KR20070004082A - Ｆｃ 수용체 다형성의 확인을 위한 핵산 기반 분석 - Google Patents

Abstract

FcνRIII 다형성에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드가 개시된다. 또한, 증폭 및/또는 시퀀싱 프라이머로서 본원에 설명된 올리고뉴클레오티드를 사용한 핵산 기반 유전자형 결정 분석이 개시된다.

FcνRIII 다형성, 올리고뉴클레오티드, 유전자형.

Description

ＦＣ 수용체 다형성의 확인을 위한 핵산 기반 분석{NUCLEIC ACID BASED ASSAYS FOR IDENTIFICATION OF FC RECEPTOR POLYMORPHISMS}

본 발명은 대체로 유전자형 결정에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개체의 FcγRIII 유전자형을 정확하고 효율적으로 결정하기 위한 핵산 기반 분석에 관한 것이다.

IgG 수용체(FcγR)는 중성구, 대식 세포, 자연 킬러(NK) 세포 및 다른 세포 유형의 표면에 발현되는 막 결합 당단백질이다. 예를 들면, FcνRIIIA(CD16)는 식세포 작용, 엔도시토시스, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC), 염증 매개자의 분비 및 항원 제시의 증진과 같은 다양한 과정에 관련되는 것으로 나타났다. Van de Winkel et al. (1993) Immunol Today 14 (5):215-21. IgG와 NK 세포의 표면에 발현된 저친화성 FcνRIIIA 수용체의 결합은 ADCC에 기여하는 근본적인 메커니즘으로 간주된다. 예를 들면, 문헌(Clynes et al. (2000) Nature Med. 6:443-446; Cooper et al. (2001) Trends Immunol. 22:633-640; Leibson (1997) Immunity 6:655-661; Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; Mosby, Edinburgh, UK))을 참조하라.

두 FcνRIII 유전자, FcνRIIIa(유전자 A) 또는 FcνRIIIb(유전자 B)가 동정되었다. Ravetch 및 Perussia (1989) J. Exp Med 170:481. FcνRIII 수용체는 염색 체 1의 긴 팔에 지도화되어 있다. Van de Winkel et al. (1993) Immunol Today 14 (5):215-21. 또한, 다양한 기능적 다형성은 아미노산 위치 158번에서 발린(V)을 페닐알라닌(F)으로 치환하는 것을 예측하는 FcνRIIIa의 두 대립유전자의 기능적 다형성(뉴클레오티드 559에서 G→T)을 포함한 FcνRIIIA에서 확인되었다. Koene et al. (1997) Blood 90:1109-1114. FcνRIIIA 158V 대립유전자는 158F 대립유전자보다 사람 IgG1에 더 잘 결합하였고, 158V 대립유전자의 증가된 결합은 효과기 세포의 증가된 활성화 및 더 양호한 ADCC을 가져온다. Shields et al.(2001) J Biol. Chem. 176:6591-6604; Vance et al.(1993) J Immunol. 151:6429-6439. 또한, 치료 결과는 158V/F 다형성에 의하여 영향을 받는 것으로 나타났는데,-- FcνRIIIa 158 F/F 동형접합체는 리투비맙과 같은 치료적 항체에 대한 감소된 반응을 나타낸다. Cartron et al. (2002) Blood 99:754-758; Weng 및 Levy (2003) J. Clin. Oncol. 21:1-8.

FcνRIIIA 158V/F 다형성의 기능적 및 임상적 의미와 관련하여, 일부 그룹이 특정 개체의 유전자형 결정을 위한 PCR-기반 방법을 제안하였다. 예를 들면, Koene et al. (1997) Blood 90 (3):1109-1114; Lepperts et al. (2000) J. Immuno Methods 242:127-132; Jiang et al. (1996) J. Immunol. Methods 199:55-59; Morgan et al. (2003) Rheumatology 42:528-533; Dall'Ozzo et al. (2003) J. Immunol. Methods 277:185-192; 및 미국 특허 제5,830,652호 및 제5,985,561호를 참조하라. 그러나, 다형성 결정에 관한 현재 이용가능한 분석은 10% 이상의 오류율을 가지고, 뿐만 아니라 FcνRIIIA(유전자 A)와 FcνRIIIB(유전자 B) 간을 효율적 으로 또는 정확하게 구별하지 못한다.

따라서, 피험체의 FcνRIII 유전자형을 정확하게 그리고 효율적으로 결정하기 위하여 사용될 수 있는 조성물 및 방법의 개발의 필요성이 있다.

발명의 개요

본 발명은 임의의 샘플에서 FcνRIII 유전자형을 결정하기 위한 민감성, 신뢰성있는 핵산-기반 테스트에 기초한다.

한 양태에서, 본 발명은 길이가 10 내지 60 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 포함한 분리된 올리고뉴클레오티드를 포함하는데, 이 뉴클레오티드 서열은 (a) SEQ ID NO: 1 내지 19로 구성된 군 중에서 선택된 서열; (b) (a)의 뉴클레오티드 서열에 80% 서열 동일성을 가진 뉴클레오티드 서열; 또는 (c) (a)와 (b)의 상보를 포함한다. 본원에 설명된 임의의 분리된 뉴클레오티드는 검출가능한 표지, 예를 들면 형광 표지(예를 들면, 6-카르복시플루오레세인(6-FAM), 테트라메틸 로다민(TAMRA) 및/또는 2',4',5',7',-테트라클로로-4-7-디클로로플루오레세인(TET))를 더 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하는 방법이 본원에 설명되는데, 이 방법은 (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계; (b) 센스 및 안티센스 프라이머로서 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드(예를 들면, SEQ ID NO:1-19)를 포함하는 적어도 첫 번째와 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 올리고뉴클레오티드의 각 조합으로 증폭된 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 증폭된 핵산의 존재 또는 부재는 피험체의 FcνRIII 유전자형을 나타내는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 FcνRIII 다형성에 대하여 특이적이다. 대안적으로, 다른 구체예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 FcνRIII 다형성에 대하여 일반적이다. 본원에 설명된 임의의 방법에서, 올리고뉴클레오티드의 추가적 조합은 예를 들면 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나 이상의 추가적 조합으로 단계 (b) 및 (c)를 반복함으로써 샘플로부터 핵산을 증폭하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 및 두 번째 조합은 각각 한 개의 프라이머를 공통으로 포함한다.

본원에 설명된 어떤 방법에서도, FcνRIIIa의 158V/F 부위의 유전자형은 결정될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 조합은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:2를 포함하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:1을 포함한다. 이러한 프라이머의 조합을 도입하는 방법에서, 올로고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 부재는 158VV 유전자형을 나타내고; 올로고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 부재 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재는 158FF 유전자형을 나타내며; 올로고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재는 158FV 유전자형을 나타낸다.

또한, 본원에 설명된 어떤 방법에서도, 추가적 뉴클레오티드 위치에 피험체의 FcRIII 유전자형도 결정될 수 있는데, 예를 들면 추가적 뉴클레오티드 위치는 121번, 153번, 179번, 207번, 313번 위치 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된다.

본원에 설명된 어떤 방법도 증폭된 핵산 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 사용된 시퀀싱 프라이머는 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

다른 양태에서, 피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계; (b) 분리된 핵산을 증폭하는 단계; (c) 시퀀싱 프라이머로 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드(예를 들면, SEQ ID NO:1-19)의 하나 이상의 적합한 조합을 사용하여 증폭된 핵산 생성물을 시퀀싱하는 단계; 및 (d) 하나 이상의 FcνRIII 다형성의 뉴클레오티드 잔기를 결정함으로써, 피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 증폭(단계 (b))은 센스 및 안티센스 프라이머로서 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 수행된다. 본원에 설명된 시퀀싱 방법 중 임의의 방법에서, FcνRIIIa의 158V/F 부위의 유전자형은 예를 들면 207번 위치의 뉴클레오티드를 결정함으로써 결정될 수 있다(예를 들면, 207번 위치의 오직 G 뉴클레오티드는 158VV를 나타내고; 207번 위치의 오직 T 뉴클레오티드는 158FF 유전자형을 나타내며; 207번 위치의 G와 T 뉴클레오티드는 158FV 유전자형을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에서, FcνRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계; (b) 센스 및 안티센스 프라이머로서 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드(예를 들면, SEQ ID NO:1-19)의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계로서, 각 조합의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 FcνRIIIa 또는 FcνRIIIb에 특이적인 단계; 및 (c) 증폭된 핵산의 존재 또는 부재를 올리고뉴클레오티드의 각 조합으로 검출하는 단계로서, 증폭된 핵산의 존재 또는 부재는 FcνRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 FcνRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계; (b) 분리된 핵산을 증폭하는 단계; (c) 시퀀싱 프라이머로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 적합한 조합을 사용하여 증폭된 핵산을 시퀀싱하는 단계; 및 (d) 121번, 153번, 179번 및 313번 위치의 뉴클레오티드를 결정함으로써, FcνRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 센스 및 안티센스 프라이머로서 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 FcνRIIIa 유전자형 결정을 위한 키트를 포함하는데, 이 키트는 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한 한 쌍 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 FcνRIIIa에 대한 생물학적 샘플의 유전자형 결정을 위한 명시된 설명서를 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 시퀀싱 프라이머, 예를 들면 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.

특정 구체예에서, 상기 방법은 일배체형을 결정하기 위하여 본원에 설명된 다수 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 것과 관련된다.

본원에 설명된 임의의 방법에서, 증폭은 PCR, RT-PCR, 전사-매개 증폭(TMA) 또는 TaqMan^TM 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 FcνRIIIa 유전자형 결정을 위한 키트에 관한 것인데, 상기 키트는 본원에 설명된 한 쌍 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 FcνRIIIa에 대한 생물학적 샘플의 유전자형 결정을 위한 명시된 설명서를 포함한다. 또한, 시퀀싱 프라이머 및 시퀀싱에 관한 설명서는 본원에 설명된 키트에 포함될 수 있거나, 대안적으로, 시퀀싱 시약 및 설명서는 별개의 키트에 포함될 수 있다. 추가적 구체예에서, 키트(들)는 폴리머라제 및 완충액을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 키트는 본원에 설명된 시퀀싱 올리고뉴클레오티드의 한 쌍 이상을 더 포함한다.

본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고하면 명백해질 것이다. 뿐만 아니라, 특정 과정 또는 조성물을 더 상세하게 설명하는 다양한 참고문헌이 본원에 기재되며, 따라서 그들 전체가 참고 인용된다.

도 1, 패널 A 및 B는 FcνRIIIa 및 FcνRIIIb 유전자로부터 뉴클레오티드 서열의 정렬을 도시한다. 도 1A는 FcνRIIIa(윗줄, HSFCGR31로 표지되고 유전자 B라고도 함) 및 FcνRIIIb(아랫줄, HSFCGR32로 표지되고 유전자 A라고도 함)로부터 부분 cDNA 서열을 정렬한다. 유전자 A 또는 유전자 B를 나타내는 위치(473번, 531번 및 641번 위치)뿐만 아니라 V→F 치환을 예측하는 559번 위치의 (유전자 A에서만 일어나는) 단일 뉴클레오티드 다형성은 도 1A에 박스로 나타낸다. 도 1B는 유전자 A 및 유전자 B의 엑손 4를 정렬하고, 엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링하여 313번 위치에 고 특이적 뉴클레오티드 변이를 포함한 두 유전자 간의 다양한 뉴클레오티드 차이를 나타낸다.

도 2는 대표적 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는 SEQ ID NO:1 내지 5의 위치 및 HSFCGR31(유전자 B) 및 HSFCGR32(유전자 A)와 관련된 이들의 정렬을 도시한다.

도 3은 본원에 설명된 증폭 및 시퀀싱 프라이머의 위치를 도시한다. 대표적 증폭(PCR) 프라이머는 두껍고 검은 화살로 나타낸다. 천연 서열에서 발생한 다형성은 검은 막대로 도시된다(엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링한 위치). 대표적 시퀀싱 프라이머는 얇은 화살로 나타낸다. 다형성을 나타내는 313번(A/C)은 엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링된다.

도 4는 엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링하여 본원에 설명된 다양한 프라이머의 위치(SEQ ID NO:6-19)를 도시한다.

도 5, 패널 A 내지 D는 프라이머(SEQ ID NO:1-5)의 다양한 조합으로부터 PCR 증폭 생성물을 나타내는 겔의 재생산이다. 각 레인은 프라이머의 다른 조합을 나타낸다. 각 패널에서 좌측에서 우측으로, 레인 1은 SEQ ID NO:4 및 1로 지정된 프라이머를 사용한 PCR의 결과를 나타내고; 레인 2는 SEQ ID NO:4 및 2로 지정된 프라이머를 사용한 PCR의 결과를 나타내며; 레인 3은 SEQ ID NO:3 및 1로 지정된 프라이머를 사용한 PCR의 결과를 나타내고; 레인 4는 SEQ ID NO:3 및 2로 지정된 프라이머를 사용한 PCR의 결과를 나타내며; 레인 5는 SEQ ID NO:5 및 1로 지정된 프라이머를 사용한 PCR의 결과를 나타내고; 레인 6은 SEQ ID NO:5 및 2로 지정된 프라이머를 사용한 PCR의 결과를 나타낸다. 레인 5에서 증폭 생성물의 존재 및 레인 6에서 증폭 생성물의 부재(공여자 1360, 패널 A 및 공여자 U03-313, 패널 D)는 피험체의 유전자형이 158FF임을 나타낸다. 레인 5에서 증폭 생성물의 부재 및 레인 6에서 증폭 생성물의 존재(공여자 1714, 패널 B)는 피험체의 유전자형이 158VV임을 나타낸다. 두 레인 5와 6에서 증폭 생성물의 존재(공여자 1210, 패널 C)는 피험체의 유전자형이 158FV임을 나타낸다.

도 6은 본원에 설명된 80개 샘플의 유전자형 결정의 결과(예를 들면, PCR 후 시퀀싱)를 도시한다. 각각의 표의 중간 칼럼은 본원에 설명된 PCR-시퀀싱 분석을 사용하여 얻은 유전자형 결정의 결과를 나타낸다. 각각의 표의 우측 칼럼("코엔"이라고 표지됨)은 당업계에 설명된 방법으로 얻은 유전자형 결정 결과를 나타낸다.

도 7은 본원에 설명된 대표적 올리고뉴클레오티드의 서열을 도시한다.

도 8은 본원에 설명된 다른 대표적 올리고뉴클레오티드의 서열을 도시한다.

도 9는 상이한 프라이머 조합의 각 8개 웰의 2개 칼럼을 함유하는 PCR에 대한 96개 웰을 도식적으로 도시한 것이다.

도 10은 도 9에 도시한 플레이트를 사용하여 96개 웰 플레이트 유전자형 결정 분석의 첨가를 도식적으로 도시한 것이다. 3개의 대조군 및 13개의 환자 샘플을 6개의 상이한 프라이머 조합에 대하여 스크리닝한다.

도 11은 PCR-시퀀싱 분석에 사용된 기준 서열을 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 실행은, 달리 지적하지 않는다면, 본 분야의 기술 내에서 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 바이러스학의 종래 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세하게 설명된다. 예를 들면, A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)을 참조하라.

본원에 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 상기 참조든지 하기 참조든지 본원에서 그 전체로서 참고 인용한다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 그 내용이 명백하게 달리 의미하지 않는다면, 복수물을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "올리고뉴클레오티드"에 대한 지시대상은 두 개 이상의 올리고뉴클레오티드의 혼합물 등을 포함한다.

하기 아민노산 약어는 텍스트 전반에 사용된다:

알라닌: Ala (A) 아르기닌: Arg (R)

아스파라긴: Asn (N) 아스파르산: Asp (D)

시스테인: Cys (C) 글루타민: Gln (Q)

글루탐산: Glu (E) 글리신: Gly (G)

히스티딘: His (H) 이소류신: Ile (I)

류신: Leu (L) 리신: Lys (K)

메티오닌: Met (M) 페닐알라닌: Phe (F)

프롤린: Pro (P) 세린: Ser (S)

트레오닌: Thr (T) 트립토판: Trp (W)

티로신: Tyr (Y) 발린: Val (V)

I. 정의

본 발명을 설명함에 있어서, 하기 용어를 사용할 것이며, 하기에 지시한 바와 같이 정의되도록 의도된다.

용어 "유전자형 결정", "일배체형 결정" 및 "DNA형 결정"은 개체의 선택된 염색체 또는 염색체의 부분의 대립유전자의 결정을 나타내는 것으로 상호교환하여 사용한다.

"분리된"은 폴리펩티드를 언급할 때, 분자가 자연 상태에서 발견되거나 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적 부재시에 존재하는 전체 개체와 지시된 분자가 분리되고 구별되는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드와 관련된 용어 "분 리된"은 자연 상태에서 그것과 정상적으로 연관된 서열이 전체 또는 부분적으로 결핍된 핵산 분자; 또는 자연 상태에 존재하는 바와 같지만, 그것과 연관된 이종 서열을 가지는 서열; 또는 염색체와 해리된 분자이다.

용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 리보뉴클레오티드나 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 이 용어는 분자의 일차 구조만을 나타낸다. 따라서, 이 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 DNA뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 RNA를 포함한다. 또한, 예를 들면 메틸화 및/또는 캡핑에 의한 변형 및 폴리뉴클레오티드의 비변형된 형태를 포함한다. 더욱 특히, 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 폴리디옥시리보뉴클레오티드(2-디옥시-D-리보스를 포함), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스를 포함), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 폴리뉴클레오티드의 임의의 다른 유형, 및 비뉴클레오티드 백본을 함유하는 다른 폴리머, 예를 들면, 폴리아미드(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)) 및 폴리모르폴리노(Anti-Virals, Inc.에서 시중 입수 가능, 오레곤주 코발리스 소재, Neugene) 폴리머를 포함하고, 다른 합성 서열-특이적 핵산 폴리머는 폴리머가 DNA 및 RNA에서 발견되는 바와 같은 염기 쌍형성 및 염기 스태킹을 허용하는 구조의 핵염기를 함유한다는 것을 제공한다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자" 간에 길이 상의 의도된 구별은 없으며, 이들 용어는 상호 교환해서 사용될 것이다. 이들 용어는 분자의 일차 구조만을 나타낸다. 따라서, 이들 용어는 예를 들면 3'-디옥시-2',5'-DNA, 올리 고디옥시리보뉴클레오티드 N3'P5' 포스포라미드산염, 2'-O-알킬-치환 RNA, 이중- 및 단일-가닥의 DNA 뿐만 아니라 이중- 및 단일-가닥의 RNA, DNA: RNA 하이브리드, 및 PNA와 DNA 또는 RNA 간의 하이브리드를 포함하고, 또한 공지된 유형의 변형, 예를 들면 당업계에 공지된 표지, 메틸화, "캡", 하나 이상의 자연적으로 발생한 뉴클레오티드를 유사체로 치환, 인터뉴클레오티드 변형, 예를 들면 비전하 결합을 가진 것들(예를 들면, 메틸 인산, 포스포트리에스테르, 포스포라미드산염, 카르바메이트), 음전하 결합을 가진 것들(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 및 양전하 결합을 가진 것들(예를 들면, 아미노알킬포스포라미드산염, 아미노알킬포스포트리에스테르), 매달려 있는 부분을 함유한 것들, 예를 들면 (뉴클리아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등을 포함한) 단백질, 삽입되는 물질을 가진 것들(예를 들면, 아크리딘, 소라렌 등), 킬레이터를 함유한 것들(예를 들면, 금속, 방사능 금속, 보론, 산화성 금속 등), 알킬레이터를 함유한 것들, 변형된 결합을 가진 것들(예를 들면, 알파 아노머 핵산 등) 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 비변형된 형태를 포함한다. 특히, DNA는 디옥시리보핵산이다.

지시된 서열"로부터 유래된" 또는 지시된 서열"에 특이적인" 폴리뉴클레오티드는 지시된 뉴클레오티드 서열의 영역에 상응하는, 즉 동일하거나 상보적인 약 6개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 8개 이상의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 약 10-12개 이상의 뉴클레오티드, 및 보다 더 바람직하게는 약 15-20개 이상의 뉴클레오티드의 인접한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 유래 된 폴리뉴클레오티드는 반드시 관심대상의 뉴클레오티드 서열로부터 물리적으로 유래될 필요는 없겠지만, 한정하는 것은 아니지만, 폴리뉴클레오티드가 유래된 영역(들)에 있는 염기의 서열에 의하여 제공된 정보에 기초한 화학합성, 복제, 역전사 또는 전사를 포함한 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 이와 같이, 이것은 원래의 폴리뉴클레오티드의 센스 또는 안티센스 배향을 나타낼 수 있다.

"상동성"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 부분 사이의 유사성 비율을 말한다. 두 폴리뉴클레오티드, 또는 두 폴리펩티드 서열은 서열이 약 50% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 더 바람직하게는 약 80%-85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95%-98% 이상의 분자의 한정된 길이에 대한 서열 유사성을 나타낼 때 서로 서로에게 "실질적으로 상동"이다. 또한, 본원에 사용된 실질적으로 상동은 열거된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다.

대체로, "동일성"은 각각 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 일치를 말한다. 동일성 백분율은 서열을 정렬하고, 두 정렬된 서열 간에 짝지은 것들을 정확하게 계수하며, 더 작은 서열의 길이에 의하여 분리하고, 그 결과를 100으로 곱함으로써 두 분자간 서열 정보의 직접적 비교에 의하여 결정할 수 있다.

펩티드 분석을 위하여 (Smith 및 Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981))의 국부 상동성 알고리즘을 채용한, (Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, 워싱턴, DC 소재)에서 ALIGN, Dayhoff, M.O.와 같이, 용이하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 상동성 및 동일성의 분석에 보조기로 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 상동성을 결정하기 위한 프로그램은 위스콘신 서열 분석 패키지, 버젼 8(Genetics Computer Group에서 입수 가능, 위스콘신주 매디슨 소재), 예를 들면 Smith 및 Waterman 알고리즘에도 의존하는 BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램으로 사용가능하다. 이들 프로그램은 제조업자에 의하여 추천되고, 위에 언급된 위스콘신 서열 분석 패키지에 설명된 디폴트 매개변수로 용이하게 이용된다. 예를 들면, 기준 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 상동성 백분율은 디폴트 수치화 표 및 6개 뉴클레오티드 위치의 간격 페널티를 가진 Smith 및 Waterman의 상동성 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.

본 발명의 관계에서 상동성 백분율을 확립하는 다른 방법은 John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의하여 개발되고, IntelliGenetics, Inc.(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 의하여 분배된, 에딘버러 대학이 저작권을 가진 프로그램의 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 이러한 패키지로부터, Smith-Waterman 알고리즘은 디폴트 매개변수가 수치화 표에 대하여 사용되는 곳에 도입될 수 있다(예를 들면, 12 개의 간격 오픈 페널티, 1 개의 갭 연장 페널티, 및 6 개의 갭). 생성된 데이터로부터, "정합(Match)" 값은 "서열 상동성"을 반영한다. 서열 간 동일성 또는 유사성 백분율을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 대체로 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들면 다른 정렬 프로그램으로는 디폴트 매개변수로 사용된 BLAST이다. 예를 들면, BLASTN 및 BLASTP는 하기 디폴트 매개변수를 사용하여 사용될 수 있다: 유전 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대값 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 소팅 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 것은 하기 인터넷 주소에서 확인할 수 있다: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

대안적으로, 상동성은 상동 영역 간의 안정한 중복부분을 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화, 그 후 단일-가닥-특이적 뉴클리아제(들)에 의한 분해 및 분해된 단편의 크기 결정에 의하여 결정될 수 있다. 실질적으로 상동인 DNA 서열은 예를 들면 특정 시스템에 한정하는 것과 같은 엄격한 조건 하의 서던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 한정하는 것은 본 분야의 기술 내에 있다. 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., 상기 참조; DNA Cloning, 상기 참조; Nucleic Acid Hybridization, 상기 참조)을 참조하라.

핵산을 설명하기 위하여 본원에 사용된 "재조합"은 그것의 기원 또는 조작 때문에 그것이 자연상태에서 연관되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 부분과 연관되지 않는 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련되어 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의하여 생성된 폴리펩티드를 의미한다. 대체로, 관심대상의 유전자를 클로닝하고, 그 후 하기 더 설명하는 바와 같이 형질전환된 개체에서 발현시킨다. 숙주 개체는 외래 유전자를 반현시켜 발현 조건 하에서 단백질을 생성한다.

"DNA-의존성 DNA 폴리머라제"는 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 사본을 합성하는 효소이다. 예로는 대장균(E. coli)에서 비롯된 DNA 폴리머라제 I과 박테리오파지 T7 DNA 폴리머라제가 있다. 모든 공지된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 합성을 개시하기 위해서 상보적 프라이머를 필요로 한다. 적합한 조건 하에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA 사본을 합성할 수 있다.

"DNA-의존성 RNA 폴리머라제" 또는 "전사효소"는 (대개 이중 가닥) 프로모터 서열을 가지는 이중 가닥 또는 부분적 이중 가닥 DNA 분자로부터 다수의 RNA 사본을 합성하는 효소이다. RNA 분자("전사체")는 프로모터의 바로 다운스트림의 특정 위치에서 시작하여 5'에서 3' 방향으로 합성된다. 전사효소의 예로는 대장균에서 비롯된 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6가 있다.

"RNA-의존성 DNA 폴리머라제" 또는 "역전사효소"는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA 사본을 합성하는 효소이다. 또한, 모든 공지된 역전사효소는 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 사본을 만드는 능력을 가진다; 따라서, 이들은 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제이다. 프라이머는 RNA 및 DNA 주형과의 합성을 개시하는 데 필요하다.

"RN아제 H"는 RNA:DNA 중복부분의 RNA 부분을 떨어뜨리는 효소이다. 이들 효소는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 대부분의 역전사효소는 보통 그들 자신의 폴리머라제 활성뿐만 아니라 RN아제 H 활성을 함유한다. 그러나, RN아제 H의 다른 공급원은 연관된 폴리머라제 활성없이 이용가능하다. 대안적으로, RN아제 H는 다양한 위치에서 RNA를 절단할 수 있어서 RNA의 부분이 녹거나 효소가 RNA의 부분을 풀게 한다.

본원에 사용된 용어 "표적 핵산 영역" 또는 "표적 핵산"은 증폭되는 "표적 서열"을 가진 핵산 분자를 나타낸다. 표적 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있고, 증폭될 수 없는 표적 서열 옆의 다른 서열들을 포함할 수 있다. 용어 "표적 서열"은 증폭되는 표적 핵산의 특정 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 표적 서열은 표적 분자 내에 함유된 프로브-혼성화 영역을 포함할 수 있는데, 프로브는 이것과 원하는 조건 하에서 안정한 하이브리드를 형성할 것이다. 또한, "표적 서열"은 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표적 서열을 주형으로 사용하여 복합체를 형성하고 연장되는 복합체형성 서열을 포함할 수 있다. 표적 핵산이 원래 단일 가닥인 경우, 용어 "표적 서열"은 또한 표적 핵산에 존재하는 "표적 서열"에 대하여 상보적인 서열을 나타낸다. "표적 핵산"이 원래 이중 가닥인 경우, 용어 "표적 서열"은 플러스(+) 및 마이너스(-) 가닥 모두를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "프라이머" 또는 "올리고뉴클레오티드 프라이머"는 즉 뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA 폴리머라제와 같은 중합유도제의 존재 및 적합한 온도, pH, 금속 농도 및 염 농도에서 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 놓여졌을 때 상보적 핵산 가닥의 합성을 개시하도록 작용하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직하게는, 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위하여 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 연장 생성물을 준비하는 데 사용되기 전에 그것의 가닥을 분리하도록 먼저 처리될 수 있다. 통상적으로, 이 변성 단계는 열에 의하여 영향을 받지만, 대안적으로 알칼리 사용 후 중화시킴으로써 수행될 수 있다. 따라서, "프라이머"는 주형에 상보적이어 서, 주형과 수소 결합 또는 혼성화에 의한 복합체를 형성하여 폴리머라제에 의하여 합성의 개시를 위한 프라이머/주형 복합체를 형성하며, 이것은 DNA 또는 RNA 합성의 과정에서 주형에 상보적인 그것의 3' 말단에 연결된 공유결합된 염기를 첨가함으로써 연장된다.

본원에 사용된 용어 "프로브" 또는 "올리고뉴클레오티드 프로브"는 표적 핵산 분석물질에 존재하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하는, 상기에서 한정한 폴리뉴클레오티드로 구성된 구조를 나타낸다. 프로브의 폴리뉴클레오티드 영역은 DNA 및/또는 RNA 및/또는 합성 뉴클레오티드 유사체로 구성될 수 있다. "올리고뉴클레오티드 프로브"가 5' 뉴클리아제 분석, 예를 들면 TaqMan^TM 기술에 사용될 때, 프로브는 임의의 증폭된 표적 올리고뉴클레오티드 서열을 검출하기 위하여 반응에 사용된 폴리머라제의 5' 엔도뉴클레아제 활성에 의하여 분해되는 하나 이상의 형광물질 및 하나 이상의 켄쳐(quencher)를 함유할 것이다. 이러한 상황에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 그것의 5' 말단에 인접한 충분한 수의 인산화 결합을 가져서, 도입된 5'-3' 뉴클레아제 활성은 결합한 프로브를 효율적으로 떨어뜨려 형광물질과 켄쳐를 분리시킬 수 있을 것이다. 올리고뉴클레오티드 프로브가 TMA 기술에 사용될 때, 하기에 설명하는 바와 같이 적합하게 표지될 것이다.

혼성화 서열은 안정한 하이브리드를 제공하기 위하여 완전한 상보성을 가질 필요는 없는 것으로 이해될 것이다. 많은 상황에서, 안정한 하이브이드는 4개 이상의 뉴클레오티드의 루프를 무시하고, 염기의 약 10%가 부정합인 곳에서 형성할 것 이다. 다라서, 본원에 사용된 용어 "상보성"은 대체로 약 90% 이상의 상보성이 있는 분석 조건 하에서 그것의 "상보 가닥"과 안정한 이중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.

용어 "혼성화하다" 및 "혼성화"는 Watson-Crick 염기쌍을 통하여 복합체를 형성하도록 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열 간의 복합체의 형성을 나타낸다. 프라이머가 표적(주형)과 "혼성화하는" 경우, 이러한 복합체(또는 하이브리드)는 예를 들면 DNA 폴리머라제가 DNA 합성을 개시하는 데 필요한 시동 기능의 역할을 하도록 충분히 안정적이다.

본원에 사용된 용어 "결합 쌍"은 핵산 이중 가닥을 형성할 수 있는 상보적 폴리뉴클레오티드 쌍과 같이, 서로서로 특이적으로 결합하는 첫 번째 및 두 번째 분자를 나타낸다. 샘플에서 결합 쌍의 두 번째 구성요소에 대한 결합 쌍의 첫 번째 구성요소의 "특이적 결합"은 샘플에서 다른 구성성분보다 더 높은 친화성과 특이성으로 두 번째 구성요소에 대한 첫 번째 구성요소의 결합, 또는 그 역에 의하여 입증된다. 결합 쌍의 구성요소 간의 결합은 통상적으로 비공유결합이다. 문맥이 명백하게 달리 의미하지 않는 한, 용어 "친화성 분자" 및 "표적 분석물질"은 본원에서 결합 쌍의 첫 번째 및 두 번째 구성요소를 각각 나타내는 데 사용된다.

용어 "특이적-결합 분자" 및 "친화성 분자"는 본원에서 상호 교환하여 사용되며, 화학적 또는 물리적 수단을 통하여 샘플에 존재하는 검출가능한 물질에 선택적으로 결합하는 분자를 나타낸다. "선택적으로 결합하다"는 다른 분자보다 관심대상의 표적에 우선적으로 결합하거나 표적에 더 큰 친화성을 가지고 결합하는 것을 의미한다. 예를 들면, DNA 분자는 실직적으로 상보적인 서열에 결합하고, 무관한 서열에는 결합하지 않을 것이다.

이중 가닥 DNA의 "변성 온도(melting temperature)" 또는 "T_m"은 가열로 인하여 또는 예를 들면 산 또는 알칼리 처리 등에 의한 염기 쌍 간의 수소 결합의 다른 해리로 인하여 DNA의 나선 구조의 절반을 잃어버리는 온도로 정의한다. DNA 분자의 T_m은 그것의 길이 및 그것의 염기 조성에 의존한다. GC 염기쌍이 풍부한 DNA 분자는 AT 염기쌍을 풍부하게 가지는 것들보다 더 높은 T_m 가진다. 분리된 DNA의 상보적 가닥은 온도가 T_m 아래로 내려갈 때 자발적으로 재결합 또는 어닐링하여 이중 가닥 DNA를 형성한다. 가장 높은 속도의 핵산 혼성화는 T_m의 약 25℃ 아래에서 발생한다. T_m은 하기 관계식을 사용하여 계산할 수 있다: T_m = 69.3 + 0.41(GC)% (Marmur et al. (1962) J. Mol. Biol. 5:109-118).

본원에 사용된 용어 "표지" 및 "검출가능한 표지"는, 한정하는 것은 아니지만, 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광체, 발색단, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제, 발색단, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 반도체 나노결정, 리간드(예를 들면, 비오틴, 아비딘, 스트렙파비딘 또는 헵텐) 등을 포함하는, 검출할 수 있는 분자를 나타낸다. 용어 "형광물질"은 검출가능한 범위에서 형광을 방출할 수 있는 물질 또는 그것의 부분을 나타낸다.

본원에 사용된 "고체 지지체"는 자성 비드, 라텍스 비드, 마이크로적정기 플 레이트 웰, 유리 플레이트, 나일론, 아가로스, 아크릴아미드 등과 같은 고체 표면을 나타낸다.

본원에 사용된 "생물학적 샘플"은, 한정하는 것은 아니지만, 혈액, 혈장, 혈청, 찌꺼기, 오줌, 골수, 담즙, 척수액, 림프액, 피부의 샘플, 피부의 방출, 호흡관, 장관 및 생식비뇨관, 눈물, 침, 젖, 혈액 세포, 기관, 생검물과 같은, 피험체로부터 분리한 조직 또는 액체의 샘플 및, 한정하는 것은 아니지만, 배양 배지에 있는 세포 및 조직, 예를 들면 재조합 세포 및 세포 성분의 성장으로부터 얻은 조성 배지를 포함한 시험관 내 세포 배양 구성물의 샘플을 나타낸다. 상기에 상세하게 설명한 샘플은 반드시 직접 얻은 형태일 필요는 없다. 예를 들면, 샘플은 예를 들면 분석 전 열처리, 원심분리 등과 같이, 사용 전에 처리될 수 있다.

"척추동물 피험체"는, 한정하는 것은 아니지만, 말과 사람과 같은 포유동물 및 조류 종을 포함한 척색동물 아문 중의 임의의 구성원을 의미한다. 용어는 특정 연령을 나타내지 않는다. 따라서, 태아뿐만 아니라 성체 및 신생 동물을 포괄하는 의미이다.

II . 일반 개관

피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하기 위한 다양한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 특히, FcνRIIIa의 158V/F 부위의 피험체의 유전자형을 결정하는 데 사용될 수 있는 신규 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 프라이머)가 설명된다. 본원에 설명된 분석의 정확성은 본원에 설명된 조성물 및 방법이 유전자 A와 유전자 B 사이를 명백하게 구별할 수 있다는 사실로부터 부분적으로 유래된다. 유전자 A와 유전자 B가 모두 염색체 1에 대한 지도임에도 불구하고, 본 개시는 유전자 B가158V/F 다형성을 포함하지 않지만, 오히려 항상 VV 동종접합이라는 것을 결정적으로 입증한다.

또한, 본원에 설명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한 FcνRIII 유전자형 결정의 방법이 설명된다. 158F/V 부위의 FcνRIIIa 유전자형은 단일 PCR 반응(예를 들면, 한 세트의 프라이머); 다중 PCR 반응의 평가(예를 들면, 프라이머의 다른 조합); 및/또는 단일 또는 다중 PCR 반응 후 시퀀싱 또는 다른 핵산 기반 분석 기술에 의하여 결정할 수 있다.

본원에 사용된 조성물 및 방법을 사용하여, 특정한 개체는 예를 들면 치료 프로토콜을 더 잘 결정하기 위하여 용이하게 유전자형 결정될 수 있다. 따라서, 임의의 피험체의 약물유전학 분석이 용이하게 수행될 수 있다.

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정 제제 또는 과정에 한정되지 않고, 이는 물론 다양할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 용어는 오직 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 한정하려는 의도는 아니다.

본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 다수의 조성물 및 방법이 본 발명의 실행에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법은 본원에 설명된다.

III . 올리고뉴클레오티드

개체의 FcνRIII 일배체형을 결정하는 데 유용한 신규 뉴클레오티드 서열을 본원에 기재한다. 또한, 본원에 기재된 프라이머 서열은 FcνRIIIA(유전자 A)와 FcνRIIIB(유전자 B) 간을 정확하게 구별하는 데 사용되었다.

편의상, 유전자 A 및 B 모두의 코딩 서열(cDNA)을 인식하는 프라이머의 넘버링 및 정렬은 문헌(Ravetch and Perussia (1989) J. Exp Med 170:481) 및 NCBI 기탁번호 NM_000569에 관하여 이루어진다. 마찬가지로, 게놈 DNA을 인식하는 프라이머의 넘버링 및 정렬은 엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 이루어진다.

대체로, 본원에 설명된 서열은 프라이머, 예를 들면 PCR 프라이머 및/또는 시퀀싱 프라이머로서 유용하다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 프라이머는 유전자 A 또는 유전자 B에 비-특이적 또는 특이적일 수 있고, 추가적으로 또한 하나 이상의 다형성, 바람직하게는 158F/V 단일 뉴클레오티드 다형성에 특이적일 수 있다(도 1). 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 도 2에 도시된 하나 이상의 추가적 다형성을 포함한 서열을 또한 증폭할 것이다. 이러한 서열의 무한정한 예를 표 1에 나타낸다.

따라서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 다형성(예를 들면, 158F/V 다형성)을 한정하는 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 유전자 A와 유전자 B를 구별하는 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 사용된 프라이머는 적어도 158F/V 다형성을 포함한 서열을 증폭시킨다. 특정 구체예에서, 사용된 프라이머는 다중 다형성을 포함한 서열을 증폭시킨다. 예를 들면, 도 3에 나타낸 바와 같이, 프라이머는, 반드시 한정하는 것은 아니지만, 엑손 4의 첫 번째 염기에 관해서 넘버링한, 121번 (G/A), 153번 (T/C), 179번 (C/T), 207번 (G/T) 및 313번 (C/A) 위치에 다형성을 포함한 서열을 증폭시킨다. 첫 번째 4 개의 위치는 NM_000569에 관하여 넘버링한 473번 (G/A), 505번 (T/C), 531번 (C/T) 및 559번 (G/T) 위치에 상응한다.

또한, 하기 실시예에 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 개시는 또한 엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링한 313번 위치의 단일 뉴클레오티드(A/C) 차이가 유전자 A 또는 유전자 B에 대하여 고도로 특이적이라는 발견을 나타낸다. 특히, 유전자 A의 경우, A 잔기가 이 위치에서 항상 발견되는 반면, 유전자 B의 경우, C 잔기가 이 위치에서 항상 발견된다. 따라서, 특정 구체예에서, 프라이머는 이 잔기를 포함하고, 따라서 유전자 A 또는 유전자 B에 특이적일 것이다.

특정 구체예에서, 구별되는 염기(예를 들면, 다형성 및/또는 유전자 A- 또는 B-특이적 염기)는 올리고뉴클레오티드 (프라이머) 서열의 말단 염기이다. 예를 들면, 도 2에 도시한 바와 같이, 3' 프라이머 158-3'A(SEQ ID NO:1)의 3' 뉴클레오티드는 158F 일배체형(예를 들면, 559번 위치의 T)에 대하여 특이적인 반면, 3' 프라이머 158-3'C(SEQ ID NO:2)의 3' 뉴클레오티드는 158V 일배체형(예를 들면, 559번 위치의 G)에 대하여 특이적이다. 유사하게, 3' 프라이머 5'T (SEQ ID NO:3)의 5' 뉴클레오티드는 유전자 B(531번 위치의 T)에 대하여 특이적인 반면에, 5' 프라이머 5'C (SEQ ID NO:5)의 3' 뉴클레오티드는 유전자 A(531번 위치의 C)에 특이적이다. 5' 프라이머 5'A (SEQ ID NO:4)는 그것이 530번 위치에서 끝나므로 유전자 A 및 유전자 B 모두에 대하여 일반적이다.

또한, 본원에 개시된 프라이머는 천연 유전자 A 또는 유전자 B 서열과 하나 이상의 부정합을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 부정합된 염기쌍의 도입은 유전자의 특이성을 증진시켰다. 바람직하게는 부정합은 프라이머의 내부이다. 특히 유용한 올리고뉴클레오티드는 각각 도시된 다양한 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 서열, 또는 그것에 대한 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같은 범위 내의 임의의 동일성 비율을 포함한, 그것에 대한 약 80-90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드가 유래되는 영역은 대체로 하나 이상의 다형성을 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 결합의 친화성을 향상시키기 위해서 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 유도체가 생성될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프라이머의 특정 길이는 중요하지 않고, 당업자에 의하여 용이하게 설계될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 특정 보존 영역의 약 5 내지 약 500 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10 내지 약 100 뉴클레오티드, 또는 더 바람직하게는 약 10 내지 약 60 뉴클레오티드, 또는 관심대상의 보존 영역으로부터 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26...35...40 등의 뉴클레오티드를 포함한 서열과 같은 범위 내의 임의의 정수를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머 서열은 길이 약 10 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 길이 약 15 내지 30 뉴클레오티드(길이 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드를 포함함) 및 보다 더 바람직하게는, 길이 약 15 내지 25 뉴클레오티드이다.

본원에 기재된 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 프라이머 및 프로브)는 표준 기술, 예를 들면 본원에 그 전체가 참고 인용된, 미국 특허 제4,458,066호 및 제4,415,732호에 개시된 포스포라미디트 화학을 통한 고체상 합성; Beaucage et al. (1992) Tetrahedron 48:2223-2311; 및 Applied Biosystems User Bulletin 제13호(1987년 4월 1일)에 의하여 용이하게 합성된다. 다른 화학합성은 예를 들면 문헌(Narang et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:90)에 기재된 포스포트리에스테르 방법 및 문헌(Brown et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:109)에 기재된 포스포디에스테르 방법을 포함한다. 폴리 A 또는 폴리 C, 또는 다른 상보적 뉴클레오티드 연장은 이러한 동일한 방법을 사용하여 프로브 내로 혼입될 수 있다. 헥사에틸렌 산화물 연장은 당업계에 공지된 방법에 의하여 프로브에 결합될 수 있다. Cload et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326; 미국 특허 제4,914,210호, Levenson et al.; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359; 및 Horn et al. (1986) Tet. Lett. 27:4705-4708.

또한, 올리고뉴클레오티드는 검출을 위해 표지에 결합될 수 있다. 표지의 첨가를 허용하는 반응적 상관성을 가진 올리고뉴클레오티드의 유도체를 형성하기 위한 공지된 일부 수단이 있다. 예를 들면, 일부 접근법은 방사성, 형광, 화학형광, 효소 또는 전자 밀집 표지가 아비딘을 통하여 부착될 수 있도록 비오틴화 프로브에 이용가능하다. 예를 들면, 페리틴-아비딘-비오틴 표지의 사용을 개시하는 문헌(Broken et al., Nucl. Acids Res. (1978) 5:363-384); 및 아미노알킬포스포라미드 연결 팔을 통한 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 비오틴화를 개시하는 문헌(Chollet et al. Nucl. Acids Res. (1985) 13:1529-1541)을 참조하라. 또한, 일부 방법은 아미노 반응기, 예를 들면 이소티오시안산염, N-히드록시숙신이미드 등에 의하여 유도체형성된 형광 또는 다른 유형의 화합물에 의하여 용이하게 표지되는 아미노-유도체형성된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 이용할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Connolly (1987) Nucl. Acids Res. 15:3131-3139, Gibson et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:6455-6467 및 Miyoshi et al.의 미국 특허 제4,605,735호)를 참조하라. 또한, 티올-특이적 표지와 반응할 수 있는 술프히드릴-유도체형성된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법을 사용할 수 있다. DNA 단편의 표지에 대한 방법론의 전반적 개관은 문헌(Matthews et al., Anal. Biochem. (1988) 169:1-25)에 제공된다.

예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 프로브의 비-리게이션 말단에 형광 분자를연결함으로써 형광으로 표지될 수 있다. 적합한 형광 표지를 선택하기 위한 안내는 문헌(Smith et al., Meth. Enzymol. (1987) 155:260-301; Karger et al., Nucl. Acids Res. (1991)19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes, Inc., Eugene, 오레곤주 소재). 바람직한 형광 표지는 미국 특허 제4,318,846호 및 문헌(Lee et al., Cytometry (1989) 10:151-164)에 개시된 플루오레세인 및 이것의 유도체 및 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 또는 NAN-2 등을 포함한다.

추가적으로, 올리고뉴클레오티드는 하기에 설명하는 기술을 사용하여 아크리디늄 에스테르(AE)로 표지할 수 있다. 현 기술은 AE 표지가 프로브 내의 임의의 위치에 놓여 지도록 할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Nelson et al. (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" in Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L.J.(ed) Press, San Diego, CA; Nelson et al. (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR" in The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090)을 참조하라. AE 분자는 프로브 내의 임의의 위치에 표지의 배치를 허용하는 비-뉴클레오티드-기반 연결 팔에 직접 연결될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,585,481호 및 제5,185,439호를 참조하라.

IV . 핵산 기반 분석

그 후, 본원에 기재된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 FcνRIII 일배체형, 예를 들면 158V/F 다형성의 FcνRIIIa 일배체형을 결정하기 위하여 하나 이상의 핵산 기반 분석에 사용된다.

유전자형 결정은 임의의 적합한 샘플에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 구아니디움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출과 같은 표준 기술을 사용하여 FcνRIII을 발현하는 세포로부터 용이하게 분리될 수 있다(Chomocyznski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156). RNA 및/또는 게놈 DNA를 분리할 수 있다. 그 후, 바람직하게는 분리된 핵산(RNA 또는 DNA)은 증폭된다.

통상적으로, 표적 핵산의 증폭은 핵산 폴리머라제를 사용하여 표적 핵산 또는 그것의 단편의 다중 사본을 생산한다. 적합한 증폭 기술, 예를 들면 전사 매개 증폭, 폴리머라제 연쇄반응(PCR), 레플리카제 매개 증폭 및 리가제 연쇄반응(LCR)은 당업계에 잘 공지되어 있다.

A. 폴리머라제 연쇄반응( PCR )

특정 구체예에서, 증폭 과정은 임의의 생물학적 샘플에서 FcRIII 일배체형을 결정하기 위하여 RT-PCR과 같은 폴리머라제 연쇄반응(PCR)-기반 기술을 포함한다. PCR은 핵산 분자 또는 분자의 혼합물에 함유된 원하는 표적 핵산 서열을 증폭하기 위한 기술이다. PCR에서, 한 쌍의 프라이머가 초과 도입되어 표적 핵산의 상보적 가닥에 혼성화한다. 프라이머는 각각 표적 핵산을 주형으로 사용하여 폴리머라제에 의하여 연장된다. 연장 생성물은 원래의 표적 가닥으로부터 해리된 후 표적 서열 자체가 된다. 그 후, 새로운 프라이머가 혼성화되고 폴리머라제에 의하여 연장되며, 순환이 반복되어 표적 서열 분자의 수를 기하학적으로 증가시킨다. 샘플에서 표적 핵산 서열을 증폭시키기 위한 PCR 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 문헌(Innis et al. (eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: basic principles and automation, in PCR: A Practical Approach, McPherson et al. (eds.) IRL Press, Oxford; Saiki et al. (1986) Nature 324:163; 뿐만 아니라 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,889,818호)에 기재되어 있으며, 이들은 그 전체로서 본원에 참고 인용된다.

특히, PCR은 증폭되고 배향된 표적 뉴클레오티드 서열의 양쪽에 인접해 있는 상대적으로 작은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이들의 3' 말단이 서로 마주보고, 각 프라이머가 다른 것 쪽으로 연장한다. 폴리뉴클레오티드 샘플은 추출되어 바람직하게는 열로 변성되고 몰 과량으로 존재하는 첫 번째 및 두 번째 프라이머와 혼성화된다. 중합반응은 프라이머- 및 주형-의존적 폴리뉴클레오티드 중합제, 예를 들면 프라이머 연장 생성물을 생산할 수 있는 효소, 예를 들면 대장균 DNA 폴리머라제 I, DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편, T4 DNA 폴리머라제, 다양한 공급원(예를 들면, Perkin Elmer)으로부터 이용할 수 있는, 호열균(Thermus aquaticus), 터무스 터모필루스(Thermus thermophilus)(United States Biochemicals), 바실루스 스테레오터모필루스(Bacillus stereothermophilus)(Bio-Rad) 또는 터모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)("Vent" 폴리머라제, New England Biolabs)으로부터 분리한 열안정 DNA 폴리머라제(Taq)를 사용하여 4개 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP -- dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)의 존재 하에 촉매된다. 이 결과는 원래 가닥의 새롭게 합성된 상보서열에 공유결합된 이들의 5' 말단에 각각의 프라이머를 함유하는 두 "긴 생성물"을 야기한다. 그 후, 반응 혼합물은 예를 들면 온도를 저하, 변성제를 비활성화 또는 폴리머라제를 더 첨가함으로써 중합반응 조건으로 돌아간다. 두 번째 순환은 두 원래의 가닥, 첫 번째 순환으로부터의 두 긴 생성물, 원래의 가닥으로부터 복제된 두 새로운 긴 생성물 및 긴 생성물로부터 복제된 두 "짧은 생성물"을 제공한다. 짧은 생성물은 각 말단에 프라이머를 가진 표적 서열의 서열을 가진다. 각각 추가적 순환시, 추가적 두 긴 생성물이 생산되어, 다수의 짧은 생성물은 전 순환의 말단에 남아있는 긴 생성물 및 짧은 생성물의 수와 동일하다. 따라서, 표적 서열을 함유한 짧은 생성물의 수는 각 순환과 함께 기하급수적으로 증가한다. 바람직하게는, PCR은 상업적으로 입수가능한 열 순환기, 예를 들면 Perkin Elmer로 수행된다.

RNA는 전술한 바와 같이 mRNA를 cDNA로 역전사하고 PCR(RT-PCR)을 수행함으로써 증폭될 수 있다. 대안적으로, 단일 효소는 미국 특허 제5,322,770호에 설명된 바와 같이 두 단계 동안 사용될 수 있다. mRNA를 cDNA로 역전사한 후, 문헌(Marshall et al. (1994) PCR Meth. App. 4:80-84)에 설명된 바와 같이 비대칭 갭 리가제 연쇄반응(RT-AGLCR)을 할 수 있다. 특정 PCR 조건(예를 들면, 온도, 순환 시간 등)은 본 발명의 실행에 중요하지 않으며, 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.

특정 구체예에서, 유전자형 결정 정확성은 프라이머의 적절한 설계 및 선택을 통하여 단일 PCR 반응에 의하여 달성된다. 예를 들면, 559번 위치의 다형성 및 313번(엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링) 위치의 유전자 특이적 다형성을 포함한 서열을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭으로부터 얻은 서열은 통상적으로 158V/F 일배체형을 결정하고 유전자 A와 유전자 B를 구별하기에 충분한 정보를 제공한다.

PCR-기반 기술의 경우, 다중 다형성을 포함하는 프라이머를 사용하는 특정 예에서 바람직할 수 있다. 다중 다형성의 포함은 내장된 내부 대조군을 제공한다. 프라이머는 유전자 A 또는 유전자 B만을 증폭시킬 수 있거나, 대안적으로, 두 유전자의 서열을 증폭시킬 수 있다. 사용될 수 있는 단일 쌍의 프라이머 조합의 대표적 예는 도 7에 나타나고(SEQ ID NO:1-11), 예를 들면, SEQ ID NO:6, 7 또는 8 중의 하나와 SEQ ID NO:9, 10 또는 11 중의 하나의 조합 또는 SEQ ID NO:1 또는 2 중의 하나와 SEQ ID NO:3, 4 또는 5 중의 하나의 조합을 포함한다.

또한, 표 1에 개시된 한 적합한 쌍의 프라이머를 사용하여 피험체로부터 얻은 DNA 샘플의 증폭이 유전자형을 결정하는 데 그 자체로 충분할 수 있다고 하더라도, 본 개시는 또한 추가적 PCR 및/또는 시퀀싱을 포함한, 유전자형 결정의 정확성을 증진시키는 추가적 분석을 제공한다.

예를 들면, 특정 구체예에서, PCR 증폭은 프라이머의 다중 조합을 사용하여 수행되고, 각 조합으로부터 얻은 증폭된 밴드의 결과 패턴은 피험체의 유전자형을 정확하게 결정하기 위하여 평가된다. 특히 바람직한 구체예에서, 다중 상이한 PCR 분석, 예를 들면 5'(순방향) 프라이머와의 다양한 조합의 3'(역방향) 프라이머를 사용한 다중 반응이 각 샘플에서 수행된다.

예로서, 6개의 PCR 증폭은 SEQ ID NO:3, 4 및 5의 5' 프라이머와 조합된 SEQ ID NO: 1 및 2의 3' 프라이머(예를 들면, SEQ ID NO: 1 및 3; SEQ ID NO: 2 및 3; SEQ ID NO: 1 및 4; SEQ ID NO:2 및 4; SEQ ID NO:1 및 5; SEQ ID NO:2 및 5)를 사용하여 수행될 수 있다. 각 증폭 반응의 결과는 (예를 들면, 겔 전기영동에 의하여) 비교될 수 있고, 특히 패턴은 피험체의 일배체형을 용이하게 확인하는 데 사용된다. 한 프라이머는 유전자 A-특이적, 유전자 B-특이적 또는 유전자 A 및 B에 일반적이고, 다른 프라이머는 158V- 또는 158F-특이적인 프라이머 쌍을 사용하면, 이 중요한 부위에서 효율적이고 정확한 유전자형 결정이 가능하다.

도 5는 다중 PCR 증폭 반응의 분석으로부터 얻은 결과를 나타내는데, 이들 각각은 프라이머의 상이한 조합을 포함한다. 증폭 후, 최종 생성물을 표준 4% 아가로스 겔에 러닝하고(또한, 실시예를 참조하라), 최종 생성물을 (있다면) 시각화한다. 도 5에서 레인은 PCR 반응에 사용된 프라이머의 특정 조합에 상응하게 표지된다. 패널 A 및 D의 패턴은 유전자 A에서 158FF(동형접합)인 피험체를 나타낸다. 패널 B는 유전자 A에서 158VV 동형접합인 피험체를 나타내는 반면, 패널 C는 유전자 A에서 158FV(이형접합)인 피험체를 나타낸다. 모든 패널은 유전자 B가 559번 위치에 다형성을 함유하지 않기 때문에 5' 프라이머 T(유전자 B 특이적, SEQ ID N0:3)와 3' 프라이머 A(158F-특이적, SEQ ID NO:1)의 조합이 PCR 생성물을 생성해서는 않된다는 점에서 내부 대조군을 포함한다.

B. 시퀀싱

또 다른 구체예에서, 본원에 설명된 유전자형 결정은 PCR 증폭의 생성물의 시퀀싱을 더 포함한다. 본원에 개시된 임의의 프라이머는 시퀀싱 프라이머로 사용될 수 있다. 다형성에 결합하고, 결합될 때 다형성 158V/F에 상응한 유전자의 부분의 시퀀싱을 허용하는 것들이 시퀀싱 프라이머로서 특히 바람직하다. 대표적 시퀀싱 프라이머는 도 8(SEQ ID NO:12-19)에 도시된다.

직접적 시퀀싱은 예를 들면 Maxam-Gilbert 방법을 사용한 화학적 시퀀싱 또는 예를 들면 Sanger 방법을 사용한 효소적 시퀀싱에 의하여 수행될 수 있다. 후자의 경우, 특정 올리고뉴클레오티드는 표준 방법을 사용하여 합성되고, 디디옥시뉴클레오티드 시퀀싱 반응의 프라이머로 사용된다. 예를 들면, 문헌(Sambrook, 상기 참조) 및 하기 실시예를 참조하라.

도 6은 전술한 프라이머를 사용한 PCR 단독("Koene")에 비해서 본원에 기재된 프라이머를 사용한 PCR에 이어서 시퀀싱("PCR-SEQ")한 후 유전자 A 158V/F의 유전자형 결정의 결과를 나타낸다. 비교한 80개의 샘플 중에서, 10개는 문헌(Koene et al., 상기 참조)에 전술된 프라이머 및 PCR 방법을 사용하여 부정확하게 유전자형 결정되었다. 구체적으로, A609201, A609372, A610260, A612201, A701320, NCM460, A609203, A701017, Kyse410으로 지시된 샘플 및 신장은 전술한 방법을 사용하여 부정확하게 유전자형 결정되었다. 또한, 본원에 설명된 분석과는 달리, 전술된 방법은 유전자 A와 유전자 B를 구별하지 않는다.

C. TaqMan ^TM

TaqMan^TM 분석(예를 들면, 문헌(Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:7276-7280)을 참조)으로 공지된 형광 5' 뉴클리아제 분석은 핵산 표적에 대한 강력하고 다용도의 PCR-기반 검출 시스템이다. 이 분석은 형광 신호의 발생을 모니터링함으로써 열 순환과 연계하여 수행된다. 이 분석 시스템은 겔 전기영동 분석을 할 필요가 없고, 표적 사본수를 결정하는 정량적 데이터를 발생시키는 능력이 있다. 예를 들면, 이전에 분석된 샘플의 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 만들 수 있다. 표준 그래프는 미지의 샘플이 비교될 수 있는 패널 구성원 각각의 사본 수로 만들어질 수 있다.

형광 5' 뉴클레아제 분석은 예를 들면 형광 리포터 염료 및 켄처로 표지된 내부 올리고뉴클레오티드 프로브를 분해하는 내생 5' 뉴클레아제 활성을 가진 AmpliTaqGold^TM DNA 폴리머라제를 사용하여 편리하게 수행된다(예를 들면, Holland et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1991) 88:7276-7280; 및 Lee et al., Nucl. Acids Res. (1993) 21:3761-3766를 참조하라). 분석 결과는 염료 및 켄처 표지를 떼어놓고, 표적 핵산의 증폭에 비례하는 형광 신호의 증가를 야기하는 형광 프로브가 분해됨에 따라 증폭 순환 동안 발생한 형광의 변화를 측정함으로써 검출된다.

증폭 생성물은 용액에서 또는 고체 지지물을 사용하여 검출될 수 있다. 이 방법에서, TaqMan^TM 프로브는 원하는 PCR 생성물 내의 표적 서열에 혼성화하도록 설계된다. TaqMan^TM 프로브의 5' 말단은 형광 리포터 염료를 함유한다. 프로브의 3' 말단은 프로브 연장을 방해하도록 차단되고, 5' 형광물질의 형광을 켄칭하는 염료를 함유한다. 연속적 증폭 동안, 5' 형광 표지는 5' 엔도뉴클레아제 활성을 가진 폴리머라제가 반응에 존재하는 경우 분리된다. 5' 형광물질의 절단은 검출될 수 있는 형광을 증가시킨다.

TaqMan^TM 분석, 시료 및 사용을 위한 조건의 상세한 설명에 대하여는, 예를 들면 본원에 모두가 그 전체로서 참고 인용되는 문헌(Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276-7280; 미국 특허 제5,538,848호, 제5,723,591호 및 제5,876,930호)을 참조하라.

D. 전사-매개 증폭 분석( TMA )

본원에 기재된 서열은 또한 전사-매개 증폭(TMA) 분석의 기초로서 사용될 수 있다. TMA는 생물학적 샘플의 매우 작은 양으로 존재하는 표적 핵산 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 서열은 직접적 분석 방법을 사용하여 검출하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 특히, TMA는 표적 서열의 10억 RNA 사본 이상을 제공할 수 있는 등온, 자체촉매 핵산 표적 증폭 시스템이다. 이 분석은 생물학적 샘플에서 표적 서열의 존재 또는 부재를 정확하게 검출하기 위해서 정량적으로 수행될 수 있다. 또한, 이 분석은 수십배의 농도 범위 이상의 표적 서열의 양의 정량적 측정을 제공할 수 있다. TMA는 온도, 이온의 세기 및 pH와 같은 반응 조건의 반복적 조작없이 표적 핵산 서열의 다중 사본을 자체촉매적으로 합성하기 위한 방법을 제공한다.

일반적으로, TMA는 하기 단계를 포함한다: (a) 일배체형인 관심대상의 생물학적 샘플로부터 RNA를 포함한 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) (i) 분리된 핵산, (ii) 첫 번째 프라이머는 존재한다면(예를 들면 (+) 가닥) 그것과 복합체를 형성하는 RNA 표적 서열의 3' 말단 부분에 충분히 상보적인 복합체형성 서열을 가지고, 두 번째 프라이머는 그것과 복합체를 형성하는 그것의 상보서열(예를 들면, (-) 가닥)의 표적 서열의 3' 말단 부분에 충분히 상보적인 복합체형성 서열을 가지며, 이때 첫 번째 올리고뉴클레오티드는 프로모터를 포함하는 복합체형성 서열에 대한 5' 서열을 더 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 올리고뉴클레오티드 프라이머, (iii) 역전사효소 또는 RNA 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제, (iv) RNA-DNA 복합체의 RNA 가닥(예를 들면 RN아제 H) 및 프로모터를 인지하는 RNA 폴리머라제를 선택적으로 분해하는 효소 활성을 반응 혼합물 내에 합하는 단계.

반응 혼합물의 성분들은 단계적으로 또는 즉시 합할 수 있다. 반응 혼합물은 표적 서열의 다중 사본을 제공하기에 충분한 시간 동안 DNA 시동 및 핵산 합성 조건을 포함하여(리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함) 올리고뉴클레오티드/표적 서열이 형성된 조건 하에 인큐베이션된다. 유리하게도, 반응은 성분 효소와 같은 반응 성분의 안정성을 유지하기에 적합한 조건 하에 그리고 증폭 반응의 과정 동안 반응 조건의 변형 또는 조작의 필요없이 일어난다. 따라서, 반응은 실질적으로 등온인 조건 하에 일어날 수 있고, 실질적으로 일정한 이온의 세기 및 pH를 포함한다. 편리하게도, 반응은 첫 번째 DNA 연장 반응에 의하여 생성된 RNA-DNA 복합체를 분리하는 변성 단계를 필요로 하지 않는다.

적합한 DNA 폴리머라제는 역전사효소, 예를 들면 조류 골수아세포종 바이러스(AMV) 역전사효소(예를 들면 Seikagaku America, Inc.에서 입수가능) 및 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(예를 들면, Bethesda Research Laboratories에서 입수가능)를 포함한다.

프라이머에 혼입하기에 적합한 프로모터 또는 프로모터 서열은 그 서열을 인식하고 결합하며, RNA 전사체가 생성되는 전사의 과정을 개시하는 RNA 폴리머라제에 의하여 특이적으로 인식되는 핵산 서열(자연적으로 발생, 합성 생산 또는 제한 분해의 생성물)이다. 서열은 추가된 안정성 또는 분해 과정에 대한 민감성 또는 증가된 전사 효율성을 부여할 수 있는 RNA 폴리머라제의 실제 인식 부위를 넘어서 연장하는 뉴클레오티드 염기를 선택적으로 포함할 수 있다. 유용한 프로모터의 예는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6 또는 대장균의 프로모터에서 비롯된 것들과 같은 특정 박테리오파지 폴리머라제에 의하여 인식되는 것들을 포함한다. 이들 RNA 폴리머라제는 상업적 공급처, 예를 들면 New England Biolabs 및 Epicentre로부터 용이하게 입수할 수 있다.

본원의 방법의 사용에 적합한 일부 역전사효소는 AMV 역전사효소와 같은 RN아제 H 활성을 가진다. 그러나, AMB 역전사효소가 사용될 때에도 대장균 RN아제 H와 같은 외생 RN아제 H를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. RN아제 H는 예를 들면 Bethesda Research Laboratories로부터 용이하게 입수할 수 있다.

이들 방법에 의하여 생산된 RNA 전사체는 전술한 메커니즘을 통하여 표적 서열의 추가적 사본을 생성하는 주형으로 작용할 수 있다. 이 시스템은 자체촉매이고, 증폭은 온도, pH, 이온의 세기 등과 같은 반응 조건을 반복적으로 변형 또는 변화시킬 필요없이 자체촉매에 의하여 일어난다.

검출은 직접 시퀀싱, 서열-특이적 올리고머와의 혼성화, 겔 전기영동 및 질량 분석을 포함한 폭넓게 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 방법은 이종 또는 동종 포맷, 동위원소 또는 비동위원소 표지뿐만 아니라 아무런 표지 없이도 사용할 수 있다.

TMA는 예를 들면 미국 특허 제5,399,491호에 상세하게 설명되는데, 이 개시는 본원에 그 전체로 참고인용된다. 전형적 분석의 한 예로서, 유전자형 결정된 피험체로부터 얻은 분리된 핵산 샘플은 완충액, 염, 마그네슘, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 프라이머, 디티오트레이톨 및 스페르미딘을 함유한 완충 농축액과 혼합된다. 선택적으로, 반응은 임의의 2차 구조를 변성하기 위해서 약 100℃에서 약 2분 동안 인큐베이션된다. 실온까지 냉각시킨 후, 역전사효소, RNA 폴리머라제 및 RN아제 H가 첨가되고, 혼합물은 37℃에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 반응은 생성물의 변성, 프로브 용액의 첨가, 60℃에서 20분 동안 인큐베이션, 비혼성화된 프로브를 선택적으로 가수분해하는 용액의 첨가, 반응을 60℃에서 6분 동안 인큐베이션 및 루미노미터로 잔여 화학형광의 측정에 의하여 분석할 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 전술된 하나 이상의 테스트는 유전자형을 확인하기 위해서 수행될 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 검출을 위하여 핵산을 증폭시키는 전사 매개 증폭(TMA)을 사용했다면, 그 후 대안적 핵산 테스팅(NAT) 분석은 예를 들면 본원에 설명된 PCR 증폭, RT PCR 등을 사용함으로써 수행된다. 따라서, 임의의 환자에서 취한 임의의 샘플은 특이적 및 선택적으로 일배체형이 될 수 있다.

용이하게 명백한 바와 같이, 본원에 설명된 분석의 설계는 수많은 변화가 가능하고, 많은 포맷은 당업계에 공지되어 있다. 상기 설명은 단지 안내서로 제공되며, 당업자는 당업계에 잘 공지된 기술을 사용하여 설명된 프로토콜을 용이하게 변형시킬 수 있다.

E. 키트

프라이머, PCR 완충액, 시퀀싱 시약 등을 포함한 전술한 분석 시약은 전술한 분석을 수행하기 위해서, 적합한 설명서 및 다른 필요한 시약과 함께 키트로 제공된다. 보통 키트는 프라이머 및 프로브의 조합(고체 매트릭스에 이미 결합되어 있거나 또는 그것들을 매트릭스에 결합시키기 위하여 시약과 분리한), 대조군 제형(양성 및/또는 음성), 분석 포맷이 동일한 것을 필요로 할 때 표지된 시약 및 표지가 신호를 직접을 발생하지 않는 경우, 신호 발생제(예를 들면, 효소 기질)를 별개의 용기에 함유할 것이다. 분석을 수행하기 위한 설명서(예를 들면, 서면, 테이프, VCR, CR-ROM 등)는 대개 키트에 포함될 것이다. 또한, 키트는 사용된 특정 분석에 따라서 다른 포장된 시약 및 재료(즉, 세척 완충액 등)를 함유할 수 있다. 전술한 것들과 같은 표준 분석은 이들 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

F. 용도

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 척추동물 피험체의 FcνRIII 일배체형, 특히 두 FcνRIIIa에 있는 158F/V 부위에 일배체형을 정확하게 결정하기 위한 신규한 조성물 및 분석의 발견에 기초한다.

FcνRIII 유전자형을 정확하게 결정하는 능력은, 한정하는 것은 아니지만, 약물유전학을 포함하여 많은 용도를 가진다. 약물유전학은 적합한 치료 프로토콜을 결정하기 위한 특정 개체의 유전자형의 결정을 나타낸다. 상기에 나타낸 바와 같이, 158F/F 유전자형을 가진 피험체는 158V/F 및 158V/V 유전자형을 가진 피험체 보다 항체 치료(예를 들면, 리투비맙)에 대하여 덜 잘 반응한다. 더욱이, 리투비맙과 같은 항체-매개 요법에 대한 반응이 사이토카인(예를 들면, IL-2)을 통한 사전 치료에 의하여 증진될 수 있다는 것이 입증되었다. 또한, 본원에 그 전체로 참고 인용되는, 2004년 3월 10일 출원된, 공동소유의 가특허출원 명칭 "USE OF FC RECEPTOR POLYMORPHISMS AS DIAGNOSTICS FOR TREATMENT STRATEGIES FOR IMMUNE-RESPONSE DISORDERS"을 참조하라.

따라서, 본원에 설명된 조성물 및 방법을 사용하여, 면역 장애에 대한 치료가 필요한 개체는 효율적이고 정확하게 유전자형 결정될 수 있고, 그에 따라서 FcνRIII-유발된 ADCC 경로를 매개하는 하나 이상의 면역치료제(예를 들면, IL-2)를 통한 개입을 위한 적합한 후보자로 지명될 수 있다. IL-2 및 뮤테인은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 그 전체로 참고 인용되는 미국 특허 제4,752,585호; 미국 특허 제4,766,106호; 미국 특허 제4,931,543호; 미국 특허 제5,700,913호; 2004년 7월 7일 출원된, "Combinatorial Interleukin-2 Muteins" 명칭의 미국 특허출원 제60/585,980호 및 2004년 3월 5일에 출원된, "Improved Interleukin-2 Muteins" 명칭의 미국 특허출원 제60/550,868호를 참조하라. IL-2 뮤테인은 상업적으로 입수할 수 있고, 또한 하기 문헌에 설명된다: 국제 공보 WO 91/04282호; WO 99/60128호; WO 00/58456호; WO 00/04048호; 유럽 특허(EP) 공보 EP 136,489호; 벨기에 특허 공보 제893,016호 및 공동소유의 미국 특허 제4,518,584호에 대응하는 1983년 10월 13일 출원된(1984년 5월 30일 공보 EP 109,748호로 공개됨) 유럽 특허출원 제83306221.9호; 유럽 특허 공보 EP 200,280호(1986년 12월 10일 공개), 유럽 특허공보 EP 118,617호 - 이들 특허 및 출원은 본원에 그 전체로 참고 인용된다.

어떤 용도에서, 유전자형 결정은 항암 모노클론 항체와 조합하여 사용되는 부가 요법(예를 들면, IL-2 면역요법 단독)의 적합성을 결정하기 위하여 면역장애, 특히 암이 있는 개체에서 수행된다. 본원에 설명된 유전자형 결정이 치료 프로토콜 설계에 도와줄 수 있는 암의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 하기 열거된 B 세포 림프종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 직장암, 흑색종, 신세포암, 급성 골수성 백혈병(AML); 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함한다.

실험

본 발명을 수행하기 위한 특정 구체예의 실시예는 하기에 있다. 실시예는 오직 설명하기 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 범주를 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니다.

사용된 수치(예를 들면, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보장하기 위하여 노력했지만, 일부 실험적 오류 및 편차는 물론 허용되어야 한다.

하기 실시예에서, 효소는 상업적 공급처에서 구입하였고, 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다.

DNA 단편의 분리시, 나타낸 곳을 제외하고, 모든 DNA 조작은 표준 과정에 따라서 이루어졌다. 문헌(Sambrook et al., 상기 참조)을 참조하라. 제한효소, T4 DNA 리가제, 대장균, DNA 폴리머라제 I, 클레노우 단편 및 다른 생물학적 시약은 상업적 공급처로부터 구입할 수 있고, 제조업자의 지시에 따라서 사용할 수 있다. 이중 가닥의 DNA 단편은 아가로스 겔에서 분리하였다.

실시예 1: 샘플로부터 DNA 의 추출

전혈 샘플을 피험체로부터 채취하였다. 샘플은 제조업자의 설명서를 따라서 PreAnalytiX's PAXgene^TM Blood DNA 튜브(Qiagen Inc., 카탈로그 #769989)에 수집되었다. 게놈 DNA는 또한 제조업자의 설명서를 따라서 PreAnalytiX's PAXgene Blood DNA 키트(Qiagen Inc)를 사용하여 전혈로부터 분리되었다.

실시예 2: PCR -기반 유전자형 결정

A. PCR 증폭

PCR 분석은 하기와 같이 수행되었다. 간단히 말하면, PCR은 GeneAmp PCR 시스템 9600 Perkin Elmer 기계(Perkin Elmer, 매사추세츠주 보스턴 소재) 상의 96 웰 플레이트 포맷에서 수행되었다.

마스터 혼합물은 하기와 같이 준비되었다. 1.5 ml 에펜도르프 테스트 튜브에, 하기 시약, 10X Stoffel 완충액(Applied Biosystems) 300 ㎕; 25 mM MgC1₂ 용액 600 ㎕; dNTP 혼합물 300 ㎕(Applied Biosystems, 카탈로그 #0032 003.109) 및 H₂0 270 ㎕가 마스터 혼합물로 준비되었고, -20℃에 분할량으로 보관되었다. 모든 완충액은 제조업자의 설명서에 따라서 보관되었다.

AmpliTaq DNA 폴리머라제 Stoffel 단편(Applied Biosystems, 카탈로그 #N808-0038) 30 ㎕는 마스터 혼합물의 해동된 분할량에 첨가되었다. 튜브는 정 프라이머 9 ㎕, 역 프라이머 9 ㎕, 마스터 혼합물 용액 225 ㎕ 및 H₂O 117 ㎕를 각각 함유한 프라이머의 다른 조합(예를 들면, 6개 튜브)으로 준비되었다.

도 9에 도시한 바와 같이, 각 튜브의 20 ㎕는 96개 웰 플레이트의 2 칼럼에 첨가되었다(예를 들면, 6개 프라이머 조합의 경우, 각 프라이머 조합에 8개 웰의 2 칼럼이 있다). 실시예 1에 설명한 분리한 게놈 DNA를 10 ng/㎕로 희석하여 5 ㎕를 다른 프라이머 조합을 함유한 칼럼에 첨가되었다(예를 들면, 6개의 다른 프라이머 조합이 사용될 때 칼럼 1-6, 도 10). 대조군도 포함되었다.

플레이트를 밀봉하여 PCR을 위해 GeneAmp PCR 시스템 9600 기계에 넣었다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95℃에서 5분 동안 인큐베이션 1 순환; 94℃에서 30초 동안 인큐베이션 35 순환; 64℃에서 30초 동안 인큐베이션 및 72℃에서 30초 동안 인큐베이션; 및 72℃에서 8분 동안 인큐베이션 1 순환. 96 웰 플레이트는 샘플을 아가로스 겔에 적용하기 전에 4℃에 냉각되었다.

B. 전기영동

TAE 겔 전기영동은 표준 기술을 사용하여 섹션 A의 PCR 생성물에 수행되었다. 50X 농축된 겔 완충액의 원액(최종 농도 40 mM 트리스-아세테이트, 1 mM Na₂EDTA, pH 8.0)은 242 g 트리스-염기; 57.1 ml 빙초산; 100 ml 0.5 M Na₂EDTA를 함유하였다. 겔 로딩 완충액은 0.25 % 브로모페놀 블루; 0.25 % 자일렌 시아놀 FF; 및 물 중의 15% Ficoll(타입 400; Pharmacia)을 함유하였다. 또한, Boehringer Mannheim (카탈로그 #1498 037)의 분자량 마커(0.07-12.2 kbp)를 사용하였다.

에티디움 브로마이드 10 ㎕/ml를 함유한 TEA 완충액 중에 표준 4% 아가로스 수평 겔이 준비되었다. 각 PCR 반응 5 ㎕를 표준 6X 로딩 완충액 1 ㎕와 혼합하여 반응 1부터 6까지 순서대로 겔의 인접 레인에 로딩하였다. 도 5를 참조하라. 겔은 일정한 100 볼트에 15-20 분 동안 걸어주고, 시각화하여 표준 UV 트랜스-조명기의 자외선(UV) 하에 사진을 찍었다.

대표적 결과는 도 5에 나타낸다. 이 결과들은 158번 위치에 FCGR3A가 다형성 발린(V158) 또는 페닐알라닌(F158)이라는 것을 확인시켜준다. FCGR3B는 발린만을 코딩하는 이 위치에서 다형성이 아니다. 본원에 설명된 프라이머의 사용은 비-특이적 프라이머(SEQ ID NO:4)뿐만 아니라 이 부위(예를 들면, SEQ ID NO:1-2)를 확인하는 프라이머 및 531번 위치(SEQ ID NP:3 및 5)의 유전자 A 와 B 간의 단일 뉴클레오티드 차이를 확인하는 프라이머의 사용에 의한 FCGR3A 158V/F 부위의 유전자형 결정을 가능케 한다. 531번 위치는 아미노산 차이를 야기하지 않는다.

전술한 바와 같이, 5' 프라이머 C(SEQ ID NO:5) 및 3' 프라이머 C(SEQ ID NO:2)를 이용하여 얻은 PCR 생성물은 V 유전자형을 가리킨다. 이 생성물이 각 샘플에 관찰되고, 5' 프라이머 C(SEQ ID NO:5) 및 3' 프라이머 A(SEQ ID NO:1)이 보이지 않는다면, 그 결과는 피험체가 V에 대하여 동형접합임을 나타낸다. 도 5, 패널 B를 참조하라. 유사하게, 5' 프라이머 C(SEQ ID NO:5) 및 3' 프라이머 A(SEQ ID NO:1)를 사용하여 얻은 PCR 생성물이 보이고, 5' 프라이머 C(SEQ ID NO:5) 및 3' 프라이머 C(SEQ ID NO:2)가 보이지 않는다면, 피험체는 유전자 A의 F에 대하여 동형접합이다. 도 5, 패널 A 및 D를 참조하라. 이들 반응 모두의 생성물은 F 및 V에 대하여 이형접합임을 나타낸다. 도 5, 패널 C를 참조하라. 또한, 내부 대조군은 유전자 B가 다형성이 아닌 만큼 존재하며, 5' 프라이머 T 및 3' 프라이머 A의 조합이 절대로 가시적 생성물을 만들지 않아야 한다.

따라서, 본원에 설명된 방법을 사용하여 158F/V 다형성의 FcνRIIIa 유전자형을 정확하게 결정할 수 있다.

실시예 5: PCR -시퀀싱

유전자형 결정을 위해서, 샘플 DNA를 증폭하고(PCR), 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 생성물을 시퀀싱하는 실험을 또한 수행하였다.

A. PCR

게놈 DNA의 PCR은 제조업자의 설명서에 따라서 BD Advantage^TM 2 PCR 키트(제품 #639206 또는 #639207)를 사용하여 수행되었다. 각 반응은 10X BD Advantage 2 PCR 완충액 5 ㎕; 5 uM/각 프라이머 혼합물의 1 ㎕(총 프라이머 농도 lO uM); 50X dNTP 혼합물 1 ㎕(각 10 mM); 50X BD Advantage 2 폴리머라제 혼합물 1 ㎕; 최종 농도 10-100 ng의 샘플 DNA; 및 최종 반응 부피 50 ㎕를 만들 수 있는 부피의 물을 함유하였다. 순환 조건은 95℃에서 5분; 95℃에서 30초 동안, 62℃에서 30초 동안 30 순환; 72℃에서 40초이었고, 4℃에 인큐베이션하였다. 순환 후, PCR 반응 생성물은 최종 용출 부피를 50 ㎕인 것을 제외하고, Qiagen's MinElute PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28004 또는 28006)를 사용하고, 제조업자의 추천 프로토콜을 따라서 정제하였다.

대조군도 분석에 포함되었다. 양성 대조군은 공지된 FcνRIII 유전자형의 게놈 DNA(예를 들면, 유전자 A의 158VF 다형성에서 G, T 및 G/T)인 반면, 음성 대조군은 통상적으로 (음성 PCR 및 시퀀싱 결과를 야기한) 게놈 DNA를 제외한 모든 시약을 포함하였다.

B. 시퀀싱

전술한 바와 같이 얻어진 PCT 생성물에 대한 시퀀싱 반응은 3100 또는 3730x1 플랫폼 상에 BigDye 터미네이터 v3.0를 사용하여 수행되었다(Applied Biosystems). 각 시퀀싱 반응은 BigDye 터미네이터 v3.0 준비 반응 혼합물(제품 번호 4390246)의 2 ㎕, 5x 완충액 1 ㎕(제품 번호 4336699), PCR 생성물 1 ㎕(약 0.02 ㎕/㎍); 2 M 프라이머 2 ㎕(SEQ ID NO:12-19의 다양한 조합) 및 물 4 ㎕를 함유하였다.

30 순환 전체는 각각의 반응: 95℃에서 10초; 50℃에서 5초; 및 60℃에서 3분에서 수행되었다. 순환 후, 반응물을 4℃에 인큐베이션하였다.

반응물은 멀티스크린 칼럼 로더(Millipore 카탈로그 #MCLO9645)로 건조한 필터 플레이트에 Amersham(카탈로그 #17-0051-01 또는 17-0052-03)의 건조한 Sephadex G-75 수지를 첨가하여 정제하였다. 이어서, 물 300 ㎕를 실온에서 30분 이상 덮어서 인큐베이션한 각 웰 및 플레이트에 첨가하였다.

필터 플레이트를 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc 카탈로그 #12565263)로 쌓고, A-4-62 스윙 버켓 로터를 가진 에펜도르프 모델 5810R에서 1650 RPM으로 3분 동안 회전시켰다. 필터 플레이트를 깨끗한 96 웰 PCR 플레이트(Sorenson Bioscience Inc., 카탈로그 #12565263 또는 균등물)의 상부 및 96 웰 베이스(Applied Biosystems, 카탈로그 #N801-0531)에 놓았다. 모든 샘플을 지정된 필터 칼럼의 중심에 이동시키고, A-4-62 스윙 버켓 로터를 가진 에펜도르프 모델 5810R에서 1800 RPM으로 5분 동안 회전시켰다. 최종 샘플 부피는 가압증기멸균된 멸균 정제수로 약 15 ㎕가 되도록 조절하였다.

그 후, 플레이트를 제조업자의 설명서(3100 사용자 매뉴얼 또는 3730x1 사용 자 매뉴얼)에 따라서 조립하였다. 프로그램된 매개변수는 분리 매질로서 POP6 및 3100 플랫폼에 대한 디폴트 모듈 "StdSeq50_POP6" 및 분리 매질로서 POP7 및 3739 플랫폼에 대한 디폴트 모듈 "LongSeq50_POP7_1"이었다. 디폴트 모듈의 러닝 시간은 6500초(3100 플랫폼) 및 5640초(3730 플랫폼)이었다. 300 염기 미만인 표적의 경우, 디폴트 모듈의 진행 시간은 더 긴 해독 길이를 가진 다른 샘플이 동일한 러닝에 포함되지 않았다면 4000초(3100 플랫폼) 또는 3600초(3730 플랫폼)로 단축되었다.

C. 분석

시퀀싱 데이터는 탁상용 컴퓨터에 전송되고 Sequencer^TM 프로젝트로 보내졌다. 각 개별 샘플에서 비롯된 FCGR3A 특이적 프라이머에 대한 서열(표 1 및 도 8)을 기준 서열과 정렬하였다(도 11). 각 개별 샘플에서 비롯된 FCGR3B 특이적 프라이머 서열 및 PCR 반응에 사용된 프라이머 서열을 기준 서열과 정렬하였다. 기준 서열 밖의 서열은 생략한다.

이어서, 유전자형 결정을 하기와 같이 수행하였다. A, C, T 및/또는 C가 각각 121번, 153번, 179번 및 313번 위치(엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링)에서 발견되었다면, 반응은 비-유전자 A-특이적인 것으로 간주되었고, 반복되었다. 이들 위치의 신호가 유전자 A 기준 서열 신호만을 정합하였다면, 샘플은 FCGR3A 및 분석된 207번 위치(cDNA의 559번 위치, 엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링)의 신호로 간주되었다. 오직 G 신호가 207번 위치에서 얻어졌다면, 샘플이 채취된 개 체의 유전자형은 158VV 동형접합이었다. 오직 T신호가 207번 위치에서 얻어졌다면, 샘플이 채취된 개체의 유전자형은 158FF 동형접합이었다. G와 T 신호가 207번 위치에서 얻어졌다면, 샘플은 158VF 이형접합 피험체로부터 채취되었다.

유사하게, FcνRIIIb 유전자형은 하기와 같이 확인되었다. G, T, C, A 신호가 각각 121번, 153번, 179번 및 313번 위치(엑손 4의 첫 번째 염기에 관하여 넘버링)에서 발견되었다면, 반응은 비-유전자 A-특이적인 것으로 간주되었고, 반복되었다. 이들 위치의 신호가 유전자 B 기준 서열 신호를 정합하였다면, 샘플은 FCGR3B로 간주되었다. 유전자 B로 결정된 샘플은 158VF 다형성을 함유하지 않았고, G 신호는 상응하는 뉴클레오티드에 보이지 않았다.

설명한 바와 같이, 136개 샘플을 테스트하였고, 135개가 정확히 FcνRIII 유전자형이었다. 어떤 경우에, 샘플은 유전자 B를 함유하지 않았다. 유전자 A 또는 유전자 B가 피험체의 게놈에 존재하지 않은 경우에는, PCR 프라이머를 사용하여 시퀀싱하는 것이 바람직할 수 있다. PCR 프라이머를 통한 시퀀싱을 통하여 121번, 153번, 179번 및 313번 위치에 있는 A 와 B 유전자 모두의 신호에 기초한 FCGR3A와 FCGR3B 유전자의 비율의 평가가 가능하다.

유전자형 분석의 결과는 도 6에 요약되고, 또한 문헌(Koene et al, 상기참조)에 설명된 방법과 비교된다. 본원에 설명된 PCR-시퀀싱 방법은 80개 샘플 전부의 피험자 유전자형을 결정한 것에 반해, 이전에 설명된 방법은 10% 이상의 오류율(10개 샘플)이 있었다.

따라서, PCR-시퀀싱 분석은 고도로 민감하여 FcνRIII 유전자형을 정확히 결 정할 수 있다.

따라서, 신규 서열 및 이들 서열을 사용한 유전자형 결정 분석이 개시되었다. 앞서 말한 것으로부터, 본 발명의 특정 구체예는 설명할 목적으로 본원에 기재되었지만, 발명의 사상 및 그것의 범주에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (29)

1. 길이가 10 내지 60 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 올리고뉴클레오티드로서,

   (a) SEQ ID NO:1 내지 19로 구성된 군 중에서 선택된 서열;

   (b) (a)의 뉴클레오티드 서열에 대하여 80% 서열 동일성을 가진 뉴클레오티드 서열; 또는

   (c) (a) 및 (b)의 상보서열

   을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
2. 제1항에 있어서, 검출가능한 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 올리고뉴클레오티드.
3. 제2항에 있어서, 검출가능한 표지는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 분리된 올리고뉴클레오티드.
4. 제3항에 있어서, 형광 표지는 6-카르복시플루오레세인(6-FAM), 테트라메틸로다민(TAMRA), 및 2',4',5',7',-테트라클로로-4-7-디클로로플루오레세인(TET)으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 올리고뉴클레오티드.
5. 피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하는 방법으로서,

   (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계;

   (b) 센스 및 안티센스 프라이머로서 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계; 및

   (c) 증폭된 핵산의 존재 또는 부재를 올리고뉴클레오티드의 각 조합으로 검출하는 단계로서, 증폭된 핵산의 존재 또는 부재는 피험체의 FcνRIII 유전자형을 나타내는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 FcνRIII 다형성에 대하여 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 FcνRIII 다형성에 대하여 일반적인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나 이상의 추가적 조합으로 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 첫 번째 및 두 번째 조합은 각각 한 프라이머를 공통으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, FcνRIIIa의 158V/F 부위의 유전자형은 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:2를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:1을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 부재는 158VV 유전자형을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제12항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 부재 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재는 158FF 유전자형을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제12항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첫 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 두 번째 조합을 사용한 증폭 생성물의 존재는 158FV 유전자형을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적 뉴클레오티드 위치의 피험체의 FcνRIII 유전자형은 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 추가적 뉴클레오티드 위치는 121번, 153번, 179번, 207번, 313번 위치 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 PCR 증폭, RT-PCR, 전사-매개 증폭(TMA), TaqMan^TM 및 이들의 조합에 의하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하는 방법으로서,

    (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계;

    (b) 분리된 핵산을 증폭하는 단계;

    (c) 시퀀싱 프라이머로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴 클레오티드의 하나의 이상의 적합한 조합을 사용하여 증폭된 핵산 생성물을 시퀀싱하는 단계; 및

    (d) 하나 이상의 FcνRIII 다형성의 뉴클레오티드 잔기를 결정함으로써, 피험체의 FcνRIII 유전자형을 결정하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 단계 (b)는 센스 및 안티센스 프라이머로서 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, FcνRIIIa의 158V/F 부위의 유전자형은 207번 위치의 뉴클레오티드를 결정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 207번 위치의 유일한 G 뉴클레오티드는 158VV 유전자형을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제21항에 있어서, 207번 위치의 유일한 T 뉴클레오티드는 158FF 유전자형을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제21항에 있어서, 207번 위치의 G 및 T 뉴클레오티드는 158FV 유전자형을 나 타내는 것을 특징으로 하는 방법.
25. FcνRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 방법으로서,

    (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계;

    (b) 센스 및 안티센스 프라이머로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계로서, 각 조합에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 FcνRIIIa 또는 FcνRIIIb에 특이적인 단계; 및

    (c) 증폭된 핵산의 존재 또는 부재를 올리고뉴클레오티드의 각 조합으로 검출하는 단계로서, 증폭된 핵산의 존재 또는 부재는 FcνRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. FcνRIIIa를 FcγRIIIb와 구별하는 방법으로서,

    (a) 핵산을 피험체에서 얻은 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계;

    (b) 분리된 핵산을 증폭하는 단계;

    (c) 시퀀싱 프라이머로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 적합한 조합을 사용하여 증폭된 핵산을 시퀀싱하는 단계; 및

    (d) 121번, 153번, 179번 및 313번 위치의 뉴클레오티드를 결정함으로써, Fc νRIIIa를 FcνRIIIb와 구별하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 단계 (b)는 센스 및 안티센스 프라이머로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 적어도 첫 번째 및 두 번째 조합을 사용하여 분리된 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. FcνRIIIa 유전자형 결정을 위한 키트로서, 제1항 내지 제4항에 따른 한 쌍 이상의 프라이머 올리고뉴클레오티드; 및 FcνRIIIa에 대한 생물학적 샘플의 유전자형 결정을 위한 명시된 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
29. 제28항에 있어서, 시퀀싱 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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