CN109694911B - 一种原发性开角型青光眼的筛查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测人类RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂在制备原发性开角型青光眼的筛查试剂中的用途。本发明还提供了一种青光眼筛查试剂盒，它包含检测人类RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂。
Description
技术领域
本发明涉及SNP领域，特别涉及与青光眼相关的SNP。
背景技术
青光眼是全球常见的且不可逆的严重致盲眼疾病，以视神经损害为主要特征，表现为视神经节细胞凋亡。原发性开角型青光眼疾病(POAG)是最常见的青光眼类型，约占所有青光眼的60％～70％；它又可以被分为高眼压型青光眼(HTG)和正常眼压型青光眼(NPG)。遗传和环境因素都会引起POAG。从遗传的角度讲，单基因突变和多基因突变都会导致POAG。导致POAG的单基因包括MYOC(编码肌纤蛋白)，OPTN(编码视神经蛋白)，WDR36(编码WD重叠结构域36)，TBK1(编码TANK结合激酶1)，和ASB10(编码锚定蛋白重复序列及SOCS盒10)。多基因突变导致POAG基因包括：CAV1-CAV28，TMCO119，CDKN2B-AS19，SIX1-SIX610，ABCA111-13，PMM211，FNDC3B12，AFAP113，GMDS13，TGFBR314，TXNRD215，ATXN215等。原发性开角型青光眼(POAG)发病隐蔽，进行缓慢，常无任何自觉症状，往往不为病人所察觉，且无有效的预防方法。因此早期诊断早期治疗是防治此类青光眼病人视功能进行性损害的有效途径。
但目前尚未见青光眼与RAMP2基因的突变位点的关联。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的原发性开角型青光眼的筛查试剂盒。
首先，本发明提供了一种基因序列，它是在人类RAMP2基因的基础上出现以下四种突变中至少一种得到：
c.160G＞A：编码区第160位碱基G突变成A；
c.338_339insA：编码区第338位和339位碱基之间插入A；
c.427G＞A：编码区第427位碱基G变成A；
c.511A＞C：编码区第511位碱基A变成C。
本发明还提供了检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂在制备青光眼的筛查试剂中的用途；所述突变位点c.117G＞C是RAMP2基因编码区第117位碱基G变成C；所述突变位点c.308T＞C是RAMP2基因编码区第308位碱基T变成C。
前述的用途中，所述的试剂包括检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类RAMP2基因编码区第117、160、308、338、339、427和/或511位碱基的核酸片段的相关试剂。
进一步地，所述检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂为Snapshot试剂。
所述检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂还可以是测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
本发明还提供了一种青光眼的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂。
前述的试剂盒中，所述的试剂除了包括检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂以外；还包括任选的用于扩增包含人类RAMP2基因编码区第117、160、308、338、339、427和/或511位碱基的核酸片段的相关试剂。
前述的试剂盒中，所述检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂为Snapshot试剂。
前述的试剂盒中，所述检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂为测序用试剂或荧光定量PCR试剂。
前述的试剂盒中，所述检测人类RAMP2基因突变位点c.117G＞C、c.160G＞A、c.308T＞C、c.338_339insA、c.427G＞A和/或c.511A＞C的相关试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
本发明首次提出了RAMP2基因的6个突变位点——Glu39Asp(c.117G＞C，rs762732530)、Glu54Lys(c.160G＞A)、Phe103Ser(c.308T＞C，rs1432940883)、Asn113Lysfs*10(c.338_339insA)、Glu143Lys(c.427G＞A)和Ser171Arg(c.511A＞C)与POAG显著相关，其中Glu54Lys(c.160G＞A)、Asn113Lysfs*10(c.338_339insA)、Glu143Lys(c.427G＞A)和Ser171Arg(c.511A＞C)等4个突变是首次被发现。
染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点，SNP在人群中大多只有两种等位型，故亦称为双等位标记，其检测是一种“+/-”或“全/无”的检测方式。SNP的检测方法多种多样，可分为测序法、杂交法、溶解法、电泳法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法，这些方法均是检测核苷酸变异的常规实验手段。本发明公开的RAMP2基因的突变位点，用现有检测核苷酸变异的方法均可以检测上述两个位点的多态性。
本发明涉及的上述SNP检测方法以人的基因组DNA为对象，样品没有限制，如体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。表明本发明易于实现。
本发明可以有效地检测原发性开角型青光眼相关的6种基因突变。
本发明除了可以应用在原发性开角型青光眼疾病辅助性诊断和个体原发性开角型青光眼疾病抗性的评估中，还为青光眼治疗的分子靶向药物的开发提供了新的启迪。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1是6个SNP位点杂合突变测序图：图中箭头所指为突变位点；a，c.117G＞C；b，c.160G＞A；c，c.308T＞C；d，c.338_339insA；e，c.427G＞A；f，c.511A＞C。
具体实施方式
以下通过实施例、实验例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。
EDTA：乙二胺四乙酸二钠
SDS：十二烷基硫酸钠
TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0)
dNTP：脱氧核苷三磷酸
实施例 本发明的试剂盒及使用方法
本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：
1.PCR扩增试剂(50人份)：
PCR扩增试剂用于扩增SNP位点所在的一段DNA序列，其组成见表1。
表1 PCR扩增试剂
表1中PCR混合液包括Taq酶、dNTP、镁离子等常规PCR所需成分；
其中引物对信息如表2所示。
表2 RAMP2基因扩增所用引物
附：Primer-1F/R引物扩增：Glu39Asp(c.117G＞C)、Glu54Lys(c.160G＞A)
Primer-2F/R引物扩增：Phe103Ser(c.308T＞C)、Asn113Lysfs*10(c.338_339insA)、Glu143Lys(c.427G＞A)、Ser171Arg(c.511A＞C)
2.RAMP2基因变异分型检测试剂(50人份)：
该试剂包括如表3所示的组分。
表3 RAMP2基因变异分型检测试剂
3.标准DNA样品：
4.使用方法：
1)DNA提取
取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。
2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段，每个突变位点PCR扩增体系如下：
反应条件(具体退火温度见表2)：
PCR产物检测：
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。
3)Sanpshot分型检测
第一步：PCR产物纯化(6.2μl体系)：
反应条件：
第二步：单碱基引物延伸反应(10μl)：
注：Bigdye Mix避光保存。
反应条件：
第三步：每孔加75％的酒精60μl，4000rpm离心30分钟沉淀DNA；倒掉酒精，室温放置30分钟，至酒精挥发完全。
第四步：ABI遗传分析仪及读取结果：
加10μl ddH2O/孔，溶解DNA样品，然后上机测序；
如果6个检测位点测序结果有任何一个出现杂合双峰，则说明该检测样本有POAG风险。
本试剂盒用于：
1、原发性开角型青光眼抗性人群的早期诊断和分型参考；
2、原发性开角型青光眼抗性人群的基因检测和可能性评估。
为了进一步说明本发明所述6个突变位点与POAG的关系，以及本发明试剂盒的效果，提供以下实验例。
实验例1突变位点的筛选
1.方法
以4763个POAG患者和10953个健康对照为对象，提取其DNA。通过二代测序技术，采用IlluminaTruSeq富集捕获，HiSeq 2000/2500序列发生器靶向筛选POAG候选基因，使每个个体的基因组DNA在文库中富集。使用自动IlluminaHiSeq 2000/2500测序仪对文库进行测序。测序序列结果利用BWA-MEM(https：//github.com/lh3/bwa)使与UCSC hg19(http：//genome.ucsc.edu/)序列一致。通过使用Samtools(http：//samtools.sourceforge.net/)和freebayes(https：//github.com/ekg/freebayes)两个数据库检测出SNP和Indel。我们根据RefSeq数据库的信息，利用Annovar(http：//annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)数据库再根据SNV的遗传位置和对基因产物的预期影响将SNV分成不同的功能类别。在生成初始SNV数据后，我们进行了进一步过滤以识别靶向测序中的高置信度SNV，并要求每个SNV(i)的质量＞Q30，(ii)深度≥5×且(iii)不位于MHC同源序列中，排除在公共数据库(dbSNP138，1000Genomes Project，Exome Variant Server和ExAC)中已有的突变体。从而得到候选SNP突变位点。最后通过Sanger测序的方法直接验证候选突变位点，验证用的引物同表2所示引物。
2.结果
在RAMP2基因序列上，POAG患者中筛选出16例RAMP2突变患者，涉及6个突变位点：Glu39Asp(c.117G＞C)、Glu54Lys(c.160G＞A)、Phe103Ser(c.308T＞C)、Asn113Lysfs*10(c.338_339insA)、Glu143Lys(c.427G＞A)、Ser171Arg(c.511A＞C)；健康对照中未筛选到突变(突变信息如表4所示)。突变和健康对照(WT)的测序结果如图1所示。前述结果表明RAMP2基因的上述6个突变位点分别与POAG显著相关。
表4 RAMP2基因6个突变位在样本中的分布
实验例2本发明试剂盒对RAMP2基因分型检测特异性测试
1.方法
将实验例1中表2中涉及的突变样本DNA以及20份健康受试者DNA作为实验材料，使用实施例中的试剂盒，按照上述实验方法操作进行检测。
1)DNA提取
取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。
2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段，每个突变位点PCR扩增体系如下：
反应条件：
PCR产物检测：
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。
3)Sanpshot分型检测
第一步：PCR产物纯化(6.2μl体系)：
反应条件：
第二步：单碱基引物延伸反应(10μl)：
反应条件：
第三步：每孔加75％的酒精60μl，4000rpm离心30分钟沉淀DNA；倒掉酒精，室温放置30分钟，至酒精挥发完全。
第四步：加10μl ddH2O/孔，溶解DNA样品，ABI遗传分析仪上机检测。
2.结果
表2中的突变样本均被检测出RAMP2基因6位点突变，其突变类型与表2全部吻合；而20份健康受试者DNA均未检出RAMP2基因6位点的突变。
综上，本发明将RAMP2基因Glu39Asp(c.117G＞C)、Glu54Lys(c.160G＞A)、he103Ser(c.308T＞C)、sn113Lysfs*10(c.338_339insA)、Glu143Lys(c.427G＞A)、Ser171Arg(c.511A＞C)位点的变异，应用于原发性开角型青光眼辅助诊断试剂盒的制备中，能达到早期筛查的目的。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省人民医院
<120> 一种原发性开角型青光眼的筛查试剂盒
<130> GY008-18P1577
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer-1F正向
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cgaagagggc ttaggaggac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer-1R反向
<400> 2
ggagtgtagt ggggcatcag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer-2F正向
<400> 3
tagcaggtag gggcagtgat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer-2R反向
<400> 4
tggttgttga gaagctcgtg 20
Claims (11)
1.检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂在制备原发性开角型青光眼的筛查试剂中的用途，其特征在于：所述突变位点c.117G>C是 RAMP2基因编码区第117位碱基G变成C；所述突变位点c.308T>C是 RAMP2基因编码区第308位碱基T变成C；所述突变位点c.160G>A是RAMP2基因编码区第160位碱基G突变成A；所述突变位点c.338_339insA是RAMP2基因编码区第338位和339位碱基之间插入A；所述突变位点c.427G>A是RAMP2基因编码区第427位碱基G变成A；所述突变位点c.511A>C是RAMP2基因编码区第511位碱基A变成C。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的相关试剂包括检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂；还包括用于扩增包含人类 RAMP2基因编码区第117、160、308、338、339、427和/或511位碱基的核酸片段的相关试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂为Snapshot试剂。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂为测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
5.一种原发性开角型青光眼的筛查试剂盒，其特征在于：它包括用于检测人类 RAMP2基因突变位点c.160G>A、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的相关试剂包括检测人类 RAMP2基因突变位点c.160G>A、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂；还包括用于扩增包含人类 RAMP2基因编码区第160、338、339、427和/或511位碱基的核酸片段的相关试剂。
7.根据权利要求5所述的筛查试剂盒，其特征在于：它还包括检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C和/或c.308T>C的相关试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的相关试剂包括检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C和/或c.308T>C的相关试剂；还包括用于扩增包含人类 RAMP2基因编码区第117和/或308位碱基的核酸片段的相关试剂。
9.根据权利要求6或8所述的试剂盒，其特征在于：所述检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂为Snapshot试剂。
10.根据权利要求6或8所述的试剂盒，其特征在于：所述检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂为测序用试剂或荧光定量PCR试剂。
11.根据权利要求6或8所述的试剂盒，其特征在于：所述检测人类 RAMP2基因突变位点c.117G>C、c.160G>A、c.308T>C、c.338_339insA、c.427G>A和/或c.511A>C的相关试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
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