KR102486630B1 - 중합효소연쇄반응을 기반으로 한 표적 점 돌연변이의 검출 방법 - Google Patents

중합효소연쇄반응을 기반으로 한 표적 점 돌연변이의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응을 기반으로 한 표적 점 돌연변이의 검출방법에 관한 것이다.

Description

중합효소연쇄반응을 기반으로 한 표적 점 돌연변이의 검출 방법 {Method of detecting of target point mutations based on polymerase chain reaction}
본 발명은 중합효소연쇄반응을 기반으로 한 표적 점 돌연변이의 검출방법에 관한 것이다.
유전자 상에 많이 존재하는 유전적인 변이는 암, 다발성 경화증 및 자가 면역 질환을 비롯한 다양한 질병의 많은 부분과 관련이 있다. 이로 인해 유전자 다형 검출은 개인 맞춤형 의료(Personalized Medicine)에 있어 필수적이다.
유전적 변이에는 치환, 결실, 삽입, 반복 등이 있다. 그 중에서 가장 많은 부분을 차지하는 것은 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)에 의한 점 돌연변이(Point mutation)이며, 약 1000개의 염기서열 당 1개의 확률로 발생한다.
이러한 점 돌연변이를 검출하기 위하여, 종래 수많은 점 돌연변이 분석 방법이 고안되어 왔는데, 대표적으로, allele-specific PCR 방법(예를 들어, 미국특허 제 5,639,611호 및 제 5,496,699), Taqman™ 프로브를 이용한 방법(예를 들어, 미국 특허 제 5,538,848호 및 제 6,326,145호) 및 차세대 염기서열 분석 방법(Ronaghi, Mostafa, et al. "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical biochemistry 242.1 (1996): 84-89.) 등이 있다.
그러나, 현재 가장 많이 활용되는 차세대 염기서열 분석 방법은 한번에 넓은 영역을 분석할 수 있다는 장점이 있지만, 적은 빈도의 점 돌연변이 유전자를 검출하는데 있어 민감도가 떨어지며, 검사 기간이 길고 비싼 비용이 발생하는 한계점이 존재한다.
따라서, 특이도와 민감도가 높은 새로운 점 돌연변이 분석 방법이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
한편, 단일염기서열변이(SNP, Single Nucletide Polymorphism)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열이 치환되어 나타나는 유전적 변이로, 병의 원인 또는 치료제에 대한 반응 등 사람마다 개인차를 가져온다. 단일염기서열변이의 검출과 확인은 맞춤의약 뿐만 아니라 신약개발에도 연결되기 때문에 관심이 집중되고 있다.
따라서, 단일염기서열 변이의 신속한 검출을 위해서 실시간 PCR 기술을 응용한 다양한 검출 방법이 사용되고 있으며, 대표적으로, DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 분석하는 방법, DNA 프로브를 이용하는 방법, 또는 PNA 프로브를 이용하는 방법 등이 있다.
하지만 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용함에 있어 제약을 가지며, 융해곡선을 분석하기 위한 프로그램 사용해야 한다는 단점을 가져 (Kirk M. Ririe et al., Analytical Biochemistry 245:154, 1997; U. Hladnik et al., Clin Exp Med, 2:105, 2002), 여전히 특이도와 민감도가 높은 새로운 점 돌연변이 분석 방법이 지속적으로 요구된다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 점 돌연변이를 구분하는 헤어핀 형태의 프라이머를 이용 시 타겟에 선택적으로 증폭을 할 수 있고, 프로브를 이용하여 타겟에 맞는 싱글만을 확인하여 점 돌연변이를 선택적으로 구분할 수 있다는 점에 착안하여, 이러한 검출 방법이 종래 방법 대비 특이도와 민감도를 증진시키고, 보다 낮은 비용으로 신속하게 점 돌연변이를 분석할 수 있으며, 나아가 SNP를 구분 또는 진단을 위한 시약이나, 암이나 바이러스와 같은 다양한 분자 진단 시장에서 효과적으로 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료; (b) 점 돌연변이를 구분하는 헤어핀 프라이머; (c) 표적 점 돌연변이에 결합하는 프로브; (d) 상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및 (d) DNA 중합효소를 포함하는, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료; (b) 점 돌연변이를 구분하는 헤어핀 프라이머; (c) 표적 점 돌연변이에 결합하는 프로브; (d) 상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및 (d) DNA 중합효소를 포함하는, 표적 점 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물 또는 키트를 포함하는, SNP 구분 또는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료, 점 돌연변이를 구분하는 헤어핀 프라이머, 표적 점 돌연변이에 결합하는 프로브, 상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머 및 중합효소를 포함하는 조성물을 반응시켜, 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료를 증폭하는 단계; 및 상기 프로브의 형광 수치를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 점 돌연변이 검출방법을 제공하는 것이다.
본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
아울러, 본원의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제1양태는 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료; 상기 표적 점 돌연변이 영역을 구분하는 헤어핀 프라이머; 상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하는 프로브; 상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및 DNA 중합효소를 포함하고, 상기 헤어핀 프라이머는 상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하여 헤어핀 구조가 펴지는, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 제2양태는 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료; 상기 표적 점 돌연변이 영역을 구분하는 헤어핀 프라이머; 상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하는 프로브; 상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및 DNA 중합효소를 포함하는, 표적 점 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 제3양태는 상기 조성물 또는 키트를 포함하는, SNP 구분 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료”는 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하는 것으로, 표적 점 돌연변이 영역을 포함하고 있는 핵산서열을 말한다. 상기 표적 적 돌연변이 영역을 포함하는 시료는 본 명세서에서 “표적 서열”, “타겟 서열”, “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열”, “표적 시료” 또는 “표적 핵산”과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용될 수 있다.
상기 시료는 gDNA 또는 cfDNA 서열일 수 있으며, 상기 gDNA는 gDNA 내 점 돌연변이 위치를 타겟으로 하는 것일 수 있고, 상기 cfDNA는 cfDNA 내 ctDNA를 타겟으로 하는 것일 수 있으나, 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 서열이면, 상기 시료에 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 “점 돌연변이”는 유전자 서열 중 한 개의 염기가 바뀌어 생기는 돌연변이를 의미하는 것으로서, 상기 시료의 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “프라이머”는 DNA 합성 시 주형에 상보적인 또 하나의 중합체 가닥이 만들어지는 개시점이 되는 짧은 유전자 서열을 의미하는 것으로, 즉 중합체 합성의 초기에 필요한 약 10 내지 22개의 염기로 이루어진 짧은 절편을 말한다.
상기 본 발명의 조성물은 시료 내 표적 점 돌연변이 영역의 검출을 위하여 2개의 프라이머를 포함하고 있는데, 하나는 헤어핀 구조의 헤어핀 프라이머과 하나는 리니어(linear) 형태의 리니어 프라이머이다.
상기 “헤어핀 프라이머”는 헤어핀 구조의 프라이머를 의미하는 것으로서, 상기 헤어핀(hairpin) 구조는 이름에서 구조적 형태를 유추할 수 있듯이 단일 가닥의 RNA 또는 DNA의 상보적 역 반복서열 간에 수소결합으로 생긴 줄기 부분과 루프 형태를 하고 있는 고리 부분을 가진 구조를 말한다.
본 발명에서 상기 헤어핀 프라이머는 상기 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 표적 시료 내에서 표적 점 돌연변이 영역을 구분하는 역할을 하는 프라이머로서, 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역이 존재할 때에는 헤어핀 구조의 줄기 부분이 완전히 펴져 신장이 되나, 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역이 존재하지 않을 시 헤어핀 구조의 줄기 부분이 완전히 펴지지 않아 신장이 되지 않거나 아주 미비하게 되는 점이 특징이다.
상기 헤어핀 프라이머는 DNA, LNA 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있으며, 구체적으로는 LNA일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
상기 LNA는 Locked Nucleic Acid를 의미하는 것으로서, DNA 5탄당에서 2번 산소와 5번 탄소에 메틸렌 브릿지(methylene bridge)를 만들어 자체 녹는점을 높여 주는 것으로, 짧은 올리고(oligo) 서열에서도 특이도를 높일 수 있는 것이 특징이며, 구체적으로는 하기 구조식 1을 가진다.
[구조식 1]
Figure 112020141236609-pat00001
또한, 상기 PNA는 Peptide Nucleic Acid를 의미하는 것으로서, DNA의 포스페이트 리보스 백본을 아미노기 치환시켜 PNA는 DNA에 비해 화학적 생물학적 열적 안정성을 가지는 것이 특징으로 하기 구조식 2를 가진다.
[구조식 2]
Figure 112020141236609-pat00002
상기 “리니어 프라이머”는 용어 그대로 특정 구조가 아닌 일반적인 리니어 형태의 프라이머로서, 상기 헤어핀 프라이머에 의해 새로운 가닥이 extension되어 생성된 새로운 가닥에 다시 결합하는 프라이머를 말하고, 이 때 프로브를 분해하는 것이 특징이며, 보다 구체적으로는 프로브가 새로운 가닥에 결합한 후 신장이 진행되면서 프로브를 분해하는 것이 특징이다.
본 발명의 용어, “프로브(probe)”는 DNA 또는 RNA의 특정 염기 서열에 상보적인 절편 또는 단편으로, 방사선 원소 또는 형광으로 표지된 말단 염기를 지니는 DNA 또는 RNA 절편을 말하고, 핵산 탐침이라고도 한다. 대개 10 내지 1000bp 정도 길이로 다양하며, DNA 또는 RNA 샘플 내의 특정 뉴클레오티드 서열을 찾기 위한 상보적인 서열을 갖는다.
본 발명에서 상기 프로브는 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역의 서열과 결합할 수 있는 상보적인 서열에 결합하는 것으로, 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료가 헤어핀 프라이머에 의해 신장된 후, 이후 리니어 프라이머가 새로운 가닥에 결합 시 상기 프로브가 함께 결합하며, 이후 연장이 되면서 프로브가 DNA 중합효소에 의해 분해되고 형광 값을 측정할 수 있게 된다.
이에 따라 본 발명의 프로브 또한 방사선 원소 또는 형광으로 표지된 말단 염기를 지니며, 구체적으로는 방사선 동위원소 또는 biotinylated uridine같은 화학물질로 표지되어 있어 표적 염기서열에 부착된 프로브를 검출할 수 있다. 비오틴이 표지된 프로브는 형광색소나 효소로 표지된 아비딘이나 스트렙타비딘 분자와 반응한 후 간접면역형광이나 효소면역측정 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 용어, “DNA 중합효소(DNA polymerase)”는 DNA 사슬에 뉴클레오타이드를 연결하면서 새로운 DNA를 합성하는 효소를 말하는 것으로, DNA를 주형으로 하여 DNA를 합성하는 효소는 DNA 의존 DNA 중합효소를 말한다.
상기 DNA 중합효소는 특별히 제한되지는 않으나, 일 예로 리니어 프라이머와 함께 프로브가 새로운 가닥에 결합 시 프로브를 분해하면서 형광 수치를 측정할 수 있도록, 말단분해활성(exonuclease)을 가지는 것일 수 있다.
또한, 다른 일 예로, 상기 DNA 중합효소는 인터컬레이팅 형광을 사용하는 경우 말단분해활성을 가지지 않을 수 있다.
상기 표적 점 돌연변이 검출용 조성물은 TMAC(Tetramethylammonium chloride)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “TMAC(Tetramethylammonium chloride)”는 염화테트라메틸암모늄으로, 하기 구조식 3을 가지며, 분자식은 C4H12ClN이고, 분자량은 110, 밀도는 1.17 g/cm3인 흰색 결정을 가지는 물질을 말한다. 상기 TMAC는 특별히 제한되지는 않으나, 0 내지 100mM의 농도로 사용할 수 있다.
[구조식 3]
Figure 112020141236609-pat00003
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 점 돌연변이 유무에 따른 증폭산물의 기작을 확인하였으며, 특히, 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역이 있을 경우, 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료; 상기 표적 점 돌연변이 영역을 구분하는 헤어핀 프라이머; 상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하는 프로브; 상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및 DNA 중합효소를 모두 포함하는 조성물을 이용하면, 추가 실험 없이 상기 조성물만으로도 신속하고 정확하게 표적 점 돌연변이 영역의 유무를 검출할 수 있음을 확인하였다. 특히 헤어핀 프라이머 LNA가 다른 종류의 헤어핀 프라이머 대비 정확하고 신속하게 표적 점 돌연변이 영역의 유무를 확인하였다.
또한, 분 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는, 상기 조성물에 TMAC를 추가로 포함할 경우, TMAC 농도를 5 내지 20mM 로 증가시켰을 때, 변이체 및 야생형의 Ct 값은 농도가 높아질수록 야생형의 Ct 값이 더 많이 높아지는 것을 확인하여, 특이성(specificity)의 측정 기준인 △Ct 값이 더 커지는 것을 확인할 수 있었다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제4양태는 (1) (a) 표적 점 돌연변이 영역을포함하는 시료를 변성(denaturation)하는 단계; (b) 상기 표적 점 돌연변이 영역에 헤어핀 프라이머가 결합하여 상기 헤어핀 프라이머의 헤어핀 구조가 펴지고, 상기 헤어핀 프라이머에서 새로운 가닥이 신장되고, 핵산이 다시 변성되는 단계; (c) (b)에서 변성된 시료에 리니어 프라이머 및 프로브가 결합하는 단계; 및 (d) 상기 리니어 프라이머 및 DNA 중합효소가 시료에 결합된 상기프로브를 분해하는 단계를 포함하는 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료를 증폭하는 단계; 및 (2) 분해된 상기 프로브의 형광 수치를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 점 돌연변이 검출방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 표적 점 돌연변이 검출방법은 중합효소연쇄반응(PCR)을 토대로 한 방법이다.
상기 “표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료”, “점 돌연변이”, “헤어핀 프라이머”, “리니어 프라이머”, “프로브” 및 “중합효소”는 상기에서 설명한 바와 같다.
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본 발명의 용어, “중합효소연쇄반응”은 2개의 프라이머 사이에 낀 DNA 부분을 시험관내에서 대량으로 증폭시킬 수 있는 방법으로, DNA 합성효소(DNA　polymerase)가　DNA 합성에 프라이머를 필요로 하는 데, 이 프라이머에서 5′→ 3′방향으로　DNA가 합성하는 것을 이용하여, ①　DNA의 외가닥에의 변성 → ② 프라이머의 결합 → ③ 중합효소에 의한 상보성 DNA의 합성 → ① 변성 → ② 프라이머의 결합···이라는 회로를 반복하여 목적하는　유전자　영역만을 시험관 내에서 증식시키는 방법을 말한다.
본 발명의 검출방법은 상기 중합효소연쇄반응을 기반으로 하고 있는 것으로서, 상기 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료를 변성하고, 이후 헤어핀 프라이머가 결합하여 신장하고, 이후 다시 변성하여 리니어 프라이머 및 프로브가 결합한 후 신장되면서 프로브가 분해되어 형광수치가 측정되는 원리로 표적 시료 내 점 돌연변이를 검출할 수 있다.
상기 변성은 일반적인 PCR 방법에서 사용되는 조건과 유사하며, 구체적으로는 90 내지 99 ℃에서 10초 내지 3분 수행할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
또한, 상기 프라이머 결합 및 신장되는 구체적인 조건 또한 PCR의 방법에서 사용되는 조건과 유사하며, 구체적으로는 55 내지 70 ℃에서 10초 내지 60초, 보다 구체적으로는 55 내지 65 ℃에서 10초 내지 40초 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
상기 형광수치를 측정하는 것은 형광으로 표지된 프로브의 말단 염기에서 발광하는 형광수치를 측정하는 것을 말하는 것으로서, 표적 시료 내 점 돌연변이가 있을 경우에만 헤어핀 프라이머에 의해 신장되어 원활하게 증폭산물이 생성됨으로써, 형광수치가 측정되게 된다. 반면, 표적 시료 내 점 돌연변이가 없을 시에는 헤어핀 프라이머가 완전히 펴지지 않아 원활히 증폭산물이 생성되지 않고, 이로 인해 프로브가 결합되지 못하여 형광수치의 측정이 불가하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 점 돌연변이 유무에 따른 증폭산물의 기작을 확인하였으며, 특히, 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역이 있을 경우, (a) 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료를 변성, 상기 시료 내 표적 점 돌연변이 영역에 헤어핀 프라이머가 결합하여 신장하고, 시료를 다시 변성하여 리니어 프라이머 및 프로브를 결합시키고 중합효소에 의해 상기 결합된 프로브가 분해되면서 프로브의 형광수치를 측정함으로써, 표적 시료 내 표적 점 돌연변이 영역을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 각 표적 점 돌연변이의 종류에 따라 디자인된 프라이머를 이용하여 다중 표적을 한 번의 반응으로 동시에 분석할 수 있고, 또한 추가적인 실험 없이 중합효소연쇄반응 조성물만으로 정확하고 신속하게 점 돌연변이의 유무를 확인할 수 있어, SNP를 구분 또는 진단을 위한 시약이나, 암이나 바이러스와 같은 다양한 분자 진단 시장에서 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 표적 점 돌연변이 검출을 위한 중합효소 연쇄반응의 조성물을 나타낸다.
도 2는 표적 점 돌연변이 유무에 따른 증폭산물의 기작을 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)는 표적 점 돌연변이 타겟이 있을 경우, 점 돌연변이와 상보적인 염기를 갖는 증폭 산물 기작을 나타내고, (b)는 표적 점 돌연변이 타겟이 없을 경우 증폭 산물이 생성되는 기작을 나타낸다.
도 3은 점 돌연변이 유무에 따른 검출 방법을 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)는 프로브가 폴리머레이즈 엑소뉴클레이즈 기능으로 분해되는 것을 나타내고, (b)는 점 돌연변이를 구분하는 방법에 대해 나타낸다.
도 4는 중합효소 연쇄반응의 열순환 과정을 나타낸 것으로, 각 과정의 온도 및 시간은 최적 조건에 맞도록 조정될 수 있다.
도 5는 본 발명의 헤어핀 형태의 프라이머의 검출 능력을 확인한 것이다. 구체적으로, (a) 및 (b)는 각각 헤어핀 형태가 아닌 프라이머와 헤어핀 형태의 프라이머로 점 돌연변이가 없는 타겟의 Ct값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 프라이머 내 헤어핀 형태의 유무에 따른 Ct 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 헤어핀 프라이머 종류에 따른 Ct 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 TMAC 농도 증가에 따른 변이체 및 야생형에서의 Ct 값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 TMAC 농도 증가에 따른 야생형의 Ct 값 증가를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 표적 점 돌연변이 유무에 따른 증폭산물 생성 기작 확인
먼저, 표적 점 돌연변이 유무에 따른 증폭산물 생성 기작을 확인해 보았으며, 구체적인 단계는 도 2와 같다.
구체적으로, 도 2 (a)는 점 돌연변이가 존재할 경우의 증폭산물 생성기작을 나타나는 것으로서, 1에서 점 돌연변이(빨간색)를 포함하는 시료를 98 ℃에서 변성하였다. 이 후, 2에서 64 ℃에서 상기 변성된 가닥에 위치한 점 돌연변이와 상보적인 서열을 가지는 프라이머 1을 결합시켰다. 또한, 3에서 64℃에서 프라이머가 결합된 후 신장되어 점 돌연변이와 상보적인 염기(주황색)가 신장되었다. 이 후, 이 가닥을 다시 98℃에서 변성하였다. 4에서 64℃에서 점 돌연변이와 상보적인 염기를 가진 가닥에 프라이머 2를 결합시키고, 5에서 64℃에서 프라이머 2가 중합효소와 합께 가닥이 신장되어, 6에서 점 돌연변이와 상보적인 염기를 갖는 타겟이 증폭되는 것을 확인하였다.
다음으로, 도 2 (b)는 점 돌연변이가 없는 wild type의 표적에서의 증폭산물 생성 기작을 나타낸 것으로, 1은 점 돌연변이를 포함하지 않는 가닥을 표현한 것이고, 이 가닥을 98 ℃에서 변성하였다. 2는 상기 변성된 가닥에 64 ℃에서 프라이머가 결합한 것을 표현한 것이며, 3은 64 ℃에서 결합된 프라이머에 의해 신장된 산물을 나타낸다. 이 산물을 다시 98 ℃에서 변성시킨 후, 4에서 상기 3에서 생성된 가닥에 프라이머 2를 결합하고 5에서 64℃에서 프라이머 2에 의해 점 돌연변이를 갖고 있지 않은 타겟이 생성되는 기작을 나타내었으며, 이 후 6에서 점 돌연변이를 갖고 있지 않는 타겟이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
이로써, 점 돌연변이를 포함할 때와 포함하지 않을 때 어떻게 프라이머에 의해 증폭산물이 생성되는지 그 기작을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 본 발명의 조성물을 이용한 표적 점 돌연변이 유무에 따른 검출 여부 확인
먼저, 본 발명의 표적 점 돌연변이 검출용 조성물의 구성을 도 1에 나타내었다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 (a) 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료; (b) 점 돌연변이를 구분하는 헤어핀 프라이머(Hairpin pimrer); (c) 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; (d) 표적 점 돌연변이에 결합하는 프로브(probe) 및 (e) 중합효소(polymerase)를 포함한다.
상기 조성물을 이용한 표적 점 돌연변이 유무에 따른 검출 여부를 확인하였으며, 구체적인 과정은 도 3에 나타내었다.
구체적으로, 본 발명의 조성물을 이용한 표적 점 돌연변이 유무에 따른 검출 여부를 확인하는 방법 또한, 상기 실시예 1을 토대로 하고 있으며, 그 중 도 2 (a)의 1과 2는 동일하다. 이후, 도 3 (a)의 3에서 생성된 점 돌연변이와 상보적인 염기를 갖는 가닥에, 도 3 (a)의 4에서, 리니어 프라이머 및 프로브를 결합시키고, 도 3 (a)의 5에서, 상기 프로브가 중합효소의 exonuclease 기능에 의해 분해되고, 상기 프로브가 결합한 뒤 분해되면, 도 3 (a)의 6에서 확인할 수 있듯이, 프로브의 형광값을 확인할 수 있다.
반면, 점 돌연변이가 존재하지 않을 경우, 도 3의 (b)에서 확인할 수 있듯이, 도 3의 (b) 3)에서와 같이, 헤어핀 프라이머는 프라이머의 3' 말단 서열과 점 돌연변이를 갖고 있지 않은 서열과 상보적이지 않아, 헤어핀 구조의 줄기 부분이 완전히 펴지지 않게 되고, 이로써 신장되지 않는 것을 확인하였다.
다만, 이 경우에도 일부 타겟이 신장되고(도 3의 (b) 4 참조), 도 3 (b)의 4 내지 6에서 확인할 수 있듯이, 가닥이 일부 신장되어 리니어 프라이머가 결합은 하지만 프로브는 결합하지 못하게 되어, 중합효소에 의해 새로운 가닥이 신장된다 하더라도 프로브가 결합하지 못함으로써 형광값을 측정할 수 없었다.
상기 실시예 1 및 2를 종합하면, 본 발명의 조성물을 이용 시 표적 시료 내 점 돌연변이를 포함 시에는 헤어핀 구조의 프라이머가 완전히 펴져 신장됨으로써 새로운 가닥이 형성되고, 여기에 리니어 프라이머와 프로브가 결합한 후 이후 중합효소에 의해 프로브가 분해되면서 형광값을 측정함으로써, 표적 시료 내 점 돌연변이의 유무를 단 하나의 실험만으로도 효과적이고 신속하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 본 발명의 검출방법에서 중합효소연쇄반응의 열순환 과정 및 헤어핀 구조의 프라이머 검출 능력 확인
본 발명의 검출방법에서 중합효소연쇄반응의 열순환 과정의 구체적인 조건을 확립하고, 헤어핀 구조의 프라이머 검출 능력을 확인해 보았다.
구체적으로, 도 4에서 본 발명의 중합효소연쇄반응의 열순환 과정을 온도와 시간을 기준으로 나타냈으며, denaturation은 98 ℃에서 2분을 수행 후 이후 10초를 더 수행하고, 이후 annealing 및 extension은 64 ℃에서 20초 정도 수행하였을 때 효과적인 것을 확인하였다.
다음으로, 프라이머를 헤어핀 구조로 제조하였을 때와 그러한 구조를 가지지 않았을 시의 점 돌연변이 확인 정도에 있어 어느 정도 차이가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 도 5의 (a)에 사용된 프라이머는 헤어핀 형태를 만들지 않은 리니어(Linear)한 형태의 프라이머를 사용하였으며, 도 5의 (b)에 사용된 프라이머는 프라이머 내에 역반복 서열을 추가해 헤어핀 형태로 만든 뒤 PCR 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 5의 (a)서 확인할 수 있듯이, 프라이머를 헤어핀 형태로 제조하지 않은 프라이머로 점 돌연변이가 없는 타겟을 측정한 Ct(threshold cycle, C(T), Ct) 값은 32로 측정된 반면, 도 5의 (b)에서 확인할 수 있듯이, 프라이머를 헤어핀 형태를 제조하여, 점 돌연변이를 보다 더 잘 구분할 수 있도록 만든 헤어핀 프라이머의 경우는 점 돌연변이가 없는 타겟의 Ct 값이 40으로 측정되는 것을 알 수 있었다. qPCR에서 Ct 값이 증가한다는 것은 증폭에 필요한 cycle이 많아진다는 것을 의미하기 때문에, 증폭이 억제되고 있다고 해석될 수 있다. 따라서, 상기 결과로부터 실제로 프라이머 내에 역반복 서열을 추가하여 헤어핀 형태를 만들어주면 Ct 값이 8 증가하므로, 이로써, 프라이머에 역반복서열을 이용하여 헤어핀 형태를 만들어주면 증폭을 256(28)배 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 프라이머 내 헤어핀 형태의 유무에 따른 Ct 값 측정 결과 확인
프라이머 내 헤어핀 형태의 유무에 따른 Ct 값의 변화를 확인하기 위하여, 프라이머에 헤어핀 형태가 있을 때와 없을 때로 나누어, 야생형으로 농도별로 실험을 진행하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 3과 같다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 야생형 농도에 상관 없이, 프라이머에 헤어핀 형태가 있으면 Ct 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, 프라이머에 헤어핀 형태가 있으면 야생형 증폭을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 헤어핀 프라이머 종류에 따른 Ct 값을 확인해 보았다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 헤어핀 프라이머 LNA에서 DNA 대비 야생형, 변이형, negative에서 보다 Ct 값이 증가하여 보다 효과적으로 증폭을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: TMAC를 추가로 포함할 때의 Ct 값 측정 결과 확인
본 발명의 표적 점 돌연변이 검출용 조성물에 TMAC를 추가로 포함하였을 때 변이체와 야생형의 Ct 값을 각각 확인해 보았다. 구체적인 실험 방법은 실시예 3과 같다.
그 결과, 도 8 및 도 9에서 확인할 수 있듯이, TMAC 농도를 5 내지 20mM 로 증가시켰을 때, 변이체 및 야생형의 Ct 값은 농도가 높아질수록 야생형의 Ct 값이 더 많이 높아져 특이성(specificity)의 측정 기준인 △Ct 값이 더 커지는 것을 확인할 수 있었으며, 야생형 만을 따로 비교하였을 때도, TMAC 농도가 높아질수록 야생형의 Ct 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료;
    상기 표적 점 돌연변이 영역을 구분하는 헤어핀 프라이머;
    상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하는 프로브;
    상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및
    DNA 중합효소를 포함하고,
    상기 헤어핀 프라이머는 상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하여 헤어핀 구조가 펴지는,
    표적 점 돌연변이 검출용 조성물.

  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 gDNA 또는 cfDNA인 것인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 gDNA 내 상기 표적 점 돌연변이 영역의 위치 또는 cfDNA 내 ctDNA를 타겟으로 하는 것인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 형광물질을 포함하는 것인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적 점 돌연변이 영역은 상기 시료의 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 헤어핀 프라이머는 상기 시료 내에 표적 점 돌연변이가 존재할 경우 증폭산물이 생성되어 이에 결합한 프로브의 형광 값을 측정할 수 있고,
    시료 내에 표적 점 돌연변이가 존재하지 않는 경우 증폭산물의 미생성으로 프로브가 결합되지 않아 프로브의 형광 값을 측정할 수 없는 것이 특징인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 헤어핀 프라이머는 DNA, LNA 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 표적 점 돌연변이 검출용 조성물에 TMAC(Tetramethylammonium chloride)가 추가로 포함될 수 있는 것인, 표적 점 돌연변이 검출용 조성물.
  9. 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료;
    상기 표적 점 돌연변이 영역을 구분하는 헤어핀 프라이머;
    상기 표적 점 돌연변이 영역에 결합하는 프로브;
    상기 프로브를 분해하는 리니어 프라이머; 및
    DNA 중합효소를 포함하는, 표적 점 돌연변이 검출용 키트.
  10. 제1항의 조성물 또는 제9항의 키트를 포함하는, SNP 구분 또는 진단용 조성물.
  11. (1) 하기의 과정을 포함하는 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료를 증폭하는 단계; 및
    (a) 표적 점 돌연변이 영역을 포함하는 시료를 변성(denaturation)하는 단계;
    (b) 상기 표적 점 돌연변이 영역에 헤어핀 프라이머가 결합하여 상기 헤어핀 프라이머의 헤어핀 구조가 펴지고, 상기 헤어핀 프라이머에서 새로운 가닥이 신장되고, 핵산이 다시 변성되는 단계;
    (c) (b)에서 변성된 시료에 리니어 프라이머 및 프로브가 결합하는 단계; 및
    (d) 상기 리니어 프라이머 및 DNA 중합효소가 시료에 결합된 상기 프로브를 분해하는 단계
    (2) 분해된 상기 프로브의 형광 수치를 측정하는 단계를 포함하는,
    표적 점 돌연변이 검출 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    상기 시료는 gDNA 또는 cfDNA인 것인, 표적 점 돌연변이 검출 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 (a)의 변성은 90 ℃ 내지 99 ℃에서 10초 내지 3분 수행되는 것인, 표적 점 돌연변이 검출 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 50 ℃ 내지 70 ℃에서 10초 내지 60초 수행되는 것인, 표적 점 돌연변이 검출 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 (2) 단계는 50 ℃ 내지 70 ℃에서 10초 내지 60초 수행되는 것인, 표적 점 돌연변이 검출 방법.
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