JP4073471B2 - 塩基変異分析用プライマー - Google Patents

Description

生命体の遺伝子分析は疾病に対する危険度、診断、予診又は治療方法の提示等と関連し広範囲に用いられている。例えば、特定人の特定遺伝子に対する変異分析を介して疾病に対する危険度がどの程度であるか予測し予防努力をするよう誘導することができる。又は、生命体に肝炎を発生させる別の生命体、例えばウイルス等の遺伝変異分析を介してそのウイルスが治療薬物に対し耐性を有するか否かを調査することにより、効果的な治療を誘導することができる。本発明は、生命体の遺伝子を分析する方法に関し、特に遺伝変異を調査する方法に関する。

人間のゲノム地図が完成されていきながら疾病に対する危険度の測定、疾病の診断又は予診、そして薬物に対する反応の予測をより広範囲に行うことができるとの可能性が提示されている。多数の個体を対象にゲノム単位の塩基配列分析をすれば個体間の多様性を示す染色体上の位置等が表われるが、これをＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）という。ＳＮＰは、生命体の染色体に配列されている塩基配列中一定頻度以上に現われる変異であり、人間の場合約１，０００個の塩基毎に１個程度の確率で現われるといわれる。人間の染色体の大きさを考慮する場合、数百万のＳＮＰが存在するのである。ＳＮＰは、個体間の形質差を説明する手段として考えられており、疾病の原因を突き止めて疾病を予防又は治療するのに用いることができる。

人間ゲノムプロジェクトにより発見されたＳＮＰ等は個体間の多様性を示すとの事実だけを示すだけで、その多様性が疾病と如何なる関連性があるのかを知らせてはいない。ＳＮＰと疾病との関係を明らかにするためには、正常人と患者に現われるＳＮＰの変異形態を比較分析（ＳＮＰスコアリング）する過程が必要である。ＳＮＰと疾病との関係を明確に突き止めるためには、多数のＳＮＰを分析しなければならないだけでなく、変異を誤謬なく分析することができなければならない。

ＳＮＰスコアリング方法にはＤＮＡシーケンシング、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Polymerase chain reaction−Single stranded conformation polymorphism）、アレル特異的混成化（allele specific hybridization）、オリゴリゲーション（oligo-ligation）（オリゴライゲーション）法、ミニシーケンシング（mini-sequencing）、そして酵素切断法によるもの等がある。ＤＮＡチップを利用した方法も紹介されているが、原理的にアレル特異的混成化と差がなく、ただオリゴヌクレオチドプローブ等を付着する固定相に差を置いたものである。

ＤＮＡシーケンシングはマキサム−ギルバート法とサンガー法があるが、現在は後者の方法が主に用いられている。この方法は、特定位置の遺伝変異の可否だけを調査するための方法であるというよりは遺伝子全体又は一部部位の塩基配列を明らかにするための方法であるが、塩基配列を明らかにすれば特定位置の遺伝変異の可否も確認することができるので、ＳＮＰスコアリングに用いることができる。しかし、調査しようとするＳＮＰの変異だけを確認するのではなく、敢えて調査しなくてもよい周辺の塩基配列を共に読取るとの面で非効率的である。

ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Orita，M．et.al，Genomics，1989，5：8874-8879）はＰＣＲで分析しようとするＳＮＰを含む配列を増幅した後、それぞれのチェーンに分離させてから、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行う。１塩基の差によりＤＮＡチェーンの２次構造が異なることになるので、この差による電気泳動移動速度の差により塩基変異の可否を調査する。
アレル特異的混成化は、ナイロンフィルタ等に付着したプローブに放射線同位元素等で標識されたサンプルＤＮＡを混成化するが、温度等混成化の条件を調節することにより塩基変異の可否を調査する方法である。
オリゴリゲーション法（Nucleic Acid Research 24，3728，1996）は、鋳型ＤＮＡと相補的でない状態ではリゲーション（ligation）（ライゲーション）が起こらない条件で反応を行い、リゲーションが進められたのかを確認することにより塩基変異を調査する方法である。
ミニシーケンシング（Genome Research 7：606，1997）は、変異の可否を調査しようとする位置の１個の塩基のみ重合されるよう条件を合わせ、重合された１個の塩基が何であるかにより検出反応が異なるよう考案された方法でＳＮＰスコアリングのために開発された方法である。

ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、アレル特異的混成化、オリゴリゲーション法等はポリアクリルアミドゲルを用いて多量のサンプルを分析するに不便であるか、又はプローブが望む位置に結合できずに発生する誤謬を確認できないという問題点がある。
ミニシーケンシングは、ＳＮＰスコアリングのため開発された技術であるため分析が簡単で多量のサンプルの分析に有利であるが、誤謬による誤った結果を確認できないという欠点を依然有しており、塩基の欠失（deletion）と挿入（insertion）を見つけ出すことができないという限界がある。

ＳＮＰスコアリングのため開発された技術中さらに１つの方法として酵素切断法がある（WO 01/90419）。この方法は、分析しようとする塩基配列をＰＣＲと同一の方法で増幅するが、増幅された結果物が２つの制限酵素により切断又は認知できる塩基配列を含むようにする。増幅された結果物を２種類の制限酵素で切断して生成された断片の分子量を測定し、塩基変異の可否を測定する方法である。この分析方法はＰＣＲによる遺伝子の増幅後直ちに制限酵素反応で断片を作ってマススペクトロメトリ等で分子量を測定するので、分析段階が簡単で迅速であるとの利点がある。しかし、WO 01/90419に記載された酵素切断法は依然誤謬による誤った分析を確認することができない。たとえば、ＰＣＲ遂行時にプライマーが望まない位置に結合する場合誤った分析結果をもたらすことがあるが、望まない位置に結合したのか否かを確認することができないという問題がある。たとえば、ＣＹＰ２Ｃ９の塩基変異を調査するため用いたプライマーがＣＹＰ２Ｃ８に結合することになることがあるが、この場合プライマーがＣＹＰ２Ｃ９でないＣＹＰ２Ｃ８に結合したとの事実を確認できないため、誤謬が発生したか否かの確認が困難である。さらに、１塩基が別の塩基に置換される変異は検測可能であるが、塩基の欠失（deletion）又は挿入（insertion）による変異は検測できないという問題点がある。さらに、隣接した２つ以上の塩基変異を同時に検測することができないという問題点がある。

WO 01/90419 Orita，M．et.al，Genomics，1989，5：8874-8879 Nucleic Acid Research 24，3728，1996 Genome Research 7：606，1997

本発明は前記の問題点を解決し、前記の必要性により考案されたもので、本発明の目的は生命体の遺伝変異を正確且つ効率的に調査することができる方法を提供することにある。

本発明は、生命体の遺伝変異を正確且つ効率的に分析する方法を提供する。
本発明を簡単に説明すれば、本発明は幾多の試料の塩基変異調査を簡単で速やかに行いながらも、プライマーが誤った位置に結合して生成する可能性のある誤謬を検証することができるようにすることにより正確な塩基変異の調査を可能にし、３２個の塩基範囲以内に隣接した幾多の塩基の変異を同時に調査するだけでなく、欠失又は挿入による遺伝変異も検測することができる方法を開発した。特に、一生命体内に幾多の遺伝型が同時に存在する場合、互いに異なる位置の塩基変異が一遺伝型に同時に存在するのか、それとも互いに異なる遺伝型に混在して存在するのかを区別することができる。たとえば、人間は同一の遺伝情報を収めている染色体が２つ（１対）ずつ存在しており、遺伝変異が起こる場合２つの染色体に全て変異があり得るが（ホモ）、１つの染色体にのみ起こることもある（ヘテロ）。隣接した２つ以上の塩基変異が全てヘテロである場合、２つの塩基変異が１つの染色体に同時に存在することがあり得るが、互いに異なる染色体に存在することもある。２通りの場合が生命体に及ぼす影響が異なる場合もあるので、これを区別する必要がある。人間を感染させるウイルスの場合も幾種類の遺伝型が混在して存在することがある。隣接した２つ以上の塩基変異が全てヘテロである場合、２つの塩基変異が１つの遺伝型に同時に存在するのか、それとも互いに異なる遺伝型に分かれて存在するのかを区別する必要がある。

本発明は、遺伝変異を分析するためその結果物が制限酵素で切断できる部位を含むよう望む塩基配列を増幅するが、制限酵素により切断された断片の塩基の数が３２個以下になるようにし、そのうち少なくとも１つの塩基はプライマーでない鋳型（template）の複製により生成されるようにし、増幅された生成物を制限酵素で切断した後分子量を測定することにより遺伝変異を分析する方法を提供する。

即ち、本発明はフォワードプライマー及びリバースプライマーを利用して特定ポリヌクレオチドを増幅する段階、前記増幅された特定ポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、２〜３２個塩基の大きさを有しながら変異配列を含む２種類以上の単一筋のポリヌクレオチド切片を生成する段階、及び前記切断された切片の分子量を測定する段階を含む遺伝子変異分析方法を提供する。本発明で、互いに異なる２つ以上の塩基変異中１つの変異は１つの単一筋（単一鎖）のポリヌクレオチド切片にのみ存在し、さらに他の単一筋のヌクレオチド切片には２つ以上の塩基変異を全て含むよう切断するのが好ましい。たとえば、．．．ＡＴＧ．．．との配列中でＡとＧが変異配列である場合、制限酵素切断により生成された第１の単一筋のヌクレオチドは２つの変異配列中Ａのみを含んでおり、第２の単一筋のヌクレオチドはＡとＧを全て含むように切断する場合である。
本発明は、遺伝変異を分析するためその生成物が制限酵素で切断できる部位を含むよう望む塩基配列を増幅するが、下記の表１のような構造の断片を作る方法を提供する。

‘制限酵素認知配列’は、互いに異なる制限酵素により同時に又は隣接して認知される配列であり、切断される配列と一致しないこともある。たとえば、FokIとBstF5Iは全てＧＧＡＴＧ配列を認知するが、切断される位置は認知配列の３’末端からそれぞれ第９／第１３と第２／第０の塩基の次である。制限酵素認知配列を認知する本発明で用いることができる少なくとも２つの制限酵素は本発明の目的に用いることができる全ての制限酵素、即ち互いに同一の最適温度又は互いに異なる最適温度を有する制限酵素が可能であり、その中でも互いに異なる最適温度を有しているのがさらに好ましく、相対的に低い最適温度を有する制限酵素としてFokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI又はBaeIが好ましく、相対的に高い最適温度を有する制限酵素としてBstF5I、TaqI、BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI又はApoIが好ましく、FokI及びBstF5I対が最も好ましい。
制限酵素BaeIは２５℃、FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI、MmeI及びAvaIIは３７℃の相対的に低い最適温度を有し、BstF5I及びTaqIは６５℃、BsaBI、BtrI及びBstAPIは６０℃、FauIは５５℃、BclI、PciI及びApoIは５０℃の相対的に高い最適温度を有する。

ＰＣＲ増幅に用いる２つのプライマーのうち１つはプライマー結合配列１、制限酵素認知配列、そしてプライマー結合配列２で構成されており、残りの１つはプライマー結合配列３で構成されている。
‘プライマー結合配列’は鋳型になる核酸と相補的に結合することができる配列であるが、制限酵素認知配列は核酸と相補的でない場合もある。プライマー結合配列１、２、そして３はプライマーがtemplate ＤＮＡと結合するためには少なくとも４つ以上でなければならないので、その塩基数は４つ以上でなければならず、８〜３０個の大きさでtemplate ＤＮＡと最もよく結合したため、８つ以上、３０個以下であるのが好ましい。‘変異前配列’は調査しようとする塩基変異の５’の方の配列である。‘変異配列’は調査しようとする塩基の変異に該当する配列である。塩基の置換、挿入、欠失が起こることもあるが、塩基数は１つのものが普通であり、２つ以上の場合もある。‘変異後配列’は変異配列の３’の方の配列である。

変異前配列と変異後配列を合わせて１つ以上であるのが好ましい。制限酵素の切断後生成される切片は変異配列を含んでいなければならず、切片の塩基数は２〜３２個であるのが好ましい。より好ましくは、１２個の塩基を有するのが良い。切断された切片の大きさを数値限定した理由は、マススペクトロメトリで分析する場合、分析結果が良好な切片のサイズを反映したのである。３２個を超える大きさを有する切片は、マススペクトロメトリを利用して分子量を計算することにより塩基変異を調査するにはあまりにも大きいので、前記のような切片の塩基数が好ましい。さらに、１つの塩基だけで成る切片の場合は変異配列だけを含んでいるものであるので、プライマーが誤った位置に結合したのかを確認するのを困難にするので好ましくない。２つの制限酵素が同一又は隣接した部位を認知するので、２つの制限酵素のうち何れか１つの反応が進められる間にさらに他の１つの制限酵素は作用しないのが好ましい。このような場合、増幅された生成物を制限酵素で切断するとき、２つの制限酵素の最適温度に鑑み互いに異なる温度で連続して反応させることができる。若しくは、１つの制限酵素で先ず切断してから残りの酵素で切断することもできる。このとき、先に用いる制限酵素による切断が変異配列を含む切片に存在する第２の制限酵素の認知配列又は切断位置を除去又は損壊してはならない。

本発明は、既存の塩基変異分析方法が有していた誤謬による誤った分析を検証することができ、３２個塩基範囲以内に隣接した幾多の塩基の変異を同時に調査することができる。特に、塩基の変異を示す生命体の遺伝型が幾種類に存在する場合、互いに異なる位置の塩基変異が１つの遺伝型に同時に存在するのか、それとも２種類以上の遺伝型に混在され存在するのかを区別することができる。さらに、欠失又は挿入による遺伝変異も検測することができる。

以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。

人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基の塩基変異
人間の癌転移抑制遺伝子として知られたmaspin（serpinb５）遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基（rs1509477；染色体１８番の第61001755の塩基）の変異を調査した。

１．ＰＣＲ増幅と制限酵素切断
Template ＤＮＡの配列（５’→３’）は下記の通りである。
ＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＡＴＴＣＡｃＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＧ（配列番号１）
下線の配列等は下記のプライマー１と２が結合する部位等である。小文字で表記された塩基は‘変異配列’（ＳＮＰ部位をいう。）である。
プライマー１（配列番号２）．５’−ＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＡｇｇａｔｇＧＣＴＡＴＴＣＡ−３’（３４ｍｅｒ）
プライマー２（配列番号３）．５’−ＣＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＡＴＧＣ−３’（２８ｍｅｒ）
小文字で表記された配列はFokI及びBstF5Iの認知配列である。
ＰＣＲ buffer（１ｘ）、ＭｇＳＯ_４ ２ ｍＭ、ｄＮＴＰ ２００ ｍＭ、Platinum Taq Polymerase（Invitrogen、10966-026）０.３１５Ｕ、プライマー１と２それぞれ０.５ｕＭ、ゲノムＤＮＡ ３６ｎｇを投入して総反応嵩を１８μｌに合わせる。そして、次の条件でＰＣＲ反応を行う。
９４℃ ２分、
９４℃ １５秒 ５５℃ １５秒 ７２℃ ３０秒（１０cycles）、
９４℃ １５秒 ６０℃ １５秒 ７２℃ ３０秒（３５cycles）

ゲノムＤＮＡは、血液から抽出し通常の方法により純粋分離する。たとえば、‘ＳＤＳ／蛋白質分解酵素Ｋ’方法を用いることができる（Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harber, 1989）又はQIAamp DNA Mini Kit 250（Qiagen 51106）を用いて血液からＤＮＡを分離することができる。ＤＮＡの濃度が低い場合、次のような方法でＤＮＡを濃縮して用いることができる。ＤＮＡ溶液に１／１０嵩の３Ｍ Sodium acetate（ｐＨ ５.３）と２.５嵩のエタノールを投入して緩やかに混合した後、−２０℃で１時間以上のあいだ放置する。４℃、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上澄液を慎重に除去し７０％エタノールを投入して４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。エタノールを乾燥させた後、望む嵩の蒸留水を添加して溶解する。

ＰＣＲを介して生成される断片の配列は次の通りである（５’→３’）。
ＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＡｇｇａｔｇＧＣＴＡＴＴＣＡ［Ｃ／Ｔ］ＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＴＧ（配列番号４）
ＡＧＴＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＡＴＴＴＴｃｃｔａｃＣＧＡＴＡＡＧＴ［Ｇ／Ａ］ＴＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＡＣ（配列番号５）
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認知される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される切片の配列であり、大括弧（[]）で表記された部位は‘変異配列’（ＳＮＰ部位をいう。）である。この反応物にFokI（ＮＥＢ Ｒ１０９Ｌ）１Ｕ、BstF5I（ＮＥＢ、Ｖ００３１Ｌ）１Ｕ、５０ｍＭ potassium acetate、２０ｍＭ Tris-acetate、１０ｍＭ magnesium acetate、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７.９ ＠ ２５℃）反応組成下で２５℃で２時間、連続的に４５℃でも２時間のあいだ反応を実施する。

酵素反応の最適化のため、増幅された生成物をFokIとBstF5Iで２５℃、３７℃、４５℃、５５℃、６５℃でそれぞれ反応した結果FokIの場合は２５℃で７０％、３７％で９０％以上反応が進められるものと確認された。併せて、BstF5Iの場合は２５℃を除いた温度で酵素反応が進められるのが確認された。したがって、FokIのみ作用することができる温度の２５℃で先ず反応させてから、BstF5Iが反応することができる温度の３７℃以上で反応させるのが好ましい。

２．精製及び脱塩
制限酵素で処理した前記の溶液からＤＮＡ切片を純粋分離した後、分子量を測定するのが好ましい。たとえば、Nucleave Genotyping Kit（Variagenics，ＵＳＡ）を用いることができる。先ず、制限酵素反応液に１Ｍ ＴＥＡＡ（Triethylammoniumacetate，ｐＨ７.６）７０μｌを添加して１分間放置する。Sample Preparation Plateに１Ｍ ＴＥＡＡ ７０μｌと前記の混合液９０μｌを順次投入して通過した後、０.１Ｍ ＴＥＡＡ ８５μｌを５回完全に通過させる。Sample Preparation Plateを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。Collection Plate上にSample Preparation Plateを位置させ、６０％ isopropanol ６０μlを投入して通過させる。溶出液がCollection Plateに集まるとCollection Plateを１１５℃で７５分間乾燥させる。

３．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ
Collection plateにＭＡＬＤＩ matrix（２２.８ｍｇ ammonium citrate，１４８.５ｍｇ hydroxypicolinic acid，１.１２ｍｌ acetonitrile，７.８ｍｌ Ｈ_２Ｏ）６μｌを添加した後、そのうち４μｌをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Biflex IV，Bruker）のAnchor chip plateに載せる。３７℃で３０分間乾燥させ、室温に暫く置いて熱を冷やした後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析する。分析方法はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのマニュアルに従う。
第４のイントロンの第２７４１の塩基が正常の場合（Ｃ／Ｃ）、酵素切断後生成される切片の分子量は２１３５.４Ｄ（７ｍｅｒ）と４０７８.６（１３ｍｅｒ）Ｄである（図１及び図２）。ヘテロの場合（Ｃ／Ｔ）、生成される切片の分子量は２１３５.４Ｄ、２１５０.４Ｄ（以上７ｍｅｒ）、４０７８.６Ｄ、そして４０６２.６Ｄ（１３ｍｅｒ）である（図３及び図４）。一方、全てＴに変異された場合（Ｔ／Ｔ）、切片の分子量は２１５０.４Ｄ（７ｍｅｒ）と４０６２.６Ｄ（１３ｍｅｒ）である(図５及び図６)。

人間の癌転移抑制遺伝子として知られたmaspin（serpinb5）遺伝子の第４のイントロンの第３５９７の塩基（rs1396782；染色体１８番の第61002611の塩基）の変異
Template ＤＮＡの配列は次の通りである。
ＣＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＴＡＴＧＡＡＧｃＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡ（配列番号６）
前記の配列で下線の部位は、下記のプライマー３と４がそれぞれ結合する部位である。小文字で表記された部位が‘変異配列’（ＳＮＰ部位をいう。）である。
プライマー３（配列番号７）．５’−ＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＴＴｇｇａｔｇＡＴＡＴＧＡＡＧ−３’（３４ｍｅｒ）
プライマー４（配列番号８）.５’−ＧＣＣＴＧＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＡ−３’（２９ｍｅｒ）
上記のプライマーで小文字で表記された部位はTemplate ＤＮＡに存在しない配列であり、FokI及びBstF5Iにより認知される配列である。ＰＣＲ反応を含む実験方法は実施例１と同一である。

ＰＣＲを介して生成される断片の配列は次の通りである（５’→３’）。
ＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＴＴｇｇａｔｇＡＴＡＴＧＡＡＧ［Ｃ／Ｔ］ＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＴＡＡＣＡＧＧＣ（配列番号９）
ＣＴＣＡＴＡＡＴＡＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡｃｃｔａｃＴＡＴＡＣＴＴＣ［Ｇ／Ａ］ＡＡＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＧＴＣＣＧ（配列番号１０）
上記の配列で小文字で示された部位は制限酵素認知配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される切片の配列であり、大括弧（[]）で表記された部位は‘変異配列’（ＳＮＰ部位をいう。）である。この反応物にFokI（ＮＥＢ Ｒ１０９Ｌ）１Ｕ、BstF5I（ＮＥＢ、Ｖ００３１Ｌ）１Ｕ、５０ｍＭ potassium acetate、２０ｍＭ Tris-acetate、１０ｍＭ magnesium acetate、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７.９ ＠ ２５℃）反応組成下で２５℃で２時間、連続的に４５℃でも２時間のあいだ反応を実施する。

第４のイントロンの第３５９７の塩基が正常の場合（Ｃ／Ｃ）、酵素切断後生成される切片の分子量は２２０９.４Ｄ（７ｍｅｒ）と３９８８.６（１３ｍｅｒ）Ｄである（図７）。ヘテロの場合（Ｃ／Ｔ）、生成される切片の分子量は２２０９.４Ｄ、２２２４.４Ｄ（以上７ｍｅｒ）、３９８８.６Ｄ、そして３９７２.６Ｄ（１３ｍｅｒ）である（図８）。一方、全てＴに変異された場合（Ｔ／Ｔ）、切片の分子量は２２２４.４Ｄ（７ｍｅｒ）と３９７２.６Ｄ（１３ｍｅｒ）である(図９)。

Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ重合酵素のチロシン−メチオニン−アスパラギン酸−アスパラギン酸（ＹＭＤＤ）部位塩基変異
人間にＢ型肝炎を誘発させるＢ型感染ウイルスのＤＮＡ重合酵素遺伝子内に位置するＹＭＤＤ部位の塩基変異を調査した。この部位の塩基変異によりＢ型肝炎の治療剤であるラミブジンに対する耐性が発生する。５５２番コドンのメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）に変化した場合にラミブジンに対する耐性が生じるものと知られている。

１．ＰＣＲ増幅と制限酵素切断
ＱＩＡamp blood kit（Qiagen，ＣＡ）を用いてＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡを血清０.２ｍｌから抽出し、このうち２μｌをＰＣＲ増幅に用いる。
Template ＤＮＡの配列（５’→３’）は下記の通りである。
ＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＡ
（配列番号１１）
下線の配列等は、下記のプライマー５と６が結合する部位等である。
プライマー５（配列番号１２）．５’−ＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴｇｇａｔｇＴＣＡＧＴＴＡＴ−３’（３１ｍｅｒ）
プライマー６（配列番号１３）．５’−ＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣ−３’（３０ｍｅｒ）
プライマー５で小文字で表記された配列はFok1及びBstF5Iの認知配列でTemplate ＤＮＡにはないものを人為的に挿入した配列であり、プライマー６で下線の配列はFokIにより認知されるのを防ぐため人為的に変更した配列である。
２０ｍＭ TrisＨＣｌ（ｐＨ８.４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰ、０.４Ｕ Platinum Taq Polymerase（Invitrogen，10966-026）、プライマー５と６それぞれ１０ｐｍｏｌを含んだ反応溶液１８μｌを用いて次の条件でＰＣＲ反応を行う。
９４℃ ２分、
９４℃ １５秒 ５０℃ １５秒 ７２℃ ３０秒（１０cycles）、
９４℃ １５秒 ５５℃ １５秒 ７２℃ ３０秒（３５cycles）

ＰＣＲを介して生成される断片の配列は次の通りである（５’→３’）。
ＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴｇｇａｔｇＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＡ（配列番号１４）
ＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＡｃｃｔａｃＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＡＧＴＡＣＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＴ（配列番号１５）
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認知される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される切片の配列である。ＰＣＲ反応物をFokI（ＮＥＢ Ｒ１０９Ｌ）１Ｕ、BstF5I（ＮＥＢ、Ｖ００３１Ｌ）１Ｕ及び反応溶液（５０ｍＭ potassium acetate、２０ｍＭ Tris-acetate、１０ｍＭ magnesium acetate、１ｍＭ ＤＴＴ）１０μｌと混合して３７℃で２時間、そして４５℃で２時間のあいだ反応を実施する。３７℃で２時間のあいだFokIで先ず切断した後、BstF5Iを投入して４５℃で２時間のあいだ切断することもできる。

２．精製及び脱塩とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ
実施例１と同様の方法で行う。
酵素切断により生成される切片の計算上の大きさと実際の分子量分析により測定した値は、０.１％以下の差を示す程度に正確に一致した（表２）。

前記の表で解像度（観察された質量と予想質量との差を予想質量で分けたもの）は全て０.１％以下である。

Ｃ型肝炎ウイルスの５’ＮＣＲ（Non Coding Region）部位の塩基変異
慢性Ｃ型肝炎の治療のためインターフェロンを用いる場合、人体のＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型に従い異なる治療効果を示し、インターフェロンを用いる前に体内に存在するＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の調査が必要である。遺伝子型を明らかにするため、５’ＮＣＲの塩基変異を調査するのが有効であり、本実施例はＣ型肝炎ウイルスの５’ＮＣＲ部位の塩基変異を分析する方法を記述したものである。

１．ＲＴ ＰＣＲ
ＱＩＡamp viral ＲＮＡ Mini kit（Qiagen，ＣＡ）を用いてＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを血清０.１４ｍｌから抽出し、このうち１０μｌをＲＴ ＰＣＲ増幅に用いる。
０.２ｍＭ ｄＮＴＰ、０.４μＭプライマー２、１０μｌ ＲＮＡを含んだ反応溶液を６５℃で５分間反応させた後、氷に１分間放置する。この反応液に２０ｍＭ TrisＨＣｌ（ｐＨ８.４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴ、０.４μＭプライマー１、１００Ｕ SuperScript III ＲＮase Ｈ−Reverse Transcriptase（Invitrogen，18080-044）、２０Ｕ ＲＮaseＯＵＴ（Invitrogen，10777-019）、０.４Ｕ Platinum Taq Polymerase（Invitrogen，10966-026）を混合した反応溶液２５μlを用いて次の条件でＲＴ ＰＣＲを行う。
５０℃ ４５分、
９４℃ ２分、
９４℃ １５秒 ５５℃ １５秒 ７２℃ １５秒（３５cycles）
７２℃ ５分

Template ＤＮＡの配列（５’→３’）は下記の通りである。
ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴ (中間省略)ＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧ（配列番号１６）
下線の配列等は下記のプライマー７と８が結合する部位等である。
プライマー７（配列番号１７）．５’−ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ−３’（２４ｍｅｒ）
プライマー８（配列番号１８）．５’−ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ−３’（２４ｍｅｒ）

２．Nested ＰＣＲ及び制限酵素切断
前記ＲＴ ＰＣＲ反応液を１／５０に希釈してそのうち２μｌを２０ｍＭ TrisＨＣｌ（ｐＨ８.４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰ、０.４Ｕ Platinum Taq Polymerase（Invitrogen，10966-026）、プライマー９と１０、１１と１２又は１３と１４をそれぞれ１０ｐｍｏｌずつを含んだ反応溶液１８μｌを用いて次の３種類のＰＣＲ反応及び制限酵素処理を実施する。反応１ではプライマー９と１０を、反応２ではプライマー１１と１２を、そして反応３ではプライマー１３と１４を用いる。３種類の反応全てのＰＣＲ反応温度及び時間は次の通りである。
９４℃ ５分、
９４℃ ３０秒 ５５℃ ３０秒 ７２℃ ３０秒（３５cycles）
７２℃ ５分

１）反応<1>
ＲＴ−ＰＣＲ反応液をプライマー９と１０を利用してＰＣＲを行う。Template ＤＮＡの配列（５’→３’）は下記の通りである。
ＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣ ...（中間省略）
...ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号１９）
下線の配列等は下記のプライマー９と１０が結合する部位等である。
プライマー９（配列番号２０）．５’−ＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧｇｇａｔｇＡＴＧＡＧＴＧＴ−３’（３２ｍｅｒ）
プライマー１０（配列番号２１）．５’−ＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣ−３’（２４ｍｅｒ）

ＰＣＲを介して生成される断片の配列は次の通りである（５’→３’）。
ＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧｇｇａｔｇＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣ...（中間省略）
ＧＣＡＧＡＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＧＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧ...（中間省略）
... ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号２２）
... ＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＡＴＣＣＣ（配列番号２３）
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認知される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される切片の配列である（７ｍｅｒと１３ｍｅｒ）。ＰＣＲ反応物をFokI（ＮＥＢ Ｒ１０９Ｌ）１Ｕ、BstF5I（ＮＥＢ、Ｖ００３１Ｌ）１Ｕ及び反応溶液（５０ｍＭ potassium acetate、２０ｍＭ Tris-acetate、１０ｍＭ magnesium acetate、１ｍＭ ＤＴＴ）１０μｌと混合して３７℃で２時間、そして４５℃で２時間のあいだ反応を実施する。３７℃で２時間のあいだFokIで先ず切断した後、BstF5Iを投入して４５℃で２時間のあいだ切断することもできる。

２）反応<2>
ＲＴ−ＰＣＲ反応液をプライマー１１と１２を利用してＰＣＲを行う。Template ＤＮＡの配列（５’→３’）は下記の通りである。
ＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴ
ＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣ...（中間省略）
...ＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＲＧＴＴＧＧＧＴＲＧＣＧＡＡ（配列番号２４）
下線の配列等は下記のプライマー１１と１２が結合する部位等である。
プライマー１１（配列番号２５）．５’−ＧＴＧＧＴＣＴＧｔｃｃａａｃＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴ−３’（３２ｍｅｒ）
プライマー１２（配列番号２６）．５’−ＴＴＣＧＣＲＡＣＣＣＡＡＣＲＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＧＧＴＣＣＧＧＣＴＡＧ−３’（３５ｍｅｒ）
Ｒで表記された塩基はアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）であり、それぞれの塩基が含まれた２種類のプライマーの混合物を用いる。

ＰＣＲを介して生成される断片の配列は次の通りである（５’→３’）。
ＧＴＧＧＴＣＴＧｔｃｃａａｃＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣ ...（中間省略）
ＣＡＣＣＡＧＡＣａｇｇｔｔｇＧＣＣＡＣＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡ
ＡＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧ ...（中間省略）
... ＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧｇａｃｃｇｔｔｇｇａＧＴＡＧＲＧＴＴＧＧＧＴＲＧＣＧＡＡ（配列番号２７）
... ＧＧＧＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣｃｔｇｇｃａａｃｃｔＣＡＴＣＲＣＡＡＣＣＣＡＲＣＧＣＴＴ（配列番号２８）
小文字で表記された部位はMmeI及びAvaIIにより認知される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される切片の配列である（１３ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、そして１９ｍｅｒ）。ＰＣＲ反応物をMmeI（ＮＥＢ Ｒ０６３７Ｌ）１.５Ｕ、５０μＭ ＳＡＭ及び１Ｘ反応溶液（５０ｍＭ potassium acetate、２０ｍＭ Tris-acetate、１０ｍＭ magnesium acetate、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７.９）１０μｌと混合して３７℃で２時間、そしてAvaII（ＮＥＢ、Ｒ０１５３Ｓ）１.５Ｕを投入して３７℃で２時間のあいだ反応を実施する。MmeIとAvaIIを同時に投入して反応させることもできる。

３）反応<3>
ＲＴ−ＰＣＲ反応液をプライマー１３と１４を利用してＰＣＲを行う。Template ＤＮＡの配列（５’→３’）は下記の通りである。
ＧＡＣＩＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣ（配列番号２９）
下線の配列等は下記のプライマー１３と１４が結合する部位等である。
プライマー１３（配列番号３０）．５’−ＧＡＣＩＧＧＧＴＣＣＴｇｇａｔｇＴＣＴＴＧＧＡ−３’（２３ｍｅｒ）
プライマー１４（配列番号３１）．５’−ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣｇｇａｔｇＣＣＣＡＡＡＴ−３’（２２ｍｅｒ）
Ｉで表記された塩基はイノシン（Inosine）である。
ＰＣＲを介して生成される断片の配列は次の通りである（５’→３’）。
ＧＡＣＩＧＧＧＴＣＣＴｇｇａｔｇＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＣ ＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧｃａｔｃｃＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣ（配列番号３２）
ＣＴＧＩＣＣＣＡＧＧＡｃｃｔａｃＡＧＡＡＣＣＴＡＧＴＴＧＧ ＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣｇｔａｇｇＣＡＣＧＧＧＧＧＣＧ（配列番号３３）
小文字で表記された部位はFokI及びBstF5Iにより認知される配列であり、下線の部位は制限酵素の切断により生成される切片の配列である。生成される切片は７ｍｅｒの２種類、１３ｍｅｒの２種類、そして１４ｍｅｒの２種類である。ＰＣＲ反応物をFokI（ＮＥＢ Ｒ１０９Ｌ）１Ｕ、BstF5I（ＮＥＢ、Ｖ００３１Ｌ）１Ｕ及び反応溶液（５０ｍＭ potassium acetate、２０ｍＭ Tris-acetate、１０ｍＭ magnesium acetate、１ｍＭ ＤＴＴ）１０μｌと混合して３７℃で２時間、そして４５℃で２時間のあいだ反応を実施する。３７℃で２時間のあいだFokIで先ず切断した後、BstF5Iを投入して４５℃で２時間のあいだ切断することもできる。

２．精製及び脱塩とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ
３つのタイプのＰＣＲ及び制限酵素切断反応液を実施例１と同様の方法で精製して分子量を測定する。
反応<1>（表３）、<2>（表４）、そして<3>（表５）により生成された切片等の大きさは、次の表３〜表５に表記した通りである。表３〜表５に示した早見表に基づき切片等の大きさを介してＣ型肝炎ウイルスの遺伝型を決定する。

人間のmaspin（serpinb5）遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基が正常の場合（Ｃ／Ｃ）の７ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基が正常の場合（Ｃ／Ｃ）の１３ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基がヘテロの場合（Ｃ／Ｔ）の７ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基がヘテロの場合（Ｃ／Ｔ）の１３ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基が全てＴに変異された場合（Ｔ／Ｔ）の７ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第２７４１の塩基が全てＴに変異された場合（Ｔ／Ｔ）の１３ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第３５９７の塩基が正常の場合（Ｃ／Ｃ）の７ｍｅｒと１３ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第３５９７の塩基がヘテロの場合（Ｃ／Ｔ）の７ｍｅｒと１３ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。 人間のmaspin遺伝子の第４のイントロンの第３５９７の塩基が全てＴに変異された場合（Ｔ／Ｔ）の７ｍｅｒと１３ｍｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリ図である。

Claims (6)

1. 一塩基多型（以下「ＳＮＰ」という。）部位を含むゲノム上の特定領域又は該特定領域の塩基配列に対応する塩基配列をその塩基配列中に含む二本鎖ポリヌクレオチドの相当する領域（以下「標的領域」という。）を、フォワードプライマーが該標的領域のフォワードプライマー結合部分に結合し、かつ、リバースプライマーが該標的領域のリバースプライマー結合部分に結合し、該標的領域をＰＣＲ増幅して特定の二本鎖ポリヌクレオチド断片を生成することができる、該フォワードプライマーと該リバースプライマーとからなるプライマーのセットであって、該プライマーのうち少なくとも一方は、その塩基配列中に、該標的領域の該プライマー結合部分の塩基配列に相補的な塩基配列の３’末端から少なくとも４塩基以上離れた位置に少なくとも０塩基以上からなる塩基配列が挿入され、該挿入された塩基配列を含む塩基配列から構成される制限酵素認知配列を含み、該特定の二本鎖ポリヌクレオチド断片は、該制限酵素認知配列を認知する２つ以上の制限酵素によって切断され、それによって得られる一本鎖ポリヌクレオチド断片はＳＮＰ部位を含み、かつ、その大きさが２〜３２個塩基となるように調製可能であることを特徴とする、遺伝子変異分析用プライマーのセット。
2. 前記フォワードプライマーは、配列番号２、７、１２、２０、２５及び３０からなる群から選ばれる１つのプライマーであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子変異分析用プライマーのセット。
3. 前記２つ以上の制限酵素は、互いに同一の、又は、互いに異なる最適温度を有することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子変異分析用プライマーのセット。
4. 前記２つ以上の制限酵素は、互いに異なる最適温度を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子変異分析用プライマーのセット。
5. 前記２つ以上の制限酵素は、FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI及びBaeIからなる群から選ばれる少なくとも１つの低い最適温度を有する制限酵素と、BstF5I、TaqI、BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI及びApoIからなる群から選ばれる少なくとも１つの高い最適温度を有する制限酵素であることを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子変異分析用プライマーのセット。
6. 前記プライマーのセットは、人間マスピン遺伝子の第４のイントロンの第２７４１又は第３５９７の塩基の変異分析、ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウィルス変異分析、又はＣ型肝炎ウィルスの遺伝子型変異分析に用いられることを特徴とする、請求項１又は２に記載の遺伝子変異分析用プライマーのセット。

Images