CN109536608B - Trpv5基因snp位点在检测重金属中毒易感性中应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种TRPV5基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用。所述SNP位点为TRPV5基因第654位核苷酸G＞A，所述TRPV5基因的序列如SEQ ID No.10所示。所述SNP位点的G与A在高血铅组和低血铅组间的差异极显著，其中，G为铅中毒易感等位基因或铅中毒高风险等位基因，A为非铅中毒易感等位基因或铅中毒低风险等位基因。因此通过检测该位点的碱基类型、判断该位点的基因型可用于检测重金属(如铅)中毒易感性或重金属中毒风险、筛查重金属中毒患者、鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因、检测与重金属中毒或代谢相关的单核苷酸多态性。本发明所提供的应用和产品在重金属中毒易感人群识别，从而合理预防重金属中毒方面具有重要价值。

Description

TRPV5基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用

技术领域

本发明属于生物医学分子检测技术领域，具体涉及一种TRPV5基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用。

背景技术

重金属原义是指比重大于5的金属(一般来讲密度大于4.5克每立方厘米的金属)，包括金、银、铜、铁、汞、铅、镉等，重金属在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒。在环境污染方面所说的重金属主要是指汞(水银)、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属非常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。在相同的重金属暴露水平上，不同的人群表现出不同的生物学效应，这在很大程度上取决于人群的遗传易感性。寻找重金属中毒的遗传易感因素有助于早期识别易感人群，有助于制定相应的预防措施保护易感人群。

TRPV5是瞬时性受体电位(TRP)通道超家族成员中TRPV亚家族通道中一员，该通道蛋白由729个氨基酸构成，分子量约为83kDa。相应的基因由在7q34染色体排列的15个外显子组成，主要分布于肾脏、破骨细胞、胎盘等。其中，肾小管中分布较高，另在破骨细胞中也有表达，其表达量虽不如在肾脏的高表达，但也提示TRPV5是介导破骨细胞骨吸收的重要通道蛋白。研究证实其与肾脏中Ca²⁺主动重吸收相关。首先，钙离子通过TRPV5进入细胞后，结合到钙结合蛋白D28K上弥散到基底外侧膜。然后，钙离子经钠钙交换器(Na⁺/Ca²⁺exchanger1,NCX1)和ATP依赖性质膜Ca²⁺-ATPase 1b(PMCA1b)排出细胞外，研究表明，Ca²⁺转运蛋白的表达取决于TRPV5调控的Ca²⁺涌入以及TRPV5的表达。

目前，尚无研究表明TRPV5基因多态性与重金属(如铅)中毒易感性相关。

发明内容

本发明的目的在于提供检测一种新SNP在检测重金属中毒易感性中的应用。

本申请发明人在研究中发现：人TRPV5基因(DNA序列如SEQ ID No.10所示)上存在两个新的SNP位点：g.103(C＞T)(SEQ ID No.10所示序列的第103位C突变为T)和g.654(G＞A)(SEQ ID No.10所示序列的第654位G突变为A)。随后通过病例-对照分析证明上述两个SNP位点的多态性或基因型与重金属(铅)中毒易感性相关。

SEQ ID No.10所示的TRPV5基因的15个外显子分别为：SEQ ID No.10所示DNA的第265-392位，第3278-3375位，第3544-3666位，第4159-4296位，第4604-4702位，第4858-5033位，第5490-5636位，第7983-8195位，第18156-18242位，第18341-18417位，第18678-18843位，第19018-19084位，第20974-21242位，第24128-24234位，和第24916-25210位。

因此，本发明保护一种与重金属中毒易感性相关的SNP位点，所述SNP位点为TRPV5基因第654位核苷酸G＞A。

进一步的，所述TRPV5基因的序列如SEQ ID No.10所示。

另外，一方面，本发明提供了检测受试者所述SNP位点的试剂在制备检测受试者重金属中毒易感性的产品中的应用；优选的，所述重金属为金、银、铜、铁、汞、铅和/或镉，更优选，铅。

所述产品还可以是如下1)-3)的产品：

1)检测与重金属中毒或代谢相关的单核苷酸多态性的产品；

2)筛查重金属中毒患者的产品；

3)鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因的产品；

所述重金属为金、银、铜、铁、汞、铅和/或镉，优选铅。

另一方面，本发明还提供了含有检测受试者所述SNP位点的试剂的上述任一所述产品，即：

一种检测与重金属中毒相关的单核苷酸多态性的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂；

一种检测重金属中毒易感性或重金属中毒风险的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂；

一种筛查重金属中毒患者的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂；

一种鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂。

在上述应用或产品中，所述检测受试者所述SNP位点的试剂可为通过下述至少一种方法确定所述SNP位点多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、质谱、荧光定量PCR；所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由PCR引物、单碱基延伸引物、和质谱仪以及相关试剂组成的组合产品。

在一种具体的实施方式中，所述检测受试者所述SNP位点的试剂包括扩增所述SNP位点的PCR引物对，以便于增加所述SNP位点的拷贝数，并进行进一步的测序、杂交、或质谱分析等；

任选的，所述检测受试者所述SNP位点的试剂还含有扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物，以便于对所述SNP位点进行扩增并对扩增的碱基进行分析。

在一种具体的实施方式中，所述PCR引物对的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；

所述单碱基延伸引物如SEQ ID No.8或其互补序列所示；

在一种实施方式中，所述受试者所述SNP位点的试剂还包括PCR反应试剂，和/或碱性磷酸酶及其反应缓冲液，和/或单碱基延伸反应试剂，和/或脱盐用树脂；

所述PCR反应试剂包括：dNTP、Mg²⁺、PCR反应预混液、和DNA聚合酶；

所述单碱基延伸反应试剂包括：ddNTP、单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸酶。

在一种实施方式中，所述检测所述SNP位点的试剂还可以与其他检测受试者重金属中毒易感性的产品进行联用；

如，上述PCR引物对可以与特异扩增包含其它SNP位点的PCR引物对混合进行多重PCR使用，以便于同时分析多个SNP位点；也可以单独使用，以便于仅分析1个SNP位点时需要；

上述单碱基延伸引物也可以与特异扩增其它SNP位点的单碱基延伸引物混合使用，以便于同时分析多个SNP位点；也可以单独使用，以便于仅分析1个SNP位点时需要。

另一方面，本发明还提供了一种检测重金属中毒易感性的PCR引物，所述PCR引物的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4。

进一步的，所述PCR引物还包括单碱基延伸引物；优选的，所述单碱基延伸引物的序列如SEQ ID No.8所示或其互补序列。

另一方面，本发明还提供了一种非治疗目的的检测受试者重金属中毒易感性的方法，包括检测受试者TRPV5基因第654位核苷酸G＞A多态性的步骤，所述TRPV5基因如SEQ IDNo.10所示，所述易感性的判断条件如下：

受试者TRPV5基因第654位核苷酸G或与其碱基互补的核苷酸C为重金属中毒高风险受试者，受试者TRPV5基因第654位核苷酸A或与其碱基互补的核苷酸T为重金属中毒低风险受试者；

优选的，所述方法包括所述检测重金属中毒易感性的PCR引物进行扩增的步骤。

另外，本发明还提供了一种用于制备上述任一所述产品的PCR引物组合，包括如下引物对：

引物对1，用于特异扩增SNP位点TRPV5基因第103位核苷酸C＞T在内的人基因组DNA片段，所述引物对1的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；

引物对2，用于特异扩增SNP位点TRPV5基因第654位核苷酸G＞A在内的人基因组DNA片段，所述引物对2的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；

可选的，还包括：引物对3(作为对照使用)，用于特异扩增SNP位点TRPV5基因第7240位核苷酸G＞A(rs1568760)在内的人基因组DNA片段，所述引物对3的上游引物如SEQID No.5所示，下游引物如SEQ ID No.6所示；

可选的，还包括：特异扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物，或检测所述SNP位点的探针；

检测单碱基延伸引物的扩增产物可以得知相应SNP位点的基因型；

检测探针的标记信号也可以得知相应SNP位点的基因型；

优选的，所述特异扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物如下：

特异扩增SNP位点TRPV5基因第103位核苷酸C＞T的单碱基延伸引物A，其序列为SEQ ID No.7或其互补序列；

特异扩增SNP位点TRPV5基因第654位核苷酸G＞A的单碱基延伸引物B，其序列为SEQ ID No.8或其互补序列；

特异扩增SNP位点TRPV5基因第7240位核苷酸G＞A(rs1568760)的单碱基延伸引物C，其序列为SEQ ID No.9或其互补序列。

本发明保护上述PCR引物组合在制备上述任一所述产品中的应用。

本发明提供的所述PCR引物组合在保留PCR扩增的高效性和灵敏性的同时，能够一管完成多个SNP位点产物扩增，兼顾了基因测序法检测的准确性；样本DNA提取后无需测定与稀释浓度，直接加样进行PCR扩增和后续SAP及iPLEX反应，避免了探针杂交等影响因素，节省时间，减少手工操作；更好地控制检测成本，提高经济和社会效益；本发明有助于将MassARRAY质谱技术用于重金属中毒易感性的检验或相关性分析，在对特定人群制定相应的预防措施前提供依据。

实验证明，SNP位点TRPV5基因第654位核苷酸(g.654)G＞A处的等位基因G与A在病例(高血铅组)和对照(低血铅组)组间的差异极显著(P＜0.01)，说明在SNP位点g.654(G＞A)处的等位基因G和A与铅中毒易感相关(OR为1.37)，在高血铅组(即铅中毒易感组，病例组)人群中在该等位基因处为G的人数明显高于低血铅组(对照组)，即判定SNP位点g.654(G＞A)处的G为铅中毒易感等位基因或铅中毒高风险等位基因，A为非铅中毒易感等位基因或铅中毒低风险等位基因。因此通过检测该位点的碱基类型、判断该位点的基因型可用于检测重金属(如铅)中毒易感性或重金属中毒风险、筛查重金属中毒患者、鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因、检测与重金属中毒或代谢相关的单核苷酸多态性。

本发明所提供的应用和产品在重金属中毒易感人群识别，从而合理预防重金属中毒方面具有重要价值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请发明人在研究中发现了人TRPV5基因(DNA序列如SEQ ID No.10所示)上存在两个新的SNP位点：g.103(C＞T)(SEQ ID No.10所示序列的第103位C突变为T)和g.654(G＞A)(SEQ ID No.10所示序列的第654位G突变为A)。随后通过病例-对照分析证明上述两个SNP位点的多态性或基因型与重金属(铅)中毒易感性相关。

SEQ ID No.10所示的TRPV5基因的15个外显子分别为：SEQ ID No.10所示DNA的第265-392位，第3278-3375位，第3544-3666位，第4159-4296位，第4604-4702位，第4858-5033位，第5490-5636位，第7983-8195位，第18156-18242位，第18341-18417位，第18678-18843位，第19018-19084位，第20974-21242位，第24128-24234位，第24916-25210位。

实施例1、TRPV5基因上新发现的两个SNP位点与重金属(铅)中毒易感性相关(病例-对照分析)

1、以长期(2年以上)暴露于铅污染工作环境下的中国汉族作业工人1301人为研究对象，根据GBZ 37-2002职业性慢性铅中毒诊断标准，将血铅≥400μg/L的人群作为高血铅组(即铅中毒易感组，病例组)，将血铅＜400μg/L的人群作为低血铅组(对照组)。经统计学分析两组人的年龄、性别、工龄等情况无统计学差异(P＞0.05)。

上述血铅测定采用美国ESA公司3010B型血铅分析仪通过阳极溶出伏安法来测定血中铅含量。

2、对上述高血铅组(铅中毒易感组)和低血铅组人群的SNP位点g.103(C＞T)和g.654(G＞A)的基因型进行检测，以已知与铅中毒易感不相关的SNP位点g.7240(G＞A)(SEQID No.10所示DNA的第7240位G突变为A，NCBI中的编号为rs1568760)为对照。

3、统计步骤1和2的结果，使用卡方检验各SNP位点的等位基因/基因型与病例-对照分组是否相关，结果如表1所示。

表1、基因分型检测结果

注：经分析上述三个SNPs基因型频率在总人群中均符合遗传学哈迪温伯格平衡(P＞0.05)，认为研究对象具有良好的代表性。

表1中的n表示数目；OR(95％CI)表示优势比(95％的置信区间)，对于疾病发病率而言，不同基因型的OR值即为该基因导致疾病发生相对危险度的估计值，当OR值＝1时，表示该因素对疾病的发生不起作用，当OR值大于1时，表示该因素是一个危险因素，当OR值小于1时，表示该因素是一个保护因素；P值表示统计学意义，当P＜0.05表示比较的样本有显著差异；当P＜0.01表示比较的样本有极显著差异。

表1的结果表明，在SNP位点g.103(C＞T)处的等位基因C与T在病例和对照组间的差异极显著(P＜0.01)，说明该SNP位点g.103(C＞T)处的等位基因C和T与铅中毒易感相关(OR为1.29)，在高血铅组(即铅中毒易感组，病例组)人群中在该等位基因处为C的人数明显高于低血铅组(对照组)，即判定SNP位点g.103(C＞T)处的C为铅中毒易感等位基因或铅中毒高风险等位基因，T为非铅中毒易感等位基因或铅中毒低风险等位基因；

同理，在SNP位点g.654(G＞A)处的等位基因G与A在病例和对照组间的差异极显著(P＜0.01)，说明在SNP位点g.654(G＞A)处的等位基因G和A与铅中毒易感相关(OR为1.37)，在高血铅组(即铅中毒易感组，病例组)人群中在该等位基因处为G的人数明显高于低血铅组(对照组)，即判定SNP位点g.654(G＞A)处的G为铅中毒易感等位基因或铅中毒高风险等位基因，A为非铅中毒易感等位基因或铅中毒低风险等位基因；

对照SNP位点g.7240(G＞A)处的等位基因G与A的不同在病例与对照组间差异不显著(P为0.75-0.50)，说明该位点等位基因与铅中毒易感不相关。

上述步骤2中的检测具体如下：

检测仪器：MassARRAY Genetic Analysis System DNA质谱基因分析系统(SEQUENOM Inc.西格诺公司，美国)；AB-Vii A7荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司(ABI))；离心机(TL-5.0W，上海)；旋转振荡仪(上海)。

检测方法：

1)引物设计

从NCBI检索SNP位点g.103(C＞T)和g.654(G＞A)以及SNP位点g.7240(G＞A)(对照，已知与铅中毒易感不相关)所在基因组的序列信息，经过生物信息学比对分析，各找到一段分别包含上述三个SNP位点之一的高度保守的区域，分别设计引物，及对应SNP位点的单碱基延伸引物，并通过分析软件和实际扩增摸索，找到效果最佳的引物组合(多重PCR扩增灵敏度最高，单碱基延伸反应中引物的特异性好、且单碱基延伸产物之间的分子量相差20Da以上)，其序列如表2和表3所示。

表2、多重PCR引物设计

表3、单碱基延伸引物设计

2)取-20℃离体保存的上述1031人的EDTA抗凝的血液，使用血液基因组提取试剂盒分别纯化血液样本中的基因组DNA。

3)多重PCR扩增：同时使用表2所示的3个引物对，分别以步骤2)获得的基因组DNA为模板，同时设以水为模板的阴性对照，进行多重PCR扩增，反应体系如下：

试剂组分	用量
		MgCl<sub>2</sub>(25mM)	1.5μL
PCR缓冲液(10×)	2.5μL
		dNTP混合物(2.5mM)	2.0μL
1μM引物混合物(各条引物摩尔浓度相同)	5.0μL
		Taq HS DNA聚合酶	2U
模板(基因组DNA溶液)	2.0μL
		H<sub>2</sub>O	补足至25μL

多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行如下循环45次：95℃变性20s、60℃退火30s、和72℃延伸20s；最后72℃延伸3min。

4)SAP反应

分别取上述步骤3)中PCR扩增后液体5μL，加入2μL SAP反应液进行SAP反应，其中，SAP反应液配方如下：

试剂组分	用量
		去离子H<sub>2</sub>O	1.53μL
SAP缓冲液	0.17μL
		SAP酶(1.7U/μL)	0.30μL
合计	2.00μL

SAP反应条件如下：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃保存。

5)单碱基延伸反应

向经过步骤4)反应的液体中分别加入2μL的延伸反应液，进行单碱基延伸反应，其中，延伸反应体系如下：

组分	用量
		去离子H<sub>2</sub>O	0.619μL
iPLEX缓冲液	0.2μL
		iPLEX终止mix	0.2μL
各单碱基延伸引物等浓度的混合物(0.5μM)	0.94μL
		iPLEX酶	0.041μL
合计	2μL

延伸反应的条件如下：

6)树脂脱盐

在每一个有样本的延伸反应液孔里加入41μL水后离心。加入15mg洁净树脂(Resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。用膜把板封好，放在旋转器上振荡摇匀15分钟。以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。

7)SpectroCHIP芯片上样

用MassARRAY^TM RS1000自动点样仪进行体积测试以找出合适的点样速度。点样的合适体积是8-12nL±25％。以板上的样本进行体积测试，然后用MassARRAY^TM RS1000自动点样仪将反应后的样本点到96点SpectroCHIP(芯片)上。

8)质谱检测

使用MassARRAY Genetic Analysis System DNA质谱基因分析系统进行质谱检测和分析，根据质谱检测峰的分子量与相应的单碱基扩增引物的分子量之差确定多重PCR产物中相应SNP位点的碱基种类。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

序列表

<110> 深圳市第二人民医院

<120> TRPV5基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用

<130> JH-SDHZ-PI-20180318X

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 1

agccacacac tgtgcataca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 2

ggtctatttg gggctgggac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 3

tttagtggcg gtggaggatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 4

gtcctttcac tcccccttgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 5

tggaaactgc ccactgtctc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 6

cacaggagag gggatgatgg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 7

caacccacat actgcatgca ca 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 8

gcagaatgac agccaagggg ga 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 9

tctctcctcc cctccagctt ca 22

<210> 10

<211> 25623

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

cacacacacc acctcacaac cacacactgc atgcacacac atacaccaca gccacacact 60

gtgcatacac gcacacccca caacccacat actgcatgca cacacacaca cctacaagct 120

gcatgctgca tacacaagtc atacaggaga taaactcaga gtcccagccc caaatagacc 180

ccatctcttg ctcagttgct gtcatcctag acctgtttct ttcgccacat ttctataatc 240

tgccagtgtc tgcaaggaga agacatgggg ggttttctac ctaaggcaga agggcccggg 300

agccaactcc agaaacttct gccctccttt ctggtcagag aacaagactg ggaccagcac 360

ctggacaagc ttcatatgct gcagcagaag aggtaggctt cctagaacga tccgtggccc 420

taccgccgtg atcctcagac cctctgaccc acctgggcct gctttccgaa tacagcaccc 480

tagaagtgta ttgtcagtgc cagtcactca gacataccct ttccttccag cccacctaat 540

tacagaatcc cagctggccc cttttagtgg cggtggagga tgtggctttg ggccacacag 600

gaaaatcttg agggtagacc taaggacaga ggcagaatga cagccaaggg ggagtgaaag 660

gaccaaaaag gaccagaggg aagaagccag gttgtgtggg atggggaggg aaggcagaag 720

caggctgctg aagaagggat gcactcctgt gggtggtgga agcacgataa ggaaacgcca 780

ttcatttgaa tgaaagtgga ctgtgtggga aaggggagga gcgctttgtt tggtgtaaca 840

ctgggtgctg accagtggag gagggcagct caggtgacac tggagggctc tgagttcagt 900

ccatctgcct tttattgagt ctactgtgtg cagaggggtg ttagatccca atgacataaa 960

gattgaatga gacttgtgcc tgctcctgga gagctcttag ttcgggcagg gctagcacac 1020

ctgcaggtaa atcatttcat ggcttagccc tgaggtccag tcccaggaag agcagctggg 1080

gcagggacga atcctgtggg ctgcttcttc ctccaagtgt tttggggctt gcctcccacc 1140

caacagctgc ctgaggggtg aggttgttga gcagacatta gcagtcacaa agggctcccc 1200

tgtactccag aagattcctg tgctttgttc aatgccctgc tgtcctcatc ttcaagttct 1260

taataatttt gaacaagggg tcctgcattt gcagtttaca ctgggcctgg tcccaagtac 1320

ctctgagccc tcatactgtc aagccctctg cttcctcatc tccccaccca atacctccag 1380

tggaatctca ccttcctgct ttagagtggg acccctgggt ctctgagaaa gtgagcttcc 1440

agccccaact tggaccctct gcagaggggc agtggggata gagggccagg gaggcaagga 1500

ctttgtttgt gcagtggcct caggatgggg gtgaatttgc aatctcagcc ctgaccactc 1560

taggctggtc agggacacca ggctccctgg gactgattcc ctgggtgaga cggggcaggg 1620

aactgactcc tcacaaaggc ccctcctagg agcactgcct taacaggtaa aaccaggccc 1680

cacctttaga ttaaaagctt cttctttaaa tgaaaacact ttggctgggc gtggtggctc 1740

acacctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gagatgggtg gatcacctga ggtcaggagt 1800

tcgagagcag cctggccaac atgctgaaac cccgtctcta ccaaaaataa aaaaactagt 1860

caggcatggt ggtgggcacc tgtagtccca gctactcggg aggctgaggc aggagaatca 1920

cttgaaccca ggaggcggaa gttgcagtga gccgagatcg caccactgca ctccagtctg 1980

ggcaatagag tgagacttcg tctcaaaaaa aataaataaa taaaataaaa acactttttc 2040

gccctggctc ctggggctat tggaagagag ggatttggag gtggggacct cagaggagcc 2100

actcatcggc ctgtcctttc tgttcttccc cctacaccat gtgcttgcct ttggggccaa 2160

tacacatatg tctagttgga gaggctccag ctttatctct ttctgggttc aaatctgggt 2220

atggtagaag caaagattaa cagaggtcct gtagaatgag tatctcaacc tgttttgcct 2280

tgagacaccc acataaacaa gctgtttaga cctttgcatc taagggtata atgcagaaga 2340

aagaggcacc ctgtaactca ccccacaact ctccaccccc tgcagggacc tgtatctaaa 2400

taacctgagg atgctgggcg caatgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggcaggcgga 2460

ttgcctgagc tcaggagttc gagatcagcc tggccaacat ggcaaaaccc catctctact 2520

aaaaatacaa aaaattagct gggcgtggtg gtgcgtgcct gtaatcccag ctactcggga 2580

gactgaggca caagaattgc ttgaacctgg gaggcagagg ctgcggtaag ctgagattgt 2640

accactgcac tccagcctag gcaacagagc aagactctgt ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700

aaaaaatagc ctgagggagt agtcagaact ttagtgcctc acaaatttca caaatttcaa 2760

aatgcctagg aaagatctag cagtcgatcc attcctcctc cctctgtgtt ttggtctccc 2820

aaactcccct tggttaaaga cagtagattc agcaggccca ggagcagggg gaccgcagat 2880

ggaagtgccc tctgtcccgc tctccaacta tccaggatct gagacagtta ctcaggttag 2940

atgaattcag ccaagcctag ggtcctcttc ttagagactc tcagaccact ctttccagac 3000

tacaggttct cttcctatta actcttcccc tccagcagag cttcaagggc catcctcaca 3060

ggagaatcac catgatgtga attgcaagga aggccctggg gctgaccctt gcccaagtcc 3120

accctcggtc attcgagtcc agtaggcact tctttccaat ttgtcactgc acgctgtgtg 3180

agtcacgttg gtcttaaaga atgtcttaga tcccctttgc tcttggcctc attctgctat 3240

gactgtctct tccaaactca cgttcacctt tccccaggat tctagagtct ccactgcttc 3300

gagcatccaa ggaaaatgac ctgtctgttc ttaggcaact tctactggac tgcacctgtg 3360

acgttcgaca aagaggtggg atctggattt aatgggatgg aggtgggggc agaagaacct 3420

actcctcctc cccaagactt cgagtttgtg aaatagggcc ttggagggtg tctctggagc 3480

ctgaggcccc ttcctcaagg gaatctgaaa agtgtctaac atctctgtct tactccaatc 3540

caggagccct gggggagacg gcgctgcaca tagcagccct ctatgacaac ttggaggcgg 3600

ccttggtgct gatggaggct gccccagagc tggtctttga gcccaccaca tgtgaggctt 3660

ttgcaggtaa ggagcctaca tggtaattca aggtggaaac tttgagatgg agggtgtgct 3720

gttgtctctt aaaattggcc tctgaaggat gggttggggt ggggtgatgg agggtcagga 3780

ggatgggctc cgttgagttg ggagaaatgc aaaggtcctg gtcttggctt ttaccaatct 3840

gtggcttcct tcagcatttc ctttcaaacc tcccatagtc cctgtaggac ctatctcaat 3900

ttctttctct catagcaaca tgagaatgat tatattcata gcaatcccct gctggctccc 3960

aataactgaa gggtaggtca atgagcaggg cagcctgagg gatgaattgc tcttagtccc 4020

aggccaccct gccaagccca gggcagaagt ctagcaaaga tctatcagga acctcctgag 4080

agggatggtg ggggatgctg tgtccctgag agaactgggg acagagggag accctgatga 4140

tggctgtctc tgggccaggt cagactgcac tgcacatcgc tgttgtgaac cagaatgtga 4200

acctggtgcg tgccctgctc acccgcaggg ccagtgtctc tgccagagcc acaggcactg 4260

ccttccgcca tagtccccgc aacctcatct actttggtga gagcagggtt gggcttgaag 4320

gatggttggc tggagaggcg ggcaaggcag agggaggcca gggcatgagg gtcctgcctt 4380

cagctccatc tgttgggcag ttgagagggg cagcccttct agggcttaat taagccagag 4440

gcccattccc ctgatggttc cttcctctgg ttctgctgga cgagtgtccc tcagcctaga 4500

actgagatat gggggatgag gaggaggccc ttatttgggg gagactgccc accccatcct 4560

gccatcctgc gttctcctgc catggatctc tctgtgtcca caggggagca ccctttgtcc 4620

tttgctgcct gtgtgaacag cgaggagatc gtgcggctgc tcattgagca tggagctgac 4680

atcagggccc aggactccct gggtaagagc tgggatgggg aggggagctg ggatgctgtg 4740

gggagcgagg gacagggtaa ggagtggagc tgggaccttt aggaagaccc cagagtgggg 4800

atggggacat cagggacttt aggccagtgg ccacatgata ccctgcgtcc tccccaggaa 4860

acacagtatt acacatcctc atcctccagc ccaacaaaac ctttgcctgc cagatgtaca 4920

acctgctgct gtcctatgat ggacatgggg accacctgca gcccctggac cttgtgccca 4980

atcaccaggg tctcaccccc ttcaagctgg ctggagtgga gggtaacact gtggtaagag 5040

acgctcccca tccctgaggt gtctttctaa tgaccctcaa cctatcctgc tggccctggg 5100

agaaatagag gtgaagggcc cacctttctc taaaatccct tttccccaaa ctccccaaag 5160

ggatggtggt cccttgcttc ctattccatc actgaaatct tcagcttcat ggtccttgac 5220

tcaagaggat ttgagaacct taccttaatg catgtgctgt gataacccaa agctctagct 5280

tcctttgcct attttcttct ttctgcactt tctggggttt tggagcagga aagatgacaa 5340

aaaagggaaa gcttgtagat gcagaggttt gctggttccc actgtctgtc tgtctcaagg 5400

ggtgggcaac tggctccatc caatggagtt gttctcctcg accaccttct cacacgttgg 5460

ccccctgact catcctggtg gtctctcaga tgttccagca cctgatgcag aagcggaggc 5520

acatccagtg gacgtatgga cccctgacct ccattctcta cgacctcacg gagatcgact 5580

cctggggaga ggagctgtcc ttcctggagc ttgtggtctc ctctgataaa cgagaggtat 5640

ggatgccaag gaggatcagg cctgtcatgt gagggaattt agtgtttgtg cagagtctgt 5700

ccacttacta agatcctggg cctgagacac ttcccagcct tataataggt ggagatgaga 5760

atagtctcct gggacatggg ggaaagtcca atgcacactc ctctcctgaa tcccctgtct 5820

ctctgcttag ctccagtccc ttctgcctac ctttcgcctt ctatcatttc agatgagaaa 5880

ctccaaataa gagctgtttc ctcatattca ttcattggtt cagcattgat atggtttgca 5940

tttgtgtcca aatgcaaaaa tttcatgtca aattgtaatc cacagtgttg gagaaggggc 6000

ctggtgggag gtgattggat catggggaca gacttccctc ttgatgttct cgtgatagtg 6060

agttttcaca agatccggtt gtttaaaagt gtgtggcacc tccccctgct ctctcttcct 6120

cctgctctct cttcctcctg ctccggccat gtaggatgtg cctgctttct tcttggcctt 6180

ttgccatgat tgtacgtttc ctcaggcctc tccagaacct gtacagcctg cagaaccatg 6240

agccaattaa acctttttat ttataaatta ccctgtgcca ggtagttctt tatagtaata 6300

tgagaatgga ctaatacaag catattgaac acccgctgta tgtcaggcac tgcacaagaa 6360

acaaacagta cagaaataaa tacaacacag ttcctgttca tcaacttcct caattctcag 6420

tccctgtcct gaataattgc aacagagcat gacatatgcc gtaatagttg tgtgtaccat 6480

gcatgcagac agccacattg aggtagagtt aacttggctt ggatagacca gagaagatgt 6540

cacagaggaa atgctggggc tggatcttca aggaagaatt gggagtcaca ggaagatgag 6600

agaaaaaaaa gagcttttta gagagggagc aacgtataga ccattcaaca atgctgggtt 6660

gagtgatgtg agggaaacga aaatttgttg aagactgcag tagagaggag aaaagacttc 6720

caggtttcag aacgttccat gagagtgcca agatgtagtt tctgttttgt atctgccaca 6780

gtgacaattt cccaggaatc cttatagatc cagaaaacat gaatgattat taatactaac 6840

gaatagaaga aaagttgagt ggctagtttg tgagatcttc ctcagagaat atccctggaa 6900

acagatacac tttgagcagg atttcttagg tattaaaagc acaatcccac tgtgtggatt 6960

tcgccaccac atatccttgg tctttgattt aagctattct caatattctc cagcaggttt 7020

cataagtgtc ttgggtcagt tgcttttttc ctccataaat cttcctttct agcccccttt 7080

cacatccttc actaccttca gctgcagttc agaagaccta gactcctgat ttaggacaaa 7140

aatagaggct ttctggctgg ggatccttca gcttcctgcc ctacactgcc gagcatgtct 7200

ggaaactgcc cactgtctct ctcctcccct ccagcttcag tagaaaagat attcatgctg 7260

ttaatggcta atcactctac tgtgctttga atctgtctct ttctaatttc tcagatgcct 7320

cctcccgtcc atcatcccct ctcctgtgta tctttaacgt ctcactggct gcttatttca 7380

gagcaccatc ccaccctgcc acatcctact gcctgtaacc tccattgctt ctttccagcc 7440

caataatact tctagagcaa atctgaccac ttccctgctt gaactcccca gttgctttct 7500

gttatattta gaaaaaacaa aaaatgcaaa cttcctacct tggcatttat gatgcatgat 7560

gacctggccc tgttcttcct cagtcattat catttctgac taccactccc aatagattct 7620

cccctctccc caaccacatc tcaactgcaa atgggcaatg gcttctcaga ccttcctgac 7680

ctggcaactg ctgttagctt atggtatgat ctttcctaac tctcccttta ctcatctaac 7740

tactactcat cctttaaatc ctctttggtg ctatggtgcc ttgtgtttac tgctatagtc 7800

atttacctgt atcactagca caaggcccag ccatatgcag gaaatatact atttgtccgt 7860

caaataagtg actgatgagc tgagtgagtg atggttgctg ccctgcctct tctggccccc 7920

agtgggataa acaacatcct tctgtgttgg tcaccccaag tttcactcta cttccatgcc 7980

aggctcgcca aattctggaa cagaccccag tgaaggagct ggtgagcttc aagtggaaca 8040

agtatggccg gccgtacttc tgcatcctgg ctgccttgta cctgctctac atgatctgct 8100

ttactacgtg ctgcgtctac cgccccctta agtttcgtgg tggcaaccgc actcattctc 8160

gagacatcac catcctccag caaaaactac tacaggtgat tctcctcaga aggggatgag 8220

agagaattgc atcaaggggt gatggtgctg gaaacgaagc catgctactc agggacgatg 8280

ccacgctctg ggttccagca ggtgtaggct cctaaacacc caggtagaaa ttagacatga 8340

gaccaggagg ccacagatgg ggtttaatga gcacaagagc atttgtccag ggagctgtgg 8400

attttctcac acaaactttg aaagagtgct tggcatgagt aagcctgtgc ttttgtgaaa 8460

ttttttggta atttacaaaa agtatcaggg ttttttagtg ggatgttcaa ggtaaactct 8520

attgctcaaa aggaggaaaa ttgtgctcca agtccatttc tgagtccatt tttgttgtat 8580

ttgggcaaca cagacagccc tgctggcctg caccctcttc tgtgtgctgt ctatatgggc 8640

ccatgggaat aatgtgtcag ctgtctgact gcctgtcaga cactctgcag aaggatgtct 8700

ggattgggta tcaggctgaa gtaaatactc tctgaggctc catttagtgt tgtgggcctg 8760

ccattctgtg ttgtggtggc caagggaaaa ctagggttag gaagaggact gattcgaggt 8820

acacagtaaa tatagaaatc tgctgttgaa gaaagtaaac ctcctttttg tgcaacagaa 8880

agggtagact ctaatgagca cttctgaata tatatattta acaactgtag ctatatttga 8940

ggggttgact ctttgtggat tactaaaatt tttgtcctgg tgagctgaaa atacacagaa 9000

ggtgatgtag gtatgtagca gaaagcaaaa gaccaggaaa aagaattttg caaagcaagt 9060

gagaactgag tgattggaga tttatctcaa tgcaggagag agcagccata ggtatagctc 9120

agcctggact aggaagcagg gtagtttcag tcggaaagag aatataaact ttctatagcc 9180

aagaagcaaa aatcctgaat ttgtttagac caaagacagc gatatgcaca gagaaagaac 9240

agggcaaaga gcccaaatga accctatgct aggtagagac actccatctc tcctgttttt 9300

agaattgcct ttatatatat acatgtatat gtatatatat atatatatgt atatatatac 9360

atgtatatgt ctatatatat atatatgtat atatatacat gtatatgtgt gtatatatat 9420

atgtatatat atacatgtat atgtatatat atatatatgt atatatatac atgtatatgt 9480

atatatatat atatgtatat atatacagtg tgtcatgtgt ccagatacac tgcctctcac 9540

caagtaggtc ttgctgcctg gggaggacaa gcctgaatgt gttagagaca ctggaagcag 9600

ttgtgctgca tgcatctcag tctggccgca aaagttgtcc ctggcatgga gacatgagga 9660

aaataaggac agttaggaga tggcaagtgg agggaggagt gattagaaat tgagaaaaca 9720

caaacaaggt ggggatgact ggacttttcc aatgctcctg gccctatttc ctcagatatg 9780

tcttctccaa ccttcctttg tctcaaattt acttggagat tttctgcatt ttgaaggtag 9840

acaggactct gggttaaaag gtgggcaatg ctgagccact gataaccaaa actctccttc 9900

ctgtgtgtct ctttctcttt gggacagggc tagttatgta caatcacatt tctttgatcc 9960

agatagtctg tatgtaaaag accgcctcct ttgcttcagg actcagaagc ataattatag 10020

ctgaacacct gacccatcct tctttctttc tctcttctgc cttccttctt gttccttggc 10080

atttttaccc tttctgcctt ctgcttcagt gaaagccact tcagctcaaa gagaagactt 10140

tggactttca gatattcttt tcttggtgga gaagtgggtg ggtaagagga ttgagaatgc 10200

tgctggaagg ggttagataa caaagaacgc taatgaaaag tccctatgct ttgagccctg 10260

gccctgattt atgggatgac tatgttcttc ttattcagta gtaagcccat ttggattaga 10320

tcaggggctc ctaaacttat catcatgatt tgaaagattc tgttttcaca gtgcaccaga 10380

ttttttaaat aataggaaat tccttttttt tcctactgtt ttcttacttg aaagtcttag 10440

aaaaaatgaa aacgcacaaa tacagtgtct tgatttgact catgcaattg ttgacatatt 10500

agttagctgg tggagctttt tcttagatga atgaatactt tactgtccaa ttatattaat 10560

aactctggga tcacagggat ctcagtcact tcaggacttc ctctgcagat ctcttgggat 10620

ctgtggaaat cactgggctc catcacccct aagatccttt ctagtttaat atctggcatt 10680

ttataagagt agtgcaacag caccatctca gaacagatga gagaaaacaa attcctctgt 10740

ataaggtagc aaaaaactac acaaaagctg atgtttgtaa agctggagtt agtttatttc 10800

tatccaattt gggggctatc ttaatgactc taagacacct cattgctcag ccataaaagt 10860

tctgctttac tagagatttc ccagaactct attaatttga gttaacttct tatctccata 10920

tatttctact tggtttaggc agagcagcat gcactatagt actagttctc ttaggtttcc 10980

aggtgagtaa aaagctcaaa gtcctggagt ccagcagctc gggttttagc cctaactctg 11040

aaatttaata cttgtttgac cttaggaaaa tcctacttcc tgccagatct gtgattttta 11100

acccagactg tacactagaa acctaggaag ctagtaaaat gactagctcc taggctacac 11160

tttagtagac ctaataagtt ggaatgtctg aagctgaggc tctggccttg gtatttttaa 11220

gaaactcttt gagtgagcca aatgttctgc caaggttgag aacccgtggc ttccatcttt 11280

gaggtaagtg cagctctgcc tttccagtct taggcccacc actctggtca tttagattcc 11340

cggattactg ttcagcaggg agttcaaatt tctcgtcaca tctccttttt gacttttgaa 11400

aaagattctc ttgagccctc ctttgatttt ctctttccca gaaatatttt gctaatccat 11460

tcattaaata aattattatt gagagcctca tataggctaa acagctgttc caggtgttgg 11520

aaattcaaca gccatggtct gagcaaaaca cacatgatgt ctgctttctt ggagtctaca 11580

gactggtttg tattaatcaa acgatcatac aaatagatac ttcattataa tctgtgactg 11640

ttggcatcaa tattattttt ttcttatgat gagaaaagca cagagtgggg aaaaaactta 11700

taacaggggc ctggtccctc tgggaggcca gagcctgctt ctgagaaaga tgactgagct 11760

gagatctagg tatgaattca acgtgaaaag agagttctag acagaaagaa tgcatattca 11820

aacgcctcaa ggcaggaata acctcaccaa agtctaggaa ctgaaagaag attcactaga 11880

gcacagagag ttgggttggg tacctccagg tgaggttgtc cagacagatc cttctcaaat 11940

tatatagtct taaagggttt tacgctttat ccccaggggg atgggaagtc agaaggattt 12000

taaacagggg gatgtacaga gtaatttttg ttttagaaaa attactctgc ttgcatggtg 12060

agtaacagat gtggggggtg gtaggaagga cattgggaga ccagtcagga ggctattaca 12120

gtttagcaag caaaagataa tgttggctgg gcacggtggc tcaggcttgt aatcccagca 12180

ctttgggagg ctgaggcggc ggatcacgag gtcaggagtt tgagaccagc ctggccaaca 12240

tagtgaaacc ccatctctcc taaaaataca aaaaattagc caggcatggt ggtgagcacc 12300

tgtaatccca gctattcggg aggctgagag aggagaatcg cttgaacgtg ggagtcagag 12360

gttgcagtga gccgagatca cgccattgca ctccaggcca ggcgacagta tgagactccg 12420

tctcaaaata aataaattta aaaaaatggt ggattggcct aggaatgtag tggggagata 12480

gagggaaggg attggcatca ggagacttat tgaaggcaaa atcatcccta ctgtgtttcc 12540

atcttttaaa aatcatcttc tacctatcac agtccgtggg atctatttgt ccacacatca 12600

tcatccctcg taagttctga acaatccaaa gcaccactgc tatttgaaaa gcaactgatt 12660

gccaactcta tacaactttg ttgaggggtc ctaaccaact catggtggaa caagcacagc 12720

acattataga cagggaaaga gatgaggaga accagggagc ccggtaggta aaaataacat 12780

ccactgagca ctgatcatga acacatgcat tcatcagtgt ttttgaggcc ttattaaact 12840

gtggattctg acagtaaggc tgggtgggac ctgagacttg gcatttccag caagctgcca 12900

ggtgaggcca atgttgtgat tctgtgcacc gcgttttgag tgacaaagca ttattctttc 12960

atttaatctt tgtagaaatc ctaacaaata aatgcaatca tcaccacttt aaagatggtg 13020

aatctgatgt caagagaggt tgaataattt ggcaaagaca ctgagctagc aaggacagca 13080

ctaggattgg gctgcaagtc tgcctccctt cagaatcctc acctttaaac accagacaag 13140

gccatttctc cctccagagt gatgtgctag gtcccagtct tctctattgg ctagccaggg 13200

cttgccacac tcacgtgtat ctacacatct catctttccc tgtcaagagg agaggcgctt 13260

gagaagtgct gtgggagagg atcagatata gaaagattca tacccccaga tactgattca 13320

tacccccaga tactcctctc cagttttgat aattggcact gttttttgat ggggttaacc 13380

tactggcata tagggcaagt cataattctg tgggaatggg tggagactct tcagaagaaa 13440

ggggtaatct cccaagccaa tacccctgag aaaatgcaga gactgggaca tgaaattaac 13500

ctttggaagg cagcttgact tacatgggaa ccagatctct ctctctctct ttatggccca 13560

gcggttctca acttgggata cacgtccaaa acgcctacag aacttttcaa gtaaatgcca 13620

ggttcttgat ccaaattaac ccagggttgg cctggacatg tgtgttgtga caaagactta 13680

acacttgatt ctgatgggca gtcttggtta ggaactcatg cccagttagg gaatcggaga 13740

agctctttgt aagagctagc agagctttct ctgaaaactt cattcctttg caagtctggg 13800

atcatggggg ggaaaaaggt ctagagctgg gctggacaac tggttctggg gcctacccac 13860

ttcccactgt ggtggcctat gttccccatc ctttccacat agtacatccc tggcccttac 13920

gacccagtag tgccccaggc actgctttgc ccactccttc tgggcatttc cttccaggca 13980

atgaactcag ctggctggga agtgagagca aatctcatta ggccaattct cagtgacgta 14040

taaatgccag cctgcatagg ggatttggtt gttgaaagct cattaaattg caagccatgt 14100

tgtggagtaa aaaattccag tcattgttag atgatattta tttttaaagg gatgtattgg 14160

agtaccttct ctgtgcgttg ttagccaggc ctgcttaggt gaccttgatc taggaatctg 14220

aaaatttcag aaaagcacga ttagttgtca ttcttttcct cttaggcctc cagataggtc 14280

tctccatccc cgcttcctgt cctccttacc acccttctgc gtctcttagg caatgcttaa 14340

cttgcacctg ctgtctcctc tctccttttt ctccttcctt ctttcctttc ttaccaactg 14400

agtgcctacc acattgtgtg catttgtgga taaaaagtag gagggaggca tccctgccct 14460

caggaagctc taagactact ggtgagacat ggggtaccca gacactttca gtgtgctggg 14520

agagggctgt caatacacag cagccccaca tgtcccagga gagacacatg acctgggcat 14580

ggaggggcag gaaaggaggc ccaggaggag tgttggcctg acctgagtct tgaggcatcg 14640

gtgagggtga gccaggtcaa catggtggag gaaggcattc tgacaaagtg gcatagcctg 14700

tgcagagacc caacttagca acccagaacc ccaatagctc aatgtggcca gagctcacac 14760

agggtatgag gacacaaggc aggggccata gcagggaggg ttttgtacat cccgtttggt 14820

actctggttt tattttttaa attcttatct cacagtgagc tttcctaatt aaaagaaaat 14880

gacgtacatc gtgctcatga cttacaaatc aagtggcaga tctgatagag agcaactgcg 14940

tcctggacag cccctctttc tcacccatgt cttactcaca ggggacaacc agtttttctt 15000

tcttttagct cttccttcct gtcatcacct ccacatccct ggaatcaaat ccttctatct 15060

ctacttgcta atcaaattta gacattatct agtgaatttc tgtgacgata aagattaaag 15120

aacactctcc actgccacct ctcctgcatt tctattctga aggcattggg gagctaggaa 15180

tgatgttaaa cagataagtc tcaggatgat atctgtgttt tagaaaggtc aattcagaag 15240

cattgtgcgg ggtgggttga atgagcggaa atagatgtag ggtaaactag atggtagatg 15300

gcatgggttt gccctaaggc ataagttctg ttaaccaagg gaaaggaaaa catgtcagag 15360

agaattggga actgaatgag taaggctgga gaatgggtgc cctgataatt tactttgcca 15420

aacataacca ggcaacaata ttttcataag gaccctaaat ctagagagtt gtgaatcagc 15480

atctcaatct agaaaaaaaa atcttgaatg caattcccaa agaataaaat ttttaaaatt 15540

aaaagaaaca tccattacag tttgggctta gggtttaatt ctaggggtgc aagggtggtt 15600

aattaaaagg gaagcctatt agcacttcaa tttaatgccc ctttccattt ctgaaatact 15660

gaaatcttcc ttacctttgc aaagagtatc tattctaaag caagagctaa cattttatat 15720

cagtgtgaaa cactggagtt ccccagaaag tctaaagaaa atcaaagtgc tttaaaagcc 15780

caatattatc attacttcta ttgcaacttt tacatacata tattgttttt gttttccaga 15840

gagattagtt tataaaacaa agcaaacaaa accctacaga agggtttgta ttctggtctt 15900

gtagagcagc aaggaagggg gctctcagga gtctgtggca ctttgcagcc tggtttaagg 15960

gtaaggaccc cggggacaga gtgctggagg cagctactct aggtcagtca gatcccaggc 16020

agtgcagagg caaaaaattg gggtttctga acacctccat tactcattag tgaatttgtg 16080

cagagtaatg cgtacttgta aagaaatctg ttgaactggt gagaggaagc cccagcagga 16140

gaatttggtg accaaaactg tccccagcat tagaggggtt tcacattttc atctcctgaa 16200

ggaatggctg ctgtgactcc ctggctggat tctaggggca ccctgatctt cacagccatc 16260

ctcgccaact tatgtgtagt ccttttcttc ttgagccaag aaaagattgg tagcatcttt 16320

tcagacatat taaatcaaga cacgacattt ttaaaataaa aatattttta tagacacata 16380

tatggcatag atgcagttat ttctatattt aatgttattt tgtttctgaa gtaatgtatt 16440

tgttatttat cctcctactc actacctgac tctgtgaagg agttggcatg ttttacaata 16500

aaagacagat gctatagaaa cattaagata aagaaaaaga acacagtccg tgaactgaat 16560

ttcaggagag aagagaagga attcaaagat agctgctaga gctgaggaca aaaaaacaaa 16620

acaaaacaaa acaaaaaaaa cgcacaaaaa aaaaccagac acacaaaaaa atagaacaaa 16680

acaaaacaaa aactctgaaa ttctttggaa gcaagtaaaa aaagaaattt gctattatat 16740

gataaaataa aatttaccag tttctcaaga gataaatgtc agaaaagttt acagagcata 16800

ccatttttta agccaaaaaa gaaaaaaaaa agtgttgact gatgtctggt cacaggttgt 16860

tagaccacag agttctccag acacacagac agaagcttct ctcctagtct ctcttggttc 16920

cctgtgttaa aagcactgcc tctcaccggg caggtgagtg tgctgctgca gtagagtctg 16980

gagagatgct tacaggttcc agctgattag cagagcaggg ataattgccg ttccttatgc 17040

taactaggga ccacattctc cctggctcaa atcatcagct ttcctgctgg ccccagggga 17100

ctctcaactc ctttcttggg tgcactattt ggagatgtga ccttggacaa cagagctccc 17160

aaaagtcaaa aggctgcttg catgtgttga aattatttgt gcaatatcat gtgggaattg 17220

tctacatggg aacacagttt tgtagaaaga agatatacag tttttattat gttttcaagt 17280

gagctcataa cttcaaaaac ataaggataa ttaatgtagg attctagcac tacatctgtg 17340

atattgcata agtttcaccg tgaagtaaca tgcattgaag tagggtggtc ttcattccac 17400

cttgaccctt ggactatacc ttctacaact actgctcagg ataggcaggg acccttcctc 17460

atagtgtctc tagccccttc tctgctcttt tctgtaatgt caaatcatca taaaaccaca 17520

gtgaatatat ctatagtgat ttatgattta taaagttcat gtaaatatat cattaatgta 17580

agcttcacaa tgactctggg aggtaagcac tgtagcctcc attttacaga tgagaaaact 17640

caagttcaga gattttccat gaatggttca aggtctcact agaggtagta gattccggat 17700

ccgtgaggga acctgaattc tgtgatatgt ttacagtgta ttcttcccac tagaagccat 17760

gatgaggttg gaaaaggtgg actttccaca tagctgaaac catcccaagc cactaatacc 17820

tcttcctgtt agctcacttg atgcgctgaa atgtgttctc agctgctcag tatatacatc 17880

ataaatttct gcttacagca tctatagaaa aggcgatttt gctagatggt agctcaagac 17940

attagcatat gtgacgtcta ttaaaccttg gatacataga ctcctgtcct ggtcacagag 18000

ttacccacaa tggcaagtac aatgggggtg gggtgatgct ggtgggaagg ggagtttcct 18060

ttattttgga tgggctttag cagctttcga tcatttgcac aaaaggattt gactctgccc 18120

atcagaaagc acttcttctg aatttcccca cataggaggc ctatgagaca cgtgaagata 18180

tcatcaggct ggtgggggag ctggtgagca tcgttggggc tgtgatcatc ctgctcctag 18240

aggtgagggg caggcggggt ccaggctaat cccatcccat ctaaggccca gactgtaccg 18300

cagtccacat tgtatttttg ctttgccgtc ctctccccag attccagaca tcttcagggt 18360

tggtgcctct cgctattttg gaaagacgat tcttgggggg ccattccatg tcatcatgtg 18420

agtatcccct cattccagcc ccctgccttt ccttaccaga atcttttcct gtctccagct 18480

cactctctga gttctaggcc tcaggtcact ctcactccaa ggacttctct ccagtggact 18540

tgtaggtgta actgtatgtg cgttttaggt gtaaagacta agcctgagtg tgtggatacc 18600

accccggtca ccactatgct gtagggacct aaaatagttc cagcttgtct ctcactctct 18660

gctttctgct cccccagcat cacctatgcc tccctggtgc tggtgaccat ggtgatgcgg 18720

ctcaccaaca ccaatgggga ggtggtgccc atgtcctttg ccctggtgct gggctggtgc 18780

agtgtcatgt atttcactcg aggattccag atgctgggtc ccttcaccat catgatccag 18840

aaggtcagtg ctttcccgaa gcttcctccg cctcaggcac aagaccttca cagacagagg 18900

gatggaggta gaatggagct ggtagaacta tgggggcctc ttgatctgtt agcgttagct 18960

gctcaaaagc agtggaaaag gaatcatccc accctttctt ccttctgttt cctgcagatg 19020

atttttggag acctaatgcg tttctgctgg ctgatggctg tggtcatctt gggatttgcc 19080

tccggtaagg caccatacac tcctctacta gatcagcaga tctagttctc cagaaagttc 19140

actctcattc ttgctctcag ttctcatttg cacttcattt tgctttcttt ttttttgttt 19200

gttttttgtt ttgttttttc ctgttggaag gtaagtctaa aagcacaccc atatttatag 19260

gaccaggggc cactcaggtt ggcctggaac gtaaagccat gtgttcaggg ccaataagat 19320

ttatgttcac taactgcctt gcaagatctt taaaggagag acaggaaaag acttttggtg 19380

agaacagggc attaaacagg aaagactggc cagtcatgga tctcagaaaa ccatgtggac 19440

aaacagagat agtgccatgc ttaactctcc tatgtttaca attcagaaga ggaaacctaa 19500

agcactcaac aacatataac ttgctttttt tctatatgtg gtcatttaaa gctgagaaaa 19560

atatgaaaga attagaaaaa ggaggtgcag aaaaacagct tggacagttt gaagatgaca 19620

gagaaaacaa aaaagaagag ttgtgaagag agactgggag aacaggaaca cacaggcacc 19680

cagtcaaggc acagccagtg aaagtgccag ggagcaaaag aaaggaacgg cacagcagga 19740

aaacacaggc aggtggaaac agccagaggg aaggagaggg tgggtggagg agcagaagaa 19800

agtccttagg gaggggcaga aagaggaagg cccaggtctg aaaagcaaaa ggccagtagc 19860

tcaaattcag tcctcagtgt ctgcaactga ccatctatta gacaagaaga ggcactagaa 19920

ggatcccccc atctctaaaa agcaatgact cagtgcagag gactctatta ctgtcctcag 19980

ggatttcccg ttcaatgggg attcccacaa aacaacagac caaaacaaaa aacaaacaaa 20040

acaaaacaac aacaacaaaa cccccaccaa aatctgaaat gtgaaagagt aaaaccatgg 20100

cgttctgcct gtttggagtt ttccacccca agcccttatg taccctttcc tcccactccc 20160

tggccatcta catctataca taacacagat tacaaaatga ggtgatggtc ccagagtggc 20220

tttctgtaga tgtcctctat ccagaactct ctaaatgttc acttcttggc cattgcactt 20280

gcttttctct taaataaata aggaggcaat gctttgtcat agaccctgtt tctgctctca 20340

gaatgtgctt cagctcccta tgcagtgagg aggctttcaa gcagtccagc gctgtcctga 20400

agttccctta cgctcactgc tatccagtag gctccaccct aagcaggaat ccgtttccta 20460

tgttggttca ggttcactca gggaaggtca gagtgatgga gggttatcta gaggccatca 20520

agattaaaaa aggggctctt cttttagcct gttcatgtgt tctgttcttt aaaaattgtt 20580

gaggattcca tacattcttg taataacttg ccttttaagt atttggtttt ctaaaatgca 20640

aaaaccagtt aggtgaccta ttatccatta tccatacaaa cacacacgct gcacacacaa 20700

ttttgttgtt gttaaatgac tattaccatg accattaccc agagtggtga acttaatcat 20760

aggacatctt agggttagac agttccacag gaaactacat ttattagtat gtaattatct 20820

gtgcatgtgt gcaagtgtat ttagatagat agatagatag atagatagat agatagatag 20880

atagatcaga gatagaataa gtgctaacca tgtccatgct tattgtgata actccattat 20940

cccatctcca tgtcctcttc ctgggcggag cagcgttcta tatcattttc cagacagagg 21000

acccaaccag tctggggcaa ttctatgact accccatggc actgttcacc acctttgagc 21060

tttttctcac tgttattgat gcacctgcca actacgacgt ggacttgccc ttcatgttca 21120

gcattgtcaa cttcgccttc accatcattg ccacactgct catgctcaac ttgttcatcg 21180

ccatgatggg cgacacccac tggagggtgg cccaggagag ggatgagctc tggagggccc 21240

aggtgagttt atttgtgtta gtcttgctaa gaagcagggg ttggagagaa aaatcaaagt 21300

ggaaaatgtt atggtggatc attcttaaaa gagtcacaga aaaacccagt gaggctgtca 21360

cctcagaaga ggtttgtgta aacctgaggt acatgtggat aaatggaagg gacagaagga 21420

ggattaaatg gacgatagtg gcaagaggtg gggttgttgc tcacagggga aaagtagacc 21480

taggattgat ccttgagtcc agtgggaact agaagtgacc ttgttctggt atattccagt 21540

tttcaatttg gatcttatct tctatttgct tctgtaaatc cctgtttctc tatgatcttt 21600

tctttatatc accatagact gataaatatt agaattagaa gtgaccctca atggccctca 21660

agttgacctc ctacttaaca taataatcat ttattggtca gaatgtcatt caatatcttc 21720

tctaatgctg attagtacct tattatcttg caaattcagg tagaggttgg gaggaaggga 21780

gttttcccat atttttaaag attttgttat tagacattta tgtcgcattg agctaaaacc 21840

tatcttctta aaatttcatt ctttggcgcc agtctttccc tctcatatat cacagaacac 21900

attcttccat ataagcacca ttcaaatatt tgaatatagc catcattttt cccttagact 21960

tttcattcat ttaatgatga tcatttagac cctgctatgt gttgacaaat gcctaggagc 22020

tagggacatg agcataaaca caacagacac catatgtgcc ctcatggagc tgacggttta 22080

gttggaaaga cgggcatgaa gtgaatgact tcacaaaaag ctgtaaaatt acagcagcaa 22140

aagtgctata gagaatgtaa ggtgctaaga ggaggataca acagaggaat cggactggga 22200

agtgaagaca tgctttcctg agggagcaac atttaagatg agaacccaaa ggtgagcaag 22260

aactaggtag ttaaaaggaa ggagggaaaa ggatgaaggt caaggttagt agcaattagg 22320

actcttggct acagggacag aaaaccaaac tcaaacagac ttgcagattt ttaaacaggg 22380

ggaagaggat gtgttagtcc tcataaatgg gaagtttaga gaattaaact aactttagag 22440

gtatctggcc agaatgcaga tccacatctt atacattaca tccattcctc tgttcggctc 22500

tcttttgacc tctcttctaa ggcaagctct cccatcgtgt ttgtgagatc atttctagaa 22560

gctccaaact ccaaaaagaa tgaggatgtg caatgcaaca cgcagctccg agggccccac 22620

tcacgttgta ttctgtgagg ctcctggtgc caggcaaaac tgcaggcttt aaaagaacat 22680

ctttccccct gccaattcct tccatgttcc atctcatggg aacacattcg ggtcataggc 22740

acatcgttga atctaaggaa agaccaagga ctagatagtg gaggtgttgg tgatggtggt 22800

ggaggggagg tttgggggaa aatagattaa ttaagcacaa ctgtgtgaag cccagtccac 22860

tcaaaccaat gcactaaaag tgatgaggga gcaattccct aaatgaaaaa tgggtgctgt 22920

tacccgagga aggacggggc tgcatgatgg ctcaggagga acaataaaca tttctttcaa 22980

ggcaaagaag aacagctatc cagggtaaga gcacagaatg actggaagtc ctgagctagg 23040

agggaacttg gtgcaattaa gaaactgaaa gaagtgtgga gtaatgagga agatagggag 23100

tagaaaaaca tgaggtgaag aatttgctat tttgaagatt gcactccttc aattaggaag 23160

ccttcctggt tctgatctat tctgattgca cccttttgtc catgctctaa tagatcatgg 23220

tttctttgaa actagaatag tccccagtat gattagggca atgcggtaca aagcgggact 23280

atgcctttcc ttacttggac ataatgctaa gggtacctaa agctgagtca ggtcttttag 23340

caaatataca aatggccctt attaagcttg tgatcagcta gcactcccac acctttgttc 23400

tatgactcac ttatctaagc ttcctaaatg taaatatagg accttagatt tggtttactt 23460

aaatttcttg ttaatgattt tacaccagca ttccaatcta gcgagataat tttatattgc 23520

ttctgttgcc ccacatatta catatccctc ccagttttgt gtcacaggca tatttgataa 23580

gcttgtttcc catgtttcat ctaagtaatt aatgagggct gagcaaagga cagaacgtgt 23640

ggtggacttg ctaccagaaa tttccctgcc aacttgcagt cattaatcaa cccttttcct 23700

tcctaagatg tggatattta atttgctgaa aattccctga acagtaacag tatcaattca 23760

tccccaagat cgtagagatt ctctttaatc attttattta aatcgagata attggtctgt 23820

ggcttttata tgaaaaagaa gttgagatta gtttggagtg actcattctc catgagtgaa 23880

tagtaatgta agggcaacta ttttattcaa aacactcaca aaaaatcctc tctcatttct 23940

tgatgagtga agctggttgc atggtgcctg gcacaggctg tggggtgaat aggtggctgt 24000

tctcaccact gacctctagt gtcctatctc acagattgcc tttggttccc tttatcagtg 24060

gcctcagtgc ctctttgaac ctcatggctc tttcagagtt cttcctgtat ctcctgcctc 24120

cttccaggtc gtggccacca cagtgatgct ggagcggaag ctgcctcgct gcctgtggcc 24180

tcgctccggg atctgtgggt gcgaattcgg gctgggggac cgctggttcc tgcggtgagt 24240

gatggtgtgc acatgcaaaa ctgcagatgt gtataaggcc acggaagcaa gggtgaccga 24300

caggcgtcct ggagcctaca ttagcctgtc taggggaggg ggctggagct gaagtggagg 24360

ggtacgaaga atgctgtgtg tacctcaggg cagccacgtg taaaaggttg tgtgcatgtg 24420

tccatgctca gacgtcagca tgggttacca gacttgctgt aaccttgttc tgagctgacc 24480

ttcatctcca gtgtactttt ggcttggatc taacttcctc cttcatattc tgccctcatc 24540

tcccggcgtg actctcctct ctcctcaaat ttacttcctg aattgcatct cgtcatcctt 24600

gtgacacgct tatctattag ttggctctgt tttctctttc acattcctac gtattagtaa 24660

cacacaaaca cacacacacc tgtgtgcgtc ctaccaccct gcaagccctg attgctcagc 24720

ctccattatc tctatcccag gttagcctgc cctccatcac ctcccttcac ttgatcccag 24780

atactcttcc tgtttcaact ctgctgcctt atttctgctt ccctcttgac cctgctttct 24840

aaatggtcac ctctacttct cccctgccca tgtctcccca cctggattga gtcctttccc 24900

ctttcccctt atcagggttg agaaccacaa tgatcagaat cctctgcgag tgcttcgcta 24960

tgtggaagtg ttcaagaact cagacaagga ggatgaccag gagcatccat ctgagaaaca 25020

gccctctggg gctgagagtg ggactctagc cagagcctct ttggctcttc caacttcctc 25080

cctgtcccgg accgcgtccc agagcagcag tcaccgaggc tgggagatcc ttcgtcaaaa 25140

caccctgggg cacttgaatc ttggactgaa ccttagtgag ggggatggag aggaggtcta 25200

ccatttttga ttaacatcgc tatcactctt gaccttactc ccggttggcc tgggggcggg 25260

gacagagacg gagacctctg cctatgcaag tgtctaactt ctgtgcctgt taatcatggg 25320

agggtgagac agaacaatcc ctaaagggtc atgcctcaca cttcacatca gaatttctgg 25380

caatgggcaa tggtcatcga ttgtctcacg tattttctgg gctcttgcaa gtcacccatc 25440

tcaggaaaaa ggaggttggc aactaaagac atgaggcagg gatgctagat taatgtcagg 25500

accatttctc ttctgcccca cgcagcccct agaaagtagt aagctgtgag gcttttctgg 25560

ctccccaggg cttacgtggg aagagccagg catggcatag aggttgtggc ccttcttttt 25620

ttc 25623

Claims (3)

1.一种检测与重金属中毒易感性相关的SNP位点的试剂在制备检测受试者重金属中毒易感性的产品中的应用，其特征在于，

所述SNP位点为TRPV5基因第103位核苷酸C＞T；

所述TRPV5基因的序列如SEQ ID No.10所示；

所述重金属为铅；

所述试剂包括扩增所述SNP位点的PCR引物对，还含有扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物，

所述TRPV5基因第103位核苷酸PCR引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示，单碱基延伸引物如SEQ ID No.7所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括PCR反应试剂，和/或碱性磷酸酶及其反应缓冲液，和/或单碱基延伸反应试剂，和/或脱盐用树脂；所述PCR反应试剂包括：dNTP、Mg²⁺、PCR反应预混液、和DNA聚合酶；所述单碱基延伸反应试剂包括：ddNTP、单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸酶。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SNP位点的试剂还可以与其他检测受试者重金属中毒易感性的产品进行联用。