KR20040026795A

KR20040026795A - 염기변이 분석 프라이머 및 그 방법

Info

Publication number: KR20040026795A
Application number: KR1020020058375A
Authority: KR
Inventors: 홍선표; 김수옥; 김석준; 이환석; 정현재
Original assignee: (주)진매트릭스
Priority date: 2002-09-26
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2004-04-01
Also published as: KR100477766B1

Abstract

본 발명은 생명체의 유전자 염기변이를 정확하고 효율적으로 조사하는 방법에 관한 것이다.

Description

염기변이 분석 프라이머 및 그 방법{Primers and method for detecting base mutation}

생명체의 유전자분석은 질병에 대한 위험도, 진단, 예진 또는 치료방법의 제시 등과 관련하여 광범위하게 사용되고 있다. 예를 들어, 특정인의 특정유전자에 대한 변이분석을 통하여 그 질병에 대한 위험도가 어느 정도인지 예측하여 예방노력을 하도록 유도할 수 있다. 본 발명은 생명체의 유전자를 분석하는 방법에 관한 것으로서, 특별히 유전변이를 조사하는 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머에 관한 것이다.

인간의 지놈지도가 완성되어 가면서 질병에 대한 위험도의 측정, 질병의 진단 또는 예진, 그리고 약물에 대한 반응의 예측을 보다 광범위하게 할 수 있다는 가능성이 제시되고 있다. 다수의 개체를 대상으로 지놈단위의 염기서열분석을 하면 개체간 다양성을 보이는 염색체상의 위치들이 나타나는데 이를 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다. SNP는 생명체의 염색체에 배열되어 있는 염기서열 중 일정 빈도 이상으로 나타나는 변이로서, 인간의 경우 약 1,000개 염기마다 1개 정도의 확률로 나타난다고 한다. 인간의 염색체 크기를 고려할 때, 수백만의SNP가 존재하는 것이다. SNP는 개체간의 형질차이를 설명하는 수단으로 여겨지고 있어 질병의 원인을 규명하여 병을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.

인간 지놈프로젝트에 의해 발견된 SNP들은 개체간 다양성을 보인다는 사실만을 보여줄 뿐 그 다양성이 질병과 어떤 관련성이 있는지를 알려주지는 않는다. SNP와 질병과의 관계를 밝히기 위해서는 정상인과 환자에게서 나타나는 SNP의 변이 형태를 비교 분석(SNP스코링)하는 과정이 필요하다. SNP와 질병과의 관계를 명확하게 규명하기 위해서는 많은 수의 SNP를 분석하여야 할 뿐만 아니라, 변이를 오류없이 분석할 수 있어야 한다.

SNP스코링 방법으로는 DNA시퀀싱, PCR-SSCP(Polymerase chain reaction -Single stranded conformation polymorphism), 알렐특이적혼성화 (allele specific hybridization), 올리고리게이션 (oligo-ligation)법, 미니시퀀싱 (mini-sequencing) 그리고 효소절단법에 의한 것들이 있다. DNA칩을 이용한 방법도 소개되고 있는데 원리적으로 알렐특이적혼성화와 다르지 않고, 다만 올리고뉴클레오타이드 프로브 등을 부착하는 고정상에 차별을 둔 것이다.

DNA시퀀싱은 맥삼-길버트법과 생거법이 있으나 현재는 후자의 방법이 주로 사용되고 있다. 이 방법은 특정위치의 유전변이 여부만을 조사하기 위한 방법이라기보다는 유전자 전체 또는 일부 부위의 염기서열을 밝히기 위한 방법이지만, 염기서열을 밝히면 특정 위치의 유전변이 여부도 확인할 수 있으므로 SNP스코링에 사용될 수 있다. 그러나, 조사하고자 하는 SNP의 변이만을 확인하는 것이 아니라 굳이 조사하지 않아도 되는 주변의 염기서열을 함께 읽는다는 면에서 비효율적이다.

PCR-SSCP(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879)는 PCR로 분석하고자 하는 SNP를 포함하는 서열을 증폭한 후, 각각의 체인으로 분리시킨 다음, 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동을 수행한다. 1염기의 차이에 의하여 DNA 체인의 2차 구조가 달라지므로 이 차이에 기인한 전기영동 이동속도 차이에 따라 염기변이 여부를 조사한다.

알렐특이적혼성화는 나일론 필터 등에 부착된 프로브에 방사선동위원소 등으로 표지된 샘플DNA를 혼성화하되, 온도 등 혼성화의 조건을 조절함으로써 염기변이의 여부를 조사하는 방법이다.

올리고리게이션법(Nucleic Acid Research 24, 3728, 1996)은 주형DNA와 상보적이지 않은 상태에서는 리게이션(ligation)이 일어나지 않는 조건에서 반응을 수행하고 리게이션이 진행되었는지를 확인함으로써 염기변이를 조사하는 방법이다.

미니시이퀸싱(Genome Research 7:606, 1997)은 변이 여부를 조사하고자 하는 위치의 1개의 염기만이 중합되도록 조건을 맞추고 중합된 1개의 염기가 무엇인가에 따라 검출반응이 다르도록 고안된 방법으로 SNP스코링을 위해서 개발된 방법이다.

PCR-SSCP, 알렐특이적혼성화, 올리고리게이션법 등은 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 많은 양의 샘플을 분석하기에 불편하거나, 프로브가 원하는 위치에 결합하지 못해서 발생하는 오류를 확인하지 못한다는 문제점이 있다.

미니시퀀싱은 SNP스코링을 위해 개발된 기술이어서 분석이 간편하고 많은 양의 샘플 분석에 유리하지만, 오류에 의한 잘못된 결과를 확인하지 못하는 단점을 여전히 가지고 있고 염기의 결실(deletion)과 삽입(insertion)을 알아낼 수 없다는한계가 있다.

SNP스코링을 위해 개발된 기술 중 또 하나의 방법으로 효소절단법이 있다 (WO 01/90419). 이 방법은 분석하고자 하는 염기서열을 PCR과 같은 방법으로 증폭을 하되, 증폭된 결과물이 두 개의 제한효소에 의해 절단되거나 인지될 수 있는 염기서열을 포함하도록 한다. 증폭된 결과물을 두 가지의 제한효소로 절단하여 생성된 단편의 분자량을 측정하여 염기변이의 여부를 측정하는 방법이다. 이 분석방법은 PCR에 의한 유전자의 증폭 후 즉시 제한효소반응으로 단편을 만들어 mass spectrometry 등으로 분자량을 측정하므로 분석단계가 간편하고 빠른 장점을 가지고 있다. 그러나, WO 01/90419에 기재된 효소절단법은 여전히 오류에 의한 잘못된 분석을 확인하지 못한다. 예를 들어, PCR 수행시 프라이머가 원하지 않은 위치에 결합할 경우 잘못된 분석결과를 초래할 수 있는데, 원하지 않은 위치에 결합하였는지 확인할 수 없다는 문제가 있다. 예를 들어 약물대사관련 유전자로 잘 알려진 CYP450계열의 유전자(CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8 등)들은 서로 다른 약물대사에 관여함에도 불구하고 염기서열에 있어 매우 유사하여 특정유전자의 염기변이를 조사할 때 프라이머가 조사하고자 하는 유전자가 아닌 다른 유전자에 결합하여 오류를 발생시킬 가능성이 높다. 즉 CYP2C9의 염기변이를 조사하기 위하여 사용한 프라이머가 CYP2C8에 결합하게 될 수 있는데, 이 경우 프라이머가 CYP2C9이 아닌 CYP2C8에 결합하였다는 사실을 확인할 수 없어 오류가 발생하였는지 여부를 확인하기 어렵다. 또한, 1염기가 다른 염기로 치환되는 변이는 검측이 가능하나, 염기의 결실(deletion) 또는 삽입(insertion)에 의한 변이는 검측하지 못한다는 문제점이있다.

본 발명에서는 생명체의 유전변이를 정확하게 그리고 효율적으로 조사할 수 있는 방법을 개발하였다. 즉, 많은 시료의 SNP스코링을 간편하고 빠르게 수행하면서도 프라이머가 잘못된 위치에 결합하여 생성될 수 있는 오류를 검증할 수 있도록 함으로써 정확한 염기변이 조사를 가능하도록 할 뿐만 아니라 결실 또는 삽입에 의한 유전변이도 검측할 수 있는 방법을 개발하였다.

도 1은 인간의 MTHFR(Methylene tetrahydrofolate reductase) 유전자의 1305번째 염기서열이 정상인 경우의 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 2는 인간의 MTHFR(Methylene tetrahydrofolate reductase) 유전자의 1305번째 염기서열이 변이에 의하여 시토신으로 바뀐 경우 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 3은 인간의 DPYD(dihydropyrimidine dehydrogenase)유전자의 1897번째 염기서열이 정상인 경우의 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 4는 인간의 DPYD(dihydropyrimidine dehydrogenase)유전자의 1897번째 염기서열이 변이에 의해 시토신이 결실된 경우 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 5는 인간의 DPYD 유전자의 295 ~ 298번째 염기서열의 염기변이가 결실되지 않고 남아 있는 경우의 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 6은 인간의 DPYD 유전자의 295 ~ 298번째 염기서열이 변이에 의해 결실된 경우의 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 7은 인간의 MTHFR 유전자의 1056번째 염기가 정상인 경우의 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

도 8은 인간의 MTHFR 유전자의 1056번째 염기가 변이에 의해 티민이 생성된 경우의 MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리결과를 보여주는 그림.

본 발명은 생명체의 유전변이를 정확하고 효율적으로 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명은 유전변이를 분석하기 위하여 그 결과물이 제한효소로 절단될 수 있는 부위를 포함하도록 원하는 염기서열을 증폭하되 제한효소에 의해 절단된 단편의 염기의 수가 32개 이하가 되도록 하고 그 중 적어도 1개의 염기는 프라이머가 아닌 주형(template)의 복제에 의해 생성되도록 하고, 증폭된 생성물을 제한효소로 절단한 다음 분자량을 측정함으로써 유전변이를 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명은 유전변이를 분석하기 위하여 그 생성물이 제한효소로 절단될 수 있는 부위를 포함하도록 원하는 염기서열을 증폭하되 아래의 그림과 같은 구조의 단편을 만들도록 하고, 증폭된 생성물을 제한효소로 절단한 다음 분자량을 측정함으로써 유전변이를 분석하는 방법을 제공한다.

5'

프라이머결합서열1

제한효소인지서열1

프라이머결합서열2

변이전서열

변이서열

변이후서열

프라이머결합서열3

제한효소인지서열2

프라이머결합서열4

3'

'제한효소인지서열'은 제한효소에 의해 인지되는 서열로서 절단되는 서열과 일치하지 않을 수 있다. 예를 들어, EcoR1에 의해 인지되는 서열은 GAATTC로서 절단되는 위치와 동일하고 계단형으로 절단된다. Fsp1에 의해 인지되는 서열은 TGCGCA로서 역시 절단되는 위치와 동일하고 일자형으로 절단된다. 한편, Fok1 과 BstF5I에 의해 인지되는 서열은 GGATG 이나 절단되는 위치는 인지서열의 3'말단으로부터 각각 9번째/13번째와 2번째/0번째 염기의 다음이다. 5'쪽의 제한효소인지서열1과 3'쪽의 제한효소인지서열2는 동일한 제한효소가 인지하는 서열일 수도 있지만 서로 다른 제한효소가 인지하는 서열일 수도 있다.

PCR증폭에 사용하는 두 프라이머 중 하나는 프라이머결합서열1, 제한효소인지서열1 그리고 프라이머결합서열2로 이루어져 있으며, 나머지 하나의 프라이머는 프라이머결합서열4, 제한효소인지서열2 그리고 프라이머결합서열3으로 이루어져 있다.

4개의 프라이머결합서열은 주형이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 서열이지만, 2개의 제한효소인지서열은 주형과 상보적이지 않을 수도 있다. 프라이머결합서열 1과 4의 염기의 수는 4개 이상이어야 하나, 바람직하게는 15개에 이상 30개 이하이어야 한다. 프라이머결합서열 2와 3의 염기의 수는 4개 이상 13개 이하이어야 한다. 바람직하게는 8개의 염기를 가지고 있는 것이 좋다. '변이전서열'은조사하고자 하는 염기변이의 5'쪽의 서열이며, 염기의 수는 0 ~ 31 개이어야 한다. '변이서열'은 조사하고자 하는 염기의 변이에 해당하는 서열이다. 염기의 치환, 삽입, 결실이 일어날 수 있는데, 염기의 수는 1개인 것이 보통이나 2개 이상인 경우도 있다. '변이후서열'은 변이서열의 3'쪽의 서열로서 염기의 수는 0 ~ 31 개이어야 한다.

변이전서열과 변이후서열을 합하여 1개의 염기 이상이어야 하고, 제한효소 절단 후 생성되는 단편은 변이서열을 포함하고 있어야 하며, 단편의 염기의 수는 2 ~ 32 개 이어야 한다. 바람직하게는 12개의 염기를 가지는 것이 좋다.

실시예1. 인간의 MTHFR(Methylene tetrahydrofolate reductase) 유전자의 1305번째 염기서열의 변이

1. PCR 증폭과 제한효소 절단.

주형이 되는 DNA(Template DNA)는 다음과 같은 서열을 갖는다(5'→3').

GGAGCTGACCAGTGAAGAAAGTGTCTTTGAAGTCTTtGTTCTTTACCTCTCGGGAGAACCAAACCGGAAT(서열목록 1)

밑줄친 서열들은 아래의 프라이머1과 2가 결합하는 부위들이다. 소문자로 표기된 염기는 '변이서열'이다. PCR증폭을 위한 프라이머는 다음과 같다.

프라이머 1. 5'-GGAGCTGACCAGTGAAGAggatgAGTGTCTT-3'(31mer)(서열목록 2)

프라이머 2. 5'-ATTCCGGTTTGGTTCTCCggatgGAGAGGTA-3'(31mer)(서열목록 3)

소문자로 표기된 서열은 Fok1의 인지서열이다.

먼저, PCR buffer(1x), MgSO₄2mM , Enhancer buffer 1x , dNTP 200uM , Platinum Taq Polymerase(Invitrogen, 10966-026) 0.315U, 프라이머 1, 2 각각 0.5uM , 지놈DNA 45ng 을 넣고 총반응액의 부피를 18ul로 만든다. 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행한다.

94℃ 2분,

94℃ 15초 - 55℃ 15초 - 72℃ 30초 (10 cycles),

94℃ 15초 - 60℃ 15초 - 72℃ 30초 (35 cycles)

지놈DNA는 혈액으로부터 추출하며 통상적인 방법에 따라 순수 분리한다. 예를 들어, SDS/단백질분해효소K'방법을 사용할 수 있다.(Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) 또는 QIAamp DNA Mini Kit 250(Qiagen 51106) 을 사용하여 혈액으로부터 DNA를 분리할 수 있다. DNA의 농도가 낮을 경우 다음과 같은 방법으로 DNA를 농축하여 사용할 수 있다. DNA 용액에 1/10 부피의 3M Sodium acetate (pH 5.3)과 2.5 부피의 에탄올을 넣고 부드럽게 섞은 다음 - 20℃ 에서 1시간 이상동안 방치한다. 4℃ , 13000 rpm 에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 70% 에탄올을 넣고 4℃ , 13000 rpm 에서10분 동안 원심분리한다. 에탄올을 건조시킨 다음 원하는 부피의 증류수를 넣어 녹인다.

PCR 반응을 통해 얻어지는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').

GGAGCTGACCAGTGAAGAAggatgGTGTCTTTGAAGTCTTNGTTCTTTACCTCTCcatccGGAGAACCAAACCGGAAT(서열목록 4)

CCTCGACTGGTCACTTCTTcctacCACAGAAACTTCAGAANCAAGAAATGGAGAGgtaggCCTCTTGGTTTGGCCTTA(서열목록 5)

위의 서열에서 볼드체로 표시된 부위는 Fok1에 의해 인지되는 서열이고, 밑줄친 부위는 제한효소의 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 'N'으로 표기된 염기는 '변이서열'이다. 또 소문자로 표시되 catcc는 볼드체로 표기된 gtagg 의 상보적 서열로서 Fok1에 의해 인지되는 서열 중 한쪽 가닥이다. 즉 볼드체를 포함하여 소문자로 표기된 두 가닥이 한 쌍을 이루어 효소의 인지서열이다. 위 반응물에 NEB buffer#4 1x , Fok(NEB R109L) I 1 U , Platinum Taq Antibody(Invitrogen 10965-028) 1U , Sigma water를 넣은 용액 10ul 을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절편을 얻는다.

2. 정제 및 탈염

제한효소를 처리한 위의 용액으로부터 DNA절편을 순수분리한 다음 분자량을 측정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Nucleave Genotyping Kit(variagenics, USA) 를 사용할 수 있다. 먼저, 제한효소 반응액에 Conditioning reagent (1M TEAA) 70ul를 넣어 1분간 둔다. Sample Preparation Plate 에 conditioning reagent 70ul 와 위의 혼합액 90ul를 차례로 넣어 column 을 통과한 후에 Wash Reagent (0.1M TEAA) 85ul를 5차례 완전히 통과시킨다. Sample Preparation Plate 를 1000 rpm에서 5분간 원심분리한다. Collection Plate 위에 Sample Preparation Plate 을 위치시키고 Elution Reagent (60% isopropanol) 60ul을 넣어 통과시킨다.용출액이 Collection plate에 모아지면 Collection Plate를 115 ℃ 에서 75분간 건조시킨다.

3. MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리

Collection plate 에 MALDI matrix(22.8 mg ammonium citrate, 148.5 mg hydroxypicolinic acid, 1.12 ml acetonitrile, 7.8 ml H2O) 6ul 를 넣은 후 그 중 4ul 를 MALDI-TOF(Biflex IV, Bruker) 의 Anchor chip plate 에 얹는다. 37 ℃ 에서 30분 동안 건조시키고 실온에 잠시 두어 열을 식힌 후 MALDI-TOF 으로 분석한다. 분석방법은 MALDI-TOF의 매뉴얼을 따른다.

1305 번째 염기(변이서열)가 정상(티민, T)인 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 3138 D과 3158 D 이다(도1 참조).

반면, 변이에 의하여 시토신(C)으로 바뀐 경우 생성되는 절편의 분자량은 각각 3123 과 3174 이다(도2 참조).

실시예2. 인간의 DPYD(dihydropyrimidine dehydrogenase)유전자의 1897번째 염기서열의 염기변이(결실)분석.

Template DNA 의 염기서열은 다음과 같다(5'→3').

5'-ATTGGTGTCAAAGTGTCACTGAACTAAAGGCTGACTTCcCAGACAACGTAAGTGTGATTTAACATCTAAAACAAG(서열목록 6)

3'- TAACCACAGTTTCACAGTGACTTGATTTCCGACTGAAGgGTCTGTTGCATTCACACTAAATTGTAGATTTTGTTC(서열목록 7)

위의 서열에서 밑줄친 부위는 프라이머3 와 4가 각각 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기가 '변이서열'이다.

프라이머 3. 5'- ATTGGTGTCAAAGTGTCAggatgTGAACTAA - 3' (31mer)(서열목록 8)

프라이머 4. 5'- CTTGTTTTAGATGTTAAATCAggatgACTTACGT - 3' (34mer)(서열목록 9)

위의 프라이머에서 소문자로 표시된 부위는 Template DNA에 존재하지 않는 서열로서 Fok1 의 인지서열을 인위적으로 삽입한 것이다. PCR 반응을 포함한 실험방법은 실시예 1과 동일하다.

PCR 을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').

ATTGGTGTCAAAGTGTCAggatgTGAACTAAAGGCTGACTTCNCAGACAACGTAAGTcatccTGATTTAACATCTAAAACAAG(서열목록 10)

GAACCACAGTTTCACAGTcctacACTTGATTTCCGACTGAAGNGTCTGTTGCATTCAgtaggACTAAATTGTACATTTTGTTC(서열목록 11)

위의 서열에서 볼드체로 표시된 부위는 Fok1에 의해 인지되는 서열이고, 밑줄친 부위는 제한효소절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며 'N'으로 표기된 염기가 '변이서열'이다. catcc는 볼드체로 표기된 gtagg 의 상보적 서열로서 Fok1에 의해 인지되는 서열 중 한쪽 가닥이다. 즉 볼드체를 포함하여 소문자로 표기된 두 가닥이 한 쌍을 이루어 효소의 인지서열이다.

1897번째 염기가 정상(시토신, C)인 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 3692.4 D과 3765.4 D 이다(도3 참조).

반면, 변이에 의하여 시토신이 결실된 경우 생성되는 절편의 분자량은 각각 3403.2 와 3436.2 이다(도4 참조).

실시예3. 인간의 DPYD 유전자의 295 ~ 298번째 염기서열의 염기변이(결실)분석

Template DNA 의 서열은 아래와 같다(5'→3').

5'- TCAGAAGAGCTGTCCAACTAATCTTGATATTAAAtcatTCATAGTATTGCAAACAAGGTAAATTCAGATTTA(서열목록 12)

3'- AGTCTTCTCGACAGGTTGATTAGAACTATAATTTagtaGTGTTCATAACGTTTGTTCCATTTAAGTCTAAAT(서열목록 13)

밑줄친 부위는 아래의 프라이머 5와 6이 결합하는 서열이며, 소문자로 표기된 부위는 '변이서열'이다.

PCR 반응을 위한 프라이머는 아래와 같다.

프라이머 5. 5'- AGAAGAGCTGTCCAACTAggatgTCTTGATA - 3'(31mer)(서열목록 14)

프라이머 6. 5'- AATCTGAATTTACCTTGTggatgTGCAATAC - 3'(31mer)(서열목록 15)

프라이머 서열에서 소문자로 표기된 곳은 제한효소의 인지서열이다. PCR 반응을 포함한 실험방법은 실시예 1과 동일하다. PCR 반응 후에 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').

AGAAGAGCTGTCCAACTAggatgTCTTGATATTAAAtcatTCATAGTATTGCAcatccACAAGGTAAATTCAGATT(서열목록 16)

TCTTCTCGACAGGTTGATcctacAGAACTATAATTTagtaGTGTTCATAACGTgtaggTGTTCCATTTAAGTCTAA(서열목록 17)

볼드체로 표기된 부위는 Fok1의 인지서열이고, 밑줄친 부위는 효소절단 후 생성되는 절편의 서열이다. catcc는 볼드체로 표기된 gtagg 의 상보적 서열로서 Fok1에 의해 인지되는 서열 중 한쪽 가닥이다. 즉 볼드체를 포함하여 소문자로 표기된 두 가닥이 한 쌍을 이루어 효소의 인지서열이다. 소문자로 표기된 부위는 결실이 일어나는 변이서열이다.

295-298번째 염기가 결실되지 않고 남아있는 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 3683.4 D과 3804.4 D 이다(도5 참조).

반면, 변이에 의하여 4염기가 결실된 경우 생성되는 절편의 분자량은 각각 2472.6 와 2544.6이다(도6 참조).

실시예4. 인간의 MTHFR 유전자의 1056번째 염기서열의 염기변이

Template DNA 의 염기서열은 다음과 같다.

5'-CATCCTCACCCAGGCGTCCCCTACCCTGGGCTCTCAGcGCCCACCCCAAGCGCCGAGAGGAAGATGTACGTCC(서열목록 18)

위의 서열에서 밑줄친 부위는 아래의 프라이머 7과 8이 각각 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기가 '변이서열'이다.

프라이머 7. 5'- CATCCTCACCCAGGCGTCGGATGCCTACCCT - 3' (31mer)(서열목록 19)

프라이머 8. 5'- GGACGTACATCTTCCTCTGGATGGGCGCTTG - 3' (34mer)(서열목록 20)

위의 프라이머에서 소문자로 표시된 부위는 Fok1 의 인지서열이다. PCR 반응을 포함한 실험방법은 실시예 1과 동일하다.

PCR 을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').

CATCCTCACCCAGGCGTC ggatgCCTACCCTGGGCTCTCAGNGCCCACCCCAAGCGCCcatccAGAGGAAGATGTACGTCC(서열목록 21)

GTAGGAGTGGGTCCGCAGcctacGGATGGGACCCGAGAGTCNCGGGTGGGGTTCGCGGgtaggTCTCCTTCTACATGCAGG(서열목록 22)

위의 서열에서 박스로 표시된 부위는 Fok1에 의해 인지되는 서열이고, 밑줄친 부위는 제한효소절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며 catcc는 볼드체로 표기된 gtagg 의 상보적 서열로서 Fok1에 의해 인지되는 서열 중 한쪽 가닥이다. 즉 볼드체를 포함하여 소문자로 표기된 두 가닥이 한 쌍을 이루어 효소의 인지서열이다. 'N'으로 표기된 염기가 '변이서열'이다.

1056번째 염기가 정상(시토신, C)인 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 3992 D과 4152 D 이다(도7 참조).

반면, 변이에 의하여 티민인 경우 생성되는 절편의 분자량은 각각 4006 와 4136 이다(도8 참조). 아래의 그림은 한 쌍의 염색체 중 하나는 정상, 또 다른 하나는 변이를 보이고 있는 경우의 결과이다.(헤테로)

본 발명은 기존의 염기변이 분석방법이 가지고 있었던 오류에 의한 잘못된 분석과 삽입 및 결실의 검사 불가능의 문제를 해결하였다.

Claims

a) 프라이머결합서열1, 제한효소인지서열1, 및 프라이머인지서열2로 구성된 프라이머; 및

b) 프라이머결합서열4, 제한효소인지서열2, 프라이머결합서열3으로 구성된 프라이머로 구성된 염기변이 분석용 프라이머
제 1 항에 있어서,

상기의 프라이머결합서열1 및 결합서열4의 염기 수는 4-30인 것을 특징으로 하는 염기변이분석용 프라이머.
제 1 항에 있어서,

상기의 프라이머결합서열2 및 3의 염기 수는 4-13인 것을 특징으로 하는 염기변이분석용 프라이머.
제 1 항에 있어서,

상기의 a) 프라이머는 서열목록2,8,14, 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머이고, 상기의 b)프라이머는 서열목록3, 9, 15 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머임을 특징으로 하는 염기변이분석용 프라이머.
a) 제 1 항의 프라이머를 사용하여 PCR 결과물이 제한효소로 절단될 수 있는 부위를 포함하도록 원하는 염기서열을 증폭하되 제한효소에 의해 절단된 단편의 염기의 수가 32개 이하가 되도록 하고 그 중 적어도 1개의 염기는 프라이머가 아닌 주형(template)의 복제에 의해 생성되도록 증폭하는 단계;

b) 증폭된 생성물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

c) 상기의 절단된 절편을 분자량을 측정하여 정상과 비교하는 단계를 포함하는 유전변이 분석 방법