JP2007532110A - Ｆｃレセプターの多型の同定のための核酸ベースのアッセイ - Google Patents

Abstract

ＦｃγＲＩＩＩ多型に対して特異的なオリゴヌクレオチドが開示される。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドを、増幅プライマーおよび／または配列決定プライマーとして使用した核酸ベースの遺伝子型決定アッセイもまた、開示される。１つの局面において、本発明は、長さが１０ヌクレオチドと６０ヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供し、そのヌクレオチド配列は：（ａ）配列番号１〜１９からなる群から選択される配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の相補鎖を含む。

Description

本発明は、一般的に、遺伝子型同定に関する。特に、本発明は個体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を正確かつ効率的に決定するための、核酸ベースのアッセイに関連する。

（背景）
ＩｇＧレセプター（ＦｃγＲ）は、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および他の細胞型の表面に発現する、膜結合糖タンパク質である。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）は、食作用、エンドサイトーシス、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、炎症性メディエーターの放出、および抗原提示の増強のような、様々な過程に関与することが示された（非特許文献１）。ＮＫ細胞の表面に発現する低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターに対するＩｇＧの結合は、ＡＤＣＣに寄与する根本的なメカニズムであると考えられる。例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４：非特許文献５を参照のこと。

２つのＦｃγＲＩＩＩ遺伝子である、ＦｃγＲＩＩＩａ（遺伝子Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（遺伝子Ｂ）が同定されている（非特許文献６）。ＦｃγＲＩＩＩレセプターは、第１染色体の長腕にマッピングされた（非特許文献１）。さらに、アミノ酸位置１５８においてバリン（Ｖ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換を予測する、ＦｃγＲＩＩＩａの２対立遺伝子の機能的多型（ヌクレオチド５５９におけるＧ→Ｔ）を含む、ＦｃγＲＩＩＩＡにおける様々な機能的多型が同定された（非特許文献７）。ＦｃγＲＩＩＩＡ １５８Ｖ対立遺伝子は、１５８Ｆ対立遺伝子よりも、ヒトＩｇＧ１により良く結合することが示され、そして１５８Ｖ対立遺伝子の増加した結合は、エフェクター細胞の増強された活性化およびより良いＡＤＣＣを引き起こす。非特許文献８；非特許文献９。治療結果も、１５８Ｖ／Ｆ多型によって影響されることが示された−−ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｆ／Ｆホモ接合体は、リツキシマブのような治療的抗体に対して減少した反応を示す。非特許文献１０；非特許文献１１。

ＦｃγＲＩＩＩＡ １５８Ｖ／Ｆ多型の機能的および臨床的関与を考慮して、いくつかのグループが、特定の個体を遺伝子型同定するためのＰＣＲに基づいた方法を提案した。例えば、非特許文献７；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；および特許文献１および特許文献２を参照のこと。しかし、現在利用可能なアッセイは、多型の決定に関して少なくとも１０％のエラー発生率を有し、そしてそれに加えて、ＦｃγＲＩＩＩＡ（遺伝子Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（遺伝子Ｂ）の間を効率的にまたは正確に区別しない。
米国特許第５，８３０，６５２号明細書 米国特許第５，９８５，５６１号明細書 Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ（１９９３）１４（５）：ｐ．２１５−２１ Ｃｌｙｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（２０００）６：ｐ．４４３−４４６ Ｃｏｏｐｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２２：ｐ．６３３−６４０ Ｌｅｉｂｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９７）６：ｐ．６５５−６６１ Ｒｏｉｔｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版；Ｍｏｓｂｙ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、ＵＫ）、２００１年 ＲａｖｅｔｃｈおよびＰｅｒｕｓｓｉａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８９）１７０：ｐ．４８１ Ｋｏｅｎｅら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：ｐ．１１０９−１１１４ Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）１７６：ｐ．６５９１−６６０４ Ｖａｎｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：ｐ．６４２９−６４３９ Ｃａｒｔｒｏｎら、Ｂｌｏｏｄ（２００２）９９：ｐ．７５４−７５８ ＷｅｎｇおよびＬｅｖｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００３）２１：ｐ．１−８ Ｌｅｐｐｅｒｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４２：ｐ．１２７−１３２ Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６）１９９：ｐ．５５−５９ Ｍｏｒｇａｎら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００３）４２：ｐ．５２８−５３３ Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００３）２７７：ｐ．１８５−１９２

従って、被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を正確かつ効率的に決定するために使用し得る組成物および方法を開発する必要性が依然として存在する。

（要旨）
本発明は、あらゆるサンプルからＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定するための、高感度の、信頼性のある核酸に基づく試験の開発に基づく。

１つの局面において、本発明は、長さが１０ヌクレオチドと６０ヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを包含し、そのヌクレオチド配列は：（ａ）配列番号１〜１９からなる群から選択される配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の相補鎖を含む。本明細書中で記載された単離ヌクレオチドのいずれも、検出可能な標識、例えば蛍光標識（例えば６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および／または２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ））をさらに含み得る。

別の局面において、被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定する方法が本明細書中で記載され、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）被験体から得た生物学的サンプルから核酸を単離する工程；（ｂ）センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、少なくとも１つの本明細書中で記載されたオリゴヌクレオチド（例えば配列番号１〜１９）を含む、少なくとも第１および第２の組み合わせを使用して単離した核酸を増幅する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドの各組み合わせで増幅された核酸の存在または非存在を検出する工程、ここで増幅された核酸の存在または非存在は、被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を示す。ある実施態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＦｃγＲＩＩＩ多型に特異的である。あるいは、他の実施態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＦｃγＲＩＩＩ多型に一般的である。本明細書中で記載された方法のいずれにおいても、例えばさらにもう１つのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことによって、サンプルから核酸を増幅するために、オリゴヌクレオチドのさらなる組み合わせを使用し得る。いくつかの実施態様において、第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、それぞれ１つのプライマーを共通に含む。

本明細書中で記載された方法のいずれにおいても、ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖ／Ｆ部位における遺伝子型を決定し得る。従って、ある実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組み合わせは、配列番号５および配列番号２を含み、そしてオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組み合わせは、配列番号５および配列番号１を含む。これらのプライマーの組み合わせを採用する方法において、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組み合わせを用いた増幅産物の存在およびオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組み合わせを用いた増幅産物の非存在は、１５８ＶＶ遺伝子型を示す；オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組み合わせを用いた増幅産物の非存在およびオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組み合わせを用いた増幅産物の存在は１５８ＦＦ遺伝子型を示す；そしてオリゴヌクレオチドプライマーの第１の組み合わせを用いた増幅産物の存在およびオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組み合わせを用いた増幅産物の存在は、１５８ＦＶ遺伝子型を示す。

さらに、本明細書中で記載された方法のいずれにおいても、さらなるヌクレオチド位置における被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型もまた決定され得、例えばそのさらなるヌクレオチド位置は、位置１２１、１５３、１７９、２０７、３１３およびその組み合わせからなる群から選択される。

本明細書中で記載された方法のいずれも、増幅した核酸産物を配列決定する工程をさらに包含し得る。ある実施態様において、使用される配列決定プライマーは、１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたオリゴヌクレオチドを含む。

別の局面において、被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定する方法が提供され、その方法は以下の工程を含む：（ａ）被験体から得た生物学的サンプルから核酸を単離する工程；（ｂ）単離した核酸を増幅する工程；（ｃ）少なくとも１つの本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチド（例えば配列番号１−１９）を含む少なくとも１つの適切なオリゴヌクレオチドの組み合わせを配列決定プライマーとして用いて、増幅した核酸産物を配列決定する工程；および（ｄ）１つまたはそれ以上のＦｃγＲＩＩＩ多型においてヌクレオチド残基を決定し、それによって被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定する工程。ある実施態様において、少なくとも１つの本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチドを含む少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅（工程（ｂ））を行う。本明細書中で記載された配列決定方法のいずれにおいても、例えば位置２０７におけるヌクレオチドを決定することによって、ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖ／Ｆ部位における遺伝子型を決定し得る（例えば、位置２０７におけるＧヌクレオチドのみが、１５８ＶＶ遺伝子型を示す；位置２０７におけるＴヌクレオチドのみが、１５８ＦＦ遺伝子型を示す；および位置２０７におけるＧおよびＴヌクレオチドが、１５８ＦＶ遺伝子型を示す）。

本発明の別の局面において、ＦｃγＲＩＩＩａをＦｃγＲＩＩＩｂから区別する方法が提供され、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）被験体から得た生物学的サンプルから核酸を単離する工程；（ｂ）少なくとも１つの本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチド（例えば配列番号１〜１９）を含む少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせをセンスおよびアンチセンスプライマーとして用いて単離した核酸を増幅する工程、ここで各組み合わせにおいて少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂに特異的である；および（ｃ）オリゴヌクレオチドの各組み合わせによって増幅された核酸の存在または非存在を検出する工程、ここで増幅された核酸の存在または非存在が、ＦｃγＲＩＩＩａをＦｃγＲＩＩＩｂから区別する。

さらに別の局面において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａをＦｃγＲＩＩＩｂから区別する方法を提供し、その方法は以下の工程を包含する：（ａ）被験体から得た生物学的サンプルから核酸を単離する工程；（ｂ）単離した核酸を増幅する工程；（ｃ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの適切なオリゴヌクレオチドの組み合わせを配列決定プライマーとして使用して、増幅した核酸を配列決定する工程；および（ｄ）位置１２１、１５３、１７９、および３１３におけるヌクレオチドを決定し、それによってＦｃγＲＩＩＩａをＦｃγＲＩＩＩｂから区別する工程。ある実施態様において、工程（ｂ）は、少なくとも１つの本明細書中で記載されたオリゴヌクレオチドを含む少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせをセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用して、単離された核酸を増幅する工程を包含する。

さらに別の局面において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型同定のためのキットを包含し、このキットは、以下を含む：少なくとも１つの本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチドを含む、１つまたはそれ以上のプライマーオリゴヌクレオチド対；およびＦｃγＲＩＩＩａに関して生物学的サンプルを遺伝子型同定するための、説明書。ある実施態様において、そのキットはさらに、配列決定プライマー、例えば１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチドを含む。

ある実施態様において、その方法は、複数の本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチドプライマー対を使用してハプロタイプを決定する工程を包含する。

本明細書中で記載された方法のいずれにおいても、増幅はＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）もしくはＴａｑＭａｎ^ＴＭ、またはその組み合わせを含み得る。

さらなる実施態様において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型同定のためのキットに関し、そのキットは以下を含む：１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたようなプライマーオリゴヌクレオチドのペア；およびＦｃγＲＩＩＩａに関して生物学的サンプルを遺伝子型同定するための、説明書。配列決定プライマーおよび配列決定に関する説明書もまた、本明細書中で記載されたようなキットに含まれてもよいし、あるいは、配列決定試薬および説明書は別のキットに含まれてもよい。さらなる実施態様において、そのキットはさらに、ポリメラーゼおよび緩衝液を含み得る。ある実施態様において、そのキットはさらに、１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたような配列決定オリゴヌクレオチドのペアを含む。

本発明のこれらの局面および他の局面が、以下の詳細な説明および添付の図を参照すると明らかになる。それに加えて、様々な参考文献が本明細書中で述べられ、それはある手順または組成物をさらに詳細に記載し、そして従ってその全体が参考として援用される。

（詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内で、化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術およびウイルス学の慣習的な方法を採用する。そのような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、最新の追加）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。

本明細書中で引用された全ての出版物、特許、および特許申請書は、前出または後掲に関わらず、これによってその全体として参考文献に組み込まれる。

この明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他に規定しなければ、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば「オリゴヌクレオチド」への言及は、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの混合物等を含む。

以下のアミノ酸の省略を本文中で使用する：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リシン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語を採用し、そして下記で示すように定義されることが意図される。

「遺伝子型同定」、「ハプロタイプ同定」および「ＤＮＡタイピング」という用語は、個体の選択された染色体または染色体の一部の対立遺伝子の決定を指し、交換可能に使用される。

ポリペプチドに言及する場合、「単離された」によって、示された分子が、その分子が天然で発見される有機体全体から分離され、かつ別個であること、または同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在しない中に存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、天然でそのヌクレオチドと通常は関連している配列を全体として、または一部欠いている核酸分子；または天然に存在しているようであるが、それと関連して異種由来の配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書中で、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形式を包含するように使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、その用語は、３本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡおよび１本鎖ＤＮＡ、および３本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡおよび１本鎖ＲＮＡを含む。この用語はまた、メチル化および／またはキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）によるような修飾、およびポリヌクレオチドの未修飾形式も含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである、あらゆる他の型のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチドバックボーンを含む他のポリマー、例えばポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅｇｏｎから、Ｎｅｕｇｅｎｅとして市販で入手可能）ポリマー、およびそのポリマーがＤＮＡおよびＲＮＡで見られるような塩基対形成および塩基のスタッキングを可能にする配置で核塩基を含むという条件で他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語の間には、意図された長さの区別は存在せず、そしてこれらの用語は交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、例えば３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホラミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、２本および１本鎖ＤＮＡ、および２本および１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡおよびＤＮＡまたはＲＮＡ間のハイブリッドを含み、そしてまた公知の型の修飾、例えば当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログによる置換、例えば無電荷の結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメート等）を有するもの、陰性荷電の結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、および陽性荷電の結合（例えばアミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するもののようなヌクレオチド間の修飾、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等を含む）のようなペンダント部分を含むもの、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート化剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を有するもの（例えばアルファアノマー核酸等）、およびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの未修飾形式を含む。特に、ＤＮＡはデオキシリボ核酸である。

指定された配列「由来の」またはそれに「特異的な」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、すなわち同一または相補的な、おおよそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０−１２ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１５−２０ヌクレオチドの連続的な配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。由来するポリヌクレオチドは、必ずしも関心のあるヌクレオチド配列から物理的に由来せず、化学的合成、複製、逆転写または転写を含むがこれに限らないあらゆる方法で産生され得、それはそのポリヌクレオチドが由来する領域の塩基の配列によって提供される情報に基づく。そのようであるので、それはもとのポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンスいずれかの方向を示し得る。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分間の類似性パーセントを指す。２つのポリヌクレオチド、または２つのポリペプチド配列は、規定された長さの分子において、その配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列類似性を示す場合、お互いに「実質的に相同性である」。本明細書中で使用される場合、実質的に相同性はまた、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に完全な同一性を示す配列も指す。

一般的に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。同一性パーセントを、配列を整列させ、２つの整列させた配列間の正確なマッチ数を計数し、短い配列の長さで除算し、そしてその結果に１００を積算することによって、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定し得る。

相同性および同一性の分析を助けるために、ペプチド分析に関して、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣにおけるＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．のような、容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用し得、それはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９、１９８１の局所相同性アルゴリズムを適応させる。ヌクレオチド配列相同性を決定するプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において入手可能であり、例えばＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムであり、それもＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、製造会社によって推奨され、上記で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅにおいて記載されたデフォルトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する相同性パーセントを、デフォルトのスコア付け表（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｃｏｒｉｎｇ ｔａｂｌｅ）および６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いたＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて決定し得る。

本発明の関係において相同性パーセントを確立する他の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって配布された、ＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。この総合ソフトウェアのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを採用し得、ここでデフォルトパラメーターをスコア付け表に対して使用する（例えば、１２のギャップペナルティ、１のギャップ延長ペナルティ、および６個のギャップ）。産生されたデータから、「マッチ」の値が、「配列相同性」を反映する。配列間の同一性または類似性パーセントを計算する、他の適切なプログラムが、当該分野で一般的に公知であり、例えば他の整列プログラムは、デフォルトパラメーターを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用し得る：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｏｄｅ＝標準；ｆｉｌｔｅｒ：なし：ｓｔｒａｎｄ＝両方；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝重複なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出し得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。

あるいは、相同的な領域間で安定な２本鎖を形成する条件化で、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、続いて１本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化された断片をサイズ決定することによって、相同性を決定し得る。実質的に相同なＤＮＡ配列を、例えば、特定の系に関して規定したようなストリンジェントな条件下における、サザンハイブリダイゼーション実験において同定し得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。

核酸分子を説明するために本明細書中で使用される「組み換え」は、その起源または操作によって、天然においてそれが関連しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される「組み換え」という用語は、組み換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、下記でさらに記載するように、目的の遺伝子をクローニングし、そして次いで形質転換した有機体において発現させる。宿主有機体は、発現条件下で外来性遺伝子を発現してタンパク質を産生する。

「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的なＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。全ての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するために相補的なプライマーが必要である。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型から相補的なＤＮＡコピーを合成し得る。

「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、（通常２本鎖の）プロモーター配列を有する２本鎖または一部２本鎖のＤＮＡ分子から、複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流にある特定の位置から始まって５’から３’の方向へ合成される。転写酵素の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６である。

「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型から相補的なＤＮＡコピーを合成する酵素である。全ての公知の逆転写酵素はまた、ＤＮＡ鋳型から相補的なＤＮＡコピーを産生する能力も有する；従って、それらはＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方である。ＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型の両方で合成を開始するためにプライマーが必要である。

「ＲＮＡｓｅＨ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素である。これらの酵素は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。ほとんどの逆転写酵素は通常、そのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮＡｓｅＨ活性を含む。しかし、ＲＮＡｓｅＨの他の供給源が、関連するポリメラーゼ活性なしに利用可能である。その分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を引き起こし得る。あるいは、ＲＮＡｓｅＨは、ＲＮＡの部分が次第になくなるか、または酵素がＲＮＡの一部を巻き戻すのを可能にするように、単に様々な位置でＲＮＡを切断し得る。

本明細書中で使用される場合、「標的核酸領域」または「標的核酸」という用語は、増幅される「標的配列」を有する核酸分子を示す。標的核酸は、１本鎖または２本鎖のいずれかであり得、そして標的配列の他に、増幅されないかもしれない他の配列を含み得る。「標的配列」という用語は、増幅される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。標的配列は、望ましい条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成する、標的分子に含まれるプローブがハイブリダイズする領域を含み得る。「標的配列」はまた、標的配列を鋳型として使用してオリゴヌクレオチドプライマーが複合体を形成し、そして伸長する複合体形成配列を含む。標的核酸がもともと１本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸に存在するような「標的配列」に相補的な配列も指す。もし「標的核酸」がもともと２本鎖であるなら、「標的配列」という用語は、プラス（＋）およびマイナス（−）鎖の両方を指す。

本明細書中で使用される「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのようなポリマー化誘導剤の存在下および適切な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度に置かれた場合に、相補的な核酸鎖の合成を開始するために作用するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅における最大の効率のために、好ましくは１本鎖であるが、２本鎖であってもよい。もし２本鎖なら、伸長産物を調製するために使用する前に、プライマーを最初に処理してその鎖を分離し得る。この変性工程は、代表的には熱によって行われるが、あるいはアルカリ、続く中和を用いて行われ得る。従って、「プライマー」は、鋳型に相補的であり、そして鋳型と水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体を形成して、ポリメラーゼによる合成の開始のためにプライマー／鋳型複合体を提供し、それがＤＮＡまたはＲＮＡ合成の過程で鋳型に相補的な、３’末端に共有結合した塩基の追加によって伸長される。

本明細書中で使用される場合、「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、標的核酸分析物に存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含む、上記で定義されたようなポリヌクレオチドから成る構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「オリゴヌクレオチドプローブ」を、ＴａｑＭａｎ^ＴＭ技術のような５’ヌクレアーゼアッセイにおいて使用する場合、プローブは少なくとも１つの蛍光剤および少なくとも１つの消光剤を含み、それはあらゆる増幅された標的オリゴヌクレオチド配列を検出するために、反応で使用されたポリメラーゼの５’エンドヌクレアーゼ活性によって消化される。この関係において、オリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に隣接する十分な数のホスホジエステル結合を有し、採用された５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、結合したプローブを効率的に分解して、蛍光剤および消光剤を分離し得る。オリゴヌクレオチドプローブをＴＭＡ技術において使用する場合、それは下記で記載されるように適切に標識される。

安定なハイブリッドを提供するために、ハイブリダイズする配列は、完全な相補性を有する必要はないことが認識される。多くの状況において、４つまたはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％より少ない塩基がミスマッチである場合、安定なハイブリッドが形成される。よって、本明細書中で使用される場合、「相補的」という用語は、アッセイ条件下でその「相補鎖」と安定な２本鎖を形成するオリゴヌクレオチドを指し、一般的にここで約９０％またはそれ以上の相同性が存在する。

「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、ワトソン−クリック塩基対形成によって複合体を形成するのに十分相補的なヌクレオチド配列間の複合体の形成を指す。プライマーが標的（鋳型）に「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、例えばＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼによって必要とされるプライミング機能を果たすのに十分安定である。

本明細書中で使用される場合、「結合対」という用語は、核酸２本鎖を形成し得る相補的なポリヌクレオチド対のような、お互いに特異的に結合する第１の分子と第２の分子とを指す。サンプルにおける結合対の第１のメンバーの、結合対の第２のメンバーに対する「特異的結合」は、サンプル中の他の成分に対するより高い親和性および特異性で、第１のメンバーが第２のメンバーに結合する、または逆もまた同じであることによって証明される。結合対のメンバー間の結合は、代表的には非共有結合である。文脈が明らかにそうでないと示さない限り、「親和性分子」および「標的分析物」という用語は、本明細書中において、それぞれ結合対の第１のメンバーと第２のメンバーとを指して使用される。

「特異的結合分子」および「親和性分子」という用語は、本明細書中において交換可能に使用され、そしてサンプル中に存在する検出可能な物質に、化学的または物理的な手段で選択的に結合する分子を指す。「選択的に結合する」によって、その分子が関心のある標的に優先的に結合すること、または他の分子よりも高い親和性で標的に結合することを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は実質的に相補的な配列に結合し、そして無関係の配列には結合しない。

２本鎖ＤＮＡの「融解温度」または「Ｔ_ｍ」は、ＤＮＡのらせん構造の半分が、熱によるか、または例えば酸またはアルカリ処理等による他の塩基対間の水素結合の解離によって失われる温度として規定される。ＤＮＡ分子のＴ_ｍは、その長さおよび塩基の組成に依存する。ＧＣ塩基対が豊富なＤＮＡ分子は、ＡＴ塩基対を豊富に有するものより高いＴ_ｍを有する。ＤＮＡの分離した相補鎖は、温度がＴ_ｍより下に低下した時に、自然に再会合またはアニーリングして２本鎖ＤＮＡを形成する。最も高い核酸ハイブリダイゼーション率は、Ｔ_ｍの約２５℃下で起こる。Ｔ_ｍを、以下の関係を用いて推定し得る：Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％（Ｍａｒｍｕｒら（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９−１１８）。

本明細書中で使用される場合、「標識」および「検出可能な標識」という用語は、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、金属ゾル、半導体、ナノ結晶、リガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはハプテン）等を包含するが、これらに限らない、検出可能な分子を指す。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲で蛍光を示し得る物質またはその一部を指す。

本明細書中で使用される場合、「固体支持体」は、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ガラスプレート、ナイロン、アガロース、アクリルアミド等のような、固体表面を指す。

本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、骨髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、呼吸、腸管および尿生殖器経路の分泌物、涙、唾液、乳、血液細胞、臓器、生検（しかしこれらに限定されない）のような、被験体から単離された組織または液のサンプル、および細胞増殖からできた培養上清および培養液中の組織、例えば組み換え細胞および細胞成分を含む（これらに限定されない）インビトロ細胞培養成分のサンプルを指す。上記で詳細に述べたサンプルは、必ずしも供給源から直接得た形式である必要はない。例えば、サンプルを使用の前に、例えば分析の前に過熱、遠心等によるように、処理し得る。

「脊椎動物被験体」によって、ウマおよびヒトのような哺乳類、および鳥類の種を含む、脊索動物亜門（これらに限定されない）のあらゆるメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成人および新生児の動物、および胎児が含まれるよう意図される。

（ＩＩ．一般的な概観）
被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定するために、様々な組成物および方法が本明細書中で提供される。特に、ＦｃγＲＩＩＩａ（遺伝子Ａ）の１５８Ｖ／Ｆ部位で被験体の遺伝子型を決定するために使用し得る、新規オリゴヌクレオチド（例えばプライマー）が記載される。本明細書中で記載されるアッセイの正確性は、部分的には、本明細書中で記載された組成物および方法が、遺伝子Ａと遺伝子Ｂとの間を明確に区別し得るという事実に由来する。遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂはどちらも第１染色体にマッピングされるが、本開示は、遺伝子Ｂは１５８Ｖ／Ｆ多型を含まず、むしろ常にＶＶホモ接合体であることを決定的に示す。

１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたオリゴヌクレオチドの使用を含む、ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型同定の方法も記載される。単一のＰＣＲ反応（例えば１セットのプライマー）によって；複数のＰＣＲ反応（例えば異なる組み合わせのプライマー）を評価することによって；および／または単一または複数のＰＣＲ反応に続く配列決定または他の核酸ベースのアッセイ技術によって、１５８Ｆ／Ｖ部位におけるＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型を決定し得る。

本明細書中で記載された組成物および方法を用いて、例えば治療プロトコールをより良く決定するために、特定の個体を容易に遺伝子型同定し得る。従って、あらゆる被験体の遺伝薬理学的分析を容易に行い得る。

本発明を詳細に記載する前に、特定の処方または過程のパラメーターはもちろん変化し得るので、本発明はそのようなものに制限されないことが理解される。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、そして制限することを意図しないことも理解される。

本明細書中で記載されたものと類似のまたは同等の多くの組成物および方法を、本発明の実施において使用し得るが、好ましい物質および方法が本明細書中で記載される。

（ＩＩＩ．オリゴヌクレオチド）
個体のＦｃγＲＩＩＩハプロタイプを決定するのに有用な新規ヌクレオチド配列が、本明細書中で記載される。さらに、本明細書中で記載されたプライマー配列を使用して、ＦｃγＲＩＩＩＡ（遺伝子Ａ）とＦｃγＲＩＩＩＢ（遺伝子Ｂ）との間を正確に区別した。

簡便さのために、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂ両方のコーディング配列（ｃＤＮＡ）を認識するプライマーのナンバリングおよび整列を、ＲａｖｅｔｃｈおよびＰｅｒｕｓｓｉａ（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：４８１およびＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００５６９と相対的に行う。同様に、ゲノムＤＮＡを認識するプライマーのナンバリングおよび整列を、エキソン４の最初の塩基と相対的に行う。

本明細書中で記載された配列は、一般的にプライマー、例えばＰＣＲプライマーおよび／または配列決定プライマーとして有用である。表１で示したように、プライマーは遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂに非特異的であっても特異的であってもよく、そしてさらに、１つまたはそれ以上の多型、好ましくは１５８Ｆ／Ｖ一塩基多型にも特異的である（図１）。ある実施態様において、そのオリゴヌクレオチドは、例えば図２で示されたような、１つまたはそれ以上のさらなる多型を含む配列も増幅する。そのような配列の制限しない例を、表１に示す。

従って、本明細書中で記載されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは１つまたはそれ以上の多型を規定するヌクレオチド（例えば１５８Ｆ／Ｖ多型）および／または遺伝子Ａを遺伝子Ｂから区別するヌクレオチドを含む。好ましくは、使用されたプライマーは、少なくとも１５８Ｆ／Ｖ多型を含む配列を増幅する。ある実施態様において、使用されたプライマーは、複数の多型を含む配列を増幅する。例えば、図３で示すように、プライマーは、エキソン４の最初の塩基に対して番号をつけた、位置１２１（Ｇ／Ａ）、１５３（Ｔ／Ｃ）、１７９（Ｃ／Ｔ）、２０７（Ｇ／Ｔ）、および３１３（Ｃ／Ａ）における多型を含むが必ずしもこれに限らない配列を増幅する。最初の４つの位置は、ＮＭ＿０００５６９に対して番号をつけた、位置４７３（Ｇ／Ａ）、５０５（Ｔ／Ｃ）、５３１（Ｃ／Ｔ）および５５９（Ｇ／Ｔ）に対応する。

さらに、下記の実施例で詳細に記載されるように、本開示はまた、エキソン４の最初の塩基に対して番号をつけた、位置３１３における単一ヌクレオチド（Ａ／Ｃ）の違いが、遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂに高度に特異的であるという発見に注目する。特に、遺伝子Ａにおいて、Ａ残基が常にこの位置で見出され、一方遺伝子Ｂにおいては、常にＣ残基がこの位置で見出される。従って、ある実施態様において、プライマーはこの残基を含み、そして従って、遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂに特異的である。

ある実施態様において、区別する塩基（例えば多型および／または遺伝子ＡまたはＢ特異的塩基）は、オリゴヌクレオチド（プライマー）配列の末端塩基である。例えば、図２で示すように、３’プライマー１５８−３’Ａ（配列番号１）の３’ヌクレオチドは、１５８Ｆハプロタイプ（例えば位置５５９のＴ）に特異的であり、一方３’プライマー１５８−３’Ｃ（配列番号２）の３’ヌクレオチドは、１５８Ｖハプロタイプ（例えば位置５５９のＧ）に特異的である。同様に、３’プライマー５’Ｔ（配列番号３番）の５’ヌクレオチドは、遺伝子Ｂ（位置５３１のＴ）に特異的であり、一方５’プライマー５’Ｃ（配列番号５）の３’ヌクレオチドは、遺伝子Ａ（位置５３１のＣ）に特異的である。５’プライマー５’Ａ（配列番号４番）は、位置５３０で終わるので、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの両方に一般的である。

本明細書中で開示されたようなプライマーはまた、１つまたはそれ以上の、天然の遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂ配列とのミスマッチを含み得る。ある場合において、ミスマッチ塩基対の導入は、遺伝子に対する増強された特異性を提供する。ミスマッチは、好ましくはプライマー内部である。特に有用なオリゴヌクレオチドは、それぞれ示されるような様々なオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはそのオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約８０〜９０％またはそれ以上の配列同一性（そのオリゴヌクレオチドに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性のような、これらの範囲内のあらゆる同一性パーセントを含む、）を示す配列を含む。上記で説明したように、そのオリゴヌクレオチドが由来する領域は、一般的に１つまたはそれ以上の多型を含む。それに加えて、標的核酸への結合の親和性を改善するために、オリゴヌクレオチドを、当該分野で周知の方法を用いて誘導体化し得る。

オリゴヌクレオチドプライマーの特定の長さは重要でなく、そして当業者によって容易に設計され得る。オリゴヌクレオチドは、特定の保存された領域の約５〜約５００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、またはより好ましくは約１０〜約６０ヌクレオチド、または目的の保存された領域からの１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６．．．３５．．．４０等のような、これらの範囲内のあらゆる整数のヌクレオチドを含む配列を含み得る。好ましくは、プライマー配列は長さが少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間（長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドのヌクレオチドを含む）、およびさらにより好ましくは長さが約１５ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間である。

本明細書中で記載されたようなオリゴヌクレオチド（例えばプライマーおよびプローブ）は、標準的な技術、例えばその全体が本明細書中に参考として援用される米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１３（１９８７年４月１日）において開示されたような、ホスホラミダイト化学による固相合成によって容易に合成される。他の化学的合成方法は、例えば、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０によって記載されたホスホトリエステル法、およびＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９によって開示されたホスホジエステル法を含む。ポリＡまたはポリＣ、または他の非相補的なヌクレオチド延長部分を、これらの同じ方法を用いてプローブに組み込み得る。酸化ヘキサエチレン延長部分を、当該分野で公知の方法によってプローブに結合し得る。Ｃｌｏａｄら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４−６３２６；Ｌｅｖｅｎｓｏｎらに対する米国特許第４，９１４，２１０号；Ｄｕｒａｎｄら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３−６３５９；およびＨｏｒｎら（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４７０５−４７０８。

さらに、オリゴヌクレオチドを、検出のために標識に結合し得る。オリゴヌクレオチドを、標識の追加を可能にする反応性官能基で誘導体化するためにいくつかの公知の方法が存在する。例えば、放射活性、蛍光、化学発光、酵素、または電子密度標識を、アビジンによって結合し得るように、プローブをビオチン化するためにいくつかのアプローチが利用可能である。例えば、フェリチン−アビジン−ビオチン標識の使用を開示するＢｒｏｋｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９７８）５：３６３−３８４；およびアミノアルキルホスホラミドリンカーアームによるオリゴヌクレオチドの５’末端のビオチン化を開示するＣｈｏｌｌｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８５）１３：１５２９−１５４１を参照のこと。アミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するためにも、いくつかの方法が利用可能であり、それらはイソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシミニド等のような、アミノ反応基によって誘導体化された蛍光または他の型の化合物によって容易に標識される、例えばＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１３１−３１３９、Ｇｉｂｓｏｎら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６４５５−６４６７およびＭｉｙｏｓｈｉらに対する米国特許第４，６０５，７３５号を参照のこと。チオール特異的標識と反応させ得る、メルカプト基誘導体化オリゴヌクレオチドを合成する方法も利用可能であり、例えばＦｕｎｇらに対する米国特許第４，７５７，１４１号；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｄｉｓ Ｒｅｓ．１３：４４８５−４５０２およびＳｐｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４８３７−４８４８を参照のこと。ＤＮＡ断片を標識するための方法論の包括的な概説が、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１６９：１−２５において提供される。

例えば、蛍光分子を、プローブのライゲーションしない末端に結合させることによって、オリゴヌクレオチドを蛍光標識し得る。適切な蛍光標識を選択するための指針を、Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：２６０−３０１；Ｋａｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４９５５−４９６２；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）において見出し得る。好ましい蛍光標識としては、フルオレセインおよび米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８９）１０：１５１−１６４において開示されたようなその誘導体、および６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１またはＮＡＮ−２等が挙げられる。

さらに、下記で記載する技術を用いて、オリゴヌクレオチドをアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識し得る。現在の技術は、ＡＥ標識を、プローブ中のあらゆる位置に置くことを可能にする。例えば、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｋｒｉｃｋａ Ｌ．Ｊ．（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ中のＮｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」；Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら（編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ中のＮｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ） ｔｏ ＰＣＲ」；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４−１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７−２０９０を参照のこと。標識をプローブ中のあらゆる位置に置くことを可能にする、非ヌクレオチドに基づくリンカーアーム化学を用いて、ＡＥ分子をプローブに直接結合し得る。例えば、米国特許第５，５８５，４８１および５，１８５，４３９号を参照のこと。

（ＩＶ．核酸ベースのアッセイ）
次いで、ＦｃγＲＩＩＩハプロタイプ、例えば１５８Ｖ／Ｆ多型におけるＦｃγＲＩＩＩａハプロタイプを決定するために、１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたオリゴヌクレオチドを、１つまたはそれ以上の核酸ベースのアッセイにおいて使用する。

遺伝子型同定を、あらゆる適切なサンプルに対して行い得る。例えば、グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６）のような標準的な技術を用いて、ＦｃγＲＩＩＩを発現する細胞から核酸を容易に単離し得る。ＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡを単離し得る。次いで単離した核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を、好ましくは増幅に供する。

標的核酸の増幅は、代表的には標的核酸またはその断片の複数のコピーを産生するために、核酸ポリメラーゼを使用する。例えば転写媒介性増殖、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、レプリカーゼによる増幅、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような、適切な増幅技術は当該分野で周知である。

（Ａ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
ある実施態様において、増幅過程は、あらゆる生物学的サンプルにおいてＦｃγＲＩＩＩハプロタイプを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術を含む。ＰＣＲは、核酸分子または分子の混合物中に含まれる、望ましい標的核酸配列を増幅するための技術である。ＰＣＲにおいて、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズさせるためにプライマーのペアが過剰に採用される。プライマーはそれぞれ、標的核酸を鋳型として使用して、ポリメラーゼによって伸長される。伸長産物は、もとの標的鎖から解離した後、それ自身標的配列となる。次いで新しいプライマーがハイブリダイズし、そしてポリメラーゼによって伸長され、そしてサイクルは反復されて標的配列分子の数が幾何学的に増加する。サンプル中の標的核酸配列を増幅するＰＣＲ法は、当該分野で周知であり、そして例えばＩｎｎｉｓら（編）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ １９９０）；ＰＣＲ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（編）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ中のＴａｙｌｏｒ（１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ： ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；および米国特許第４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、および４，８８９，８１８号において記載され、これらは全て全体として本明細書中で参考文献に組み込まれる。

特に、ＰＣＲは、その３’末端がお互いに向き合う方向で、各プライマーが他方に向かって伸長する、増幅される標的ヌクレオチド配列をはさむ比較的短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。ポリヌクレオチドサンプルを抽出および好ましくは熱によって変性し、そしてモル過剰で存在する第１および第２のプライマーとハイブリダイズさせる。４つのデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ−−ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、プライマー伸長産物を産生し得るあらゆる酵素、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、様々な供給源（例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのような、プライマーおよび鋳型依存性のポリヌクレオチドポリマー化剤を用いて、ポリマー化は触媒される。これは、その５’末端に、もとの鎖の新規に合成された相補鎖に共有結合したそれぞれのプライマーを含む、２つの「長い産物」を生ずる。次いでその反応混合物を、例えば温度を下げる、変性剤を不活性化するか、またはより多くのポリメラーゼを加えることによって、ポリマー化条件に戻し、そして２回目のサイクルが開始される。２回目のサイクルは、２本のもとの鎖、最初のサイクルからの２本の長い産物、もとの鎖から複製された２本の新しい長い産物、および長い産物から複製された２本の「短い産物」を提供する。短い産物は、各末端にプライマーを有する、標的配列の配列を有する。さらなるサイクルそれぞれにおいて、さらに２本の長い産物が産生され、そして短い産物の数は、前のサイクルの最後に残った長いおよび短い産物の数と同じである。従って、標的配列を含む短い産物の数は、各サイクルで指数関数的に増加する。好ましくは、ＰＣＲは市販で入手可能なサーマルサイクラー、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒで行う。

ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写し、そして次いで上記で記載したようにＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことによって、ＲＮＡを増幅し得る。あるいは、米国特許第５，３２２，７７０号において記載されたように、両方の工程において単一の酵素を使用し得る。ｍＲＮＡをまた、ｃＤＮＡへ逆転写し、続いてＭａｒｓｈａｌｌら（１９９４）ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：８０−８４によって記載されたように、非対称ギャップ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｇａｐ）リガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行い得る。特定のＰＣＲ条件（例えば温度、サイクリング時間等）は、本発明の実施に重要ではなく、当業者によって容易に決定され得る。

ある実施態様において、賢明なプライマーのデザインおよび選択によって、単一のＰＣＲ反応によって遺伝子型同定の精度が達成される。例えば、位置５５９における多型および位置３１３（エキソン４の最初の塩基と相対的に番号をつけた）における遺伝子特異的多型を含む配列を増幅するプライマーを用いたＰＣＲ増幅から生じた配列が、代表的には１５８Ｖ／Ｆハプロタイプを決定するため、および遺伝子Ａを遺伝子Ｂから区別するために十分な情報を提供する。

ＰＣＲベースの技術に関して、ある場合には複数の多型を含むプライマーを使用することが好ましくあり得る。複数の多型を含むことは、組み込まれた内部コントロールを提供する。選択されたプライマーは、遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂのみを増幅してもよいし、または両方の遺伝子由来の配列を増幅してもよい。使用し得るプライマーの単一対の組み合わせの代表的な例を図７（配列番号１−１１番）に示し、そして例えば配列番号６、配列番号７または配列番号８の１つと、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１の１つとの組み合わせ、または配列番号１または配列番号２の１つと、配列番号３、配列番号４または配列番号５の１つとの組み合わせを含む。

さらに、表１で開示された１つの適切なプライマー対を用いた、被験体から得たＤＮＡサンプルの増幅は、それ自身で遺伝子型を決定するために十分であり得るが、本開示はまた、さらなるＰＣＲおよび／または配列決定を含む、遺伝子型同定の精度を増強するさらなるアッセイを提供する。

例えば、ある実施態様において、複数のプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲ増幅を行い、そして各組み合わせから得てできた増幅されたバンドのパターンを評価して被験体の遺伝子型を正確に決定する。特に好ましい実施態様において、各サンプルに対して複数の異なるＰＣＲアッセイ、例えば５’（順方向）プライマーと様々に組み合わせた様々な３’（逆方向）プライマーを用いた複数の反応を行う。

例のために、配列番号３、配列番号４および配列番号５の５’プライマーと組み合わせた配列番号１および配列番号２の３’プライマー（例えば配列番号１および配列番号３；配列番号２および配列番号３；配列番号１および配列番号４；配列番号２および配列番号４；配列番号１および配列番号５；配列番号２および配列番号５）を用いて、６つのＰＣＲ増幅を行い得る。各増幅反応の結果を比較し得（例えばゲル電気泳動によって）、そして特定のパターンを使用して容易に被験体をハプロタイプ決定する。一方のプライマーが遺伝子Ａ特異的、遺伝子Ｂ特異的、または遺伝子ＡおよびＢに一般的であり、そして他方のプライマーが１５８Ｖ−または１５８Ｆ−特異的であるプライマー対を使用することによって、この重要な部位において効率的かつ正確な遺伝子型同定が可能になる。

図５は、それぞれ異なる組み合わせのプライマーを含む、複数のＰＣＲ増幅反応の分析から得られた結果を示す。増幅の後、得られた産物を標準的な４％のアガロースゲル（実施例も参照のこと）に流し、そしてできた産物（もしあるなら）を可視化した。図５のレーンは、ＰＣＲ反応に使用した特定のプライマーの組み合わせに対応して標識する。パネルＡおよびパネルＤのパターンは、遺伝子Ａにおいて１５８ＦＦ（ホモ接合体）である被験体を示す。パネルＢは、遺伝子Ａにおいて１５８ＶＶホモ接合体である被験体を示し、一方パネルＣは、遺伝子Ａにおいて１５８ＦＶ（ヘテロ接合体）である被験体を示す。全てのパネルは内部コントロールを含み、ここで、遺伝子Ｂは位置５５９における多型を含まないので、５’プライマーＴ（遺伝子Ｂ特異的、配列番号３）および３’プライマーＡ（１５８Ｆ特異的、配列番号１）の組み合わせはＰＣＲ産物を産生しないはずである。

（Ｂ．配列決定）
さらに他の実施態様において、本明細書中で記載されたような遺伝子型同定は、さらにＰＣＲ増幅産物の配列決定する工程を包含する。本明細書中で開示されたプライマーのいずれも、配列決定プライマーとして使用し得る。配列決定プライマーとして特に好ましいのは、多型に結合し、そして結合した場合に多型１５８Ｖ／Ｆに対応する遺伝子の部分の配列決定を可能にするものである。代表的な配列決定プライマーを、図８に示す（配列番号１２〜１９）。

例えばマクサム・ギルバート法を用いた化学的配列決定によって、または例えばサンガー法を用いた酵素的配列決定によって、直接的な配列決定を達成し得る。後者の場合、特異的なオリゴヌクレオチドを標準的な方法を用いて合成し、そしてジデオキシヌクレオチド配列決定反応のプライマーとして使用する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、前出および下記の実施例を参照のこと。

図６は、以前に記載されたプライマー（「Ｋｏｅｎｅ」）を用いたＰＣＲ単独と比較した、本明細書中で記載されたプライマーを用いたＰＣＲ後の配列決定（「ＰＣＲ−ＳＥＱ」）の後の、遺伝子Ａ １５８Ｖ／Ｆ部位における遺伝子型同定の結果を示す。比較した８０サンプルのうち、１０個はＫｏｅｎｅら、前出、において以前に記載されたプライマーおよびＰＣＲ法を用いて、誤って遺伝子型同定された。具体的には、Ａ６０９２０１、Ａ６０９３７２、Ａ６１０２６０、Ａ６１２２０１、Ａ７０１３２０、ＮＣＭ４６０、Ａ６０９２０３、Ａ７０１０１７、Ｋｙｓｅ４１０、およびｋｉｄｎｅｙは、以前に記載された方法を用いて、誤って遺伝子型同定された。それに加えて、本明細書中で記載されたアッセイと異なり、以前に記載された方法は、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの間を区別しない。

（Ｃ．ＴａｑＭａｎ^ＴＭ）
ＴａｑＭａｎ^ＴＭアッセイ（例えばＨｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６−７２８０を参照のこと）として知られる蛍光発生的な５’ヌクレアーゼアッセイは、強力および用途の広い、ＰＣＲベースの核酸標的の検出システムである。従って、本明細書中で記載されたプライマーおよびプローブも、被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定するために、ＴａｑＭａｎ^ＴＭ分析で使用し得る。分析を、蛍光シグナルの産生をモニタリングすることによって、サーマルサイクリングと組み合わせて行う。そのアッセイシステムは、ゲル電気泳動分析を不要にし、そして標的のコピー数の決定を可能にする定量的データを産生する能力を有する。例えば、以前に分析したサンプルの連続的な希釈を用いて標準曲線を産生し得る。パネルメンバーそれぞれのコピー数を用いて標準グラフを作成し得、それに対して未知のサンプルを比較し得る。

蛍光発生的な５’ヌクレアーゼアッセイを、蛍光リポーター色素および消光剤の両方で標識された内部オリゴヌクレオチドプローブを消化するために、例えば内因性５’ヌクレアーゼ活性を有するＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼを用いて簡便に行う（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６−７２８０；およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：３７６１−３７６６を参照のこと）。蛍光プローブが消化され、色素および消光剤標識が分離し、そして標的核酸の増幅に比例する蛍光シグナルの増加を引き起こすので、増幅サイクルの間に起こる蛍光の変化を測定することによって、アッセイの結果を検出する。

増幅産物を、溶液中で、または固体支持体を用いて検出し得る。本方法において、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブを、望ましいＰＣＲ産物内の標的配列にハイブリダイズするようデザインする。ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブの５’末端は、蛍光リポーター色素を含む。プローブの３’末端は、プローブの伸長を防止するため保護され、そして５’フルオロフォアの蛍光を消光する色素を含む。続く増幅の間に、もし反応中に５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが存在するなら、５’蛍光標識は切断される。５’フルオロフォアの切断は、蛍光の増加を引き起こし、それを検出し得る。

ＴａｑＭａｎ^ＴＭアッセイの詳細な説明、そこで使用する試薬および条件に関して、例えばＨｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６−７２８０；米国特許第５，５３８，８４８、５，７２３，５９１、および５，８７６，９３０号を参照のこと、これらは全てその全体として本明細書中で参考文献に組み込まれる。

（Ｄ．転写媒介性増幅アッセイ（ＴＭＡ））
本明細書中で記載された配列を、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）アッセイの基礎としても使用し得る。ＴＭＡは、生物学的サンプル中にわずかな量で存在する標的核酸配列を同定する方法を提供する。そのような配列は、直接的なアッセイ方法を用いて検出することが困難または不可能であり得る。特に、ＴＭＡは、等温、自己触媒の核酸標的増幅システムであり、それは標的配列の１０億以上のＲＮＡコピーを提供し得る。生物学的サンプル中の標的配列の存在または非存在を正確に検出するために、そのアッセイを定性的に行い得る。そのアッセイはまた、数オーダーの程度の濃度範囲で標的配列の量の定量的測定を提供し得る。ＴＭＡは、温度、イオン強度およびｐＨのような反応条件を反復して操作することなく、自己触媒的に複数のコピーの標的核酸配列を合成する方法を提供する。

一般的に、ＴＭＡは以下の工程を含む：（ａ）ハプロタイプ決定する、関心のある生物学的サンプルから、ＲＮＡを含む核酸を単離する；および（ｂ）反応混合物に（ｉ）単離した核酸、（ｉｉ）第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマー、第１のプライマーは、もし存在するなら（例えば（＋）鎖）それと複合体を作るために、ＲＮＡ標的配列の３’末端部分に十分相補的な複合体化配列を有し、そして第２のプライマーはそれと複合体を作るために、その相補鎖（例えば（−）鎖）の標的配列の３’末端部分に十分相補的な複合体化配列を有する、ここで第１のオリゴヌクレオチドは、さらにプロモーターを含む配列を複合体化配列の５’に含む、（ｉｉｉ）逆転写酵素またはＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（ＲＮＡ分解酵素Ｈのような）および（ｖ）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを合わせる。

反応混合物の成分を、段階的にまたは一度に合わせ得る。反応混合物を、ＤＮＡプライミングおよび核酸合成条件（リボヌクレオチド３リン酸およびデオキシリボヌクレオチド３リン酸を含む）を含む、オリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条件下で、複数のコピーの標的配列を提供するために十分な時間インキュベートする。構成成分酵素のような反応構成成分の安定性を維持するために適切な、および増幅反応の過程の間に反応条件の修飾または操作を必要としない条件下で、その反応は有利に起こる。よって、実質的に等温で、そして実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む条件下で、その反応は起こり得る。その反応は簡便に、最初のＤＮＡ伸長反応によって産生されたＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離するために変性工程を必要としない。

適切なＤＮＡポリメラーゼは、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（例えばＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（例えばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）のような、逆転写酵素を含む。

プライマーに組み込むために適切なプロモーターまたはプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列（天然に存在する、合成的に産生される、または制限消化の産物のいずれか）であり、ＲＮＡポリメラーゼはその配列を認識および結合し、そして転写の過程を開始し、それによってＲＮＡ転写物が産生される。その配列は、任意でＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基を含み得、それはさらなる安定性または分解過程に対する感受性、または転写効率の増加を与え得る。有用なプロモーターの例は、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６由来のもののような、あるバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるもの、またはＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターを含む。これらのＲＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＥｐｉｃｅｎｔｒｅのような市販の供給源から容易に入手可能である。

ＡＭＶ逆転写酵素のような、本明細書中における方法で使用するために適切な逆転写酵素のいくつかは、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する。しかし、ＡＭＶ逆転写酵素を使用する場合でも、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡ分解酵素Ｈのような外来性ＲＮＡ分解酵素Ｈを加えることが好ましくあり得る。ＲＮＡ分解酵素は、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから容易に入手可能である。

これらの方法によって産生されたＲＮＡ転写物は、上記で記載したメカニズムによって、標的配列のさらなるコピーを産生するための鋳型として作用し得る。そのシステムは自己触媒的であり、そして増幅は、温度、ｐＨ、イオン強度等のような反応条件を反復して修正または変更する必要なく自己触媒的に起こる。

直接的配列決定、配列特異的オリゴマーとのハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動および質量分析を含む、広く様々な方法を用いて、検出を行い得る。これらの方法は、異種または同種の形態、同位元素または非同位元素標識を使用し得る、および標識を全く使用しない。

ＴＭＡは、例えば米国特許第５，３９９，４９１号において詳細に記載されており、その開示はその全体として本明細書中で参考文献に組み込まれる。典型的なアッセイの１つの例において、遺伝子型同定される被験体から単離された核酸サンプルを、緩衝液、塩、マグネシウム、ヌクレオチド３リン酸、プライマー、ジチオトレイトール、およびスペルミジンを含む緩衝液濃縮物と混合する。反応を任意で約１００℃で約２分間インキュベートしてあらゆる２次構造を変性させる。室温に冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ分解酵素Ｈを加え、そして混合物を３７℃で２から４時間インキュベートする。次いで産物を変性し、プローブ溶液を加え、６０℃で２０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解するための溶液を加え、反応物を６０℃で６分間インキュベートし、そしてルミノメーターで残った化学発光を測定することによって、反応物をアッセイし得る。

上記で述べたように、遺伝子型を確認するために、２つまたはそれ以上の上記で記載した試験を実施し得る。例えば、もし最初の試験が、検出のために核酸を増幅するために転写媒介性増幅（ＴＭＡ）を使用したなら、例えば、本明細書中で記載されたような、ＰＣＲ増幅、ＲＴ ＰＣＲ等を用いることによって、第２の核酸検査（ＮＡＴ）アッセイを行う。従って、あらゆる被験体由来のあらゆるサンプルを、特異的におよび選択的にハプロタイプ決定し得る。

容易に明らかであるように、本明細書中で記載されたアッセイのデザインは、多くの変化を受けやすく、そして多くの形式が当該分野において公知である。上記の説明は、指針としてのみ提供され、そして当業者は、当該分野で周知の技術を用いて、記載されたプロトコールを容易に修飾し得る。

（Ｅ．キット）
上記で記載されたようなアッセイを行うために、プライマー、ＰＣＲ緩衝液、配列決定試薬等を含む、上記で記載されたアッセイの試薬を、適切な指示および他の必要な試薬と共に、キット中で提供し得る。そのキットは、通常別々の容器にプライマーの組み合わせおよびプローブ（固体マトリックスに既に結合しているか、またはそれらをマトリックスに結合させるための試薬と別々に）、コントロール処方（ポジティブおよび／またはネガティブ）、アッセイ形式がそれを必要とする場合は標識された試薬、および標識がシグナルを直接産生しないならばシグナル産生試薬（例えば酵素基質）を含む。アッセイを行うための説明書（例えば書かれた、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭ等）が、通常キットに含まれる。キットはまた、使用される特定のアッセイに依存して、他の包装された試薬および材料（すなわち洗浄緩衝液等）も含み得る。上記で記載されたもののような、標準的なアッセイを、これらのキットを用いて実施し得る。

（Ｆ．適用）
上記で記載したように、本発明は、脊椎動物被験体のＦｃγＲＩＩＩハプロタイプ、特に両方のＦｃγＲＩＩＩａにおける１５８Ｆ／Ｖ部位におけるハプロタイプを正確に決定するための、新規組成物およびアッセイの発見に基づく。

ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を正確に決定する能力は、薬理遺伝学を含むがこれに限らない、多くの適用を有する。薬理遺伝学は、適切な治療プロトコールを決定するために、特定の個体の遺伝子型を決定することを指す。上記で記載したように、１５８Ｆ／Ｆ遺伝子型を有する被験体は、１５８Ｖ／Ｆおよび１５８Ｖ／Ｖ遺伝子型を有する被験体より、抗体治療（例えばリツキシマブ）に対する反応が良くない。さらに、リツキシマブのような抗体による治療に対する反応を、サイトカイン（例えばＩＬ−２）による前処理によって増強し得ることが示された。２００４年３月１０日に提出された、「ＵＳＥ ＯＦ ＦＣ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭＳ ＡＳ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ ＦＯＲ ＩＭＭＵＮＥ−ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」というタイトルの、共有される仮特許出願も参照のこと、これは本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。

従って、本明細書中で記載された組成物および方法を用いて、免疫異常の治療の必要がある個体は、効率的および正確に遺伝子型同定され得、そして、それによって、ＦｃγＲＩＩＩがきっかけとなるＡＤＣＣ経路を媒介する１つまたはそれ以上の免疫治療（例えばＩＬ−２）による介入の適切な候補として指定される。ＩＬ−２タンパク質およびムテインは、当該分野で公知である。例えば米国特許第４，７５２，５８５号；米国特許第４，７６６，１０６号；米国特許第４，９３１，５４３号；米国特許第５，７００，９１３号；２００４年７月７日に提出され、そして「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ Ｍｕｔｅｉｎｓ」というタイトルの米国連続番号第６０／５８５，９８０号、および２００４年３月５日に提出され、そして「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ Ｍｕｔｅｉｎｓ」というタイトルの米国連続番号第６０／５５０，８６８号を参照のこと、これらは本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。ＩＬ−２ムテインは市販で入手可能であり、そしてまた以下の文書においても記載される：国際公開第ＷＯ９１／０４２８２；ＷＯ９９／６０１２８；ＷＯ００／５８４５６；ＷＯ００／０４０４８号；欧州特許（ＥＰ）公開第ＥＰ１３６，４８９号；１９８３年１０月１３日に提出された欧州特許出願第８３３０６２２１．９号（公開番号第ＥＰ１０９，７４８号の下に１９８４年５月３０日公開、これはベルギー特許第８９３，０１６号、および共有された米国特許第４，５１８，５８４号と同一である）；欧州特許公開第ＥＰ２００，２８０号（１９８６年１２月１０日公開）、欧州特許公開第ＥＰ１１８，６１７号、これらの特許および出願は全て、本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。

ある適用において、免疫異常、特に癌に悩まされる個体に対して、抗癌モノクローナル抗体と組み合わせて使用する補助治療（例えばＩＬ−２免疫療法単独）の適合性を決定するために、遺伝子型同定を行う。本明細書中で記載されたような遺伝子型同定が治療プロトコールをデザインするのを助け得る癌の例は、下記で列挙したＢ細胞リンパ腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、大腸癌、黒色腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれに限らない。

（実験）
下記は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。実施例は、説明目的のためにのみ提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図しない。

使用される数字（例えば量、温度等）に関して精度を保証する努力がなされたが、もちろんいくらかの実験誤差および逸脱は許容されるべきである。

以下の実施例において、酵素は市販の供給源から購入し、そして製造会社の指示に従って使用した。

ＤＮＡ断片の単離において、記載された場合を除いて、全てのＤＮＡ操作を標準的な手順に従って行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。制限酵素、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、および他の生物学的試薬を、市販の供給業者から購入し得、そして製造会社の指示に従って使用した。２本鎖ＤＮＡ断片を、アガロースゲル上で分離した。

（実施例１：サンプルからのＤＮＡの抽出）
全血サンプルを被験体から得た。サンプルを、製造会社の指示に従って、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ’ｓ ＰＡＸｇｅｎｅ^ＴＭ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｔｕｂｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カタログ番号第７６９９８９番）に回収した。ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ’ｓ ＰＡＸｇｅｎｅ^ＴＭ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ）を用いて、これも製造会社の指示に従って、全血からゲノムＤＮＡを単離した。

（実施例２：ＰＣＲベースの遺伝子型同定）
（Ａ．ＰＣＲ増幅）
ＰＣＲアッセイを、以下のように行った。簡単には、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）において、９６穴プレート形式でＰＣＲを行った。

マスター混合物を以下のように調製した。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに、以下の試薬をマスター混合物として調製した：３００μｌの１０×Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；６００μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２溶液；３００μｌのｄＮＴＰミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号第００３２００３．１０９番）；および２７０μｌのＨ_２Ｏ、およびアリコートで−２０℃で保存した。全ての緩衝液を、製造会社の指示に従って保存した。

３０μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号第Ｎ８０８−００３８番）を、マスター混合物の解凍したアリコートに加えた。異なるプライマーの組み合わせを有するチューブを調製し（例えば６チューブ）、それぞれ９μｌの順方向プライマー、９μｌの逆方向プライマー、２２５μｌのマスター混合物溶液および１１７μｌのＨ_２Ｏを含んでいた。

図９で示したように、各チューブの２０μｌを、９６穴プレートの２カラムに加えた（例えば、６つのプライマーの組み合わせに関して、各プライマーの組み合わせに対してそれぞれ８ウェルの２カラムが存在した）。実施例１において記載されたように単離したゲノムＤＮＡを、１０ｎｇ／μｌに希釈し、そして５μｌを異なるプライマーの組み合わせを含むカラムに加えた（例えば、６つの異なるプライマーの組み合わせを使用する場合、カラム１−６、図１０）。コントロールも含んでいた。

プレートを密封し、そしてＰＣＲのためにＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６００機に置いた。ＰＣＲ条件は：９５℃で５分間インキュベーションの１サイクル；９４℃で３０秒間インキュベーション；６４℃で３０秒間インキュベーションおよび７２℃で３０秒間インキュベーションの３５サイクル；および７２℃で８分間インキュベーションの１サイクルであった。サンプルをアガロースゲルにかける前に、９６穴プレートを４℃で冷却した。

（Ｂ．電気泳動）
セクションＡのＰＣＲ産物に対して、標準的な技術を用いて、ＴＡＥゲル電気泳動を行った。５０×濃縮ゲル緩衝液のストックは、（４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩、１ｍＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の最終濃度のために）２４２ｇのＴｒｉｓ−Ｂａｓｅ；５７．１ｍｌの氷酢酸；１００ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ_２ＥＤＴＡを含んでいた。ゲル負荷緩衝液は、０．２５％のブロモフェノールブルー；０．２５％のキシレンシアノールＦＦ；および１５％のＦｉｃｏｌｌ（タイプ４００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＨ_２Ｏ中に含んでいた。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの分子量マーカー（０．０７−１２．２ｋｂｐ）（カタログ番号第１４９８０３７番）も使用した。

１０μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む、ＴＥＡ緩衝液中標準的な４％アガロース水平ゲルを調製した。５μｌの各ＰＣＲ反応物を、１μｌの標準６×負荷緩衝液と混合し、そして反応１から６までの順番で、ゲルの隣接するレーンに負荷した。図５を参照のこと。ゲルを一定の１００ボルトで１５〜２０分間流し、標準的なＵＶトランスイルミネーターで紫外（ＵＶ）光の下で視覚化および撮影した。

典型的な結果を、図５に示す。これらの結果は、位置１５８において、ＦＣＧＲ３Ａはバリン（Ｖ１５８）またはフェニルアラニン（Ｆ１５８）の多型であることを確認する。ＦＣＧＲ３Ｂは、この位置においてバリンのみをコードし、多型ではない。本明細書中で記載されたようなプライマーの使用は、この部位を同定するプライマー（例えば配列番号１−２番）および非特異的プライマー（配列番号４番）、および位置５３１において遺伝子ＡおよびＢの間の１ヌクレオチドの違いを同定するプライマー（配列番号３および５番）を用いることによって、ＦＣＧＲ３Ａ １５８Ｖ／Ｆ部位の遺伝子型同定を可能にする。位置５３１は、アミノ酸の違いを引き起こさない。

上記で記載されたように、５’プライマーＣ（配列番号５）および３’プライマーＣ（配列番号２）を用いて得られたＰＣＲ産物は、Ｖ遺伝子型を示す。もしこの産物が個体のサンプルに関して観察され、そして５’プライマーＣ（配列番号５）および３’プライマーＡ（配列番号１）を用いて得られたＰＣＲ産物が見えなければ、その結果は、その被験体はＶのホモ接合体であることを示す。図５、パネルＢを参照のこと。同様に、５’プライマーＣ（配列番号５）および３’プライマーＡ（配列番号１）を用いて得られたＰＣＲ産物が見え、そして５’プライマーＣ（配列番号５）および３’プライマーＣ（配列番号２）を用いて得られた産物が見えなければ、その被験体は遺伝子ＡにおいてＦのホモ接合体である。図５、パネルＡおよびＤを参照のこと。これらの反応の両方における産物は、ＦおよびＶのヘテロ接合体である被験体を示す。図５、パネルＣを参照のこと。遺伝子Ｂは多型ではなく、そして５’プライマーＴおよび３’プライマーＡの組み合わせは見える産物を生じないので、内部コントロールも存在する。

従って、本明細書中で記載された方法を用いて、１５８Ｆ／Ｖ多型におけるＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型を正確に決定し得る。

（実施例５：ＰＣＲ−配列決定）
遺伝子型同定のために、サンプルＤＮＡを増幅し（ＰＣＲ）、そしてその産物を本明細書中で開示されたようなオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定する実験も行った。

（Ａ．ＰＣＲ）
ゲノムＤＮＡのＰＣＲを、ＢＤ Ａｄｖａｎｔａｇｅ^ＴＭ２ ＰＣＲキット（製品番号第６３９２０６または６３９２０７番）を用いて、製造会社の指示に従って行った。各反応は、５μｌの１０×ＢＤ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ緩衝液；１μｌの５μＭ／各プライマー混合物（全プライマー濃度 １０μＭ）；１μｌの５０×ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭ）；１μｌの５０×ＢＤ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼミックス；１０−１００ｎｇの最終濃度までのサンプルＤＮＡ；および最終的な反応容積を５０μｌにする容積の水を含んでいた。サイクリング条件は、９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で４０秒間の３０サイクル；および４℃でインキュベーションした。サイクリングの後、ＰＣＲ反応産物を、ＱｉａｇｅｎのＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号第２８００４または２８００６番）を用いて、そして最終的な溶出容積が５０μｌであった以外は、製造会社の推奨するプロトコールに従って精製した。

コントロールもアッセイに含めた。ポジティブコントロールは、公知のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型（例えば遺伝子Ａの１５８ＶＦ多型におけるＧ、Ｔ、およびＧ／Ｔ）のゲノムＤＮＡであり、一方ネガティブコントロールは、典型的にはゲノムＤＮＡ以外の全ての試薬を含んでいた（それはネガティブなＰＣＲおよび配列決定結果を生じた）。

（Ｂ．配列決定）
上記で記載されたように得られたＰＣＲ産物に対する配列決定反応を、３１００または３７３０ｘｌプラットフォームのいずれかで、ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ３．０を用いて行った（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各配列決定反応は、２μｌのＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｒｅａｄｙ反応混合物（製品番号（ｐａｒｔ ｎｏ．）４３９０２４６）、１μｌの５×緩衝液（製品番号４３３６６９９）、１μｌのＰＣＲ産物（約０．０２μｌ／μｇ）；２μｌの２μＭプライマー（配列番号１２−１９の様々な組み合わせ）および４μｌの水を含んでいた。

各反応に対して合計３０サイクルを行った：９５℃で１０秒間；５０℃で５秒間；および６０℃で３分間。サイクリングの後、反応物を４℃でインキュベートした。

４５μｌのＡｍｅｒｓｈａｍの乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５樹脂（カタログ番号第１７−００５１−０１または１７−００５２−０３番）を、マルチスクリーンＣｏｌｕｍｎ Ｌｏａｄｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号第ＭＣＬＯ９６４５番）と共に、乾燥フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号第ＭＡＨＶ Ｎ４５ １０番）に加えることによって、反応物を精製した。続いて、３００μｌの水を各ウェルに加え、そしてプレートをカバーし、そして室温で少なくとも３０分間インキュベートした。

フィルタープレートを９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ カタログ番号第１２５６５２６３番）と重ね、そしてＡ−４−６２スイングバケットローターを有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｏｄｅｌ ５８１０Ｒで、１６５０ＲＰＭで３分間遠心した。フィルタープレートを清潔な９６穴ＰＣＲプレート（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、カタログ番号第１２５６５２６３番または同等物）の上、および９６穴ベース（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号第Ｎ８０１−０５３１番）の上に置いた。全てのサンプルを指定のフィルターカラムの中心に移動させ、そしてＡ−４−６２スイングバケットローターを有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｏｄｅｌ ５８１０Ｒで、１８００ＲＰＭで５分間遠心した。最終的なサンプル容積を、オートクレーブした精製水で、約１５μｌであるように調整した。

次いでそのプレートを、製造会社の指示に従って組み立てた（３１００ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌまたは３７３０ｘｌ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ）。プログラムされたパラメーターは、３１００プラットフォームに関して、分離培地としてＰＯＰ６およびデフォルトモジュール「ＳｔｄＳｅｑ５０＿ＰＯＰ６」、そして３７３９プラットフォームに関して、分離培地としてＰＯＰ７およびデフォルトモジュール「ＬｏｎｇＳｅｑ５０＿ＰＯＰ７＿１」であった。デフォルトモジュールにおけるランタイムは、６５００秒（３１００プラットフォーム）および５６４０秒（３７３０プラットフォーム）であった。約３００塩基より少ない標的に関しては、もし同じランにより長い読み取り長さを有するほかのサンプルが含まれなければ、デフォルトモジュールのランタイムを４０００秒（３１００プラットフォーム）または３６００秒（３７３０プラットフォーム）に短縮した。

（Ｃ．分析）
配列決定データをデスクトップコンピューターへ移し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｅｒ^ＴＭプロジェクトへインポートした。各個体のサンプル由来のＦＣＧＲ３Ａ特異的プライマー（表１および図８）の配列を、参照配列（図１１）と整列させた。各個体のサンプル由来のＦＣＧＲ３Ｂ特異的プライマー由来の配列およびＰＣＲ反応で使用したプライマー由来の配列を、参照配列と整列させた。参照配列を超える配列は、削除した。

続いて、遺伝子型同定を以下のように行った。もし位置１２１、１５３、１７９、および３１３（エキソン４の最初の塩基と相対的に番号をつけた）においてそれぞれＡ、Ｃ、Ｔおよび／またはＣが見出されたら、その反応は遺伝子Ａ特異的ではないと考え、そして反応を繰り返した。もしこれらの位置におけるシグナルが、遺伝子Ａ参照配列シグナルのみとマッチしたら、そのサンプルはＦＣＧＲ３Ａと考えられ、そして位置２０７（エキソン４の最初の塩基と相対的に番号をつけた、ｃＤＮＡの位置５５９）からのシグナルを分析した。位置２０７においてＧシグナルのみが得られたら、サンプルが得られたその個体の遺伝子型は、１５８ＶＶホモ接合体であった。位置２０７においてＴシグナルのみが得られたら、サンプルが得られたその個体の遺伝子型は、１５８ＦＦホモ接合体であった。もし位置２０７においてＧおよびＴシグナルが得られたら、そのサンプルは１５８ＦＶヘテロ接合体の被験体から得られた。

同様に、ＦｃγＲＩＩＩｂ遺伝子型を、以下のように確認した。もし位置１２１、１５３、１７９、および３１３（エキソン４の最初の塩基と相対的に番号をつけた）においてそれぞれＧ、Ｔ、Ｃ、Ａシグナルが見出されたら、その反応は遺伝子Ｂ特異的ではないと考え、そして反応を繰り返した。もしこれらの位置におけるシグナルが、遺伝子Ｂ参照配列シグナルのみとマッチしたら、そのサンプルはＦＣＧＲ３Ｂと考えられた。遺伝子Ｂと決定されたサンプルは、１５８ＶＦ多型を含んでおらず、そして対応するヌクレオチドにＧシグナルが見られた。

１３６サンプルを記載されたように試験し、そして１３５は正確にＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型同定された。１つの場合において、サンプルは遺伝子Ｂを含んでいなかった。遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂのいずれかが被験体のゲノムから非存在している場合、ＰＣＲプライマーを用いて配列決定することが望ましくあり得る。ＰＣＲプライマーによる配列決定は、位置１２１、１５３、１７９、および３１３におけるＡおよびＢ遺伝子両方からのシグナルに基づいて、ＦＣＧＲ３ＡおよびＦＣＧＲ３Ｂ遺伝子の比を推定することを可能にする。

遺伝子型同定分析の結果を、図６にまとめ、そしてＫｏｅｎｅら、前出において記載された方法とも比較する。本明細書中で記載されたＰＣＲ−配列決定法は、被験体の遺伝子型を８０サンプル全てにおいて決定し、一方以前に記載された方法は、１０％より多いエラー率（１０サンプル）を有していた。

従って、ＰＣＲ−配列決定アッセイは高感度であり、そしてＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を正確に決定し得る。

よって、新規配列およびこれらの配列を用いた遺伝子型同定アッセイが開示された。前述のことから、本発明の特定の実施態様が、説明の目的のために本明細書中で記載されたが、その意図および範囲から逸脱することなく、様々な修飾がなされ得ることが認識される。

パネルＡおよびＢは、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ遺伝子由来のヌクレオチド配列の配列比較を示す。図１Ａは、ＦｃγＲＩＩＩａ（上列、ＨＳＦＣＧＲ３１と標識され、そして遺伝子Ｂとも呼ばれる）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（下列、ＨＳＦＣＧＲ３２と標識され、そして遺伝子Ａとも呼ばれる）由来の部分的なｃＤＮＡ配列を整列させる。図１Ａにおいてボックス中に以下のものも示される：遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂを示す位置（位置４７３、５３１および６４１）およびＶ→Ｆの置換を予測する位置５５９における一塩基多型（遺伝子Ａでのみ起こる）。 図１Ｂは、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂのエキソン４を整列させ、そしてエキソン４の最初の塩基と相対的に番号をつけた、位置３１３における非常に特異的なヌクレオチド変異を含む、２つの遺伝子間の様々なヌクレオチドの相違を示す。 図２は、配列番号１〜５と指定された例示的なオリゴヌクレオチド配列の位置およびそのＨＳＦＣＧＲ３１（遺伝子Ｂ）およびＨＳＦＣＧＲ３２（遺伝子Ａ）との関係における整列を示す。 図３は、本明細書中で記載されたような増幅および配列決定プライマーの位置を示す。典型的な増幅（ＰＣＲ）プライマーを、太い、暗色の矢印で示す。天然の配列で起こる多型を、黒色のバーで示す（位置は、エキソン４の最初の塩基に対して番号をつけた）。例示的な配列決定プライマーを、細い矢印で示す。３１３（Ａ／Ｃ）と呼ばれる多型に、エキソン４の最初の塩基に対して番号をつける。 図４は、エキソン４の最初の塩基に対して番号をつけた、本明細書中で記載されたような様々なプライマーの位置を示す（配列番号６〜１９）。 図５、パネルＡ〜Ｄは、様々なプライマーの組み合わせ（配列番号１〜５）由来のＰＣＲ増幅産物を示すゲルの複製である。各レーンは、異なるプライマーの組み合わせを示す。各パネルの左から右へ、レーン１は、配列番号４および配列番号１と呼ばれるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す；レーン２は、配列番号４および配列番号２と呼ばれるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す；レーン３は、配列番号３および配列番号１と呼ばれるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す；レーン４は、配列番号３および配列番号２と呼ばれるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す；レーン５は、配列番号５および配列番号１と呼ばれるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す；およびレーン６は、配列番号５および配列番号２と呼ばれるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。レーン５における増幅産物の存在およびレーン６における増幅産物の非存在は（ドナー１３６０、パネルＡおよびドナーＵ０３−３１３、パネルＤ）、その被験体の遺伝子型が１５８ＦＦであることを示す。レーン５における増幅産物の非存在およびレーン６における増幅産物の存在は（ドナー１７１４、パネルＢ）、その被験体の遺伝子型が１５８ＶＶであることを示す。レーン５および６の両方における増幅産物の存在は（ドナー１２１０、パネルＣ）、その被験体の遺伝子型が１５８ＦＶであることを示す。 図６は、本明細書中で記載されたような（例えばＰＣＲに続く配列決定）、８０サンプルの遺伝子型同定の結果を示す。各表の中央の列は、本明細書中で記載されたＰＣＲ−配列決定アッセイを用いて得られた遺伝子型結果を示す。各表の右列（「Ｋｏｅｎｅ」と標識される）は、当該分野において記載された方法で得られた遺伝子型同定結果を示す。 図７は、本明細書中で記載されたような、例示的なオリゴヌクレオチドの配列を示す。 図８は、本明細書中で記載されたような、他の例示的なオリゴヌクレオチドの配列を示す。 図９は、６つの異なるプライマーの組み合わせの、それぞれ８個のウェルの２列を含む、ＰＣＲのための９６穴プレートの模式的表示である。 図１０は、図９で示したプレートを用いた９６穴プレート遺伝子型決定アッセイの追加の模式的表示である。３つのコントロールおよび１３個の被験体サンプルを、６つの異なるプライマーの組み合わせに対してスクリーニングする。 図１１は、ＰＣＲ−配列決定アッセイで使用される参照配列を示す。

Claims (29)

1. １０ヌクレオチド長と６０ヌクレオチド長との間のヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列は、
   （ａ）配列番号１〜配列番号１９からなる群より選択される、配列；
   （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；または
   （ｃ）（ａ）および（ｂ）の相補体、
   を含む、単離されたオリゴヌクレオチド。
2. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
3. 前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項２に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
4. 前記蛍光標識が、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４−７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される、請求項３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
5. 被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定する方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）該被験体から得られた生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
   （ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の組み合わせおよび第２の組み合わせを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して、該単離された核酸を増幅する工程；ならびに
   （ｃ）オリゴヌクレオチドの各組み合わせで増幅された核酸の存在または非存在を検出する工程であって、該増幅された核酸の存在または非存在は、該被験体の該ＦｃγＲＩＩＩの遺伝子型を示す工程、
   を包含する、方法。
6. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＦｃγＲＩＩＩの多型に対して特異的である、請求項５に記載の方法。
7. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、少なくとも１つのＦｃγＲＩＩＩの多型に一般的である、請求項５に記載の方法。
8. オリゴヌクレオチドプライマーの１以上のさらなる組み合わせを用いて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
9. 前記オリゴヌクレオチドの第１の組み合わせおよび第２の組み合わせが、共通の１つのプライマーをそれぞれ含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖ／Ｆ部位の遺伝子型が決定される、請求項９に記載の方法。
11. オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１の組み合わせは、配列番号５と配列番号２とからなる、請求項１０に記載の方法。
12. オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２の組み合わせは、配列番号５と配列番号１とからなる、請求項１１に記載の方法。
13. オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１の組み合わせを使用した増幅産物が存在し、かつオリゴヌクレオチドプライマーの前記第２の組み合わせを使用した増幅産物が非存在であることが、１５８ＶＶ遺伝子型を示す、請求項１２に記載の方法。
14. オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１の組み合わせを使用した増幅産物が非存在であり、かつオリゴヌクレオチドの前記第２の組み合わせを使用した増幅産物が存在することが、１５８ＦＦ遺伝子型を示す、請求項１２に記載の方法。
15. オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１の組み合わせを使用した増幅産物が存在し、かつオリゴヌクレオチドの前記第２の組み合わせを使用した増幅産物が存在することが、１５８ＦＶ遺伝子型を示す、請求項１２に記載の方法。
16. さらなるヌクレオチド位置において被験体のＦｃＲＩＩＩ遺伝子型が決定される、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記さらなるヌクレオチド位置が、１２１位、１５３位、１７９位、２０７位、３１３位およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記核酸が、ＰＣＲ増幅、ＲＴ−ＰＣＲ、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ＴａｑＭａｎ^ＴＭおよびこれらの組み合わせによって増幅される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 被験体のＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該被験体から得られた生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
    （ｂ）該単離された核酸を増幅する工程；
    （ｃ）該増幅された核酸産物を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの適した組み合わせを配列決定プライマーとして使用して、配列決定する工程；および
    （ｄ）１つ以上のＦｃγＲＩＩＩ多型におけるヌクレオチド残基を決定し、それにより該被験体の該ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子型を決定する工程、
    を包含する、方法。
20. 工程（ｂ）が、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の組み合わせおよび第２の組み合わせをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して、前記単離された核酸を増幅する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
21. ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖ／Ｆ部位における遺伝子型が、２０７位におけるヌクレオチドを決定することによって決定される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. ２０７位におけるＧヌクレオチドのみが、１５８ＶＶ遺伝子型を示す、請求項２１に記載の方法。
23. ２０７位におけるＴヌクレオチドのみが、１５８ＦＦ遺伝子型を示す、請求項２１に記載の方法。
24. ２０７位におけるＧヌクレオチドおよびＴヌクレオチドが、１５８ＦＶ遺伝子型を示す、請求項２１に記載の方法。
25. ＦｃγＲＩＩＩｂからＦｃγＲＩＩＩａを識別する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）被験体から得られた生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
    （ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の組み合わせおよび第２の組み合わせを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して、該単離された核酸を増幅する工程であって、ここで各組み合わせにおける該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂに対して特異的である、工程；ならびに
    （ｃ）オリゴヌクレオチドの各組み合わせを用いて増幅された核酸の存在または非存在を検出する工程であって、ここで増幅された核酸の存在または非存在によって、ＦｃγＲＩＩＩｂからＦｃγＲＩＩＩａを識別する、工程、
    を包含する、方法。
26. ＦｃγＲＩＩＩｂからＦｃγＲＩＩＩａを識別する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）被験体から得られた生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
    （ｂ）該単離された核酸を増幅する工程；
    （ｃ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの適切な組み合わせを配列決定プライマーとして使用して、該増幅された核酸を配列決定する工程；および
    （ｄ）１２１位、１５３位、１７９位および３１３位におけるヌクレオチドを決定し、それによってＦｃγＲＩＩＩｂからＦｃγＲＩＩＩａを識別する、工程、
    を包含する、方法。
27. 工程（ｂ）が、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の組み合わせおよび第２の組み合わせを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して、前記単離された核酸を増幅する工程を包含する、請求項２６に記載の方法。
28. ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型決定のためのキットであって、該キットは、
    １対以上の請求項１〜４に記載のオリゴヌクレオチドのプライマー；および
    ＦｃγＲＩＩＩａについて生物学的サンプルを遺伝子型決定するための説明書、
    を備える、キット。
29. 配列決定プライマーをさらに備える、請求項２８に記載のキット。

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