JP2023526441A - 複合遺伝子バリアントの検出およびフェージングのための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
複合遺伝子バリアントの決定のための方法、システム、およびコンピュータプログラム製品を開示する。開示の方法、システム、およびコンピュータプログラム製品は、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場ヌクレオチド配列を得る工程；野生型配列を有する野生型足場ヌクレオチド配列を得る工程；試料由来の少なくとも１つの配列の前記変異足場および前記野生型足場に対するアラインメントを作成する工程；ならびに前記野生型足場に対してではなく、前記変異足場に対するアラインメントに基づいて、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を前記試料が含むことを決定する工程を含み得る。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、発明の名称が「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＰＨＡＳＩＮＧ ＯＦ ＣＯＭＰＬＥＸ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＲＩＡＮＴＳ」である２０２０年５月１９日出願の米国仮特許出願第６３／０２６，９４８号に基づく利益および優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、その全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。
本出願は、発明の名称が「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＰＨＡＳＩＮＧ ＯＦ ＣＯＭＰＬＥＸ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＲＩＡＮＴＳ」である２０２０年５月１９日出願の米国仮特許出願第６３／０２６，９４８号に基づく利益および優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、その全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。
分野
本開示は、複合遺伝子バリアントの検出およびフェージングのための方法およびシステムに関する。
本開示は、複合遺伝子バリアントの検出およびフェージングのための方法およびシステムに関する。
背景
次世代配列決定（ＮＧＳ）は、多数の標的配列のリードが得られる大量の並行した配列決定過程を指す。このテクノロジーは、患者試料中の多数の臨床的に関連した遺伝子領域を同時かつ迅速に査定することが可能であるので、遺伝子診断分野で広く使用されている。バリアントの同定は、一般に、任意の配列変動の存在を査定するために配列リードをゲノム基準に対してアラインメントすることによって行われ、バリアント検出におけるその分析感度は、リードマッピング精度に大きく依存する。短いリード（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）を使用したＮＧＳバリアント検出は、点変異、小さな挿入および欠失（インデル）では十分であるが、構造的バリアントおよび反復しているか高相同配列中に存在するバリアントの検出においては限界がある。最新のヒトゲノムビルド（高度に異なる領域のためにいくつかのオルタナティブアレルを含むＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９およびＧＲＣｈ３８／ＨＧ３８）を用いたとしても、ほとんどのアライナーは、リファレンスとして使用される一次配列が１つに制限される。結果として、リファレンスと非常に異なる試料リードは、不正確にマッピングされるか、全くマッピングされない場合がある。このリファレンスの偏りは、バリアント検出の感度および特異性に影響を及ぼし、偽陽性および偽陰性となる。
次世代配列決定（ＮＧＳ）は、多数の標的配列のリードが得られる大量の並行した配列決定過程を指す。このテクノロジーは、患者試料中の多数の臨床的に関連した遺伝子領域を同時かつ迅速に査定することが可能であるので、遺伝子診断分野で広く使用されている。バリアントの同定は、一般に、任意の配列変動の存在を査定するために配列リードをゲノム基準に対してアラインメントすることによって行われ、バリアント検出におけるその分析感度は、リードマッピング精度に大きく依存する。短いリード（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）を使用したＮＧＳバリアント検出は、点変異、小さな挿入および欠失（インデル）では十分であるが、構造的バリアントおよび反復しているか高相同配列中に存在するバリアントの検出においては限界がある。最新のヒトゲノムビルド（高度に異なる領域のためにいくつかのオルタナティブアレルを含むＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９およびＧＲＣｈ３８／ＨＧ３８）を用いたとしても、ほとんどのアライナーは、リファレンスとして使用される一次配列が１つに制限される。結果として、リファレンスと非常に異なる試料リードは、不正確にマッピングされるか、全くマッピングされない場合がある。このリファレンスの偏りは、バリアント検出の感度および特異性に影響を及ぼし、偽陽性および偽陰性となる。
バリアントフェージングを使用して、２つのバリアントが染色体の同一コピー内（シス）または複合ヘテロ接合体として２つの異なるコピー内（トランス）に存在するかどうかを同定する。フェージング情報は、特に常染色体劣性障害における臨床的帰結の予想に不可欠である。フェージングを統計的に推測するアプローチ（すなわち、集団または家系に基づく方法）には、試験のために大規模コホートまたは世代の異なる家族が必要であり、稀な変異またはｄｅ ｎｏｖｏ変異に適用不可能な場合がある。ＮＧＳの場合、リードに基づいたフェージングのためのアルゴリズムは、標的領域中に２またはそれを超えるヘテロ接合バリアントを有する重複リードをより大きなハプロタイプブロックにコンピュータによってアセンブルするために開発されている。ロングリードシーケンシングのためのＮＧＳプラットフォームは、複数のバリアントを１つの配列リードに連結し、それにより、直接的なフェージング情報を提供することができる；しかしながら、コストが高く、低スループットであり、塩基あたりのエラー率が高いので、臨床遺伝子検査での使用が制限されている。連結リード配列決定は、低いエラー率で長いハプロタイをコンピュータによって構築およびフェージングすることができるが、小さな構造バリアントの検出における感度には限度がある場合があり、主にゲノムフェージングで使用されている。構造バリアントの場合、ゲノムリファレンスの偏りは、マッピングの失敗に起因して、密接に関連する対立遺伝子でさえもフェージングをさらに混乱させ得る。したがって、複合遺伝子バリアントの検出および特徴づけのための改良された方法およびシステムが必要である。
概要
次世代配列決定による遺伝子バリアントの検出およびフェージングのためのカスタム足場アプローチを使用する方法およびシステムを開示する。前述の方法およびシステムは、種々の方法で具体化され得る。
次世代配列決定による遺伝子バリアントの検出およびフェージングのためのカスタム足場アプローチを使用する方法およびシステムを開示する。前述の方法およびシステムは、種々の方法で具体化され得る。
種々の実施形態では、試料中の複合遺伝子バリアントの存在または非存在を検出する方法であって、（ａ）複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場ヌクレオチド配列を得る工程；（ｂ）野生型配列を有する野生型足場ヌクレオチド配列を得る工程；（ｃ）試料由来の少なくとも１つの配列の変異足場および野生型足場に対するアラインメントを生成する工程；および（ｄ）野生型足場に対してではなく、変異足場に対するアラインメントに基づいて、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を試料が含むことを決定する工程を含む、方法を開示する。
種々の実施形態では、試料中の複合遺伝子バリアントの存在または非存在を検出する方法であって、ゲノムの標的領域内に複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、変異足場中の複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、配列リードをマッピングする工程；アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、野生型足場中に野生型配列を含むマッチング配列に、配列リードをマッピングする工程；計算装置によって、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、カウントによって、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；計算装置によって、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および計算装置によって、試料が変異を含むかどうかの決定に基づいて、試料に複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程を含む、方法を開示する。
いくつかの実施形態では、変異足場は、複合バリアント配列、野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；さらなる人為的な遺伝的変動は、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；変異足場中の複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に配列リードをマッピングする工程は、さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、配列リードと複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程は、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよびさらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する配列リードのみが変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いてアラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、計算装置によって、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；計算装置によって、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、試料に複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および試料中の複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、試料に関連する被験体を処置する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、処置は、治療剤または規定食の変更である。
いくつかの実施形態では、治療剤はビタミンＢ６であり、あるいは、食事の変更は低メチオニン食である。
いくつかの実施形態では、複合バリアント配列は２つの変異を有する。
いくつかの実施形態では、方法は、変異足場中のマッチング配列への配列リードのマッピングに基づいて、２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および計算装置によって、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、試料に複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、複合遺伝子バリアントは、シスタチオニンベータ－シンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子の標的領域に存在する。
いくつかの実施形態では、変異足場および野生型足場は、（ｉ）シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉ）トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉｉ）ｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含まない６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、または（ｉｖ）６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含まないｃ．８３３Ｔ＞Ｃを有する配列を区別する。
方法、システム、およびコンピュータプログラム製品の種々の実施形態では、カスタム足場は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ足場である。
ハプロタイプ分離のためのかかるカスタム足場、および、必要に応じて、本明細書中に開示の方法にしたがってバリアントリードアウトとして役立つようにデザインされた塩基変化を含むシステムおよび／またはキットも本明細書中に開示する。例えば、１またはそれを超えるデータプロセッサ；および１またはそれを超えるデータプロセッサ上で実行されたときに、１またはそれを超えるデータプロセッサが、本明細書中に開示の方法工程のうちのいずれかを含む動作を実施する命令を含む非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を含むシステムを開示する。１またはそれを超えるデータプロセッサが、本明細書中に開示の方法工程のうちのいずれかを含む動作を実施するように構成された命令を含む、非一時的な機械可読記憶媒体において明白に具体化されるコンピュータプログラム製品も開示する。
詳細な説明
短いリードを使用して標的にされた構造バリアントの検出およびフェージングを可能にするために、バリアント特異的なカスタマイズされたリファレンス配列を、リードアラインメントの足場として利用する計算方法を開発した。このカスタマイズにより、異なるハプロタイプ由来のリードを対応するカスタム足場上に正確にマッピングすることが可能であり、それにより、遺伝子型決定が改良される。バリアントフェージングは、リードの効率的な選別を強化する足場配列中のマーカーの導入によってさらに容易にされ得る。これらの足場を、任意の標的領域のために構築し、大規模なアルゴリズムの開発や解析時間の増大を伴わずに、既存のバリアント分析ワークフローに組み込むことができる。
短いリードを使用して標的にされた構造バリアントの検出およびフェージングを可能にするために、バリアント特異的なカスタマイズされたリファレンス配列を、リードアラインメントの足場として利用する計算方法を開発した。このカスタマイズにより、異なるハプロタイプ由来のリードを対応するカスタム足場上に正確にマッピングすることが可能であり、それにより、遺伝子型決定が改良される。バリアントフェージングは、リードの効率的な選別を強化する足場配列中のマーカーの導入によってさらに容易にされ得る。これらの足場を、任意の標的領域のために構築し、大規模なアルゴリズムの開発や解析時間の増大を伴わずに、既存のバリアント分析ワークフローに組み込むことができる。
１つの実施形態では、カスタム足場アプローチは、標準的なリファレンスベースのアラインメントアプローチ（例えば、ＨＧ１９、ＧＲＣｈ３８）ではしばしば偽陽性または偽陰性に至る困難な領域中のＮＧＳバリアントの検出に注目している。例えば、反復領域、相同領域、または偽遺伝子領域を有する遺伝子について、標準的なリファレンスゲノム上のリードアラインメントでは、不正確にマッピングされるか、全くマッピングされない場合があり、それにより、バリアント検出において偽陽性および偽陰性が生じる。本明細書中で開示される場合、カスタム足場を、各々の困難なバリアントのためにデザインし、ハプロタイプによる配列リードの適切な分離（「ハプロタイプ分離」）に合わせ、それにより、困難な標的バリアントの配列決定効率および検出感度、特異性およびフェージングを大きく改善することができる。より具体的には、配列決定システム（例えば、ＮＧＳ）自体の機能性の特異的な改良、すなわち、配列決定システムによる配列リードの不適切な分離の軽減、ならびにバリアントの同定システムおよびフェージングシステムによるバリアントコーリングおよびフェージングにおける感度および特異性の改善を本明細書中に開示する。
ある特定の実施形態では、カスタマイズされた足場は、各々の困難なバリアントのために構築され得る。かかる足場は、バリアント含むリードをバリアントを含まないリードと分離して、検出の感度および特異性を改善し得る。目的のバリアントに加えて、これらの足場は、さらなるデザインパラメータも含み得る。例として、６８ｂｐ挿入を含むシスタチオニンベータ－シンターゼ（ＣＢＳ）複合体バリアントについて、６８ｂｐ挿入の存在についての読み取りに役立てるために、塩基変化をカスタム足場（６８ｂｐ挿入の内側）に導入し得る。本明細書中に詳述するように、足場中に塩基変化を有すると、遺伝子中で起こり得る６８ｂｐ ｉｎｓと点変異（ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ）との間のフェージングも可能である。このアプローチは、任意のバリアントに使用され得るが、バリアント配列の構造的性質に起因して検出および／またはフェージングが困難であり得る。例えば、本明細書中に開示の例に加えて、カスタム足場は、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ）中の困難な５５ｂｐ欠失の検出のために開発されており、得られた５５ｂｐ欠失を有するリードは、優先的にＧＢＡＰ１偽遺伝子領域に対してアラインメントされる。
複合遺伝子バリアントを検出およびフェージングする方法
複合遺伝子バリアントを検出およびフェージングするための技術を開示する。この技術は、様々な方法（例えば、方法、システム、非一時的なコンピュータ可読媒体の記憶コードまたは１またはそれを超えるプロセッサによって実行される命令）で具体化され得る。
複合遺伝子バリアントを検出およびフェージングするための技術を開示する。この技術は、様々な方法（例えば、方法、システム、非一時的なコンピュータ可読媒体の記憶コードまたは１またはそれを超えるプロセッサによって実行される命令）で具体化され得る。
１つの実施形態では、試料中の複合遺伝子バリアントの存在または非存在を検出する方法であって、（ａ）複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む少なくとも１つの変異足場ヌクレオチド配列を得る工程；（ｂ）野生型配列を有する野生型足場ヌクレオチド配列を得る工程；（ｃ）試料由来の少なくとも１つの配列の変異足場および野生型足場に対するアラインメントを生成する工程；および（ｄ）野生型足場に対してではなく、変異足場に対するアラインメントに基づいて、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を試料が含むことを決定する工程を含む、方法を開示する。
例えば、図１に示すように、方法１００は、複合バリアントの性質を決定する工程１０２を含み得る。本明細書中のＣＢＳについて詳述した配列のデータベースで見出される目的の標的に関連することが知られている変異を分析することによってこれを行い得る。次に、方法は、複合遺伝子バリアント（ＣＧＶ）に関連する少なくとも１つの態様（すなわち、変異）を組み込む変異足場配列を得る工程１０４を含み得る。例えば、変異足場は、欠失および／または挿入および／または点変異を組み込むように構築され得る。また、方法は、ＣＧＶに関連する他の変異を組み込むさらなる変異足場を得る工程１０５を含み得る。場合によっては、工程１０６で、変異足場は、足場に対してアラインメントされた配列が目的の変異を含むことを示すためのマーカーとして使用することができるさらなるバリアント配列を含むように構築され得る。方法は、定義された野生型配列を含む足場を得る工程１０７、および、必要に応じて、リファレンス配列を含む足場を得る工程１０８をさらに含み得る。
被験体がＣＧＶを有するかどうかを決定するために、方法は、例えば、本明細書中に詳細に開示の配列決定のための方法、システム、およびコンピュータプログラム製品を使用して、被験体についてのＣＧＶに関連する標的部位のＤＮＡ配列を決定する工程１０９を含み得る。あるいは、配列データは、本明細書中に開示の方法、システム、およびコンピュータプログラム製品を使用した特徴づけのためのデータベースから得てもよい。次いで、方法の工程１１０は、被験体の目的の標的の核酸配列の、個別の変異体、野生型、および必要に応じたリファレンス足場に対するアラインメントを生成し得る。１つの実施形態では、配列決定により、複数の配列が足場の各々にアラインメントされるように、目的の標的の複数の配列リードが生成される（例えば、ＮＧＳ）。次いで、アラインメントは、工程１１２で分析されて、被験体がＣＧＶに関連する変異を含むかどうかを決定し、必要に応じて、工程１１４で、ＣＧＶに関連する変異のフェージング（すなわち、変異が同一または異なる染色体コピー上に存在するかどうか）を決定し得る。方法は、結果を被験体または医療提供者に報告する工程１１６を含み得る。１つの実施形態では、方法工程のうちの少なくともいくつかは、計算システム（例えば、大規模並行型シーケンサーを含む計算システム）によって制御される。
ある特定の実施形態では、開示の方法は、複合バリアント配列が２つの変異を有すること、および／または２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）いずれに存在するのかを決定する工程を含み得る。変異足場および野生型足場に対する試料由来の配列のアラインメントにより、変異が試料においてヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれであるかを決定することができる。方法は、任意の複合バリアントのために使用され得る。１つの実施形態では、複合遺伝子バリアントは、ＣＢＳ遺伝子中に存在する。例えば、ある特定の実施形態では、足場は、（ｉ）シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉ）トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉｉ）ｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含まない６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、または（ｉｖ）６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含まないｃ．８３３Ｔ＞Ｃを有する配列を区別する。あるいは、足場は、ＣＢＳ遺伝子または類似の様式での任意の他の遺伝子中の他の変異を区別するために使用され得る。
図２ａおよび２ｂは、ＣＢＳ遺伝子中の複合バリアントを示す。具体的には、図２ａおよび図２ｂは、２１番染色体上のＣＢＳ遺伝子についての野生型配列（図２ａ）ならびにｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントおよび複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］（図２ｂ）を示す。ＣＢＳ遺伝子は、酵素シスタチオニンベータ－シンターゼをコードし、その欠損によりホモシスチン尿症を発症する。図２ａに示すように、シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む６８ｂｐ挿入の配列構造は、ＣｌｉｎＶａｒおよびｇｎｏｍＡＤ（補強証拠を含むゲノム配列決定データおよびヒトにおける変動と表現型との間の関係についての報告に無料でアクセスできる公開データベース）におけるｃ．８３２＿８３３ｉｎｓ６８と等価である。両方のパネルにおいて、コードエクソン８に影を付けており、ｃ．８３３野生型塩基はハイライトし、野生型配列と６８ｂｐ挿入配列との間で異なる塩基の位置を四角で囲っている。イントロン配列の重複箇所に下線を引いている。下のパネルでは、６８ｂｐ挿入配列をボックス中に示し、シス位のｃ．８３３Ｃバリアントの相対的位置をハイライトしている。イントロン配列を小文字で示す。図２ｂは、エクソンを示すバリアント領域の略図を示し、正常な［Ｔ］または病原性［Ｃ］のバリアントとしてのｃ．８３３塩基の位置を示した。また、ｃ．８４４塩基とｃ．８４５塩基との間の６８ｂｐ挿入を網掛けで示す。点線は、オルタナティブスプライシングによって切り出された領域を示す。
したがって、図２ａおよび２ｂに示すように、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントは、ＣＢＳ遺伝子のコードエクソン８の５’末端付近で生じ、少数の相違塩基を除いて、イントロン７の最後の５２塩基およびエクソン８の最初の１６塩基が重複している（ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ ｃｈｒ２１：４４４８３１７３－４４４８３２４０）。挿入された配列は、野生型塩基のコピーｃ．８３３Ｔおよびイントロン７－エクソン８ジャンクションの３’スプライス部位を含み、後者は、転写物においてオルタナティブスプライシングを引き起こす。結果として、挿入物中のｃ．８３３Ｔ野生型塩基が保持される一方で、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントは、シス位に挿入物が存在する場合、切り出される（図２ｂ）。したがって、シス位に６８ｂｐ挿入を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアント（ＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８）が生じるとき、これは、良性の複合バリアントＮＭ＿００００７１．２：ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を形成する。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃの臨床的解釈がｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の存在およびこれを用いたフェージングに依存するので、遺伝子試験において両方のバリアントを正確に遺伝子型同定し、フェージングすることが不可欠である。
種々の実施形態では、足場は、ハイスループット配列決定データをアラインメントするために使用されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏ足場である。例えば、図３は、本開示の実施形態のＣＢＳ複合遺伝子バリアントについての、カスタム足場およびＨＧ１９リファレンスゲノムに対するシミュレートしたリードのアラインメントを示す。カスタム変異足場（ＣＢＳ＿ＭＵ）（左のパネル）およびカスタム野生型足場（ＣＢＳ＿ＷＴ）（中央のパネル）およびＨＧ１９リファレンスゲノム（ＨＧ１９）（右のパネル）に対するシミュレートしたリードアラインメントを、（ａ）点変異（ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ）のみを有する配列、（ｂ）６８塩基対（ｂｐ）挿入（ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８）のみを有する配列、（ｃ）シス位に６８ｂｐ挿入（ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８）を含む点変異（ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ）を含む配列（すなわち、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］）、および（ｄ）トランス位に６８ｂｐ挿入を含む点変異（ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ）を含む配列（すなわち、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］）について示す。リードアラインメントを、塩基毎のカバレッジトラック上にＤＮＡ配列を示すＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ；Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して可視化した。１つの実施形態では、ｂ～ｄ中のカスタム足場アラインメントについて、６８ｂｐ挿入を含むいくつかのリードはまた、配列相同性が高いのでＲｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴに対してアラインメントされる；しかしながら、ソフトクリップされた末端は、一般に、バリアントコーラーによって無視される。１つの実施形態では、Ｒｅｆ：ＨＧ１９の場合、６８ｂｐ挿入を含む全てのリードの強制アラインメントおよびソフトクリッピングは、挿入についてのバリアントのコールに影響を及ぼすので、共存する場合、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントは複合バリアントの検出を妨げる。矢印は、足場およびＨＧ１９リファレンス上のバリアントコーリングのために使用される有益な塩基を指し示す。６８ｂｐ挿入配列とＨＧ１９リファレンス配列との間で異なる塩基のうちの２つを、小さな矢印を用いて示す。挿入配列の最末端の第３の相違塩基は、コーラーによるソフトクリッピングに起因してアラインメント中に認められない。
したがって、ＣＢＳ＿ＷＴ足場は、正常な遺伝子型（野生型）を示し、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９に基づいてｃｈｒ２１：４４４８０００１－４４４８５０００に５，０００ｂｐのＣＢＳ遺伝子領域を含む。ＣＢＳ＿ＭＵ足場は、挿入遺伝子型（変異型）であり、ＣＢＳ＿ＷＴ足場と同一のゲノム領域＋共通の６８ｂｐ挿入配列を含む。アラインメントアルゴリズムにおけるミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違に起因して、挿入を有するリードのみがＣＢＳ＿ＭＵ足場に対してアラインメントされるであろう。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントも６８ｂｐ挿入と同一のペアードエンドリード中に生じる場合、ＣＢＳ＿ＭＵ足場中の３２５２位に塩基の変化として検出されるであろう（すなわち、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇ；図３ｃ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）。他方では、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントのみを有するリードは、ＣＢＳ＿ＷＴ足場に対してアラインメントされ、この病原性バリアントを、ＣＢＳ＿ＷＴ：３１８４Ａ＞Ｇとして同定することができる（図３ａ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴ）。
ある特定の実施形態では、変異足場は、複合バリアント配列、野生型配列のいずれにも見出されないさらなる遺伝的変動を含み、ここで、本明細書中に開示のように、さらなる遺伝的変動は、複合遺伝子バリアントを含む特異的変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ。例えば、ＣＢＳ＿ＭＵ足場は、足場の３２１０位にさらなるＧ＞Ｃ塩基変化を有する（ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０と命名）。ＣＢＳ＿ＭＵ足場中で「Ｇ」から「Ｃ」に塩基が変更することにより、６８ｂｐ挿入を有するリードを容易に同定するための所定のバリアントリードのためのマーカーとして役立つ予想ミスマッチが作出される（図２ｂ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）。
したがって、１つの実施形態では、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントのみ含むリードは、ＣＢＳ＿ＷＴ足場のみに対してアラインメントされる（図３ａ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵと比較したＲｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴ）。ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントを含むリードは、ＣＢＳ＿ＭＵ足場に対して優先的にアラインメントされ（図３ｂ～ｄ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０でＧ＞Ｃリードアウトによって同定されるのに対して、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇでの塩基変化の同時出現（１００％ＶＡＦでもある）は、６８ｂｐ挿入がシス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含むことを示す（図２ｃ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）。挿入配列とリファレンス配列との間の相同性が高いので、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８配列を含むリードの画分も、非アラインメントリード末端のソフトクリッピングに起因して、ＣＢＳ＿ＷＴ足場にアラインメントされ得る。
１つの実施形態では、また、変異足場を使用して、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の２つのコピー（シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含むものおよび反対の対立遺伝子上に含むもの）を用いて試料の遺伝子型を決定する。この場合、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０Ｇ＞ＣおよびＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇでの塩基変化がそれぞれ１００％および５０％であることにより、複合ヘテロ接合性と同定することができる。あるいは、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃがｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］に対してトランス位に生じる場合、ＣＢＳ＿ＭＵ足場およびＣＢＳ＿ＷＴ足場の両方に対するリードアラインメントには、検出のためにはそれぞれ約６０％、１００％、および１００％のＣＢＳ＿ＷＴ：３１８４Ａ＞Ｇ、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０Ｇ＞Ｃ、およびＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇを使用することが必要であると考えられ、ここで、１００％から約６０％へのＣＢＳ＿ＷＴ：３１８４Ａ＞ＧのＶＡＦの減少は、両方の対立遺伝子上にｃ．８３３Ｔ＞Ｃが存在することに起因すると予想される。
様々なハイスループット配列決定プラットフォームを使用して、アラインメントのために使用された配列データがアラインメントされ得る。１つの実施形態では、配列決定は、次世代配列決定（ＮＧＳ）であり、大規模並行型シーケンサーを用いて実施される。
複合遺伝子バリアントの検出およびフェージングのためのシステム
本明細書中に記載の１またはそれを超える実施形態を、プログラムのモジュール、エンジン、またはコンポーネントを使用して実装することができる。プログラムのモジュール、エンジン、またはコンポーネントは、１またはそれを超える提示したタスクまたは機能を実行することができるプログラム、サブルーチン、プログラムの一部、またはソフトウェアコンポーネントまたはハードウェアコンポーネントを含むことができる。本明細書中で使用される場合、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュールまたはコンポーネントと独立してハードウェアコンポーネント上に存在することができる。あるいは、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュール、プログラム、または機械の共用の要素またはプロセスであり得る。図４は、開示の実施形態の配列の獲得ならびに複合遺伝子バリアントの同定およびフレージングのためのゲノムバリアントコーリングプラットフォーム４００のブロック図を示し、種々の実施形態の分析システム４０５の種々のサブシステムの実装のために使用され得る１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能なモジュール、エンジン、またはコンポーネント（例えば、プログラム、コード、または命令）を図示する。モジュール、エンジン、またはコンポーネントは、非一時的なコンピュータ媒体に記憶され得る。必要に応じて、モジュール、エンジン、またはコンポーネントのうちの１つまたは複数は、システムメモリ（例えば、ＲＡＭ）にロードされ、分析システム４０５の１またはそれを超えるプロセッサによって実行され得る。図４に指名した例では、足場構築サブシステム４１０、配列決定サブシステム４１５、ならびにバリアント同定およびフレージングサブシステム４２０を実装しているモジュール、エンジン、またはコンポーネントを示す。
本明細書中に記載の１またはそれを超える実施形態を、プログラムのモジュール、エンジン、またはコンポーネントを使用して実装することができる。プログラムのモジュール、エンジン、またはコンポーネントは、１またはそれを超える提示したタスクまたは機能を実行することができるプログラム、サブルーチン、プログラムの一部、またはソフトウェアコンポーネントまたはハードウェアコンポーネントを含むことができる。本明細書中で使用される場合、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュールまたはコンポーネントと独立してハードウェアコンポーネント上に存在することができる。あるいは、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュール、プログラム、または機械の共用の要素またはプロセスであり得る。図４は、開示の実施形態の配列の獲得ならびに複合遺伝子バリアントの同定およびフレージングのためのゲノムバリアントコーリングプラットフォーム４００のブロック図を示し、種々の実施形態の分析システム４０５の種々のサブシステムの実装のために使用され得る１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能なモジュール、エンジン、またはコンポーネント（例えば、プログラム、コード、または命令）を図示する。モジュール、エンジン、またはコンポーネントは、非一時的なコンピュータ媒体に記憶され得る。必要に応じて、モジュール、エンジン、またはコンポーネントのうちの１つまたは複数は、システムメモリ（例えば、ＲＡＭ）にロードされ、分析システム４０５の１またはそれを超えるプロセッサによって実行され得る。図４に指名した例では、足場構築サブシステム４１０、配列決定サブシステム４１５、ならびにバリアント同定およびフレージングサブシステム４２０を実装しているモジュール、エンジン、またはコンポーネントを示す。
また、図４は、標本、化学物質、薬物、または他の材料を試験および分析する研究所（標本および核酸の処理のための試薬および特殊な実験施設を必要とする）を含むウェットラボサブシステム４２５を図示する。ゲノムバリアントコーリングプラットフォーム４００は、ウェットラボサブシステム４２５内のブロック４３５で核酸または核酸混合物４３０を得る工程を含む。核酸４３０は、任意のタイプの好適な生物標本または生物試料４３７（例えば、試験試料）から単離され得る。試料または試験試料は、被験体またはその一部（例えば、ヒト被験体、妊婦、癌患者、胎児、または腫瘍など）から単離または入手した任意の標本であり得る。標本の非限定的な例としては、被験体由来の流動物または組織（血液または血液製剤（例えば、血清または血漿など）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、腹膜洗浄液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡視下洗浄液）、生検試料（例えば、着床前胚由来；癌生検）、頭蓋穿刺試料、細胞（血球、胎盤細胞、胚または胎児の細胞、胎児有核細胞または胎児細胞残遺物、正常細胞、異常細胞（例えば、癌細胞））、またはその一部（例えば、ミトコンドリア、核、または抽出物など）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。ある特定の例では、核酸４３０は、１またはそれを超えるバリアントを含む。本明細書中で使用される場合、用語「バリアント」または「配列バリアント」は、リファレンス配列および／または足場配列と異なる核酸配列を指す。典型的な核酸配列バリアントとしては、制限されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、短い欠失および挿入の多型（Ｉｎｄｅｌ）、コピー数変動（ＣＮＶ）、マイクロサテライトマーカー、または短い縦列反復、および構造変動が挙げられる。
ウェットラボサブシステム４２５内のブロック４４０で、核酸４３０が前処置されるか、前処理される。前処置または前処理の方法としては、濾過、沈殿、富化、希釈、蒸発、混合、遠心分離、凍結、凍結乾燥、濃縮、増幅、核酸断片化、妨害成分の不活化、試薬の添加、溶解、およびライブラリの調製などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの例では、核酸４３０は、切断または剪断によって断片化される。例えば、核酸分子（核酸テンプレート遺伝子分子またはその増幅産物など）は、２つの（またはそれを超える）より小さな核酸分子に切断され得る。剪断または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であり得、種々の方法、試薬、または条件のうちのいずれか（例えば、化学的、酵素的、物理的な剪断（例えば、物理的断片化）が挙げられる）によって行うことができる。剪断または切断された核酸を、好適な方法によって生成することができ、方法の非限定的な例としては、物理的方法（例えば、剪断、例えば、超音波処理、フレンチプレス、加熱、ＵＶ照射など）、酵素的プロセス（例えば、酵素的切断剤（例えば、好適なヌクレアーゼ、好適な制限酵素、好適なメチル化感受性制限酵素））、化学的方法（例えば、アルキル化、ＤＭＳ、ピペリジン、酸加水分解、塩基加水分解、および加熱など、またはその組み合わせ）など、またはその組み合わせが挙げられる。
いくつかの例では、核酸４３０は増幅される。例えば、試料中の核酸（例えば、標的核酸）は、標的核酸と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列またはその一部を有するアンプリコン核酸を線形的または指数関数的に生成するプロセスに供し得る。ある特定の実施形態では、核酸４３０の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
いくつかの例では、核酸ライブラリは、核酸４３０に基づいて生成される。核酸ライブラリは、特定のプロセス（その非限定的な例としては、固相（例えば、固体支持体、フローセル、ビーズ）上の固定化、富化、増幅、クローニング、検出、および／または核酸配列決定が挙げられる）のために調製、アセンブリ、および／または修飾される複数のポリヌクレオチド分子（例えば、核酸の試料）を含み得る。核酸ライブラリは、標的化または非標的化調製プロセスによって調製され得る。
足場構築サブシステム４１０内のブロック４４５では、１またはそれを超える足場４４７は、困難な標的バリアントについての検出およびフェージングの効率、感度、および特異性の改善を容易にするために構築される。本明細書中で使用される場合、「足場」は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで構築された配列アセンブリであり、これに対して新規のリードがアラインメントされ得る。配列アセンブリは、配向および順序は正しいが、必ずしも１つの連続した配列ストレッチに連結されていない一連のコンティグを含み得る。コンティグ（「隣接している」に由来する）は、合わせてヌクレオチド配列のコンセンサス領域を示す一連の重複ヌクレオチドセグメントのセットである。種々の例では、１またはそれを超える足場４４７は、染色体またはゲノムの標的領域（ＣＢＳ遺伝子領域など）のためにｉｎ ｓｉｌｉｃｏで構築される。標的領域は、複合遺伝子バリアントを有することが公知の領域として選択され得る。本明細書中で使用されるように、「複合遺伝子バリアント」は、構造バリアント（すなわち、サイズが少なくとも５０個のヌクレオチドのゲノム中の変異）または反復配列もしくは高相同配列中に存在するバリアントである。
いくつかの例では、変異足場ヌクレオチド配列は、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む標的領域のために構築され、野生型足場ヌクレオチド配列は、野生型配列を有する標的領域のために構築される。変異足場および野生型足場は、複合遺伝子バリアントを有する配列リードと複合遺伝子バリアントを持たない配列リードとを識別可能である。野生型足場は、標的領域について正常な遺伝子型の塩基対を含むように構築される。ある特定の例では、野生型足場は、標的配列を含むゲノムのためのリファレンスゲノムに基づいて構築される。変異足場は、変異を含む標的領域について異常な遺伝子の塩基対（すなわち、野生型配列および複合遺伝子バリアント配列の塩基対）を含むように構築される。いくつかの例では、変異足場は、複合遺伝子バリアント配列、野生型配列のいずれにも見出されないさらなる遺伝的変動を含むようにさらに構築される。さらなる遺伝的変動は、複合遺伝子バリアントを含む特異的変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立ち得る。例えば、ｈｇ１９リファレンス領域ｃｈｒ２１：４４，４８０，００１－４４，４８５，０００と同一の第１の足場ＣＢＳ＿ＷＴが構築され得る。また、第２の足場ＣＢＳ＿ＭＵは、同一の領域から構築され得るが、共通の６８ｂｐ挿入＋挿入を検出するためのマーカーとして役立つ６８ｂｐ挿入内に導入されたＧ＞Ｃ塩基変化を含む。
配列決定サブシステム４１５内のブロック４５０では、核酸４３０（必要に応じて、前処理または前処置される）が配列決定される。核酸配列決定は、一般に、配列リード群を産生する。本明細書中で使用される場合、「リード（ｒｅａｄｓ）」（例えば、「リード（ａ ｒｅａｄ）」、「配列リード」）は、本明細書中に記載されているか、当該分野で公知の任意の配列決定プロセスによって産生された短いヌクレオチド配列である。リードは、核酸断片の一方の末端から生成することができ（「シングルエンドリード」）、時折、核酸断片の両端から生成される（例えば、ペアエンドリード、ダブルエンドリード）。配列リードの長さは、しばしば、特定の配列決定テクノロジーに関連する。ハイスループット法は、例えば、数十から数百塩基対（ｂｐ）までサイズが様々であり得る配列リードを提供する。ナノポア配列決定は、例えば、数十から数百、数千の塩基対までサイズが様々であり得る配列リードを提供することができる。いくつかの実施形態では、配列リードは、約１５ｂｐ～約９００ｂｐ長の平均、中央値、平均、または絶対長である。ある特定の実施形態では、配列リードは、約１０００ｂｐまたはそれを超える平均、中央値、平均、または絶対長である。任意の好適な核酸配列決定法を使用することができ、その非限定的な例としては、大量並行様式で（例えば、大規模並行型シーケンサーを用いる）ＤＮＡを配列決定することができる次世代（例えば、第２世代および第３世代）配列決定技術が挙げられる。いくつかの実施形態では、次世代配列決定法は、目的の特異的な染色体、遺伝子、または領域が配列決定される標的化アプローチを利用する。例えば、試料由来の核酸は、標的領域（例えば、ＣＢＳ遺伝子の標的領域またはＣＢＳ遺伝子自体）について配列決定され得る。ある特定の実施形態では、試料中のほとんどまたは全ての核酸が無作為に配列決定、増幅、および／または捕捉される非標的化アプローチが使用される。
配列決定サブシステム４１５内のブロック４５５では、配列リードがフィルタリングされ得る。いくつかの実施形態では、ある特定の配列リードは、フィルターアウトされる（すなわち、複合遺伝子バリアント配列などの遺伝子の変化の存在または非存在を決定するために配列リード分析から排除される）。フィルターアウトされ得るリードとしては、例えば、不一致リード、あいまいなリード、オフターゲットリード、１またはそれを超える不確定の塩基コールを有する単一分子バーコード（ＳＭＢ）配列を有するリード、低品質の試料インデックスを有するリード、および低品質のバーコード（例えば、単一分子バーコード）を有するリードが挙げられる。低品質配列（例えば、バーコード、インデックス）は、配列中の１またはそれを超えるヌクレオチドの位置についての塩基品質スコアにしたがって同定され得る。塩基品質スコア、すなわち、品質スコアは、塩基コーリング中のエラーの確率の予測である。品質スコアは、一連の品質予測値を使用する品質テーブルによって生成され得、配列リードの生成のために使用された配列決定プラットフォームのある特定の特徴に依存し得る。一般に、高品質スコアは、塩基コールがより信頼性があり、不正確な塩基コールの可能性が低いことを示す。例えば、品質スコアが４０の塩基コールについては、１０，０００塩基コール中に１つの不正確な塩基コールが予想され得、または品質スコアが３０の塩基コールについては、１，０００塩基コール中に１つの不正確な塩基コールが予想され得、または品質スコアが１０の塩基コールについては、１０塩基コール中に１つの不正確な塩基コールが予想され得る。
配列リード（必要に応じてフィルタリングされた）および必要に応じた品質スコアは、生配列決定データ４６０として出力される。いくつかの例では、生配列決定データ４６０は、さらなる処理のためにＦＡＳＴＱファイルなどの標準化されたファイル形式で出力される。他の例では、生配列決定データ４６０は、バイナリーベースコール（ＢＣＬ）形式などの塩基形式で出力され、脱多重化を用いてさらなる処理のためにＦＡＳＴＱなどの標準化されたファイル形式に変換される。ＦＡＳＴＱは、生配列データおよび品質スコアの両方を記憶するテキストベースの配列決定データファイル形式である。
配列決定サブシステム４１５内のブロック４６５では、生配列決定データ４６０の配列リードは、マッピングされ、指定された核酸領域（例えば、染色体または標的領域などのその一部）にマッピングされているリード数はカウントと称される。マッピングヌクレオチド配列リード（すなわち、物理的なゲノムの位置が未知の断片由来の配列情報）は、リファレンスゲノムまたは１またはそれを超える足場４４７中のマッチング配列（例えば、ゲノム部分または富化部分（例えば、標的富化プローブ））との得られた配列リードのアラインメントを含む。かかるアラインメントでは、配列リードは、リファレンス配列または１またはそれを超える足場４４７に対してアラインメントされ、アラインメントされた配列リードは、「マッピングされた」、「マッピングされた配列リード」、または「マッピングされたリード」と称される。ある特定の例では、配列リードは、変異足場中の複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列にマッピングされ、配列リードは、野生型足場中に野生型配列を含むマッチング配列にマッピングされる。
「アラインメントされた」または「アラインメント」は、マッチ（例えば、１００％同一）または部分的マッチと同定され得る２またはそれを超える核酸配列（例えば、配列リードおよび変異足場）を指す。アラインメントは、コンピュータ（例えば、ソフトウェア、プログラム、モジュール、またはアルゴリズム）によって行われ、その非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓパイプラインの一部として販売されているヌクレオチドデータの効率的な局所アラインメント（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムを含む。いくつかの例では、配列リードのアラインメントは、１００％配列マッチであり得る。他の例では、アラインメントは、１００％未満の配列マッチ（すなわち、不完全なマッチ、部分的マッチ、部分的アラインメント）である。ある特定の例では、アラインメントアルゴリズムは、バリアントまたは複合遺伝子バリアントを有するリードのみが変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を含むようにパラメータ化される。マッピングされた配列リードは、「ヒット」または「カウント」と称され得る。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列リードは、種々のパラメータにしたがってグループ化（すなわち、区分化）され、特定のゲノム部分または足場４４７に割り付けられる。生配列決定データ４６０の配列リードの１またはそれを超える足場４４７とのアラインメントにより、配列決定システム（例えば、ＮＧＳ）自体の機能性が特異的に改善され、すなわち、配列決定システムによる配列リードの不適切な分離が減少し、バリアントの同定およびフェージングシステムによるバリアントコーリングおよびフェージングの感度および特異性が改善される。より具体的には、ミスマッチおよびギャップペナルティコストは、最低のコスト（ゼロまたは最小のミスマッチまたはギャップ）を用いてリードを位置に強制的にマッピングさせる。結果として、野生型由来のリードは、常に野生型足場にマッピングされる一方で、変異を含むリードは、常に変異足場にマッピングされる。また、リード長が同一のハプロタイプに属する両方のバリアントを対照にするのに十分な長さである場合、これはハプロタイプに適用される（「フェージング」）。
配列決定サブシステム４１５内のブロック４７０では、選択された特徴量または変数に基づいてマッピングまたは区分化された配列リードを定量化して、１またはそれを超える部分（例えば、リファレンスゲノムまたは１またはそれを超える足場４４７の一部）にマッピングされたリードの量または数を決定することができる。いくつかの実施形態では、部分またはセグメントにマッピングされた配列リードの量は、カウントまたはリード密度と称される。ある特定の実施形態では、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードがカウントされ、野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードがカウントされる。カウントにより、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量が行われる。
カウントを、好適な方法、操作、または数学的プロセスによって決定することができる。カウントは、時折、ゲノム部分またはセグメントに対応するゲノム部分の群、ゲノムの小領域（例えば、コピー数変動領域、コピー数変化領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微小重複領域、微小欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域）に対応する部分の群にマッピングされた全ての配列リードの直和であり、そして／あるいは、時折、ゲノムに対応する部分の群である。リード定量は、時折、比であり、時折、領域ａ中の一部の定量の、領域ｂ中の一部の定量に対する比である。領域ａは、時折、１つの部分（例えば、野生型足場）、セグメント領域、コピー数変動領域、コピー数変化領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微小重複領域、微小欠失領域、染色体領域、常染色体領域、および／または性染色体領域である。領域ｂは、独立して、時折、１つの部分（例えば、変異足場）、セグメント領域、コピー数変動領域、コピー数変化領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微小重複領域、微小欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域、全ての常染色体を含む領域、性染色体を含む領域、および／または全ての染色体を含む領域である。
アラインメントは、標準化された形式（ＢＡＭファイルなど）に変換され、選別ツールを用いて選別してインデックスを付け、生マッピングデータ４７５として出力され得る。アラインメントは、リード名、リード配列、リードの品質、アラインメント情報、カスタムタグ、およびカウントまたは定量の情報を含む。リード名は、染色体、開始座標、アラインメントの品質、およびマッチ記述子のストリングを含む。いくつかの例では、ブロック４６５および４７０で実施されるマッピングおよびアラインメントプロセスは、レーンの統合（例えば、複数の試料由来の配列アラインメントの統合）、重複のマーキング（例えば、配列決定ワークフロー中に生じる人為的に重複している可能性が高いリードを同定する）、塩基品質スコアにおける系統誤差の検出および補正（例えば、塩基品質スコアの再較正）、および／またはマッピングおよびアラインメントの品質のチェック（例えば、マッピングされたリードの特徴にしたがって生マッピングデータ４７５中の配列決定アラインメントデータを試験し、配列決定および／またはデータのマッピングにおける偏りを検出するのに役立つデータの全体図を提供する）をさらに含み得る。
バリアント同定およびフレージングサブシステム４２０内のブロック４８０および必要に応じたブロック４８５では、生マッピングデータ４７５を、本明細書中に記載の技術を使用して分析して、（ｉ）配列リード内に複合遺伝子バリアントを含むバリアントを検出し、必要に応じて、（ｉｉ）検出されたバリアントを元の染色体に割り当てる（すなわち、フェージング）。バリアントコールは、個別のゲノムまたはトランスクリプトーム中の所与の位置に、リファレンス（例えば、リファレンスゲノムおよび／または１またはそれを超える足場４４７）に対してヌクレオチドに相違があるとの結論である。バリアントコールは、バリアント頻度の推定によって行われ得、バリアントコールの信頼性の尺度である。バリアントコーリングは、アラインメントされたリードがリファレンスゲノムおよび／または１またはそれを超える足場４４７と異なる場合を同定する工程（すなわち、リード配列内の位置のリードカバレッジをカウントし、位置ベースのカウント情報に基づいて複合遺伝子バリアントを含むバリアントを検出する工程）、および同定された相違またはバリアントを、バリアント同定および必要に応じたフェージングデータ４９０の一部として、バリアントコール形式（ＶＣＦ）などの標準化されたファイル形式で出力する工程を含み得る。所定の閾値は、バリアントのフィルタリングおよび検出のために使用され得る。例えば、１つの基準は、少なくとも５オルタナティブアレル深度および１％を超えるアレル頻度を有する全ての報告されたバリアントをリクエストすることを含み得る。しかしながら、ゲノム中の各遺伝子座は、配列構成、マッピング可能性、バックグラウンドノイズレベルなどに関して異なる特徴を有し得る。位置特異的閾値または位置特異的モデルを使用して、バックグラウンドノイズ由来のシグナルまたは真のバリアントが区別され得る。
いくつかの例では、バリアントコーリングは、試料由来の１またはそれを超える配列の変異足場に対するアラインメントおよび試料由来の１またはそれを超える配列の野生型足場に対する非アラインメント（アラインメントを行わない）に基づいて、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうかを決定することを含み得る。複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、この決定を行い得る。ある特定の例では、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する。例えば、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量が設定閾値量より高い場合、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むと決定し得る。あるいは、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量が設定閾値量より高く、かつ野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量が設定閾値量未満である場合、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むと決定し得る。
バリアントコーリングは、変異が試料中でヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれであるかを決定する工程含むフェージングをさらに含み得る。例えば、２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）のいずれに存在するのかを決定する工程。いくつかの例では、バリアントコーリングは、リード配列が２またはそれを超える変異を有することを決定する工程をさらに含み得る。変異足場および野生型足場は、（ｉ）シス位に病原性変異を含む複合バリアント配列を有する配列、（ｉｉ）トランス位に病原性変異を含む複合バリアント配列を有する配列、（ｉｉｉ）病原性変異を含まない複合バリアント配列を有する配列、または（ｉｖ）複合バリアント配列を含まない病原性変異を有する配列を識別することができる。フェージング情報は、標準化されたファイル形式でのバリアントの同定およびフェージングデータ４９０の一部としての出力であり得る。したがって、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントなどの病原性バリアントが複合遺伝子バリアントと同一のペアエンドリード中にも生じる場合、病原性バリアントは、変異足場中の塩基変化として検出されるであろう。他方では、病原性バリアントのみを含むリードは野生型足場にアラインメントされ、病原性バリアントが同定されるであろう。
効率的なバリアントコーリングおよびフェージングを容易にするために、変異足場は、さらなる人為的な遺伝的変動（例えば、足場位置での塩基変化）を用いて構築され得る。さらなる人為的な遺伝的変動は、複合バリアント配列、野生型配列のいずれにも見出されない。変異足場中のさらなる人為的な遺伝的変動により、（例えば、複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのための）複合遺伝子バリアントを有するリードを容易に同定するための所定のバリアントコールのためのマーカーとして役立つ予想ミスマッチが得られる。変異足場中の複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に配列リードをマッピングする工程は、さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、配列リードと複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することをさらに含み得る。複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程は、複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよびさらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることをさらに含み得る。
試料に複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果４９０は、試料が変異を含むかどうかの決定に基づいて出力されるか提供される。例えば、複合遺伝子バリアントの存在または非存在は、その場で表示されるか、別のデバイスに転送され得る。複合遺伝子バリアントの存在または非存在は、被験体（例えば、試料に関連する被験体）の識別子と共に出力され得る。いくつかの例では、複合遺伝子バリアントの存在または非存在は、記憶デバイスのエンドユーザーに出力される。いくつかの例では、試料に複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果は、試料が複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して出力される。したがって、ヘテロ接合性またはホモ接合性の決定を使用して、処置の決定および治療の選択肢およびプロトコルに影響を及ぼすことができる。必要に応じて、試料中の複合遺伝子バリアントの存在にしたがって試料に関連する被験体に処置を施す。あるいは、コンピュータに実装される方法、システム、またはコンピュータプログラム製品は、試料中の複合遺伝子バリアントの存在にしたがって試料に関連する被験体に対して処置（例えば、所与の処置の開始を推奨する結果を医療従事者に提供すること、処置行為を自動的に誘発する結果を提供すること、および結果に基づいて医療従事者が処置行為を取る結果を提供することなど）を開始する。いくつかの例では、処置は、治療剤または規定食の変更である。例えば、複合遺伝子バリアントがＣＢＳ遺伝子の標的領域中に存在する場合、治療剤はビタミンＢ６であり得るか、食事の変化は低メチオニン食であり得る。
図５は、本明細書中に開示の配列バリアントコールおよびフェージングを同定および／または確証するために使用され得る配列決定データを獲得するための、開示の実施形態と併せて使用される得る分析システム５００（例えば、図４に関して記載の分析システム４０５）の概要図である。分析システム５００は、任意の配列決定技術（合成しながら配列決定する技術、ライゲーション技術、ナノポア配列決定、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）、および大規模並行型シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）を組み込んだ技術など）にしたがって実装され得る。特定の実施形態では、分析システム５００は、ＤＮＡ沈着物が各光ダイオードと１対１でアラインメントされるように、光ダイオード上に作製されたナノウェルを備えたＣＭＯＳセンサを使用して操作されるように構成され得る。分析システム５００は、４つのヌクレオチドのうちの２つのみが標識され、任意の所与の画像について検出可能な「１チャンネル」検出デバイスであり得る。例えば、チミンは永久的な蛍光標識を有し得る一方で、アデニンは、検出可能な形態の同一の蛍光標識を使用する。グアニンは永久的に暗色であり得、シトシンは最初は暗色であり得るが、サイクル中に標識を付加することができる。したがって、各サイクルは、最初の画像ではチミンおよびアデニンのみが検出可能であるが、第２の画像ではチミンおよびシトシンのみが検出可能となるように、色素が任意のアデニンから切断され、任意のシトシンに付加される最初の画像および第２の画像を含み得る。両方の画像を通して暗色である任意の塩基はグアニンであり、両方の画像を通して検出可能な任意の塩基はチミンである。第１の画像では検出可能であるが、第２の画像では検出不可能な塩基はアデニンであり、第１の画像では検出可能ではないが、第２の画像では検出可能な塩基はシトシンである。最初の画像および第２の画像由来の情報を組み合わせることによって、４つ全ての塩基が、１つのチャンネルを使用して識別可能である。
分析システム５００は、別個の試料処理デバイス５０５および計算装置５１０を含み得る。しかしながら、これらは、単一のデバイスとして実装され得る。さらに、計算装置５１０は、ローカルであるか、試料処理デバイス５０５とネットワークで結ばれ得る。示した実施形態では、試料は、計算装置５１０中の試料基板５１５（例えば、フローセルまたはスライド）上にロードし得、画像化して配列データを生成する。例えば、生物試料と相互作用する試薬は、イメージングモジュール５２０によって生成された励起ビームに反応して特定の波長の蛍光を発し、それにより、イメージングのための放射線が戻る。例えば、蛍光成分は、成分の相補性分子にハイブリッド形成する蛍光をタグ化した核酸またはポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドに組み込まれた蛍光をタグ化したヌクレオチドによって生成され得る。当業者に認識されるように、試料の色素が励起される波長および蛍光を発する波長は、特定の色素の吸収スペクトルおよび発光スペクトルに依存するであろう。かかる戻った放射線は、方向付けられた光を遡って伝播し得る。この逆ビームは、一般にイメージングモジュール５２０の検出光学系に方向付けられ得る。
イメージングモジュール検出光学系は、任意の好適なテクノロジーに基づき得、例えば、デバイス中の位置に影響を受ける光子に基づいて画素化された画像データを生成する電荷結合素子（ＣＣＤ）センサであり得る。しかしながら、種々の他の検出器のうちのいずれかも使用され得ることが理解されるであろう（時間遅延積分（ＴＤＩ）操作のために構成された検出器配列、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出器、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）検出器、ガイガーモード光子カウンター、任意の類似のテクノロジー、またはその任意の組み合わせ（例えば、ＴＤＩモード検出を、回線走査と結合することができる）が挙げられるが、これらに限定されない）。
イメージングモジュール５２０は、例えば、プロセッサ５２５を介してプロセッサ制御下にあり得、試料回収デバイス５０５は、Ｉ／Ｏコントロール５３０、内部バス５３５、不揮発性メモリ５４０、ＲＡＭ５４５、およびメモリが本明細書中に記載の実行可能な命令配列の処理を記憶することができるような任意の他のメモリ構造をさらに含み得る。計算装置５１０は、１またはそれを超える通信バス５６０を使用してメモリ５５５および計算装置５１０の他の構成要素と通信しているプロセッサ５５０を含み得る。プロセッサ５５０は、本明細書中に提供されたゲノム配列データを操作するためにメモリ５５５に記憶されたプロセッサ実行可能命令を実行するように構成されている。特定の実施形態では、イメージングモジュール５２０によって取得された画像データに基づいて、分析システム５００は、配列リードの各塩基についての塩基コールを含む配列決定データを生成するように構成され得る。さらに、画像データに基づいて、個別のリードは、リファレンスゲノムおよび／または１またはそれを超える足場に対してマッピングされるか、アラインメントされ得る。また、プロセッサ５５０は、アラインメントされた配列リードに対するバリアントコーリングおよびフェージングなどの下流解析を行うようにプログラミングされ得る。プロセッサ５５０は、ＢＡＭファイルなどの標準化された形式で配列データを操作し、種々の標準化された形式（ＶＣＦまたはＧＶＣＦファイルなど）でバリアントコールおよびフェージングを出力するように構成され得る。
また、計算装置５１０は、この例では、ユーザー入力を受け入れるための１またはそれを超えるユーザー入力デバイス５６５（キーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロフォンなど）を含む。また、計算装置５１０は、ユーザーインターフェースなどのユーザーに視覚的出力を提供するためのディスプレイ５７０を含む。また、計算装置５１０は、通信インターフェース５７５を含む。いくつかの例では、通信インターフェース５７５は、１またはそれを超えるネットワーク（ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）；広域ネットワーク（「ＷＡＮ」）（インターネットなど）；メトロポリタンエリアネットワーク（「ＭＡＮ」）；二地点間接続または同位層間接続などが挙げられる）を使用して通信できる場合がある。他のデバイスとの通信は、任意の好適なネットワークプロトコルを用いて行われ得る。例えば、１つの好適なネットワークプロトコルは、インターネットプロトコル（「ＩＰ」）、伝送制御プロトコル（「ＴＣＰ」）、ユーザーデータグラムプロトコル（「ＵＤＰ」）、またはその組み合わせ（ＴＣＰ／ＩＰまたはＵＤＰ／ＩＰなど）が挙げられ得る。
実施例
カスタム足場アプローチを、臨床的に有意な、ＣＢＳ遺伝子の複合バリアントの検出のために査定した。ＣＢＳ遺伝子は、酵素シスタチオニンベータ－シンターゼをコードし、その欠損により、ホモシスチン尿症（ＯＭＩＭ２３６２００）を発症する。キャリア試験パネルは、病原性ＣＢＳバリアント（単一のヌクレオチドバリアントＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ（ｒｓ５７４２９０５、ＮＰ＿００００６２．１：ｐ．Ｉｌｅ２７８Ｔｈｒ、ＨＧ１９ ｃｈｒ２１：４４４８３１８４Ａ＞Ｇ）が挙げられる）を査定し得る。このバリアントは、０．０２％（１０００人ゲノムプロジェクト）から０．１５％（ゲノム集約データベースまたはｇｎｏｍＡＤ；式２＊ｐ＊［１－ｐ］を使用して染色体ベースの集団頻度ｐ＝０．０８％から変換し、ハーディ・ワインベルグ平衡を想定する）までの範囲の集団キャリア頻度が報告されている。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントは、しばしば、シス位に６８ｂｐ挿入ＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８を含み、良性の複合バリアントＮＭ＿００００７１．２：ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を形成する。ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の集団キャリア頻度は、民族の違いで非常に変動し、その範囲は、アフリカ人および北欧人種の４０～５０％から、東アジア人の２．５％、およびアメリカ先住民の１％未満までである。今日まで、シス位にのみｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を有するｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８は、分離すると報告されている；しかしながら、いくつかの他のシナリオ（トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含むｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］（疾患重症度を減弱さえもし得る複合バリアント）が挙げられる）も妥当である。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃの臨床的解釈がｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の存在およびこれを用いたフェージングに依存するので、遺伝子試験において両方のバリアントを正確に遺伝子型同定し、フェージングすることが不可欠である。
カスタム足場アプローチを、臨床的に有意な、ＣＢＳ遺伝子の複合バリアントの検出のために査定した。ＣＢＳ遺伝子は、酵素シスタチオニンベータ－シンターゼをコードし、その欠損により、ホモシスチン尿症（ＯＭＩＭ２３６２００）を発症する。キャリア試験パネルは、病原性ＣＢＳバリアント（単一のヌクレオチドバリアントＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ（ｒｓ５７４２９０５、ＮＰ＿００００６２．１：ｐ．Ｉｌｅ２７８Ｔｈｒ、ＨＧ１９ ｃｈｒ２１：４４４８３１８４Ａ＞Ｇ）が挙げられる）を査定し得る。このバリアントは、０．０２％（１０００人ゲノムプロジェクト）から０．１５％（ゲノム集約データベースまたはｇｎｏｍＡＤ；式２＊ｐ＊［１－ｐ］を使用して染色体ベースの集団頻度ｐ＝０．０８％から変換し、ハーディ・ワインベルグ平衡を想定する）までの範囲の集団キャリア頻度が報告されている。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントは、しばしば、シス位に６８ｂｐ挿入ＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８を含み、良性の複合バリアントＮＭ＿００００７１．２：ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を形成する。ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の集団キャリア頻度は、民族の違いで非常に変動し、その範囲は、アフリカ人および北欧人種の４０～５０％から、東アジア人の２．５％、およびアメリカ先住民の１％未満までである。今日まで、シス位にのみｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を有するｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８は、分離すると報告されている；しかしながら、いくつかの他のシナリオ（トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含むｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］（疾患重症度を減弱さえもし得る複合バリアント）が挙げられる）も妥当である。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃの臨床的解釈がｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の存在およびこれを用いたフェージングに依存するので、遺伝子試験において両方のバリアントを正確に遺伝子型同定し、フェージングすることが不可欠である。
全ての可能性のある遺伝子型とＣＢＳバリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８のフェージングの順列を正確に区別することができるバリアント特異的カスタム足場のデザインおよび構築を開示する。臨床試験におけるアプローチの有用性を、６０，０００を超える患者標本および２つの１０００人ゲノムプロジェクトの細胞株トリオにおけるｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントのみまたは複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］としての検出に方法を適用することによって実証する。アラインメントのリファレンスとして１つの一次配列を使用する従来の方法と比較した場合、カスタマイズされた足場法は、マッピングの偏りという問題を回避し、重要なフェージング情報も得られた。開示の方法およびシステムは、特に、集団データセットで過小評価され得る複合バリアントについてのアッセイの感度および特異性が有意に改善した。
カスタム足場組成物およびバリアントコール分析
本発明者らのカスタム足場アプローチで使用するための６８ｂｐ挿入配列を定義するために、ｇｎｏｍＡＤおよびＣｌｉｎＶａｒデータベースを検索した。バリアントについて以下の２つの記述が存在することが見出された：ＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８（ＣｌｉｎＶａｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ＩＤ ２１２８２３）およびＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８３２＿８３３ｉｎｓ６８（ＣｌｉｎＶａｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ＩＤ ２２６４８２）。これらの記述は、その挿入部位および配列が異なっており、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃがシス位に存在していた場合、その位置を、挿入配列の一部（すなわち、ｃ．８３２＿８３３ｉｎｓ６８）または挿入配列と分離して（すなわち、［ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］）割り付けることができる。さらに精査すると、６８ｂｐ挿入および野生型ゲノムの配列がエクソンで挿入が生じる部位で同一であるので、両方の記述は等価であると結論付けた（図２ａ）。分析においてｃ．８３３Ｔ＞Ｃを挿入配列と区別するため、また一貫性を保つために、６８ｂｐ挿入はｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８と称され、シスバリアントはｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］と称される。本明細書中で考察されるように、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントは、ＣＢＳ遺伝子のコードエクソン８の５’末端付近で生じ、小数の相違塩基を除いて、イントロン７の最後の５２塩基およびエクソン８の最初の１６塩基が重複している（ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ ｃｈｒ２１：４４４８３１７３－４４４８３２４０）。挿入された配列は、野生型塩基のコピーｃ．８３３Ｔおよびイントロン７－エクソン８ジャンクションの３’スプライス部位を含み、後者は、転写物においてオルタナティブスプライシングを引き起こす。結果として、挿入物中のｃ．８３３Ｔ野生型塩基が保持される一方で、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントは、シス位に挿入物が存在する場合、切り出される（図２ｂ）。ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントの２つのオルタネートアレルが、ｇｎｏｍＡＤ（ｖ２．１．１）で報告されていることも示された。１つの対立遺伝子は、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９リファレンスゲノムと３塩基異なり（約９６％同一；以後、共通の６８ｂｐ挿入と称される）、さらなる相違塩基を有する他の集団（ＨＧ１９と約９４％同一）よりも一般集団において多く見られ、ｇｎｏｍＡＤにおいてアフリカ民族の１６個体のみで同定される（以後、稀な６８ｂｐ挿入と表す）。にもかかわらず、いずれかの対立遺伝子配列を用いて、６８ｂｐ挿入配列とリファレンスゲノム配列（例えば、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９またはＧＲＣｈ３８／ＨＧ３８）との間の類似性が高いとｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントを有するリードが標準的なゲノムアセンブリに強制アラインメントされ、それにより、挿入および／またはｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントの検出が複雑になり、偽コールに至る可能性がある。
本発明者らのカスタム足場アプローチで使用するための６８ｂｐ挿入配列を定義するために、ｇｎｏｍＡＤおよびＣｌｉｎＶａｒデータベースを検索した。バリアントについて以下の２つの記述が存在することが見出された：ＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８（ＣｌｉｎＶａｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ＩＤ ２１２８２３）およびＮＭ＿００００７１．２：ｃ．８３２＿８３３ｉｎｓ６８（ＣｌｉｎＶａｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ＩＤ ２２６４８２）。これらの記述は、その挿入部位および配列が異なっており、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃがシス位に存在していた場合、その位置を、挿入配列の一部（すなわち、ｃ．８３２＿８３３ｉｎｓ６８）または挿入配列と分離して（すなわち、［ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］）割り付けることができる。さらに精査すると、６８ｂｐ挿入および野生型ゲノムの配列がエクソンで挿入が生じる部位で同一であるので、両方の記述は等価であると結論付けた（図２ａ）。分析においてｃ．８３３Ｔ＞Ｃを挿入配列と区別するため、また一貫性を保つために、６８ｂｐ挿入はｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８と称され、シスバリアントはｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］と称される。本明細書中で考察されるように、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントは、ＣＢＳ遺伝子のコードエクソン８の５’末端付近で生じ、小数の相違塩基を除いて、イントロン７の最後の５２塩基およびエクソン８の最初の１６塩基が重複している（ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ ｃｈｒ２１：４４４８３１７３－４４４８３２４０）。挿入された配列は、野生型塩基のコピーｃ．８３３Ｔおよびイントロン７－エクソン８ジャンクションの３’スプライス部位を含み、後者は、転写物においてオルタナティブスプライシングを引き起こす。結果として、挿入物中のｃ．８３３Ｔ野生型塩基が保持される一方で、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントは、シス位に挿入物が存在する場合、切り出される（図２ｂ）。ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントの２つのオルタネートアレルが、ｇｎｏｍＡＤ（ｖ２．１．１）で報告されていることも示された。１つの対立遺伝子は、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９リファレンスゲノムと３塩基異なり（約９６％同一；以後、共通の６８ｂｐ挿入と称される）、さらなる相違塩基を有する他の集団（ＨＧ１９と約９４％同一）よりも一般集団において多く見られ、ｇｎｏｍＡＤにおいてアフリカ民族の１６個体のみで同定される（以後、稀な６８ｂｐ挿入と表す）。にもかかわらず、いずれかの対立遺伝子配列を用いて、６８ｂｐ挿入配列とリファレンスゲノム配列（例えば、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９またはＧＲＣｈ３８／ＨＧ３８）との間の類似性が高いとｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントを有するリードが標準的なゲノムアセンブリに強制アラインメントされ、それにより、挿入および／またはｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントの検出が複雑になり、偽コールに至る可能性がある。
この課題に取り組むために、６８ｂｐ挿入を含むリードおよび含まないリードを識別するための２つのカスタム足場（ＣＢＳ＿ＷＴおよびＣＢＳ＿ＭＵ）を構築した（図３）。ＣＢＳ＿ＷＴ足場は、正常な遺伝子型を表し、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９に基づいて５，０００ｂｐのＣＢＳ遺伝子領域をｃｈｒ２１：４４４８０００１－４４４８５０００に含む。ＣＢＳ＿ＭＵ足場は、挿入遺伝子型であり、ＣＢＳ＿ＷＴ足場と同一のゲノム領域＋共通６８ｂｐ挿入配列からなる。アラインメントアルゴリズムにおけるミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違に起因して、挿入を有するリードのみがＣＢＳ＿ＭＵ足場に対してアラインメントされるであろう。効率的なバリアントコーリングおよびフェージングを容易にするために、足場の３２１０位にさらなるＧ＞Ｃ塩基変化を含むＣＢＳ＿ＭＵ足場も構築した（ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０と命名する）。この位置の野生型塩基は、霊長類で高度に保存されており、１０００人ゲノムプロジェクトおよびｄｂＳＮＰ１５０データベースによると、多形性、病原性バリアントは知られていない。ＣＢＳ＿ＭＵ足場中で「Ｇ」から「Ｃ」に塩基が変更することにより、６８ｂｐ挿入を有するリードを容易に同定するための所定のバリアントリードのためのマーカーとして役立つ予想ミスマッチが作出される（図２ｂ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントが６８ｂｐ挿入と同一のペアエンドリードでも生じる場合、ＣＢＳ＿ＭＵ足場中の３２５２位の塩基変化として検出されるであろう（すなわち、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇ；図３ｃ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）。他方では、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントのみを含むリードは、ＣＢＳ＿ＷＴ足場に対してアラインメントされ、この病原性バリアントは、ＣＢＳ＿ＷＴ：３１８４Ａ＞Ｇと同定されるであろう（図３ａ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴ）。
シミュレートされたリードを用いたカスタマイズされた足場のアプローチの査定
リードマッピングの特異性についてカスタム足場を査定するために、全ての可能な遺伝子型の組み合わせを表すシミュレートされたリードを、ＡＲＴシミュレーションツールキットを使用して生成した。試験されたバリアントコールおよび対応するバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を表１にまとめ、これは遺伝子型コーリング過程における参照表としても機能する。使用したカスタム足場および所与のＣＢＳ遺伝子型のための各足場に対してアラインメントされるリードの百分率を示す。カスタムＣＢＳ＿ＭＵ足場が６８ｂｐ挿入配列を含むので、少なくとも１つの対立遺伝子上にｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８を含む任意のバリアント組み合わせがＭＵ：３２１０Ｃ＞Ｇでのバリアント頻度１００％であることに留意のこと。６８ｂｐ挿入を含む少数のリードもＣＢＳ＿ＷＴ足場に対してアラインメントされると考えられるので、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８またはｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］のいずれかがヘテロ接合性の試料は、ホモ接合性の試料と比較して、この足場へのリードマッピングが多いであろう。
表１
リードマッピングの特異性についてカスタム足場を査定するために、全ての可能な遺伝子型の組み合わせを表すシミュレートされたリードを、ＡＲＴシミュレーションツールキットを使用して生成した。試験されたバリアントコールおよび対応するバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を表１にまとめ、これは遺伝子型コーリング過程における参照表としても機能する。使用したカスタム足場および所与のＣＢＳ遺伝子型のための各足場に対してアラインメントされるリードの百分率を示す。カスタムＣＢＳ＿ＭＵ足場が６８ｂｐ挿入配列を含むので、少なくとも１つの対立遺伝子上にｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８を含む任意のバリアント組み合わせがＭＵ：３２１０Ｃ＞Ｇでのバリアント頻度１００％であることに留意のこと。６８ｂｐ挿入を含む少数のリードもＣＢＳ＿ＷＴ足場に対してアラインメントされると考えられるので、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８またはｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］のいずれかがヘテロ接合性の試料は、ホモ接合性の試料と比較して、この足場へのリードマッピングが多いであろう。
表１
予想通り、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントのみを含むリードが、ＣＢＳ＿ＷＴ足場のみに対してアラインメントされた（図３ａ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴのＲｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵとの比較）。ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントを含むリードは、ＣＢＳ＿ＭＵ足場に優先的にアラインメントされ（図３ｂ－ｄ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０でのＧ＞Ｃリードアウトが１００％ＶＡＦであることによって容易に同定されたのに対して、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇでの塩基変化（これも１００％ＶＡＦ）の同時出現は、６８ｂｐ挿入がシス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを有することを示した（図３ｃ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ）。挿入配列とリファレンス配列との間の相同性が高いので、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８配列を含むリードの画分も、非アラインメントリード末端のソフトクリッピングに起因して、ＣＢＳ＿ＷＴ足場にアラインメントされた。得られたカバレッジ深度の増加は、構造バリアントが存在することを示唆し得る；しかしながら、バリアントコーラーがソフトクリッピングされた塩基を無視するので、６８ｂｐ挿入配列はそのまま同定されない（図３ｂ、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴ）。また、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ足場を使用して、ｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の２つのコピー（一方はシス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含み、他方は反対の対立遺伝子上に含む（表１、最後の行））を含む試料の遺伝子型を決定した。この場合、それぞれ１００％および５０％のＶＡＦでのＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０Ｇ＞ＣおよびＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇの塩基変化により、複合ヘテロ接合性が同定されるであろう。あるいは、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃがｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］に対してトランスで生じる場合、ＣＢＳ＿ＭＵ足場およびＣＢＳ＿ＷＴ足場の両方に対するリードアラインメントは、検出のためにＣＢＳ＿ＷＴ：３１８４Ａ＞Ｇ、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０Ｇ＞Ｃ、およびＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２Ａ＞Ｇをそれぞれ約６０％、１００％、および１００％のＶＡＦで使用する必要があるであろう（表１、最後から２番目の行；図３ｄ）。両方の対立遺伝子上にｃ．８３３Ｔ＞Ｃが存在することにより、ＣＢＳ＿ＷＴ：３１８４Ａ＞ＧについてのＶＡＦが１００％から約６０％までの減少することが予想される。
カスタム足場アプローチと比較して、ＨＧ１９リファレンスゲノムに対するアラインメントは、ＣＢＳバリアントの検出およびフェージングに難題をもたらした（図３ｂ～ｄ、Ｒｅｆ：ＨＧ１９）。６８ｂｐ挿入が本質的に野生型配列の重複であるので、このバリアントを含む全てのリードは、単独またはｃ．８３３Ｔ＞Ｃとの組み合わせのいずれであっても、左側および右側のブレークポイントでの非アラインメントリード末端のソフトクリッピングによってＨＧ１９リファレンスゲノムに対して強制的にアラインメントされた。結果としてのリードカバレッジの増加は、挿入（図３ｂ～ｄ、Ｒｅｆ：ＨＧ１９）を示し得るが、挿入配列中に野生型ｃ．８３３Ｔ塩基がさらに存在するので、ｃｈｒ２１：４４４８３１８４でのｃ．８３３Ｔ＞Ｃ対立遺伝子頻度は、バリアントコーリング閾値未満に低下し、それにより、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントの検出に影響を及ぼし得る（図３ｃ、Ｒｅｆ：ＨＧ１９）。対照的に、病原性バリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃのみを含むリードは、ＨＧ１９リファレンス配列と容易にアラインメントされ、バリアントは、ｃｈｒ２１：４４４８３１８４で容易に検出された（図３ａ、Ｒｅｆ：ＨＧ１９）。トランス位にｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントを含むバリアントを含むリードのアラインメントは、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ自体のプロフィールと類似するプロフィールを有していたが、ｃｈｒ２１：４４４８３１８４での変異塩基についての対立遺伝子頻度はより低かった（図３ｄ、Ｒｅｆ：ＨＧ１９）。
カスタマイズされた足場対アラインメントリファレンスとしての一次配列の比較による査定
カスタム足場アプローチの性能をさらに評価するために、ＣＢＳバリアントコールと、１０００人ゲノムプロジェクトトリオ、ＣＥＰＨ／ＵＴＡＨ家系ＮＡ１２８７８／ＮＡ１２８９１／ＮＡ１２８９２、およびＹＲＩ家系ＮＡ１９２４０／ＮＡ１９２３９／ＮＡ１９２３８についてのＮＧＳデータ分析による単一のリファレンスゲノムマッピング由来のコールとを比較した。サンガー配列決定を使用して、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントがＮＡ１２８９２（ＣＥＰＨの母）、ＮＡ１９２４０（ＹＲＩの娘）、およびＮＡ１９２３８（ＹＲＩの母）に存在することが同定および確認されている。メンデル遺伝学によって推定したところ、３つ全ての細胞株において２つのバリアントがシス位にあると決定された。
カスタム足場アプローチの性能をさらに評価するために、ＣＢＳバリアントコールと、１０００人ゲノムプロジェクトトリオ、ＣＥＰＨ／ＵＴＡＨ家系ＮＡ１２８７８／ＮＡ１２８９１／ＮＡ１２８９２、およびＹＲＩ家系ＮＡ１９２４０／ＮＡ１９２３９／ＮＡ１９２３８についてのＮＧＳデータ分析による単一のリファレンスゲノムマッピング由来のコールとを比較した。サンガー配列決定を使用して、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８バリアントがＮＡ１２８９２（ＣＥＰＨの母）、ＮＡ１９２４０（ＹＲＩの娘）、およびＮＡ１９２３８（ＹＲＩの母）に存在することが同定および確認されている。メンデル遺伝学によって推定したところ、３つ全ての細胞株において２つのバリアントがシス位にあると決定された。
リファレンスとしてカスタム足場を使用して、３つ全ての１０００人ゲノムプロジェクト試料は、ＣＢＳ＿ＭＵ：３２１０およびＣＢＳ＿ＭＵ：３２５２での塩基変化によって示すように（図６）シス位に６８ｂｐ挿入を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントが正確に遺伝子型同定された（Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵおよびＲｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴ）。したがって、図６は、本開示の実施形態にしたがってカスタム足場を使用した２つの１０００Ｇトリオ中のｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の検出を示す。ＣＥＰＨ（ａ～ｃ）およびＹＲＩトリオ（ｄ～ｆ）についてのカスタム足場Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ上のリードアラインメントを示す。特徴的なアラインメントプロフィールは、ＣＥＰＨの母（ｂ）およびＹＲＩの母－娘のデュオ（ｄ、ｅ）がｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントを保有することを示す。リファレンスとしてＨＧ１９使用した場合、リードアラインメントプロフィールは、ＣＥＰＨおよびＹＲＩトリオの全てのメンバーと類似する（ｂ～ｅ）。矢印は、バリアントコーリングのために使用される有益な塩基を指し示す。６８ｂｐ挿入配列とＨＧ１９リファレンス配列との間の２つの相違塩基を、小さな矢印によって示す。挿入配列の末端の第３の相違塩基は、ソフトクリッピングに起因してアラインメント中に認められない。
両方のトリオにおけるｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の対立遺伝子分離は、予想されるメンデル遺伝パターンに対応し、それにより、カスタム足場法によるフェーズ割り付けが正確であることが確認された。しかしながら、ＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ビルドをリファレンスとして使用した場合、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントを含む試料由来のリードは、リファレンスゲノムに対してマッピングされるように取り組まれ、６８ｂｐ挿入のみを直接検出することができるか、リードカバレッジの増加に基づいてアラインメント中の構造バリアントと推測することができる（図６、Ｒｅｆ：ＨＧ１９）。
１０００人ゲノムプロジェクト（ＮＣＢＩ１０００Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｐｈａｓｅ ３，ｖｅｒ３．７）由来のバリアントデータのより綿密な試験から、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントはＮＡ１９２４０、ＮＡ１９２３８のいずれについても呼び出されなかったことが明らかとなった；これらのバリアントについてのＣＢＳ遺伝子型データはＮＡ１２８９１については利用できなかった。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃについての全集団のキャリア率は、１０００人ゲノムプロジェクトにおいては０．０２％（２０１９年１１月３０日にアクセス）、およびｇｎｏｍＡＤについては０．１５％（２０１９年１１月３０日にアクセス）であることが見出された；１０００Ｇｅｎｏｍｅｓデータセットのいずれかにおける複合バリアントの頻度に関する情報は、利用できなかった。この見かけ上の矛盾は、ＮＧＳアラインメント法を使用したので、シス位に６８ｂｐ挿入が生じた場合に２つのトリオにおいて１０００人ゲノムプロジェクトによってｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントが喪失した可能性が高いことを示唆している。ＮＧＳデータをさらに調査するために、本発明者らは、第２のコーリング法ＧＡＴＫ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｃａｌｌｅｒ（ｖｅｒ．４）を使用し、これは、変動のある任意の領域についてのＳＮＰおよびインデルを同時に検出するために既存のマッピングデータの代わりにリードの局所ｄｅ ｎｏｖｏ再アセンブリを使用する。アセンブリしたリードを再アラインメントするためのリファレンスとしてＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９を使用して、ＧＡＴＫ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｃａｌｌｅｒは、ＮＡ１９２４０、ＮＡ１９２３８、およびＮＡ１２８９１中のシスバリアントを正確に呼び出した。したがって、領域の変動レベルを考慮することができるさらなる分析法を用いることなく、これらの所見は、標準的なリファレンスゲノムに対してリードをアラインメントしたときにＣＢＳバリアントの予想検出限度と一致した。
カスタマイズされた足場を使用した臨床標本を用いたＣＢＳバリアント分析
カスタマイズされた足場アプローチを、キャリア試験のために参照された全米から入手した６０，３１８個の連続標本の分析に適用した（表２）。キャリア率は、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントについては１８．４９％、病原性ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントについては０．１７％と決定された。これらの試験においてｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］について認められたキャリア率は、アフリカ人／アフリカ系アメリカ人における４０％までおよびアメリカ先住民集団における１％未満という一般集団頻度について報告された範囲と一致している。少数の臨床例（０．０１２％）について、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃは、一方の染色体上に良性の複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の一部として、および他方の染色体上の病原性の単一ヌクレオチドバリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃとしても検出された（図７）。トランス位に６８ｂｐ挿入を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントの出現は、本発明者らの標本セットでは認められず、これは公開された集団研究と一致している。
カスタマイズされた足場アプローチを、キャリア試験のために参照された全米から入手した６０，３１８個の連続標本の分析に適用した（表２）。キャリア率は、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントについては１８．４９％、病原性ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントについては０．１７％と決定された。これらの試験においてｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］について認められたキャリア率は、アフリカ人／アフリカ系アメリカ人における４０％までおよびアメリカ先住民集団における１％未満という一般集団頻度について報告された範囲と一致している。少数の臨床例（０．０１２％）について、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃは、一方の染色体上に良性の複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の一部として、および他方の染色体上の病原性の単一ヌクレオチドバリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃとしても検出された（図７）。トランス位に６８ｂｐ挿入を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントの出現は、本発明者らの標本セットでは認められず、これは公開された集団研究と一致している。
図７は、本開示の実施形態のトランスで複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃ単一ヌクレオチドバリアントの検出を示す。カスタム足場およびＨＧ１９ゲノムアセンブリを使用したリードアセンブリの比較を、病原性バリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃがｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントに対してヘテロ接合性である臨床試料についてＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒを使用して示す。矢印は、足場およびＨＧ１９上のバリアント検出についての有益な塩基の位置を示す。ＨＧ１９をリファレンスとして使用して、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃは、予想される座標で明確に検出されるが、６８ｂｐ挿入は検出されない。ＤＮＡ配列を塩基毎のカバレッジトラック上に示し、６８ｂｐ挿入配列とＨＧ１９リファレンス配列との間で相違することが公知の塩基のうちの２つを、Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴアラインメントおよびＲｅｆ：ＨＧ１９アラインメント中に小さな矢印によって示す。
表２
表２
民族性を自己報告した１８６１個の臨床試料のサブセットを、異なる群のキャリア率を評価するためにさらに分析した。比較として、ｇｎｏｍＡＤにおけるｃ．８３３Ｔ＞Ｃ（ｒｓ５７４２９０５）についての染色体ベースの集団頻度を抽出し、キャリア率に変換した。表２は、全体のｃ．８３３Ｔ＞Ｃキャリア率（全ての民族）とヨーロッパ系の個体についてのｃ．８３３Ｔ＞Ｃキャリア率は、ｇｎｏｍＡＤと本研究との間で非常に類似していた。同様に、この研究で分析した異なる民族群の間のｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントについての集団頻度は、東アジア人群を除いて、ｇｎｏｍＡＤで見出された頻度と一致していた（表２）。東アジア人群について、臨床標本中のキャリア率は、ｇｎｏｍＡＤでははるかに高く、中国人集団で以前に報告されたキャリア率に酷似していた。さらに、種々の民族の８５試料を、ＣＢＳ＿ＭＵ足場を使用して、シス位に稀な６８ｂｐ挿入配列を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃがヘテロ接合性と同定された。これらのうち、１４試料は、共通の６８ｂｐ挿入配列含むｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントを含む複合ヘテロ接合体であった（図８）。したがって、図８は、ＣＢＳ＿ＭＵ足場による臨床試料中の稀な６８ｂｐ挿入の検出を示す。６８ｂｐ挿入の稀な対立遺伝子がヘテロ接合性の試料（ａ）、および共にシス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む稀なおよび共通の６８ｂｐ挿入対立遺伝子が複合ヘテロ接合体である試料（ｂ）の代表例を示す。稀な６８ｂｐ挿入対立遺伝子を含むリードがＲｅｆ：ＣＢＳ＿ＭＵ足場上のＭＵ：３２３９でのさらなるリードアウトによって検出されることが認められる。Ｒｅｆ：ＣＢＳ＿ＷＴアラインメントおよびＲｅｆ：ＨＧ１９アラインメント中の小さな矢印によって示された塩基は、６８ｂｐ挿入配列とＨＧ１９リファレンス配列との間で異なる。稀な６８ｂｐ挿入対立遺伝子中の２つの他の相違塩基は、配列の最末端に生じるためにソフトクリッピングされ、アラインメント中に認められない。分析は、カスタム足場アプローチが、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントの同定に失敗した他の集団データベース（例えば、１０００Ｇｅｎｏｍｅｓ）のために使用されてきた方法と比較して、ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントおよび６８ｂｐ挿入などの困難なバリアントの検出およびフェージングを改善することをさらに実証した。
ヒトゲノムＤＮＡを用いたハイスループット配列バリアント検出におけるＮＧＳの成功は、ここ何年かで臨床遺伝子検査分野を改革してきた。単一のヌクレオチドバリアントおよび小さな挿入または欠失バリアントの検出のためのＮＧＳの性能は、リードアラインメントのための現在の標準的なヒトリファレンスゲノムビルドを使用しても精度が高い。しかしながら、単一のリファレンスゲノムアプローチは、異なるハプロタイプ由来のリードが同一のゲノム領域に強制的にアラインメントされ、それにより、偽陽性および偽陽性のコールが得られるので、重複、偽遺伝子、パラロガス遺伝子、または複合バリアントを含む領域中のバリアント検出は、時折うまくいかない。この研究では、２つの臨床的に重要なＣＢＳバリアントを例として使用して、カスタマイズされたバリアント特異的足場アプローチが、これらの複合領域についてのリードをハプロタイプによって分離することを可能にすることが見出された。高度に保存された塩基に予め定義したミスマッチに組み込んで、バリアントコールの効率的な選別およびフェージングのための変異足場をさらにカスタマイズする。開示のカスタム足場アラインメント法を、容易に拡大および適合させて、高額の装置、計算法の大規模なカスタマイズを必要とすることなく、他の技術的に困難な標的バリアントを検出することができる。現在のヒトリファレンスゲノムビルドを利用する標準的なＮＧＳパイプラインと組み合わせて適用する場合、開示の方法は、バリアントコーリングプロセスの性能を改善することができる。
カスタム足場アプローチは、バリアント型の決定および感度および精度の高いフェージング情報の取得を可能にする。入力としてシミュレートされた短いリードを使用して、全てのバリアントおよびＣＢＳ複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］についてはフェージング組み合わせの問題が首尾よく解決され、それにより、アッセイの感度および特異性が改善された。１０００人ゲノムプロジェクト由来の２つの広く研究されたトリオの分析から、メンデル遺伝パターンについて予想されるように分離した親子デュオにおいてｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントの存在が明らかとなり、これは、代表的なサンガー配列決定の結果と一致していた。
標準的なゲノムリファレンスに対してリードを直接アラインメントしたコーラーを用いてこのバリアントを検出しようとしても、さらなるアルゴリズム（ＧＡＴＫ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｃａｌｌｅｒ中のアルゴリズムなど）が使用されない限り、成功しなかった。また、ｃ．８３３Ｔ野生型塩基も含む６８ｂｐ挿入の配列が、リファレンスゲノムの配列とほとんど同一であることを考慮すると、シス位で生じたときにｃ．８３３Ｔ＞Ｃのバリアント対立遺伝子頻度が過小評価されることが見出されることは驚くべきことではなかった。１０００Ｇｅｎｏｍｅｓデータ中の稀なバリアントのフェージングおよび補完のエラーは、サンプルサイズが限られていたためであった。開示の実験は、初期のＮＧＳ分析で使用アラインメント法の結果として、１０００Ｇｅｎｏｍｅｓ試料中のｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントが未検出のままであったかもしれないこと、およびこれらのデータ中に他の複合バリアントまたは稀なバリアント（これらも過小報告された）が存在し得ることが示唆される。
カスタマイズされた足場を匿名の臨床試料（６０，０００標本超）の大規模コホートに適用して、病原性バリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃについての代表的な集団キャリア頻度データおよび良性の複合バリアントｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］についてのキャリア頻度を得た。これらの試料をキャリア試験から得たので、確認バイアスを除外することができないが、しかしながら、他者によって報告されているように、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］は、試料セット中に病原性ｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアント（０．１７％）よりもはるかに高い頻度で（１８．４９％）認められた。ｃ．８３３Ｔ＞Ｃについての認めら得た全頻度は、ｇｎｏｍＡＤにおける全頻度とほぼ同一であり、前述のｇｎｏｍＡＤは、健康な個体から本質的になり、したがって、臨床コホートに類似する。さらに、ｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の対立遺伝子頻度は、集団の民族性に依存して１００倍超変動することが報告されている。試料の小さなサブセット（約３．１％）を民族性によって対立遺伝子頻度を比較することも可能であった。標本数が限られていたにもかかわらず、結果は、東アジア人を除いて分析した民族集団についてｇｎｏｍＡＤと一致しており、このことは、東アジア人群の試料の本発明者らのデータセットにおける人口構成が異なっていたかもしれないことを示唆していた。共通の６８ｂｐ挿入対立遺伝子を使用してＣＢＳ＿ＭＵ足場をデザインしたにもかかわらず、シス位に稀なｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８対立遺伝子を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃバリアントが、この足場を使用して０．１４％の試料中に検出されたことも注目に値する。全てはｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］がヘテロ接合性であり、これらのうちの０．０２％は、共通の６８ｂｐ挿入対立遺伝子を有するｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］複合バリアントが複合ヘテロ接合性であり、これは、開示のアプローチが挿入の他のバリエーションを同定およびフェージングすることができることを示していた。興味深いことに、使用したコホート内で、トランス位にｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含むｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む６つの試料も同定され、遺伝子型頻度は０．０１２％であった。この複合ヘテロ接合性は、イタリアのコホートにおいて軽症型のホモシスチン尿症を罹患した患者で以前に同定されていたが、今までに、遺伝子型頻度情報は報告されていなかった。
したがって、１つの実施形態では、開示のカスタム足場アラインメントアプローチは、特殊な機器、試薬、またはソフトウェアのコストを加算することなく、標準的なＮＧＳパイプラインおよび現在のヒトリファレンスゲノムビルドを使用してバリアントを正確に呼び出しおよびフェージングすることができる。フェージング能がリード長に制限されるが、このアプローチは、困難な遺伝子内領域内（例えば、重複しているか他の遺伝子との相同性が高い領域内）に生じる複合構造バリアントの検出およびフェージングに特に好適である。２つの臨床的に重要なＣＢＳバリアントを使用して実証されるように、特にキャリア試験などの臨床試験のために稀なバリアントおよび／または複合バリアントを検出し、正確に遺伝子型同定することができれば、より良好な生殖リスクの査定が可能であり、患者ケアの管理において医師に指針を示すのに役立つであろう。
方法
細胞株および標本
１０００人ゲノムプロジェクト由来の２つの親子トリオ（ユタ州の北／西ヨーロッパ系の集団（ＣＥＰＨ／ＵＴＡＨ；ＮＡ１２８７８、ＮＡ１２８９１、およびＮＡ１２８９２）およびナイジェリアのイバダンのヨルバ族（ＹＲＩ；ＮＡ１９２４０、ＮＡ１９２３９およびＮＡ１９２３８）を示す）の細胞株ＤＮＡを、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から入手した。本発明者らのＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭキャリア試験パネルでの試験のために参照された臨床標本に関するＣＢＳゲノムデータを、本発明者らのＣＬＩＡ承認臨床試験研究所（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（登録商標）Ｈｏｌｄｉｎｇｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で入手した。
細胞株および標本
１０００人ゲノムプロジェクト由来の２つの親子トリオ（ユタ州の北／西ヨーロッパ系の集団（ＣＥＰＨ／ＵＴＡＨ；ＮＡ１２８７８、ＮＡ１２８９１、およびＮＡ１２８９２）およびナイジェリアのイバダンのヨルバ族（ＹＲＩ；ＮＡ１９２４０、ＮＡ１９２３９およびＮＡ１９２３８）を示す）の細胞株ＤＮＡを、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から入手した。本発明者らのＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭキャリア試験パネルでの試験のために参照された臨床標本に関するＣＢＳゲノムデータを、本発明者らのＣＬＩＡ承認臨床試験研究所（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（登録商標）Ｈｏｌｄｉｎｇｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で入手した。
以下の全ての手技は、ヒト実験において責任能力のある委員会（施設内および国家の）の倫理規範および１９７５年のヘルシンキ宣言（２０００年改訂）にしたがった。ヒト被験体保護のための米国連邦政府政策にしたがって、表示データの非識別化により、施設内審査委員会から適用が免除された（連邦行政令第４５編第４６部１０１（ｂ）（４））。試験を明示された時点で委託医師によって全ての患者から同意を得た。全ての標本は、この研究での使用前にＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓで方針および手技にしたがって非識別化された。
ＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭキャリア試験ＮＧＳパネル
ＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭＮＧＳキャリア試験は、ＣＢＳ遺伝子を含む多重遺伝子パネルである。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ法（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ライブラリの調製および標的の富化を行った。簡潔に述べれば、ゲノムＤＮＡを、超音波処理（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）によって断片化し、その後に末端修復、Ａテール化、およびアダプターのライゲーションを行った。標的富化工程を、約０．５Ｍ塩基を捕捉するためのカスタムデザインのＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡベイトを使用して行い、マルチプレックス配列決定のために捕捉後にライブラリにインデックスを付けた。９６ライブラリまでを共にプールし、ＭｉＳｅｑＶ３化学またはＨｉＳｅｑ２５００の急速運転モード（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のいずれかを使用して、１５×最小塩基カバレッジで、２×１５０サイクルにてペアエンド配列決定した。生配列決定データを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ ｖ．１．８．２ソフトウェアを用いて脱多重化して、各試料についてｆａｓｔｑ配列を生成した。
ＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭＮＧＳキャリア試験は、ＣＢＳ遺伝子を含む多重遺伝子パネルである。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ法（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ライブラリの調製および標的の富化を行った。簡潔に述べれば、ゲノムＤＮＡを、超音波処理（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）によって断片化し、その後に末端修復、Ａテール化、およびアダプターのライゲーションを行った。標的富化工程を、約０．５Ｍ塩基を捕捉するためのカスタムデザインのＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡベイトを使用して行い、マルチプレックス配列決定のために捕捉後にライブラリにインデックスを付けた。９６ライブラリまでを共にプールし、ＭｉＳｅｑＶ３化学またはＨｉＳｅｑ２５００の急速運転モード（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のいずれかを使用して、１５×最小塩基カバレッジで、２×１５０サイクルにてペアエンド配列決定した。生配列決定データを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ ｖ．１．８．２ソフトウェアを用いて脱多重化して、各試料についてｆａｓｔｑ配列を生成した。
バリアントの検出
ある特定の実施形態では、カスタマイズされた足場は、各々の困難なバリアントのためにデザインされ得る。かかる足場は、バリアント含むリードをバリアントを含まないリードと分離して、検出の感度および特異性を改善し得る。目的のバリアントに加えて、これらの足場は、さらなるデザインパラメータを含むこともできる。例として、６８ｂｐ挿入を含むＣＢＳ複合バリアントについて、塩基変化を、６８ｂｐ挿入の存在についてのリードアウトとして役立てるために、カスタム足場に導入した（６８ｂｐ挿入の内側）。本明細書中に詳述するように、足場中に塩基変化を有することにより、６８ｂｐ ｉｎｓと点変異（ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ）との間をフェージングすることもできる。Ｉｌｌｕｍｉｎａペア末端配列リードを、ＣＬＣｂｉｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｅｒ（バージョン９．１．１）およびＷｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン１０．１．１）（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した内部開発および確証済みのバリアント検出ワークフローのための入力として使用した。このワークフローは、２つの部門を有していた。主な部門では、最初にリードをトリミングしてライブラリのアダプター配列および低品質の塩基を除去し（Ｑ２０最小品質閾値）、次いで、これらをＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ヒトゲノムビルドに対してアラインメントし、その後に重複リードの除去、局所的再アラインメント、バリアント検出、および注釈付を行うことによって、ＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭパネルのための全ての配列決定リードを分析した。ＣＢＳバリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の検出およびフェージングのために、２つのカスタム足場に対するリードアラインメントのための第２のワークフロー部門を、リードトリミング工程後に実装した。第１の足場ＣＢＳ＿ＷＴは、ＨＧ１９リファレンス領域ｃｈｒ２１：４４４８０００１－４４４８５０００と同一であった。第２の足場ＣＢＳ＿ＭＵも同一の領域に由来していたが、共通の６８ｂｐ挿入に加えて、挿入を検出するためのマーカーとして役立つ６８ｂｐ挿入内にＧ＞Ｃ塩基変化が導入されていた。足場へのリードマッピング後、バリアントの分析およびフェージング決定前に重複リードを除去した。このワークフローベンチからの出力をメイン部門出力に送信して、最終バリアント報告を作成した。
ある特定の実施形態では、カスタマイズされた足場は、各々の困難なバリアントのためにデザインされ得る。かかる足場は、バリアント含むリードをバリアントを含まないリードと分離して、検出の感度および特異性を改善し得る。目的のバリアントに加えて、これらの足場は、さらなるデザインパラメータを含むこともできる。例として、６８ｂｐ挿入を含むＣＢＳ複合バリアントについて、塩基変化を、６８ｂｐ挿入の存在についてのリードアウトとして役立てるために、カスタム足場に導入した（６８ｂｐ挿入の内側）。本明細書中に詳述するように、足場中に塩基変化を有することにより、６８ｂｐ ｉｎｓと点変異（ｃ．８３３Ｔ＞Ｃ）との間をフェージングすることもできる。Ｉｌｌｕｍｉｎａペア末端配列リードを、ＣＬＣｂｉｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｅｒ（バージョン９．１．１）およびＷｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン１０．１．１）（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した内部開発および確証済みのバリアント検出ワークフローのための入力として使用した。このワークフローは、２つの部門を有していた。主な部門では、最初にリードをトリミングしてライブラリのアダプター配列および低品質の塩基を除去し（Ｑ２０最小品質閾値）、次いで、これらをＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ヒトゲノムビルドに対してアラインメントし、その後に重複リードの除去、局所的再アラインメント、バリアント検出、および注釈付を行うことによって、ＩｎｈｅｒｉｔｅｓｔＳＭパネルのための全ての配列決定リードを分析した。ＣＢＳバリアントｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．［８３３Ｔ＞Ｃ；８４４＿８４５ｉｎｓ６８］の検出およびフェージングのために、２つのカスタム足場に対するリードアラインメントのための第２のワークフロー部門を、リードトリミング工程後に実装した。第１の足場ＣＢＳ＿ＷＴは、ＨＧ１９リファレンス領域ｃｈｒ２１：４４４８０００１－４４４８５０００と同一であった。第２の足場ＣＢＳ＿ＭＵも同一の領域に由来していたが、共通の６８ｂｐ挿入に加えて、挿入を検出するためのマーカーとして役立つ６８ｂｐ挿入内にＧ＞Ｃ塩基変化が導入されていた。足場へのリードマッピング後、バリアントの分析およびフェージング決定前に重複リードを除去した。このワークフローベンチからの出力をメイン部門出力に送信して、最終バリアント報告を作成した。
また、１０００Ｇｅｎｏｍｅｓトリオ中の２つのＣＢＳバリアントの分析を、推奨されるＧＡＴＫベストプラクティスにしたがってＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ ｖｅｒ．４．０；Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中のＨａｐｌｏｔｙｐｅｃａｌｌｅｒを使用し、さらにリファレンス配列としてＧＲＣｈ３７／ＨＧ１９ビルドとして使用して実施した。シミュレートされたリードのアラインメントを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ，Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して可視化した。
バリアントリードのシミュレーション
自家製のＰｙｔｈｏｎスクリプトを、リードシミュレーションのためにプラットフォーム特異的エラーモデルおよび塩基品質プロフィールを使用するＡＲＴパッケージを利用して、シミュレートされたバリアントリードを作成するために開発した。この研究で使用したペアリードシミュレーションのパラメータは、以下の通りであった：２００×カバレッジ、リード長１５０ｂｐ、断片サイズ３００ｂｐ、断片サイズの標準偏差１００ｂｐ、およびＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑエラーモデル。ＡＲＴツールを使用したシミュレーションのための入力配列テンプレートは、全ての可能な遺伝子型および２つのＣＢＳ標的化バリアントであるｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８のフェージング組み合わせ、ならびに標的化バリアントのいずれかの末端側の５００個のさらなる隣接塩基を表していた。シミュレーション入力で使用したｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の全ての遺伝子型の組み合わせは、バリアントコーリング後に正確な遺伝子型の割り付けを報告することが確認されていた。
自家製のＰｙｔｈｏｎスクリプトを、リードシミュレーションのためにプラットフォーム特異的エラーモデルおよび塩基品質プロフィールを使用するＡＲＴパッケージを利用して、シミュレートされたバリアントリードを作成するために開発した。この研究で使用したペアリードシミュレーションのパラメータは、以下の通りであった：２００×カバレッジ、リード長１５０ｂｐ、断片サイズ３００ｂｐ、断片サイズの標準偏差１００ｂｐ、およびＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑエラーモデル。ＡＲＴツールを使用したシミュレーションのための入力配列テンプレートは、全ての可能な遺伝子型および２つのＣＢＳ標的化バリアントであるｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８のフェージング組み合わせ、ならびに標的化バリアントのいずれかの末端側の５００個のさらなる隣接塩基を表していた。シミュレーション入力で使用したｃ．８３３Ｔ＞Ｃおよびｃ．８４４＿８４５ｉｎｓ６８の全ての遺伝子型の組み合わせは、バリアントコーリング後に正確な遺伝子型の割り付けを報告することが確認されていた。
サンガー法での確認
ＮＧＳによって検出されたＣＢＳバリアントを、以下の内部でデザインされた標的特異的なＭ１３タグ化プライマーを用いたサンガー配列決定によって確認した：
順方向：５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴ－３’（配列番号４）
逆方向：５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＴＴ－３’（配列番号５）。
ＮＧＳによって検出されたＣＢＳバリアントを、以下の内部でデザインされた標的特異的なＭ１３タグ化プライマーを用いたサンガー配列決定によって確認した：
順方向：５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴ－３’（配列番号４）
逆方向：５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＴＴ－３’（配列番号５）。
ＰＣＲ増幅を、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ中の０．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｕＭ ｄＮＴＰ、および２５０ｎＭプライマーおよび以下のサイクリング条件を使用して行った：９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の伸長を３５サイクル；７２℃で３分間を１サイクル。サンガー配列決定を、ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して行った。ＡＢＩ３７３０ＸＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でのキャピラリー電気泳動。ＳｅｑＳｃａｐｅ ｖ２．５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、配列分析および可視化のために使用した。
ＰＣＲ増幅を、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ中の０．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｕＭ ｄＮＴＰ、および２５０ｎＭプライマーおよび以下のサイクリング条件を使用して行った：９５℃で１０分間を１サイクル；９５℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の伸長を３５サイクル；７２℃で３分間を１サイクル。サンガー配列決定を、ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して行った。ＡＢＩ３７３０ＸＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でのキャピラリー電気泳動。ＳｅｑＳｃａｐｅ ｖ２．５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、配列分析および可視化のために使用した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
試料中の複合遺伝子バリアントの存在または非存在を検出する方法であって、
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う、カウントする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
を含む、方法。
(項目２)
前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目４)
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体を処置する工程
をさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目５)
前記処置が、治療剤または規定食の変更である、項目４に記載の方法。
(項目６)
前記治療剤がビタミンＢ６であり、あるいは、前記食事の変更が低メチオニン食である、項目５に記載の方法。
(項目７)
前記複合バリアント配列が２つの変異を有する、項目１に記載の方法。
(項目８)
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、項目７に記載の方法。
(項目９)
前記複合遺伝子バリアントが、シスタチオニンベータ－シンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子の標的領域に存在する、項目１に記載の方法。
(項目１０)
前記変異足場および野生型足場は、（ｉ）シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉ）トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉｉ）ｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含まない前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、または（ｉｖ）前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含まないｃ．８３３Ｔ＞Ｃを有する配列を区別する、項目９に記載の方法。
(項目１１)
システムであって、
１またはそれを超えるプロセッサ；
前記１またはそれを超えるプロセッサに連結したメモリであって、前記メモリが、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能な複数の命令を記憶し、前記複数の命令が、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行されたときに、前記１またはそれを超えるプロセッサが、
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
を含む処理を行うための命令を含む、メモリ
を含む、システム。
(項目１２)
前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、項目１１に記載のシステム。
(項目１３)
前記処理が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、項目１１に記載のシステム。
(項目１４)
前記処理が、
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体に処置を開始する工程
をさらに含む、項目１１に記載のシステム。
(項目１５)
前記複合バリアント配列が２つの変異を有し、前記処理が、
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、項目１１に記載の方法。
(項目１６)
非一時的な機械可読記憶媒体において明白に具体化されるコンピュータプログラム製品であって、１またはそれを超えるデータプロセッサに以下を含む動作を実施させるように構成された命令を含む、コンピュータプログラム製品：
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程。
(項目１７)
前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目１８)
前記動作が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目１９)
前記動作が、
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体に処置を開始する工程
をさらに含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目２０)
前記複合バリアント配列が、２つの変異を有し、前記動作が、
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
試料中の複合遺伝子バリアントの存在または非存在を検出する方法であって、
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う、カウントする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
を含む、方法。
(項目２)
前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目４)
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体を処置する工程
をさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目５)
前記処置が、治療剤または規定食の変更である、項目４に記載の方法。
(項目６)
前記治療剤がビタミンＢ６であり、あるいは、前記食事の変更が低メチオニン食である、項目５に記載の方法。
(項目７)
前記複合バリアント配列が２つの変異を有する、項目１に記載の方法。
(項目８)
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、項目７に記載の方法。
(項目９)
前記複合遺伝子バリアントが、シスタチオニンベータ－シンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子の標的領域に存在する、項目１に記載の方法。
(項目１０)
前記変異足場および野生型足場は、（ｉ）シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉ）トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉｉ）ｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含まない前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、または（ｉｖ）前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含まないｃ．８３３Ｔ＞Ｃを有する配列を区別する、項目９に記載の方法。
(項目１１)
システムであって、
１またはそれを超えるプロセッサ；
前記１またはそれを超えるプロセッサに連結したメモリであって、前記メモリが、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能な複数の命令を記憶し、前記複数の命令が、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行されたときに、前記１またはそれを超えるプロセッサが、
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
を含む処理を行うための命令を含む、メモリ
を含む、システム。
(項目１２)
前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、項目１１に記載のシステム。
(項目１３)
前記処理が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、項目１１に記載のシステム。
(項目１４)
前記処理が、
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体に処置を開始する工程
をさらに含む、項目１１に記載のシステム。
(項目１５)
前記複合バリアント配列が２つの変異を有し、前記処理が、
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、項目１１に記載の方法。
(項目１６)
非一時的な機械可読記憶媒体において明白に具体化されるコンピュータプログラム製品であって、１またはそれを超えるデータプロセッサに以下を含む動作を実施させるように構成された命令を含む、コンピュータプログラム製品：
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程。
(項目１７)
前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目１８)
前記動作が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目１９)
前記動作が、
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体に処置を開始する工程
をさらに含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
(項目２０)
前記複合バリアント配列が、２つの変異を有し、前記動作が、
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、項目１６に記載のコンピュータプログラム製品。
Claims (20)
- 試料中の複合遺伝子バリアントの存在または非存在を検出する方法であって、
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う、カウントする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
を含む、方法。 - 前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、請求項１に記載の方法。 - 前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体を処置する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 前記処置が、治療剤または規定食の変更である、請求項４に記載の方法。
- 前記治療剤がビタミンＢ６であり、あるいは、前記食事の変更が低メチオニン食である、請求項５に記載の方法。
- 前記複合バリアント配列が２つの変異を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、請求項７に記載の方法。 - 前記複合遺伝子バリアントが、シスタチオニンベータ－シンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子の標的領域に存在する、請求項１に記載の方法。
- 前記変異足場および野生型足場は、（ｉ）シス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃ変異を含む６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉ）トランス位にｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含む前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、（ｉｉｉ）ｃ．８３３Ｔ＞Ｃを含まない前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を有する配列、または（ｉｖ）前記６８ｂｐ挿入［８４４＿８４５ｉｎｓ６８］を含まないｃ．８３３Ｔ＞Ｃを有する配列を区別する、請求項９に記載の方法。
- システムであって、
１またはそれを超えるプロセッサ；
前記１またはそれを超えるプロセッサに連結したメモリであって、前記メモリが、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行可能な複数の命令を記憶し、前記複数の命令が、前記１またはそれを超えるプロセッサによって実行されたときに、前記１またはそれを超えるプロセッサが、
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
を含む処理を行うための命令を含む、メモリ
を含む、システム。 - 前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、請求項１１に記載のシステム。 - 前記処理が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
- 前記処理が、
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体に処置を開始する工程
をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。 - 前記複合バリアント配列が２つの変異を有し、前記処理が、
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。 - 非一時的な機械可読記憶媒体において明白に具体化されるコンピュータプログラム製品であって、１またはそれを超えるデータプロセッサに以下を含む動作を実施させるように構成された命令を含む、コンピュータプログラム製品：
ゲノムの標的領域内に前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含む配列を含む変異足場を得る工程；
前記ゲノムの標的領域内に野生型配列を含む野生型足場を得る工程；
大規模並行型シーケンサーによって、配列リードを生成する標的領域について試料由来の核酸を配列決定する工程；
アラインメントアルゴリズムを使用した計算装置によって、前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記アラインメントアルゴリズムを使用した前記計算装置によって、前記野生型足場中に前記野生型配列を含むマッチング配列に、前記配列リードをマッピングする工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程であって、ここで、前記カウントによって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量および前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量を行う工程；
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が変異を含むかどうかを決定する工程；および
前記計算装置によって、前記試料が前記変異を含むかどうかの決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程。 - 前記変異足場が、前記複合バリアント配列、前記野生型配列のいずれにも見出されないさらなる人為的な遺伝的変動をさらに含む；
前記さらなる人為的な遺伝的変動が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異の存在および／またはフェージングのためのマーカーとして役立つ；
前記変異足場中の前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列に前記配列リードをマッピングする工程が、前記さらなる人為的な遺伝的変動に基づいて、前記配列リードと前記複合遺伝子バリアント配列を含むマッチング配列との間の予想ミスマッチを同定することを含む；および
前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードをカウントする工程が、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードおよび前記さらなる人為的な遺伝的変動をカウントすることを含む、請求項１６に記載のコンピュータプログラム製品。 - 前記動作が、前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を有する前記配列リードのみが前記変異足場に対してアラインメントされるように、ミスマッチコストとギャップペナルティコストの相違を用いて前記アラインメントアルゴリズムをパラメータ化する工程をさらに含む、請求項１６に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記動作が、
前記計算装置によって、前記複合遺伝子バリアント配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量対前記野生型配列を含む配列にマッピングされた配列リードの定量に基づいて、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むことを決定する工程；
前記計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むという決定に基づいて、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するという結果を出力する工程；および
前記試料中の前記複合遺伝子バリアントの存在にしたがって、前記試料に関連する被験体に処置を開始する工程
をさらに含む、請求項１６に記載のコンピュータプログラム製品。 - 前記複合バリアント配列が、２つの変異を有し、前記動作が、
前記変異足場中のマッチング配列への前記配列リードのマッピングに基づいて、前記２つの変異が同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかを決定する工程；および
計算装置によって、前記試料が前記複合遺伝子バリアントに特徴的な変異を含むかどうか、および前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在するかどうかの決定に基づいて、前記２つの変異が前記同一の染色体上（シス）または異なる染色体上（トランス）に存在することに関する表記を使用して、前記試料に前記複合遺伝子バリアントが存在するか存在しないという結果を出力する工程
をさらに含む、請求項１６に記載のコンピュータプログラム製品。
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