的免疫療法加以測試。舉例而言，環二核苷酸(CDN)，諸如環二聚鳥苷單磷酸酯(c-di-GMP)、環二聚腺苷單磷酸酯(c-di-AMP)及環GMP-AMP (cGAMP)係可誘發免疫反應的一類STING促效劑。
相反，STING拮抗劑亦已變成受關注的治療領域，原因在於其阻斷多種自體免疫疾病中的過度活化STING蛋白質。最近，許多公司已開發出多種小分子STING拮抗劑，諸如C-176及H-151。
對來自1000個基因體計劃之單核苷酸多型性(SNP)資料的分析揭露，存在五種主要STING單倍型，其攜帶特定SNP，引起STING多肽序列的變異。主要STING變體為R232，其特徵為232位置存在精胺酸。其為最普遍的人類STING單倍型，對偶基因頻率為57.6%，且因此被視為野生型。STING變體HAQ (R71H-G230A-R293Q)具有20.4%的對偶基因頻率且含有三種SNP。此HAQ變體在71位置具有替代精胺酸的組胺酸、在230位置具有替代甘胺酸的丙胺酸且在293位置具有替代精胺酸的麩醯胺酸。STING變體H232 (R232H)的特徵為232位置具有替代精胺酸的組胺酸，對偶基因頻率為13.7%。STING單倍型AQ (G230A-R293Q)在230位置含有替代甘胺酸的丙胺酸，且在293位置含有替代精胺酸的麩醯胺酸，對偶基因頻率為5.2%。最後，STING變體Q (R293Q)在293位置含有替代精胺酸的麩醯胺酸，且具有1.5%的對偶基因頻率[2]。
此等STING蛋白質變體中之每一者在活化後，在IFN產生方面不同。舉例而言，天然STING配位體cGAMP為H232變體的較弱活化因子。因此，將瞭解，若將要經歷STING促效劑或拮抗劑療法之特定患者中所存在之STING對偶基因的標識符已知，則將更佳地指導STING促效劑或拮抗劑的治療性施用。
目前，STING基因分型使用三種方法，亦即，桑格定序(Sanger sequencing)、塔曼-PCR (Taqman-PCR)，及基於FRET雜交探針的解鏈曲線分析。桑格定序需要高度先進的儀器，且因此為非常昂貴的SNP偵測方法。另外，實驗室方案及結果解譯需要專門實踐的操作人員花費大量的時間，導致處理時間長達約37小時。相較於桑格定序，塔曼-PCR及FRET雜交解鏈曲線分析的耗時較短，總處理時間約3至5小時。然而，此等方法中之每一者所需的儀器購置成本非常高且是許多實驗室不可承受的。另外，基於FRET的方法亦利用兩組探針，增加了此技術的總體成本。
相應地，此項技術中對於改良的STING基因分型方法，亦即，偵測個體之STING基因中之遺傳多型性模式存在或不存在的STING基因分型方法，存在相當大的需求。詳言之，需要一種提供快速、便宜及便捷方式的方法，藉由該方式可測定患者的STING基因型。相應地，此將得到改良的診斷工具，其用於評估STING促效劑/拮抗劑療法是否適於罹患疾病之患者，諸如癌症、與纖維化或自體發炎疾病相關的慢性炎症，或感染性疾病，諸如病毒、細菌、寄生蟲及真菌引起的彼等疾病。
因此，根據本發明之第一態樣，提供一種用於測定個體中之「干擾素基因刺激因子」(STING)基因之遺傳多型性模式的方法，該方法包含： -  在獲自個體的樣品中擴增STING基因內包含單核苷酸多型性(SNP)的基因體DNA序列；及 -  對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(RFLP)模式分析，以測定樣品中之STING基因的遺傳多型性模式。
根據第二態樣，提供一種用於測定個體中之「干擾素基因刺激因子」(STING)基因之遺傳多型性模式的裝置，該裝置包含： -   用於在獲自個體的樣品中擴增STING基因內包含單核苷酸多型性(SNP)之基因體DNA序列的構件；及 -   用於對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(RFLP)模式分析的構件，以測定樣品中之STING基因的遺傳多型性模式。
根據第三態樣，提供一種用於測定「干擾素基因刺激因子」(STING)促效劑或STING拮抗劑治療個體之功效的方法，該方法包含： -   使用根據第一態樣的方法或第二態樣的裝置測定獲自個體之樣品中之干擾素基因刺激因子(STING)基因的遺傳多型性模式；及 -   基於STING基因的遺傳多型性模式，確定該個體是否適於STING促效劑或拮抗劑療法。
在本發明之第四態樣中，提供一種診斷或預後工具，用於評估個體是否適於「干擾素基因刺激因子」(STING)促效劑或拮抗劑療法，其包含： -   使用第一態樣的方法或第二態樣的裝置測定獲自個體之樣品中之干擾素基因刺激因子(STING)基因的遺傳多型性模式；及 -   基於該遺傳多型性模式，確定該個體是否適於STING促效劑或拮抗劑療法。
根據第五態樣，提供一種治療罹患以「干擾素基因刺激因子」(STING)蛋白質活性不足或STING基因表現不足為特徵之疾病之個體的方法，該方法包含： -   在獲自個體的樣品中擴增STING基因內包含單核苷酸多型性(SNP)的基因體DNA序列； -   對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(RFLP)模式分析，以測定樣品中之STING基因的遺傳多型性模式；及 -   將或已將STING促效劑投與該個體，藉此治療該疾病。
根據第六態樣，提供一種治療罹患以「干擾素基因刺激因子」(STING)蛋白質過度活化或STING基因過度表現為特徵之疾病之個體的方法，該方法包含： -   在獲自個體的樣品中擴增STING基因內包含單核苷酸多型性(SNP)的基因體DNA序列； -   對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(RFLP)模式分析，以測定樣品中之STING基因的遺傳多型性模式；及 -   將或已將STING拮抗劑投與該個體，藉此治療該疾病。
有利的是，本發明之第一及第二態樣的方法及裝置使用組織或血液樣品，能夠非常快速且簡單地測定STING基因中存在或不存在某些SNP且相應地測定個體所攜帶的特定STING對偶基因中存在或不存在某些SNP，從而可在僅數小時內產生非常準確的結果。該等方法及裝置便宜且對儀器投資的要求最小。另外，藉由凝膠電泳簡單地可視化限制片段可容易進行基因分型，無需特定的軟體，所需的技術專家經驗極少。考慮到每個機構每天所測試之患者的數目，本發明之方法具有成本效益且執行起來簡單。因此，該等方法為可測定患者的STING基因型提供非常快速且便宜的方式。因此，根據本發明之第三及第四態樣，可容易確定患者是否適於用STING促效劑或拮抗劑治療。根據本發明之第五及第六態樣，此意謂在後續療法中向個體投與正確且最有效的STING促效劑或拮抗劑。
STING基因位於染色體5的位置31.2，且在www.ncbi.nlm.nih.gov已知且容易獲得STING編碼序列的一個實施例。STING基因的多型性模式可包含至少一種存在於STING基因中的多型性或多型性區域。STING基因中的多型性模式包含超過一種、較佳兩種存在於STING基因中的多型性或多型性區域。STING基因中之多型性模式包含三種或更多種存在於STING基因中的多型性或多型性區域。
術語「多型性」可指一種基因或其一部分(例如對偶基因變體)的超過一種形式在群體內併存。存在至少兩種不同形式(亦即，兩種不同核苷酸序列)的基因之一部分稱為「基因的多型性區域」。基因之多型性區域上的特定基因序列稱為對偶基因。
術語「對偶基因」可指在獲自個體之DNA中不同多型性位點處所發現的不同序列變體。舉例而言，STING基因之各多型性區域具有至少兩種不同對偶基因。各對偶基因之序列變體可為單個或多個鹼基變化，包括但不限於插入、缺失或取代，或可為不同數目個序列重複。因此，多型性區域可為單核苷酸(亦即，單核苷酸多型性，或SNP)，其標識在不同的對偶基因中不同。在其他實施例中，多型性區域亦可為若干核苷酸長度。
術語「基因型」、「對偶基因模式」或「多型性模式」可指一或多種對偶基因在一或多個多型性位點處的標識。基因型、對偶基因模式或多型性模式可由一或多個多型性位點處的同型接合或異型接合狀態組成。
目前已知有五種主要STING基因單倍型攜帶引起STING多肽序列變異的特定SNP。
術語「單倍型」可指通常一起遺傳的基因變體或DNA變體集合，諸如SNP，且此等單倍型集合通常位於一條染色體上。構成單倍型之對偶基因可位於染色體上之不同位置，但一起遺傳。
因此，STING基因的多型性模式可包含存在於STING基因中的至少一種SNP、至少兩種SNP、至少三種SNP或至少四種SNP。
在第一實施例中，STING變體為R232。在此實施例中，個體在位置232處具有精胺酸。其為最普遍的人類STING變體，對偶基因頻率為57.6%，且因此被視為野生型。
編碼R232的SNP稱為rs1131769。STING rs1131769 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) A-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs1131769 SNP的G-對偶基因或A-對偶基因。
編碼人類STING變體R232之一個實施例的核苷酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 1，該序列如下：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
[SEQ ID No: 1]
人類STING變體R232 (粗體，加下劃線)之一個實施例的胺基酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 2，該序列如下：
Figure 02_image005
[SEQ ID No: 2]
因此，STING基因中所測定的多型性模式較佳對應於STING變體R232。較佳地，STING變體R232包含或由基本上如SEQ ID No: 2中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 1中所示之核酸序列編碼。
在第二實施例中，STING變體為其中存在三種SNP的R71H-G230A-R293Q或「HAQ」。此人類STING變體具有20.4%的對偶基因頻率。在此實施例中，組胺酸置換位置71之精胺酸；丙胺酸置換位置230之甘胺酸；且麩醯胺酸置換位置293之精胺酸。
編碼R71H的SNP稱為rs11554776。STING rs11554776 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) A-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs11554776 SNP的G-對偶基因或A-對偶基因。
編碼G230A的SNP稱為rs78233829。STING rs78233829 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) C-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs78233829 SNP的G-對偶基因或C-對偶基因。
編碼R293Q的SNP稱為rs7380824。STING rs7380824 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) A-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs7380824 SNP的G-對偶基因或A-對偶基因。
編碼人類STING變體HAQ之一個實施例的核苷酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 3，該序列如下：
Figure 02_image007
Figure 02_image009
[SEQ ID No: 3]
人類STING變體HAQ (粗體，加下劃線)之一個實施例的胺基酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 4，該序列如下：
Figure 02_image011
[SEQ ID No: 4]
因此，所測定之STING基因中的多型性模式較佳包含對應於STING變體R71H-G230A-R293Q或「HAQ」的SNP。較佳地，STING變體R71H-G230A-R293Q或「HAQ」包含或由基本上如SEQ ID No: 4中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 3中所示之核酸序列編碼。
在第三實施例中，STING變體為其中存在一種SNP的R232H或「H232」。此人類STING變體具有13.7%的對偶基因頻率。在此實施例中，組胺酸置換位置232處的精胺酸。
編碼人類STING變體H232之一個實施例的核苷酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 5，該序列如下：
Figure 02_image013
[SEQ ID NO: 5]
人類STING變體H232 (粗體，加下劃線)之一個實施例的胺基酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 6，該序列如下：
Figure 02_image015
[SEQ ID NO: 6]
因此，所測定之STING基因中的多型性模式較佳包含對應於STING變體R232H或「H232」的SNP。較佳地，STING變體R232H或「H232」包含或由基本上如SEQ ID No: 6中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 5中所示之核酸序列編碼。
在第四實施例中，STING變體為其中存在兩種SNP的G230A-R293Q或「AQ」。此人類STING變體具有5.2%的對偶基因頻率。在此實施例中，丙胺酸置換位置230處的甘胺酸；且麩醯胺酸置換位置293處的精胺酸SNP。
編碼G230A的SNP稱為rs78233829。STING rs78233829 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) C-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs78233829 SNP的G-對偶基因或C-對偶基因。
編碼R293Q的SNP稱為rs7380824。STING rs7380824 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) A-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs7380824 SNP的G-對偶基因或A-對偶基因。
編碼人類STING變體AQ之一個實施例的核苷酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 7，該序列如下：
Figure 02_image017
Figure 02_image019
[SEQ ID No: 7]
人類STING變體AQ (粗體，加下劃線)之一個實施例的胺基酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 8，該序列如下：
Figure 02_image021
[SEQ ID No: 8]
因此，所測定之STING基因中的多型性模式較佳包含對應於STING變體G230A-R293Q或「AQ」的SNP。較佳地，STING變體G230A-R293Q或「AQ」包含或由基本上如SEQ ID No: 8中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 7中所示之核酸序列編碼。
在第五實施例中，STING變體為其中存在一種SNP的R293Q或「Q」。此人類STING變體具有1.5%的對偶基因頻率。在此實施例中，麩醯胺酸置換位置293處的精胺酸。
編碼R293Q的SNP稱為rs7380824。STING rs7380824 SNP的對偶基因可標識為(i) G-對偶基因，及(ii) A-對偶基因。因此，方法可包含偵測或測定STING rs7380824 SNP的G-對偶基因或A-對偶基因。
編碼人類STING變體Q之一個實施例的核苷酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 9，該序列如下：
Figure 02_image023
Figure 02_image025
[SEQ ID No: 9]
人類STING變體Q (粗體，加下劃線)之一個實施例的胺基酸序列在本文中稱為SEQ ID No: 10，該序列如下：
Figure 02_image027
[SEQ ID No: 10]
因此，所測定之STING基因中的多型性模式較佳包含對應於STING變體R293Q或「Q」的SNP。較佳地，STING變體R293Q或「Q」包含或由基本上如SEQ ID No: 2中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 1中所示之核酸序列編碼。
樣品較佳為獲自測試個體的生物學身體樣品。測定樣品中之STING基因的遺傳多型性模式因此較佳在活體外進行。樣品可包含組織、血液、血漿、血清、脊髓液、尿、汗、唾液、痰、淚、乳房抽吸物、前列腺液、精液、陰道液、糞便、子宮頸刮片、羊水、眼內液、黏液、呼氣中的水分、動物組織、細胞溶解物、腫瘤組織、毛髮、皮膚、口腔刮片、指甲、骨髓、軟骨、外髓質、骨粉末、耳垢，或其組合。樣品可為切片。
在另一個實施例中，樣品可容納於測試個體內，該測試個體可為實驗動物(例如小鼠或大鼠)或人類，其中方法係基於活體內的測試。或者，樣品可為離體樣品或活體外樣品。因此，所測試的細胞可存在於組織樣品中(基於離體的測試)或細胞可在培養物中生長(活體外樣品)。較佳地，生物樣品為離體樣品。
樣品在用於本發明之前可經預處理(例如稀釋、濃縮、分離、部分純化、冷凍等)。較佳地，樣品為經處理之血液樣品。
樣品可以包含血液、尿液或組織。因此，最佳地，樣品包含血液樣品。血液可為靜脈或動脈血。裝置可包含用於接收所提取之樣品的樣品收集容器。血液樣品可立即加以分析。或者，進行分析之前，血液樣品可在低溫下儲存，例如在冰箱中儲存，或甚至冷凍。偵測STING基因中的SNP可針對全血進行。然而，較佳地，血液樣品包含血清。較佳地，血液樣品包含成核的細胞。
進行STING分析(亦即，測定STING基因中是否存在SNP)之前，可進一步處理血液。舉例而言，可添加抗凝血劑，諸如檸檬酸鹽(諸如檸檬酸鈉)、水蛭素、肝素、PPACK或氟化鈉。因此，為了防止血液樣品凝結，樣品收集容器可以含有抗凝血劑。或者，可將血液樣品離心或過濾，以分離出血液或血清部分中的有核細胞部分，其可以用於分析。因此，較佳的是，利用血液或血清樣品的有核細胞部分來分析或檢定STING基因中是否存在SNP。較佳的是，活體外利用血清樣品或獲自個體之血液的有核細胞部分分析STING基因中是否存在SNP。
熟習此項技術者已知用於擴增包含STING相關SNP之基因體DNA序列的擴增技術且包括(但不限於)選殖、聚合酶鏈反應(PCR)、特定對偶基因的聚合酶鏈反應(PASA)、聚合酶鏈接合、巢式聚合酶鏈反應，及其類似技術。
因此，偵測步驟可包含樣品擴增，例如PCR擴增。PCR涉及擴增DNA，較佳擴增少量DNA，以便隨後容易偵測基因多型性模式。熟習此項技術者熟知基本擴增方案的多種變化形式。基於PCR的偵測方式包括複數種多型性或標記物同時進行的多重擴增。舉例而言，已熟知選擇PCR引子來產生在尺寸上不重疊且可同時加以分析的PCR產物。或者，可用以不同形式標記且因此各自可以不同形式偵測的引子擴增不同的標記物。當然，基於雜交之偵測方式允許對樣品中的多種PCR產物達成差異性偵測。允許對複數種標記物達成多重分析的其他技術已為人知。
熟習此項技術者應瞭解，PCR反應包含此項技術中熟知的進行PCR反應之試劑混合物。舉例而言，混合物可包含緩衝液、正向引子、反向引子、模板、聚合酶及水。
PCR可為定量(Q)-PCR、滴式數位PCR及Crystal TMDigital TMPCR。所有此等技術在分子生物學中為常規的且已為熟習此項技術者所知。
較佳地，DNA聚合酶活化及初始變性係在94℃與98℃之間、95℃與98℃之間、96℃與98℃之間或97℃與98℃之間的溫度下進行。最佳地，初始變性係在98℃的溫度下進行。較佳地，DNA聚合酶活化及初始變性進行30秒至5分鐘、或1分鐘至4分鐘、或2分鐘至3分鐘的時段。最佳地，初始變性進行2分鐘45秒的時段。
較佳地，PCR進行20至40個循環，或25至35個循環。最佳地，PCR進行30個循環。較佳地，循環包括以下步驟： -   變性； -   黏接；及 -   延長。
較佳地，變性步驟係在94至98℃、95至98℃、96至98℃或97至98℃的溫度下進行。最佳地，變性步驟係在98℃的溫度下進行。較佳地，變性步驟進行20秒至2分鐘、20秒至1分鐘或20秒至30秒的時段。最佳地，變性步驟進行30秒。
較佳地，黏接步驟係在40至60℃或50至60℃的溫度下進行。最佳地，黏接步驟係在60℃的溫度下進行。較佳地，黏接步驟進行30秒至2分鐘或30秒至1分鐘的時段。最佳地，黏接步驟進行30秒。
較佳地，延長步驟係在70至75℃、71至74℃或72至73℃的溫度下進行。最佳地，延長步驟係在72℃的溫度下進行。較佳地，延長步驟進行30秒至2分鐘、或30秒至1分鐘的時段。最佳地，延長步驟進行30秒。
較佳地，PCR包括最終延長步驟。較佳地，最終延長步驟係在70至75℃、71至74℃或72至73℃的溫度下進行。最佳地，最終延長係在72℃的溫度下進行。較佳地，最終延長進行5至15分鐘、6至14分鐘、7至13分鐘、8至12分鐘或9至11分鐘的時段。最佳地，最終延長進行10分鐘的時段。
較佳地，PCR使用一對引子：正向引子與反向引子。正向引子設計成使得其與所關注之序列上游的核苷酸序列互補，而反向引子設計成使得其與所關注之序列下游的核苷酸序列互補。
能夠與引子序列雜交的STING核苷酸序列可為DNA或RNA序列。RNA序列可為miRNA、mRNA或siRNA。
在本發明之上下文內，術語「引子」表示可特異性地與標靶基因序列雜交且用於起始擴增的核苷酸序列。本發明之引子為單股核苷酸序列，其長度在10個核苷酸與50個核苷酸之間、在10個核苷酸與40個核苷酸之間、在10個核苷酸與30個核苷酸之間、在10個核苷酸與25個核苷酸之間、在11個核苷酸與50個核苷酸之間、在11個核苷酸與40個核苷酸之間、在11個核苷酸與30個核苷酸之間、在11個核苷酸與25個核苷酸之間、在13個核苷酸與50個核苷酸之間、在13個核苷酸與40個核苷酸之間、在13個核苷酸與30個核苷酸之間、在13個核苷酸與25個核苷酸之間、在14個核苷酸與50個核苷酸之間、在14個核苷酸與40個核苷酸之間、在14個核苷酸與30個核苷酸之間、在14個核苷酸與25個核苷酸之間、在15個核苷酸與50個核苷酸之間、在15個核苷酸與40個核苷酸之間、在15個核苷酸與30個核苷酸之間、在15個核苷酸與25個核苷酸之間。較佳地，本發明之引子具有15個核苷酸與30個核苷酸之間的長度。更佳地，本發明之引子具有15與25之間的長度。
較佳地，引子與STING核苷酸序列中的標靶序列完全匹配，亦即，具有100%互補性，從而允許與其發生特異性雜交且與另一區域基本上不雜交。
較佳地，引子設計成與側接SNP的序列雜交，該等SNP對應於胺基酸殘基71、230、232及293。此原因係此等殘基處之取代對應於五種主要STING變體。
在其中SNP位置對應於胺基酸殘基71的一個實施例中，本文提供的正向引子如下： GTCTGTTTTGTAGATCGAGAAATGG [SEQ ID NO: 11]
因此，在一個較佳實施例中，正向引子包含或由基本上如SEQ ID No: 11所示的核苷酸序列或其片段或變體組成。較佳地，正向引子能夠與一種序列雜交，該序列與基本上如SEQ ID No: 11所示的核苷酸序列或其片段或變體互補，且該正向引子與其成對的反向引子一起擴增對應於胺基酸殘基71的標靶序列。
在其中SNP位置對應於胺基酸殘基71的一個實施例中，本文提供的反向引子如下： AGAATGGTCATGGATTTCTTGG [SEQ ID NO: 12]
因此，在一個較佳實施例中，反向引子包含或由基本上如SEQ ID No: 12所示的核苷酸序列或其片段或變體組成。較佳地，反向引子能夠與一種序列雜交，該序列與基本上如SEQ ID No: 12所示的核苷酸序列或其片段或變體互補，且該反向引子與其成對的正向引子一起擴增對應於胺基酸殘基71的標靶序列。PCR產物較佳為991 bp。
在其中SNP位置對應於胺基酸殘基230或232的一個實施例中，本文提供的正向引子如下： CAGCTAGGGACACTACAGCTCAGA [SEQ ID NO: 13]
因此，在一個較佳實施例中，正向引子包含或由基本上如SEQ ID No: 13所示的核苷酸序列或其片段或變體組成。較佳地，正向引子能夠與一種序列雜交，該序列與基本上如SEQ ID No: 13所示的核苷酸序列或其片段或變體互補，且該正向引子與其成對的反向引子一起擴增對應於胺基酸殘基230及232的標靶序列。
在其中SNP位置對應於胺基酸殘基230或232的一個實施例中，本文提供的反向引子如下： CTGGCCTCCTGTACAATGAGAGT [SEQ ID NO: 14]
因此，在一個較佳實施例中，反向引子包含或由基本上如SEQ ID No: 14所示的核苷酸序列或其片段或變體組成。較佳地，反向引子能夠與一種序列雜交，該序列與基本上如SEQ ID No: 14所示的核苷酸序列或其片段或變體互補，且該反向引子與其成對的正向引子一起擴增對應於胺基酸殘基230及232的標靶序列。PCR產物較佳為501 bp。
在其中SNP位置對應於胺基酸殘基293的一個實施例中，本文提供的正向引子如下： CTCCATAGCCCCTTCTGACTCTT [SEQ ID NO: 15]
因此，在一個較佳實施例中，正向引子包含或由基本上如SEQ ID No: 15所示的核苷酸序列或其片段或變體組成。較佳地，正向引子能夠與一種序列雜交，該序列與基本上如SEQ ID No: 15所示的核苷酸序列或其片段或變體互補，且該正向引子與其成對的反向引子一起擴增對應於胺基酸殘基293的標靶序列。
在其中SNP位置對應於胺基酸殘基293的一個實施例中，本文提供的反向引子如下： GGCTTAGTCTGGTCTTCCTCTTACC [SEQ ID NO: 16]
因此，在一個較佳實施例中，反向引子包含或由基本上如SEQ ID No: 16所示的核苷酸序列或其片段或變體組成。較佳地，反向引子能夠與一種序列雜交，該序列與基本上如SEQ ID No: 16所示的核苷酸序列或其片段或變體互補，且該反向引子與其成對的正向引子一起擴增對應於胺基酸殘基293的標靶序列。PCR產物較佳為314 bp。
較佳地，RFLP模式分析包含對基因體DNA進行限制酶消化以產生至少一個片段；及對該至少一個片段進行凝膠電泳。STING基因中存在SNP將使得片段呈現與野生型片段模式不同的遷移概況。
熟習此項技術者應瞭解，限制酶消化反應包含此項技術中熟知的進行PCR反應之試劑混合物。舉例而言，混合物可包含PCR產物、緩衝液、限制酶及水。
在一個實施例中，限制酶為HhaI。較佳地，HhaI在對應於胺基酸殘基71的位置切割基因體DNA。
在一個實施例中，HpaII可在對應於胺基酸殘基230的位置切割基因體DNA。在另一個實施例中，限制酶為Eco91I。較佳地，Eco91I在對應於胺基酸殘基230的位置切割基因體DNA。
在另一個實施例中，限制酶為Hin1II。較佳地，Hin1II在對應於胺基酸殘基232的位置切割基因體DNA。
在另一個實施例中，限制酶為HpaII。較佳地，HpaII在對應於胺基酸殘基293的位置切割基因體DNA。
五種主要STING單倍型的特徵為存在於71、230、232及293位置的胺基酸。視存在於此等位置的胺基酸及所用限制酶而定，產生不同長度的片段。
在其中精胺酸位於71位置的一個實施例中，限制酶消化產生750 bp片段及241 bp片段。在其中組胺酸位於71位置的一個實施例中，限制酶消化產生991 bp片段。
在其中甘胺酸位於230位置的一個實施例中，限制酶消化產生317 bp片段及184 bp片段。在其中丙胺酸存在於230位置的一個實施例中，限制酶消化產生501 bp片段。
在其中精胺酸存在於232位置的一個實施例中，限制酶消化產生501 bp片段。在其中組胺酸位於232位置的一個實施例中，限制酶消化產生317 bp片段及184 bp片段。
在其中精胺酸存在於293位置的一個實施例中，限制酶消化產生162 bp片段、116 bp片段及36 bp片段。在其中麩醯胺酸存在於293位置的一個實施例中，限制酶消化產生198 bp片段及116 bp片段。
較佳地，限制酶消化係在35至40℃、36至39℃、或37至38℃的溫度下進行。最佳地，限制酶消化係在37℃的溫度下進行。
較佳地，限制酶消化進行5分鐘至4小時的時段。更佳地，限制酶消化進行10分鐘至3小時、或15分鐘至2小時的時段。最佳地，限制酶消化進行一小時的時段。
在一個實施例中，片段在瓊脂糖凝膠上電泳。較佳地，凝膠中的瓊脂糖濃度在0.5%與4%之間，或在1%與3.5%之間。最佳地，凝膠中的瓊脂糖濃度在2%與3%之間。
較佳地，片段在聚丙烯醯胺凝膠上電泳。較佳地，凝膠中的聚丙烯醯胺濃度在5%與10%之間。更佳地，凝膠中的聚丙烯醯胺濃度在6%與9%之間，或在7%與8%之間。最佳地，凝膠中的聚丙烯醯胺濃度為8%。較佳地，聚丙烯醯胺凝膠置於0.5x TBE緩衝液中。
較佳地，凝膠在溴化乙錠染色溶液中培育20秒至5分鐘，或30秒至4分鐘，或40秒至3分鐘，或50秒至2分鐘。最佳地，凝膠在溴化乙錠染色溶液中培育一分鐘。較佳地，使用UV凝膠記錄系統將凝膠可視化。
第五態樣的方法可包含將或已將STING促效劑投與個體以治療選自由以下組成之群的疾病：癌症、細菌感染、病毒感染、寄生蟲感染、真菌感染、免疫介導之病症、中樞神經系統疾病、周邊神經系統疾病、神經退化性疾病、情緒障礙、睡眠障礙、腦血管疾病、周邊動脈疾病及心血管疾病。然而，最佳地，用STING促效劑治療癌症。
STING促效劑之實例包括合成CDN STING促效劑及小分子STING促效劑。舉例而言，環二核苷酸(CDN)，諸如環二聚鳥苷單磷酸酯(c-di-GMP)、環二聚腺苷單磷酸酯(c-di-AMP)及環GMP-AMP (cGAMP)係可誘發免疫反應的一類STING促效劑。
STING促效劑之實例亦包括STING之小分子調節劑，其更多資訊可見於WO2018/234805、WO2018/234807、WO2019/243825及WO2019/243823。
在其中個體具有STING單倍型R232、HAQ、R232H、AQ或Q的一個實施例中，投與STING促效劑。
應瞭解，『促效劑』、『效應子』或活化因子，當其指STING時，包含刺激STING之分子、分子組合或複合物。
第六態樣之方法可包含將或已將STING拮抗劑投與個體以治療選自由以下組成之群的疾病：自體免疫疾病、肝纖維化、脂肪肝病、非酒精性脂肝炎(NASH)、肺纖維化、狼瘡、敗血症、類風濕性關節炎(RA)、I型糖尿病、嬰兒期發作的STING相關血管病變(SAVI)、艾卡迪-高鐵瑞症候群(Aicardi-Goutieres syndrome，AGS)、家族性凍瘡樣狼瘡(FCL)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、視網膜血管病變、神經炎症、全身性發炎反應症候群、胰臟炎、心血管疾病、非酒精性脂肪肝病、腎纖維化、中風及年齡相關之黃斑部變性(AMD)。
STING拮抗劑之實例包括小分子STING拮抗劑，諸如C-176及H-151，及STING路徑拮抗劑。
STING拮抗劑之實例亦包括STING之小分子調節劑。
應瞭解，『拮抗劑』當其指STING時包含抑制、抵消、下調及/或脫敏STING之分子、分子組合或複合物。『拮抗劑』涵蓋抑制STING之組成性活性之任何試劑。組成性活性為在配位體/STING相互相用缺乏的情況下所顯現的活性。『拮抗劑』亦涵蓋抑制或阻止STING之經刺激(或經調節)之活性的任何試劑。
「個體(subject)」或「個體(individual)」可為脊椎動物、哺乳動物或家畜。因此，本發明之藥劑可用於治療任何哺乳動物，例如家畜(例如馬)、寵物，或可用於其他獸醫學應用。最佳地，個體為人類。
應瞭解，本發明延及基本上包含本文所提及之任何序列之胺基酸或核酸序列(包括其變體或片段)的任何核酸或肽或變體、其衍生物或類似物。術語「基本上胺基酸/核苷酸/肽序列」、「變體」及「片段」可為與本文所提及之任一種序列之胺基酸/核苷酸/肽序列具有至少40%序列一致性(例如，與SEQ ID No: 1-16所標識之序列40%一致)的序列。
亦設想序列一致性與所提及之任一種序列大於65%、更佳大於70%、甚至更佳大於75%且仍更佳大於80%序列一致性的胺基酸/聚核苷酸/多肽序列。較佳地，胺基酸/聚核苷酸/多肽序列與所提及之任一種序列具有至少85%一致性，更佳至少90%一致性，甚至更佳至少92%一致性，甚至更佳至少95%一致性，甚至更佳至少97%一致性，甚至更佳至少98%一致性，且最佳地，與本文所提及之任一種序列具有至少99%一致性。
熟習此項技術者將瞭解如何計算兩種胺基酸/聚核苷酸/多肽序列之間的一致性百分比。為了計算兩種胺基酸/聚核苷酸/多肽序列之間的一致性百分比，首先必須對兩種序列進行比對，隨後計算序列一致性值。兩種序列的一致性百分比可採取不同值，此取決於：(i)用於比對序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman (用不同程式執行)，或得自3D比較的結構比對；及(ii)比對方法所用的參數，例如局域相對於全域比對、所用的成對評分矩陣(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)，及空隙罰分，例如函數形式及常數。
進行比對時，存在多種不同方式來計算兩種序列之間的一致性百分比。舉例而言，可將一致性數除以：(i)最短序列長度；(ii)比對長度；(iii)序列的平均長度；(iv)非空隙位置的數目；或(v)不包括突出端之等效位置的數目。另外，應瞭解，一致性百分比亦強烈地依賴於長度。因此，序列對愈短，則可預期偶然存在的序列一致性愈高。
因此，應瞭解，蛋白質或DNA序列的準確比對為一種複雜過程。流行的多重比對程式ClustalW (Thompson等人, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680；Thompson等人, 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)為一種用於對本發明之蛋白質或DNA產生多重比對的較佳方式。適用於ClustalW的參數可為如下：就DNA比對而言：空隙開放罰分=15.0，空隙延長罰分=6.66，且矩陣=一致性。就蛋白質比對而言：空隙開放罰分=10.0，空隙延長罰分=0.2，且矩陣=Gonnet。就DNA及蛋白質比對而言：ENDGAP=-1，且GAPDIST=4。熟習此項技術者將瞭解，為了達成最佳的序列比對，可能必需改變此等及其他參數。
較佳地，接著可利用此類比對、根據(N/T)*100計算兩種胺基酸/聚核苷酸/多肽序列之間的一致性百分比計算，其中N為序列共享一致殘基的位置數，且T為所比較之位置總數目，包括空隙且包括或不包括突出端。較佳將突出端納入計算。因此，用於計算兩種序列之間之一致性百分比的最佳方法包含(i)使用適合的參數集合、使用ClustalW程式製備序列比對，例如如上文所闡述；及(ii)將N及T的數值插入下式：- 序列一致性=(N/T)*100。
由於遺傳密碼之簡併性，因此顯而易見，本文所述之任何核酸序列均可變化或改變而實質上不影響其所編碼之蛋白質的序列，以提供其功能變體。適合的核苷酸變體為序列藉由用編碼序列內之相同胺基酸之不同密碼子取代而改變、從而產生靜默(同義)變化的變體。其他適合的變體為具有同源核苷酸序列、但包含藉由不同密碼子取代而改變之序列之全部或一部分的彼等變體，該等不同密碼子編碼具有與其所取代之胺基酸相似之生物物理學特性之側鏈的胺基酸，以產生保守變化。舉例而言，非極性、疏水性小胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸及甲硫胺酸。非極性、疏水性大胺基酸包括苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。極性中性胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸。帶正電荷(鹼性)之胺基酸包括離胺酸、精胺酸及組胺酸。帶負電荷(酸性)之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。因此應瞭解哪些胺基酸可經具有相似生物物理學特性之胺基酸置換，且熟習此項技術者將知曉編碼此等胺基酸之核苷酸序列。
本文(包括任何隨附申請專利範圍、摘要及附圖)所述之所有特徵及/或如此揭示之任何方法或製程之全部步驟可與以上態樣中之任一者以任何組合形式組合，但其中至少一些此類特徵及/或步驟互斥的組合除外。
實例參考圖1，本發明人已設計一種用於快速且可靠鑑別STING基因中存在或不存在突變且相應地使用組織或血液樣品測定個體攜帶哪些STING對偶基因的新穎方法。該方法涉及對獲自人類個體之基因體DNA的含SNP序列進行PCR擴增。此後為RFLP分析，其根據特定SNP的存在或不存在來鑑別個體之STING變體。
材料及方法 收集血液獲得簽名的同意書(根據機構倫理審批委員會準則( Institutional Ethical Approval Committee guidelines))之後，利用Vacuette肝素鈉塗覆的真空管自個別健康供者收集500 µl新鮮全血。
基因體 DNA 分離及量測通常市售的商用套組可用於根據製造商方案分離基因體DNA。此類套組由Qiagen (QIAamp DNA血液小型套組，目錄號#51104)及Promega (Wizard®基因體DNA純化套組，目錄號#A1120)出售。在此實例中，本發明人使用QIAGEN套組。藉由使用光譜光度計(Agilent technologies Cary 60 UV-Vis)監測260 nm UV吸光度來定量及量測DNA。
針對各 SNP 位置的 PCR根據下文提及的PCR條件及使用用於下文所述之各SNP擴增的引子組，針對各SNP位置進行PCR。 a) 用於各SNP擴增的引子組：
用於 gDNA 模板 PCR 的 引子組
引子 ID 引子 SNP 序列
Fwd71 SNP_71_Fwd GTCTGTTTTGTAGATCGAGAAATGG [SEQ ID No: 11]
Rev71 SNP_71_Rev AGAATGGTCATGGATTTCTTGG [SEQ ID No: 12]
Fwd230 SNP_230/232_Fwd CAGCTAGGGACACTACAGCTCAGA [SEQ ID No: 13]
Rev230 SNP_230/232_Rev CTGGCCTCCTGTACAATGAGAGT [SEQ ID No: 14]
Fwd293 SNP_293_Fwd CTCCATAGCCCCTTCTGACTCTT [SEQ ID No: 15]
Rev293 SNP_293_Rev GGCTTAGTCTGGTCTTCCTCTTACC [SEQ ID No: 16]
b)各SNP PCR的PCR反應表：
使用gDNA模板的Phusion Pol hSTING選殖PCR反應
組分 濃度 體積 (ul) 最終濃度
緩衝液 5x 4.0 1x
dNTPs 10mM 0.4 200uM
正向引子 10uM 1.0 0.5uM
反向引子 10uM 1.0 0.5uM
模板 50-100ng 1.0   
Phusion Pol 2U/ul 0.2 0.02U/ul
水    12.4   
總計    20.0   
c) PCR循環說明： 初始變性：98℃維持2分鐘45秒 變性：98℃維持30秒 黏接：60℃維持30秒 延長：72℃維持30秒 循環：30個循環 最終延長：72℃維持10分鐘
限制酶消化製備以下反應混合物且在37℃下培育1小時。使5 µl消化的樣品於0.5X TBE緩衝液中、在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳解析。將凝膠在溴化乙錠染色溶液中培育一分鐘且使用UV凝膠記錄系統可視化。
試劑 體積
PCR產物 5ul
FD Green 10x緩衝液 1ul
限制酶 0.5ul (0.5U)
水 3.5ul
總計 10ul
RFLP 模式分析使用gDNA模板消化後，在電泳遷移中所預期的片段模式：
PCR 產物尺寸 (bp) 位置限制酶 胺基酸 STING 變體 片段 (bp)
991 71 HhaI Arg(R71) His (H71) R232/H232 HAQ 750/ 241 991
501 230 Eco91I Gly(G230) Ala(A230) R232/H232 HAQ/A230 317/184 501
501 232 Hin1II Arg(R232) His (H232) R232/HAQ H232 501 317/184
314 293 HpaII Arg(R293) Gln(Q293) R232/H232 HAQ/Q293 162/116/36 198/116
結果在此實例中，本發明人使用其新近設計的方法鑑別STING基因中存在或不存在SNP，且因此測定十二位健康人類供者所攜帶的特定STING對偶基因。本發明人首先自各個別健康供者收集新鮮全血且接著自樣品中分離且量測基因體DNA。接著對基因體DNA之含SNP序列進行PCR擴增以產生DNA樣品的多個複本。本發明人接著利用限制酶消化將DNA碎片消化成更小片段。此後，本發明人進行凝膠電泳以根據尺寸來分離所產生的DNA片段。最後，利用限制片段長度多型性(RFLP)模式分析來測定各個體之基因型中所攜帶的特定STING對偶基因。
使用此新設計之方法，本發明人能夠快速且可靠地鑑別存在於健康人類供者之STING基因中的SNP，且因此測定個體之STING變體。本發明人設計的方法鑑別出對應於五種主要STING變體的SNP：R232、HAQ、H232、AQ及Q。因此，PCR引子設計成與側接對應於胺基酸殘基71、230、232及293之SNP的序列雜交，因為此等殘基處的取代對應於五種主要STING變體。
如圖2-13中所說明，本發明人接著利用RFLP模式分析、基於DNA片段之電泳遷移來測定各個體所攜帶的STING變體。舉例而言，如圖2中所示，人類供者D1攜帶STING對偶基因R232/R232。此由於PCR產物之RFLP模式分析基於片段長度揭露位置71存在精胺酸、位置230存在甘胺酸、位置232存在精胺酸及位置293存在精胺酸。相應地，人類供者D1攜帶STING對偶基因R232/R232。相比之下，人類供者D5 (圖6)攜帶STING對偶基因HAQ/HAQ，原因在於PCR產物的RFLP模式分析揭露位置71存在組胺酸、位置230存在丙胺酸、位置232存在精胺酸及位置293存在麩醯胺酸。藉由鑑別SNP且測定STING變體，此方法的資訊充分揭露兩位個體適於用STING促效劑治療。
結論總之，因此，本發明人已開發出一種使用組織或血液樣品測定個體所攜帶之特定STING對偶基因的新穎方法。詳言之，此新穎方法快速且可靠且因此可在數小時內產生準確的結果。另外，此新穎方法不需要對昂貴試劑及儀器的需求。因此，考慮到所測試之患者數目龐大，此方法具有成本效益且具有執行可行性。相應地，此方法因此可用作診斷工具，以基於患者的STING基因型來確定該患者的最有效STING促效劑療法。
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為更好地理解本發明且表明如何可將實施例付諸於實施，現將藉助於實例參考附圖，其中：- 圖 1為說明根據本發明之STING基因分型方法之一個實施例的流程圖； 圖 2顯示人類供者D1之SNP分型：STING R232/R232； 圖 3顯示人類供者D2之SNP分型：STING R232/HAQ； 圖 4顯示人類供者D3之SNP分型：STING H232/HAQ； 圖 5顯示人類供者D4之SNP分型：STING R232/H232； 圖 6顯示人類供者D5之SNP分型：STING HAQ/HAQ； 圖 7顯示人類供者D6之SNP分型：STING R232/H232； 圖 8顯示人類供者D7之SNP分型：STING H232/HAQ； 圖 9顯示人類供者D8之SNP分型：STING R232/R232； 圖 10顯示人類供者D9之SNP分型：STING R232/R232； 圖 11顯示人類供者D10之SNP分型：STING R232/R232； 圖 12顯示人類供者D11之SNP分型：STING R232/HAQ；及 圖 13顯示人類供者D12之SNP分型：STING R232/R232。 

          <![CDATA[<110>  印度商裘拉德製藥私人有限公司(Curadev Pharma Pvt Ltd)]]>
          <![CDATA[<120>  用於人類個體中基因分型STING變體之快速方法]]>
          <![CDATA[<130>  93217PCT1]]>
          <![CDATA[<140> TW 110120542]]>
          <![CDATA[<141> 2021-06-07]]>
          <![CDATA[<150>  2008579.1]]>
          <![CDATA[<151>  2020-06-08]]>
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          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  2170]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          gttcattttt cactcctccc tcctaggtca cacttttcag aaaaagaatc tgcatcctgg       60
          aaaccagaag aaaaatatga gacggggaat catcgtgtga tgtgtgtgct gcctttggct      120
          gagtgtgtgg agtcctgctc aggtgttagg tacagtgtgt ttgatcgtgg tggcttgagg      180
          ggaacccgct gttcagagct gtgactgcgg ctgcactcag agaagctgcc cttggctgct      240
          cgtagcgccg ggccttctct cctcgtcatc atccagagca gccagtgtcc gggaggcaga      300
          agatgcccca ctccagcctg catccatcca tcccgtgtcc caggggtcac ggggcccaga      360
          aggcagcctt ggttctgctg agtgcctgcc tggtgaccct ttgggggcta ggagagccac      420
          cagagcacac tctccggtac ctggtgctcc acctagcctc cctgcagctg ggactgctgt      480
          taaacggggt ctgcagcctg gctgaggagc tgcgccacat ccactccagg taccggggca      540
          gctactggag gactgtgcgg gcctgcctgg gctgccccct ccgccgtggg gccctgttgc      600
          tgctgtccat ctatttctac tactccctcc caaatgcggt cggcccgccc ttcacttgga      660
          tgcttgccct cctgggcctc tcgcaggcac tgaacatcct cctgggcctc aagggcctgg      720
          ccccagctga gatctctgca gtgtgtgaaa aagggaattt caacgtggcc catgggctgg      780
          catggtcata ttacatcgga tatctgcggc tgatcctgcc agagctccag gcccggattc      840
          gaacttacaa tcagcattac aacaacctgc tacggggtgc agtgagccag cggctgtata      900
          ttctcctccc attggactgt ggggtgcctg ataacctgag tatggctgac cccaacattc      960
          gcttcctgga taaactgccc cagcagaccg gtgaccgtgc tggcatcaag gatcgggttt     1020
          acagcaacag catctatgag cttctggaga acgggcagcg ggcgggcacc tgtgtcctgg     1080
          agtacgccac ccccttgcag actttgtttg ccatgtcaca atacagtcaa gctggcttta     1140
          gccgggagga taggcttgag caggccaaac tcttctgccg gacacttgag gacatcctgg     1200
          cagatgcccc tgagtctcag aacaactgcc gcctcattgc ctaccaggaa cctgcagatg     1260
          acagcagctt ctcgctgtcc caggaggttc tccggcacct gcggcaggag gaaaaggaag     1320
          aggttactgt gggcagcttg aagacctcag cggtgcccag tacctccacg atgtcccaag     1380
          agcctgagct cctcatcagt ggaatggaaa agcccctccc tctccgcacg gatttctctt     1440
          gagacccagg gtcaccaggc cagagcctcc agtggtctcc aagcctctgg actgggggct     1500
          ctcttcagtg gctgaatgtc cagcagagct atttccttcc acagggggcc ttgcagggaa     1560
          gggtccagga cttgacatct taagatgcgt cttgtcccct tgggccagtc atttcccctc     1620
          tctgagcctc ggtgtcttca acctgtgaaa tgggatcata atcactgcct tacctccctc     1680
          acggttgttg tgaggactga gtgtgtggaa gtttttcata aactttggat gctagtgtac     1740
          ttagggggtg tgccaggtgt ctttcatggg gccttccaga cccactcccc acccttctcc     1800
          ccttcctttg cccggggacg ccgaactctc tcaatggtat caacaggctc cttcgccctc     1860
          tggctcctgg tcatgttcca ttattgggga gccccagcag aagaatggag aggaggagga     1920
          ggctgagttt ggggtattga atcccccggc tcccaccctg cagcatcaag gttgctatgg     1980
          actctcctgc cgggcaactc ttgcgtaatc atgactatct ctaggattct ggcaccactt     2040
          ccttccctgg ccccttaagc ctagctgtgt atcggcaccc ccaccccact agagtactcc     2100
          ctctcacttg cggtttcctt atactccacc cctttctcaa cggtcctttt ttaaagcaca     2160
          tctcagatta                                                            2170
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          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 
              130                 135                 140                 
          Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 
                      260                 265                 270         
          Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 
              290                 295                 300                 
          Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 
                  355                 360                 365             
          Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 
              370                 375                 
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          gttcattttt cactcctccc tcctaggtca cacttttcag aaaaagaatc tgcatcctgg       60
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          Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Ala Glu Glu Leu His His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 
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          Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 
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          Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 
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              210                 215                 220                 
          Leu Pro Gln Gln Thr Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 
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          Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 
                      260                 265                 270         
          Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 
              290                 295                 300                 
          Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 
                  355                 360                 365             
          Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 
              370                 375                 
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          gttcattttt cactcctccc tcctaggtca cacttttcag aaaaagaatc tgcatcctgg       60
          aaaccagaag aaaaatatga gacggggaat catcgtgtga tgtgtgtgct gcctttggct      120
          gagtgtgtgg agtcctgctc aggtgttagg tacagtgtgt ttgatcgtgg tggcttgagg      180
          ggaacccgct gttcagagct gtgactgcgg ctgcactcag agaagctgcc cttggctgct      240
          cgtagcgccg ggccttctct cctcgtcatc atccagagca gccagtgtcc gggaggcaga      300
          agatgcccca ctccagcctg catccatcca tcccgtgtcc caggggtcac ggggcccaga      360
          aggcagcctt ggttctgctg agtgcctgcc tggtgaccct ttgggggcta ggagagccac      420
          cagagcacac tctccggtac ctggtgctcc acctagcctc cctgcagctg ggactgctgt      480
          taaacggggt ctgcagcctg gctgaggagc tgcgccacat ccactccagg taccggggca      540
          gctactggag gactgtgcgg gcctgcctgg gctgccccct ccgccgtggg gccctgttgc      600
          tgctgtccat ctatttctac tactccctcc caaatgcggt cggcccgccc ttcacttgga      660
          tgcttgccct cctgggcctc tcgcaggcac tgaacatcct cctgggcctc aagggcctgg      720
          ccccagctga gatctctgca gtgtgtgaaa aagggaattt caacgtggcc catgggctgg      780
          catggtcata ttacatcgga tatctgcggc tgatcctgcc agagctccag gcccggattc      840
          gaacttacaa tcagcattac aacaacctgc tacggggtgc agtgagccag cggctgtata      900
          ttctcctccc attggactgt ggggtgcctg ataacctgag tatggctgac cccaacattc      960
          gcttcctgga taaactgccc cagcagaccg gtgaccatgc tggcatcaag gatcgggttt     1020
          acagcaacag catctatgag cttctggaga acgggcagcg ggcgggcacc tgtgtcctgg     1080
          agtacgccac ccccttgcag actttgtttg ccatgtcaca atacagtcaa gctggcttta     1140
          gccgggagga taggcttgag caggccaaac tcttctgccg gacacttgag gacatcctgg     1200
          cagatgcccc tgagtctcag aacaactgcc gcctcattgc ctaccaggaa cctgcagatg     1260
          acagcagctt ctcgctgtcc caggaggttc tccggcacct gcggcaggag gaaaaggaag     1320
          aggttactgt gggcagcttg aagacctcag cggtgcccag tacctccacg atgtcccaag     1380
          agcctgagct cctcatcagt ggaatggaaa agcccctccc tctccgcacg gatttctctt     1440
          gagacccagg gtcaccaggc cagagcctcc agtggtctcc aagcctctgg actgggggct     1500
          ctcttcagtg gctgaatgtc cagcagagct atttccttcc acagggggcc ttgcagggaa     1560
          gggtccagga cttgacatct taagatgcgt cttgtcccct tgggccagtc atttcccctc     1620
          tctgagcctc ggtgtcttca acctgtgaaa tgggatcata atcactgcct tacctccctc     1680
          acggttgttg tgaggactga gtgtgtggaa gtttttcata aactttggat gctagtgtac     1740
          ttagggggtg tgccaggtgt ctttcatggg gccttccaga cccactcccc acccttctcc     1800
          ccttcctttg cccggggacg ccgaactctc tcaatggtat caacaggctc cttcgccctc     1860
          tggctcctgg tcatgttcca ttattgggga gccccagcag aagaatggag aggaggagga     1920
          ggctgagttt ggggtattga atcccccggc tcccaccctg cagcatcaag gttgctatgg     1980
          actctcctgc cgggcaactc ttgcgtaatc atgactatct ctaggattct ggcaccactt     2040
          ccttccctgg ccccttaagc ctagctgtgt atcggcaccc ccaccccact agagtactcc     2100
          ctctcacttg cggtttcctt atactccacc cctttctcaa cggtcctttt ttaaagcaca     2160
          tctcagatta                                                            2170
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 
              130                 135                 140                 
          Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 
                      260                 265                 270         
          Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 
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          Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 
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          Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 
                  355                 360                 365             
          Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 
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          gttcattttt cactcctccc tcctaggtca cacttttcag aaaaagaatc tgcatcctgg       60
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          agatgcccca ctccagcctg catccatcca tcccgtgtcc caggggtcac ggggcccaga      360
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          Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 
              130                 135                 140                 
          Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Leu Pro Gln Gln Thr Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 
                      260                 265                 270         
          Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 
              290                 295                 300                 
          Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 
                  355                 360                 365             
          Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  2170]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          gttcattttt cactcctccc tcctaggtca cacttttcag aaaaagaatc tgcatcctgg       60
          aaaccagaag aaaaatatga gacggggaat catcgtgtga tgtgtgtgct gcctttggct      120
          gagtgtgtgg agtcctgctc aggtgttagg tacagtgtgt ttgatcgtgg tggcttgagg      180
          ggaacccgct gttcagagct gtgactgcgg ctgcactcag agaagctgcc cttggctgct      240
          cgtagcgccg ggccttctct cctcgtcatc atccagagca gccagtgtcc gggaggcaga      300
          agatgcccca ctccagcctg catccatcca tcccgtgtcc caggggtcac ggggcccaga      360
          aggcagcctt ggttctgctg agtgcctgcc tggtgaccct ttgggggcta ggagagccac      420
          cagagcacac tctccggtac ctggtgctcc acctagcctc cctgcagctg ggactgctgt      480
          taaacggggt ctgcagcctg gctgaggagc tgcgccacat ccactccagg taccggggca      540
          gctactggag gactgtgcgg gcctgcctgg gctgccccct ccgccgtggg gccctgttgc      600
          tgctgtccat ctatttctac tactccctcc caaatgcggt cggcccgccc ttcacttgga      660
          tgcttgccct cctgggcctc tcgcaggcac tgaacatcct cctgggcctc aagggcctgg      720
          ccccagctga gatctctgca gtgtgtgaaa aagggaattt caacgtggcc catgggctgg      780
          catggtcata ttacatcgga tatctgcggc tgatcctgcc agagctccag gcccggattc      840
          gaacttacaa tcagcattac aacaacctgc tacggggtgc agtgagccag cggctgtata      900
          ttctcctccc attggactgt ggggtgcctg ataacctgag tatggctgac cccaacattc      960
          gcttcctgga taaactgccc cagcagaccg gtgaccgtgc tggcatcaag gatcgggttt     1020
          acagcaacag catctatgag cttctggaga acgggcagcg ggcgggcacc tgtgtcctgg     1080
          agtacgccac ccccttgcag actttgtttg ccatgtcaca atacagtcaa gctggcttta     1140
          gccgggagga taggcttgag caggccaaac tcttctgcca gacacttgag gacatcctgg     1200
          cagatgcccc tgagtctcag aacaactgcc gcctcattgc ctaccaggaa cctgcagatg     1260
          acagcagctt ctcgctgtcc caggaggttc tccggcacct gcggcaggag gaaaaggaag     1320
          aggttactgt gggcagcttg aagacctcag cggtgcccag tacctccacg atgtcccaag     1380
          agcctgagct cctcatcagt ggaatggaaa agcccctccc tctccgcacg gatttctctt     1440
          gagacccagg gtcaccaggc cagagcctcc agtggtctcc aagcctctgg actgggggct     1500
          ctcttcagtg gctgaatgtc cagcagagct atttccttcc acagggggcc ttgcagggaa     1560
          gggtccagga cttgacatct taagatgcgt cttgtcccct tgggccagtc atttcccctc     1620
          tctgagcctc ggtgtcttca acctgtgaaa tgggatcata atcactgcct tacctccctc     1680
          acggttgttg tgaggactga gtgtgtggaa gtttttcata aactttggat gctagtgtac     1740
          ttagggggtg tgccaggtgt ctttcatggg gccttccaga cccactcccc acccttctcc     1800
          ccttcctttg cccggggacg ccgaactctc tcaatggtat caacaggctc cttcgccctc     1860
          tggctcctgg tcatgttcca ttattgggga gccccagcag aagaatggag aggaggagga     1920
          ggctgagttt ggggtattga atcccccggc tcccaccctg cagcatcaag gttgctatgg     1980
          actctcctgc cgggcaactc ttgcgtaatc atgactatct ctaggattct ggcaccactt     2040
          ccttccctgg ccccttaagc ctagctgtgt atcggcaccc ccaccccact agagtactcc     2100
          ctctcacttg cggtttcctt atactccacc cctttctcaa cggtcctttt ttaaagcaca     2160
          tctcagatta                                                            2170
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 
              130                 135                 140                 
          Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 
                      260                 265                 270         
          Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 
              290                 295                 300                 
          Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 
                  355                 360                 365             
          Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          gtctgttttg tagatcgaga aatgg                                             25
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          agaatggtca tggatttctt gg                                                22
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          cagctaggga cactacagct caga                                              24
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          ctggcctcct gtacaatgag agt                                               23
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          ctccatagcc ccttctgact ctt                                               23
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          ggcttagtct ggtcttcctc ttacc                                             25
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021

Claims (28)

  1. 一種用於測定個體中「干擾素基因刺激因子」(Stimulator of Interferon Genes (STING))基因之遺傳多型性模式的方法，該方法包含： 擴增獲自個體的樣品中中該STING基因內包含單核苷酸多型性(SNP)的基因體DNA序列；及 對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism；RFLP)模式分析，以測定該樣品中之該STING基因的該遺傳多型性模式。
  2. 一種用於測定以「干擾素基因刺激因子」(STING)促效劑或STING拮抗劑治療個體之功效的方法，該方法包含： 使用如請求項1之方法測定獲自個體之樣品中干擾素基因刺激因子(STING)基因的遺傳多型性模式；及 基於該STING基因的該遺傳多型性模式，確定該個體是否適於STING促效劑或拮抗劑療法。
  3. 如請求項1或2之方法，其中所測定之該STING基因的該多型性模式對應於STING變體R232，視情況，其中該STING變體R232包含或由基本上如SEQ ID No: 2中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 1中所示之核酸序列編碼。
  4. 如請求項1或2之方法，其中所測定之該STING基因的該多型性模式包含對應於STING變體R71H-G230A-R293Q或「HAQ」的SNP，視情況，其中該STING變體R71H-G230A-R293Q或「HAQ」包含或由基本上如SEQ ID No: 4中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 3中所示之核酸序列編碼。
  5. 如請求項1或2之方法，其中所測定之該STING基因的該多型性模式包含對應於STING變體R232H或「H232」的SNP，視情況，其中該STING變體R232H或「H232」包含或由基本上如SEQ ID No: 6中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 5中所示之核酸序列編碼。
  6. 如請求項1或2之方法，其中所測定之該STING基因的該多型性模式包含對應於STING變體G230A-R293Q或「AQ」的SNP，視情況，其中該STING變體G230A-R293Q或「AQ」包含或由基本上如SEQ ID No: 8中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 7中所示之核酸序列編碼。
  7. 如請求項1或2之方法，其中所測定之該STING基因的該多型性模式包含對應於STING變體R293Q或「Q」的SNP，視情況，其中該STING變體R293Q或「Q」包含或由基本上如SEQ ID No: 2中所示之胺基酸序列組成且/或由基本上如SEQ ID No: 1中所示之核酸序列編碼。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該擴增步驟視情況包含PCR， 其中該PCR包含初始變性步驟，該初始變性步驟在介於94與98℃之間、或介於96與98℃之間、或介於97與98℃之間的溫度下進行介於30秒與5分鐘、或介於1分鐘與4分鐘、或介於2分鐘與3分鐘之間的時段；且/或 其中該PCR進行介於20與40個之間的循環、或介於25與35個之間的循環，其中一個循環包括一個變性步驟、一個黏接步驟及一個延長步驟。
  9. 如請求項11之方法，其中該變性步驟係在介於94與98℃、或介於95與98℃、或介於96與98℃、或介於97與98℃之間的溫度下進行介於20秒與2分鐘之間、或介於20秒與1分鐘之間、或介於20秒與30秒之間的時段；且/或 其中該黏接步驟係在介於40與60℃之間、或介於50與60℃之間的溫度下進行介於30秒與2分鐘、或介於30秒與1分鐘之間的時段；且/或 其中該延長步驟係在介於70與75℃之間、或介於71與74℃之間、或介於72與73℃之間的溫度下進行介於30秒與2分鐘之間、或介於30秒與1分鐘之間的時段。
  10. 如請求項8或9之方法，其中該PCR包括最終延長步驟，該最終延長步驟係在介於70與75℃之間、或介於71與74℃之間、或介於72與73℃之間的溫度下進行介於5分鐘與15分鐘之間、或介於6分鐘與14分鐘之間、或介於7分鐘與13分鐘之間、或介於8分鐘與12分鐘之間、或介於9分鐘與11分鐘之間的時段。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該PCR使用一正向引子及一反向引子，該正向引子及反向引子設計成與側接該等SNP的序列雜交，該等SNP對應於該STING變體的胺基酸殘基71、230、232及293。
  12. 如請求項11之方法，其中該SNP位置對應於胺基酸殘基71，其中該正向引子包含基本上如SEQ ID No: 11中所示之核苷酸序列，或其變體或片段，且該反向引子包含基本上如SEQ ID No: 12中所示之核苷酸序列，或其變體或片段。
  13. 如請求項11之方法，其中該SNP位置對應於胺基酸殘基230或232，其中該正向引子包含基本上如SEQ ID No: 13中所示之核苷酸序列，或其變體或片段，且該反向引子包含基本上如SEQ ID No: 14中所示之核苷酸序列，或其變體或片段。
  14. 如請求項11之方法，其中該SNP位置對應於胺基酸殘基293，其中該正向引子包含基本上如SEQ ID No: 15中所示之核苷酸序列，或其變體或片段，且該反向引子包含基本上如SEQ ID No: 16中所示之核苷酸序列，或其變體或片段。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該RFLP模式分析包含：對該基因體DNA進行限制酶消化以產生至少一個片段；及對該至少一個片段進行凝膠電泳。
  16. 如請求項15之方法，其中該限制酶消化反應包含該基因體DNA、緩衝液、限制酶及水。
  17. 如請求項16之方法，其中該限制酶為HhaI且在對應於胺基酸殘基71的位置切割該基因體DNA。
  18. 如請求項16之方法，其中該限制酶為Eco91I且在對應於胺基酸殘基230的位置切割該基因體DNA。
  19. 如請求項16之方法，其中該限制酶為Hin1II且在對應於胺基酸殘基232的位置切割該基因體DNA。
  20. 如請求項16之方法，其中該限制酶為HpaII且在對應於胺基酸殘基293的位置切割該基因體DNA。
  21. 如請求項17之方法，其中當精胺酸位於71位置時，限制酶消化產生750 bp片段及241 bp片段，且/或當組胺酸位於71位置時，限制酶消化產生991 bp片段。
  22. 如請求項18之方法，其中當甘胺酸位於230位置時，限制酶消化產生317 bp片段及184 bp片段，且/或當丙胺酸存在於230位置時，限制酶消化產生501 bp片段。
  23. 如請求項19之方法，其中當精胺酸存在於232位置時，限制酶消化產生501 bp片段，且/或當組胺酸存在於232位置時，限制酶消化產生317 bp片段及184 bp片段。
  24. 如請求項20之方法，其中當精胺酸存在於293位置時，限制酶消化產生162 bp片段、116 bp片段及36 bp片段，且/或當麩醯胺酸存在於293位置時，限制酶消化產生198 bp片段及116 bp片段。
  25. 如請求項15至24中任一項之方法，其中該限制酶消化係在介於35與40℃之間、或介於36與39℃之間、或介於37與38℃之間的溫度下進行介於5分鐘與4小時之間、或介於10分鐘與3小時之間、或介於15分鐘與2小時之間的時段。
  26. 如請求項15至25中任一項之方法，其中該凝膠電泳步驟包含使片段在聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠上進行電泳，其中該凝膠中之聚丙烯醯胺濃度介於5%與10%之間，或介於6%與9%之間，或介於7%與8%之間，且該凝膠中瓊脂糖濃度介於0.5%與4%之間，或在2%與3%之間。
  27. 一種使用如請求項1至26中任一項之方法測定個體中「干擾素基因刺激因子」(STING)基因之遺傳多型性模式的裝置，該裝置包含： 用於擴增獲自個體的樣品中該STING基因內包含單核苷酸多型性(SNP)之基因體DNA序列的構件；及 用於對經擴增的DNA執行限制片段長度多型性(RFLP)模式分析的構件，以測定該樣品中之該STING基因的該遺傳多型性模式。
  28. 一種用於評估個體是否適於「干擾素基因刺激因子」(STING)促效劑或拮抗劑療法的診斷或預後工具，其包含： 使用如請求項1至26中任一項之方法或如請求項27之裝置測定獲自個體之樣品中該干擾素基因刺激因子(STING)的遺傳多型性模式；及 基於該遺傳多型性模式，確定該個體是否適於STING促效劑或拮抗劑療法。
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