JP7054133B2 - 配列解析方法、配列解析装置、参照配列の生成方法、参照配列生成装置、プログラム、および記録媒体 - Google Patents

配列解析方法、配列解析装置、参照配列の生成方法、参照配列生成装置、プログラム、および記録媒体 Download PDF

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Description

本発明は、遺伝子の変異を解析するためにコンピュータによって実施される配列解析方法、配列解析装置、配列解析プログラム、および記録媒体に関する。
従来、遺伝子配列の解析は基礎研究、臨床研究、および医療のいずれにおいても重要なツールとして活用されている。近年では、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）が登場し、大量の遺伝子配列情報を高速かつ網羅的に得ることが可能になり、遺伝子配列の解析は、より広範囲の分野において活用されるようになった。
遺伝子配列の解析を活用する技術の一例として、ターゲットシーケンシングが挙げられる。ターゲットシーケンシングは、ゲノム配列全体のうち、ターゲット領域のみに限定して塩基配列を決定する手法である。ターゲットシーケンシングによって、遺伝性疾患の関連遺伝子、およびがん関連遺伝子などを含むターゲット領域の遺伝子配列のみを解析することが可能となり、シーケンスコストを低く抑えつつ、有用性の高い解析結果を得ることができる。
例えば、特定の疾患に関連する遺伝子に生じる複数の変異を、次世代シーケンサーを用いて詳細かつハイスループットに解析する遺伝子パネルは、疾患を診断するツールとして高い有用性が認められている。
特許文献１には、ターゲットシーケンシングによって得られるリード配列を迅速かつ効率的にマッピングする方法が開示されている。特許文献１に記載の方法では、ゲノム全体ではなく配列読取の対象となる標的領域のみの参照配列に対してリード配列をマッピングするため、計算効率が向上する。また、標的領域に類似するリード配列が誤って標的領域にマッピングされることを防止するため、リード配列のアライメントにおいて参照ゲノムの標的領域と類似する代替領域の参照配列も用いている。読み取られたリード配列に対する標的領域および代替領域の一致度をそれぞれ判定し、代替領域よりも標的領域に類似する場合に、リード配列は標的領域にマッピングされる。
特表２０１５－５３６６６１号公報
しかしながら、解析対象となる遺伝子の配列中には、多型、変異、およびメチル化などが生じる場合がある。例えば、欠損や挿入といった変異が生じている場合には、変異のない標的領域の参照配列を用いた場合にアライメント精度が低下する場合があった。
本発明は、配列中に多型、変異、およびバイサルファイト処理後のメチル化シトシンなどを含むリード配列を、より正確にマッピングする配列解析方法および配列解析装置等を実現することを目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る配列解析方法は、核酸配列を解析する方法であって、核酸配列から読み取られた複数のリード配列を取得する取得ステップと、それぞれのリード配列を、単一の参照配列を参照してアライメントすることにより核酸配列を決定する決定ステップと、を含み、参照配列中には、少なくとも第１の再編成配列、および、第１の再編成配列とは異なる第２の再編成配列を含む。
上記の構成によれば、核酸配列から読み取られた複数のリード配列を、複数の再編成配列を含む単一の参照配列を参照してアライメントする。これにより、解析対象の遺伝子の配列中に、多型、変異、およびメチル化などが生じている場合であっても、リード配列をより正確にマッピングすることができる。
また、再編成配列の数が変化した場合であっても、複数の再編成配列を含む単一の参照配列を参照してリード配列をアライメントするため、アライメントに用いる参照配列の数は変化しない。それゆえ、新しい変異に関する情報を、リード配列のアライメントに容易に反映させることができる。
「リード配列」とは、シーケンシングによって得られたポリヌクレオチド配列を意味する。「再編成配列」とは、ゲノム配列に含まれる野生型のエクソンなどに生じた公知の多型、変異、およびメチル化の少なくとも１つを含む該エクソンの部分配列または全配列である。
「参照配列」とは、リード配列が遺伝子上のどの領域に対応するか、およびリード配列が遺伝子上のどの変異に対応するかなどを判定するために、リード配列をマッピングする対象となる配列である。解析対象となる遺伝子毎に、参照配列として（１）野生型のエクソンの部分配列または全配列である野生型参照配列、および（２）野生型のエクソンの配列から公知の多型、変異を含む再編成配列を一繋がりに連結した単一の参照配列が用いられ得る。バイサルファイトシーケンスを行う場合は、バイサルファイト処理後に非メチル化シトシンがウラシルに変換された配列を野生型配列とし、シトシンのままの配列を再編成配列とすることができる。「マッピング」とは、各リード配列と、用いた参照配列中の塩基配列との一致度が高い領域に、該リード配列を整列させる処理を意味している。
「単一の参照配列」とは、解析対象となる遺伝子毎に、該解析対象となる遺伝子に関する２つ以上の再編成配列を１繋がりに連結して生成される配列である。単一の参照配列は、リード配列をマッピングするときに、再編成配列を含む唯一の参照配列として用いられる。
なお、バイサルファイトシーケンスとは、ＤＮＡのメチル化を解析する手法の１つである。ＤＮＡを構成する４種の塩基のうちシトシンがメチル化されてメチル化シトシンとなる場合があり、これをＤＮＡのメチル化と呼ぶ。バイサルファイトシーケンスは、このメチル化シトシンを検出するために用いられるシーケンス法である。バイサルファイトシーケンスでは、試料に含まれるＤＮＡをバイサルファイトで処理することにより、該ＤＮＡのメチル化されていないシトシンをウラシルに塩基置換する。一方、メチル化シトシンは、バイサルファイトによって処理されてもウラシルに塩基置換されない。このバイサルファイト処理の後に配列解析を行い、ウラシルに変換されなかったシトシンを決定することにより、試料ＤＮＡ中においてメチル化されていたシトシンを決定することができる。
「変異」とは、遺伝子の多型、置換およびＩｎＤｅｌなどの変異のうちの少なくともいずれかを意味する。「ＩｎＤｅｌ（Insertion and/or Deletion）」は、挿入、欠失、または、挿入および欠失の両方が含まれた変異を意味している。遺伝子の「多型」は、ＳＮＶ（Single Nucleotide Variant、一塩基多型）、ＶＮＴＲ（Variable Nucleotide of Tandem Repeat、反復配列多型）、およびＳＴＲＰ（Short Tandem Repeat Polymorphism、マイクロサテライト多型）などを含む。
再編成配列は、多型、変異、およびメチル化の少なくとも１つを含む配列であってもよい。
多型は、反復配列多型、マイクロサテライト、および一塩基多型のうちのいずれかであり、変異は、置換、欠失、および挿入のうちのいずれかであってもよい。
決定ステップにおいて、リード配列を参照配列と比較し、リード配列と参照配列との一致率が最も高い参照配列上の領域にリード配列をマッピングしてもよい。
決定ステップ以前に、第１の再編成配列と第２の再編成配列とを予め取得し、第１の再編成配列と第２の再編成配列とを含む参照配列を生成する参照配列生成ステップをさらに含んでいてもよい。
第１の再編成配列、および第２の再編成配列は、変異情報データベース（３、３ａ）から取得される既知変異情報に基づいて生成されてもよい。
「既知変異情報」とは、公開既知変異情報および公開されていない変異情報とを含んでいてもよい。「公開既知変異情報」は、変異に関する情報に限らず、多型、およびメチル化に関する情報も含んでいてもよい。また、既知変異情報は、公開既知変異情報と同様に、変異、多型、およびメチル化に関する情報を含んでいてもよい。
変異情報データベース（３、３ａ）には、既知変異情報と、既知変異情報が変異情報データベース（３、３ａ）に記憶された日時を示す情報とが関連付けられていてもよい。
参照配列生成ステップにおいて、第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が変異情報データベース（３、３ａ）に新たに記憶された場合、新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、第１の再編成配列、第２の再編成配列、および第３の再編成配列を含む参照配列を生成してもよい。
参照配列生成ステップにおいて、第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が変異情報データベース（３、３ａ）に新たに記憶された場合、新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、第１の再編成配列または第２の再編成配列に第３の再編成配列を連結して、参照配列を生成してもよい。
変異情報データベース（３、３ａ）に記憶された既知変異情報のそれぞれに個別の識別情報が付与されており、第１の再編成配列、第２の再編成配列、および第３の再編成配列は、それぞれ異なる識別情報が付与された既知変異情報に基づいて生成されてもよい。
第１の再編成配列および第２の再編成配列は、多型、変異、またはメチル化を含んでおり、第１の再編成配列および第２の再編成配列は、所定の多型、変異、メチル化を有するエクソンの部分配列または全配列であってもよい。
取得ステップにおいて、核酸配列のうち、複数のベイトを用いて選択された産物の核酸配列を読み取ることによって複数のリード配列を取得してもよい。
オリゴＤＮＡが、核酸配列を読み取るために用いられる部材表面に固定されていてもよい。核酸配列を読み取るために用いられる部材としては、例えば、図１３および図１４などに示すフローセルなどが挙げられる。
決定ステップにおいて、複数のリード配列の各々は、野生型参照配列および再編成配列を含む参照配列と比較されてもよい。
参照配列は、解析対象となる１以上の遺伝子について生成された再編成配列を含んでいてもよい。
リード配列の読み取りは、次世代シーケンサーを用いて実施されてもよい。
上記の課題を解決するために、本発明の別の態様に係る配列解析装置は、核酸配列を解析する配列解析装置（１）であって、核酸配列から読み取られた複数のリード配列を取得するリード配列情報取得部（１１１）と、それぞれのリード配列を、単一の参照配列を参照してアライメントすることにより核酸配列を決定する配列決定部（１１３）と、を備え、参照配列中には、少なくとも、第１の再編成配列、および、第１の再編成配列とは異なる第２の再編成配列を含む。
上記の構成によれば、核酸配列から読み取られた複数のリード配列を、複数の再編成配列を含む単一の参照配列を参照してアライメントする。これにより、解析対象の遺伝子の配列中に、多型、変異、およびメチル化などが生じている場合であっても、リード配列をより正確にマッピングすることができる。また、新しい変異に関する情報が単一の参照配列の中でアップロードできるため、再編成配列の数が変化した場合であっても、単一の参照配列を参照してリード配列をアライメントすることができ、解析プログラムのルーチンを改変しなくてもよい、という効果も奏する。
配列決定部（１１３）は、リード配列を参照配列と比較し、リード配列と参照配列との一致率が最も高い、参照配列上の領域を決定する構成であってもよい。
第１の再編成配列と第２の再編成配列とを含む参照配列を生成する参照配列生成部（１１５）とをさらに備えていてもよい。
参照配列管理部（１１２）は、第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いる既知変異情報を、変異情報データベース（３、３ａ）から取得してもよい。
参照配列生成部（１１５）は、第１の再編成配列、第２の再編成配列、および第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報に基づいて生成した第３の再編成配列を含む参照配列を生成してもよい。
参照配列生成部（１１５）は、第１の再編成配列または第２の再編成配列に、第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報に基づいて生成した第３の再編成配列を連結して、参照配列を生成してもよい。
変異情報データベース（３、３ａ）に記憶された既知変異情報のそれぞれに個別の識別情報が付与されており、参照配列管理部（１１２）は、第１の再編成配列、第２の再編成配列、および第３の再編成配列を、それぞれ異なる識別情報が付与された既知変異情報に基づいて生成してもよい。
配列決定部（１１３）は、複数のリード配列の各々を、野生型参照配列および参照配列と比較してもよい。
配列決定部（１１３）によって決定された核酸配列が参照配列、および野生型参照配列のいずれに一致するかに関する情報を出力する出力部（１４）をさらに備えていてもよい。
上記の課題を解決するために、本発明の別の態様に係る参照配列生成方法は、シーケンサー（２）によって読み取られたリード配列の核酸配列を決定するために用いられる参照配列の生成方法であって、第１の再編成配列および第２の再編成配列を取得する再編成配列取得ステップと、第１の再編成配列と第２の再編成配列とを一繋がりに連結した参照配列を生成する参照配列生成ステップとを含む。
上記の構成によれば、第１の再編成配列と第２の再編成配列とを一繋がりに連結して、単一の参照配列を生成する。このように生成された単一の参照配列を用いたアライメントすることにより、リード配列の核酸配列を決定すれば、上記配列解析方法と同様の効果を奏する。
第１の再編成配列および第２の再編成配列は、多型、変異、およびメチル化の少なくとも１つを含む配列であってもよい。
多型は、反復配列多型、マイクロサテライト、および一塩基多型のうちのいずれかであり、変異は、置換、欠失、および挿入のうちのいずれかであってもよい。
第１の再編成配列、および第２の再編成配列は、変異情報データベース（３、３ａ）から取得された情報に基づいて生成されてもよい。
変異情報データベース（３、３ａ）には、既知変異情報と、既知変異情報が変異情報データベース（３、３ａ）に記憶された日時を示す情報とが関連付けられていてもよい。
参照配列生成ステップにおいて、第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が変異情報データベース（３、３ａ）に新たに記憶された場合、新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、第１の再編成配列、第２の再編成配列、および第３の再編成配列を含む参照配列を生成してもよい。
参照配列生成ステップにおいて、第１の再編成配列および第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が変異情報データベース（３、３ａ）に新たに記憶された場合、新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、第１の再編成配列または第２の再編成配列に第３の再編成配列を連結して、参照配列を生成してもよい。
第１の再編成配列および第２の再編成配列は、多型、変異、またはメチル化を含んでおり、第１の再編成配列および第２の再編成配列は、多型、変異、メチル化を有するエクソンの部分配列または全配列であってもよい。
上記の課題を解決するために、本発明の別の態様に係る参照配列生成装置は、シーケンサー（２）によって読み取られたリード配列の核酸配列を決定するために用いられる参照配列を生成する参照配列生成装置であって、第１の再編成配列および第２の再編成配列を取得する参照配列管理部と、第１の再編成配列と第２の再編成配列とを一繋がりに連結した参照配列を生成する参照配列生成部とを備える。
上記の構成によれば、再編成配列の数が変化した場合であっても、リード配列をアライメントするために用いる参照配列の数は変化しない。それゆえ、新しい変異に関する情報を、リード配列のアライメントに容易に反映させることができる。
本発明の各態様に係る配列解析装置（１）は、コンピュータによって実現してもよい。また、コンピュータにて実現させる配列解析装置（１）のプログラム、およびそれを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体も、本発明の範疇に入る。
本発明によれば、解析対象の遺伝子の配列中に、多型、変異、およびメチル化などが生じている場合であっても、リード配列をより正確且つ効率的にマッピングすることができる。
配列解析装置の適用例を示す図である。 配列解析装置の一例を示す機能ブロック図である。 検査機関で実施される検査の処理の流れを示したフローチャートである。 外部の変異情報データベースからダウンロードした公開既知変異情報を用いて、参照配列を生成する方法の一例を説明する概念図である。 参照配列データベースのデータ構造の例を示す図である。 遺伝子パネル情報データベースのデータ構造の例を示す図である。 参照配列の生成方法の例を説明するイメージ図である。 参照配列の生成方法の別の例を説明するイメージ図である。 参照配列を生成および更新する処理の流れの一例を説明するフローチャートである。 試料ＤＮＡの塩基配列をシーケンサーによって解析するための前処理の手順の一例を説明するフローチャートである。 シーケンシングの手順の一例を説明するフローチャートである。 試料の断片化の工程（ａ）、およびインデックス配列およびアダプター配列の付与の工程（ｂ）の例について説明する図である。 ハイブリダイズの工程の一例について説明する図である。 解析対象となるＤＮＡ断片を回収する工程の一例について説明する図である。 ＤＮＡ断片をフローセルに供する工程の一例について説明する図である。 解析対象となるＤＮＡ断片を増幅する工程の一例について説明する図である。 シーケンシング工程の一例について説明する図である。 配列解析装置によるリード配列の解析の流れの一例を説明するフローチャートである。 リード配列情報のファイルフォーマットの一例を示す図である。 （ａ）は、配列決定部によるアライメントを説明する図であり、（ｂ）は、配列決定部のアライメント結果のフォーマットの一例を示す図である。 参照配列データベースの構造例を示す図である。 参照配列データベースに含まれる参照配列（野生型の配列を示すものでないもの）に組み込まれる既知の変異の例を示す図である。 アライメントの詳細な工程の一例を説明するフローチャートである。 参照配列を用いて行われるアライメントの概要を説明する図である。 リード配列と単一の参照配列とを比較することにより、リード配列のマッピングを行う処理の一例を示すフローチャートである。 スコア算出の一例を示す図である。 スコア算出の他の例を示す図である。 参照配列を用いた場合のスコア算出の一例を示す図である。 変異同定部が生成する結果ファイルのフォーマットの一例を示す図である。 変異データベースの構造の一例を示す図である。 変異データベース中の変異に関する情報の構造の詳細例を示す図である。 配列解析装置の適用の変形例を示す図である。 配列解析装置の適用の変形例を示す図である。
本実施の形態では、ＤＮＡを含む試料を、シーケンサーで配列を読み取るための長さに断片化し、それぞれのＤＮＡ断片の塩基配列をシーケンサーで読み取り、読み取ったリード配列を、変異を含む複数の再編成配列を一繋がりに連結した単一の参照配列にマッピングすることによってアライメントを行う。
複数の再編成配列を一繋がりに連結した単一の参照配列を利用しない場合、リード配列と２以上の再編成配列とを比較してリード配列のマッピングを行おうとすると、一般的には、まずマッピング対象のリード配列と野生型参照配列とを比較し、一つの再編成配列１を読み出して、該リード配列と再編成配列１とを比較する。次に、再編成配列２を読み出して、該リード配列と再編成配列２とを比較する。この方法では、リード配列と全ての再編成配列とを比較し終えるまで、１つずつ再編成配列を読み出してリード配列と比較する処理を繰り返す必要がある。
しかしながら、遺伝子に生じた変異に対する関心は、近年、益々高まっており、変異に関する情報は、今後も研究開発の進展に伴い全世界的に追加され、蓄積されるものと考えられる。それゆえ、リード配列のアライメントの際に、公知の変異を含む再編成配列の数は固定されるものではなく、徐々に増加したり、時には減少したりする。
１つずつ再編成配列を読み出してリード配列と比較する上述した一般的な方法では、公知の変異に関する情報がアップロードされたり、削除されたりして、公知の変異を含む再編成配列の数が変化した場合に、読み出すべき再編成配列を追加したり削除したりするためのプログラムルーチンを改変する必要がある。
一方、本実施の形態では、リード配列を、野生型参照配列と比較した後、複数の再編成配列を一繋がりに連結した単一の参照配列と比較し、リード配列との一致率が所定の基準を満たす参照配列上の位置を特定する。
このように、本実施の形態では、複数の再編成配列を一繋がりに連結した参照配列を用いることによって、再編成配列の数が変化した場合であっても、単一の参照配列の中で新しい変異に関する情報をアップロードできるため、プログラムルーチンを改変しなくてもよいという利点がある。
本発明の実施形態について、詳細に説明する。
以下では、本発明の実施形態に係る配列解析装置１が、検査機関１１０に設置されている場合を例に挙げて説明する。図１は、配列解析装置１の適用例を示す図である。
（検査機関１１０）
検査機関１１０は、１または複数の医療機関２１０から届けられる試料を検査・解析して、解析結果を医療機関２１０に提供する機関である。検査機関１１０には、図１に示すように、１台または複数台のシーケンサー２、および配列解析装置１などが設置されている。
図１に示す検査機関１１０では、医療機関２１０からの解析依頼に応じて、試料が解析され、解析結果に基づいて解析報告書が作成される。ここで、「試料」とは、「サンプル」とも換言でき、当該分野において標本、調製物と同義で用いられ、供給源としての生物材料（例えば、個体、血液、体液、尿、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる任意の調製物が意図される。
（変異情報データベース３）
図１に示す変異情報データベース３は、検査機関１１０の外部において管理されている公開配列情報データベースおよび公開既知変異情報データベースなどである。公開配列情報データベースとしては、NCBI RefSeq（ウェブページ、www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）、NCBI GenBank（ウェブページ、www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）、UCSC Genome Browserなどが挙げられる。また、公開既知変異情報データベースとしては、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ウェブページ、www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/）、ＣｌｉｎＶａｒデータベース（ウェブページ、www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）およびdbSNP（ウェブページ、www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）などが挙げられる。なお、変異情報データベース３は、公開既知変異に関し、人種あるいは動物種別毎の頻度情報を含む公開既知変異情報データベースであってもよい。このような情報を有する公開既知変異情報データベースとしては、HapMap Genome Browser release #28、Human Genetic Variation Browser（ウェブページ、www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/SnpDB/index.html）および1000 Genomes（ウェブページ、www.1000genomes.org/）が挙げられ、これらのデータベースからは、例えば、日本人の変異頻度情報などを入手することができる。
（シーケンサー２）
シーケンサー２は、試料に含まれる遺伝子の塩基配列を読み取るために利用される解析装置であり、例えば、ＤＮＡ断片の塩基配列を同時並行で大量に読み取ることが可能な次世代シーケンサーであることが望ましい。次世代シーケンサーは、近年開発の進められている一群の塩基配列解析装置であり、クローン的に増幅したＤＮＡテンプレートまたは単独ＤＮＡ分子をフローセル内で大量に並列処理を行うことによって、飛躍的に向上した解析能力を有している。
シーケンサー２に適用可能なシークエンシング技術の例としては、イオン半導体シークエンシング、ピロシークエンシング（pyrosequencing）、可逆色素ターミネータを使用するシークエンシング・バイ・シンセシス（sequencing-by-synthesis）、シークエンシング・バイ・リゲーション（sequencing-by-ligation）、およびオリゴヌクレオチドのプローブ結紮によるシークエンシングなどの、１ラン当たりに多数のリード配列を取得可能なシーケンシング技術が挙げられる。
シーケンシングに用いるシーケンシングプライマーは特に限定されず、目的の領域を増幅させるのに適した配列に基づいて、適宜設定される。また、シーケンシングに用いられる試薬についても、用いるシーケンシング技術およびシーケンサー２に応じて好適な試薬を選択すればよい。
（配列解析装置１の構成）
配列解析装置１は、核酸配列から読み取られた複数のリード配列を取得して、それぞれのリード配列を、第１の再編成配列および第２の再編成配列を少なくとも含む単一の参照配列を参照してアライメントすることにより核酸配列を決定する装置である。
図２に示す配列解析装置１は、配列解析装置１が備える各部を統括して制御する制御部１１、制御部１１が使用する各種データを記憶する記憶部１２、出力部１４、入力部１５、および通信部１６を備えている。制御部１１は、ＣＰＵ等のプロセッサであり、リード配列情報取得部１１１、配列決定部１１３、変異同定部１１４、参照配列管理部１１２および参照配列生成部１１５を備えている。記憶部１２は、ハードディスクドライブ等であり、遺伝子パネル情報データベース１２１、参照配列データベース１２２、および変異データベース１２３が記憶されている。また、記憶部１２には、配列解析のためのプログラム、単一の参照配列を生成するためのプログラム等も記憶されている。出力部１４は、ディスプレイ、プリンタ、スピーカ等を含む。入力部１５は、キーボード、マウス、タッチセンサ等を含む。また、タッチセンサとディスプレイとが一体化されたタッチパネルのような、入力部および出力部の双方の機能を有する装置を用いてもよい。通信部１６は、制御部１１が外部の装置と通信するためのインターフェースである。
図３は、医療機関２１０から解析依頼を受け付けた場合に検査機関１１０で実施される検査の処理の流れを示したフローチャートである。まず、検査機関１１０では、配列解析に用いる単一の参照配列を生成する処理が行われる（ステップＳ５１）。
（ステップＳ５１：単一の参照配列の生成処理）
ステップＳ５１の処理は、制御部１１の参照配列管理部１１２および参照配列生成部１１５によって行われる。図４は、外部の変異情報データベース３からダウンロードした公開既知変異情報を用いて、参照配列を生成する方法の一例を説明する概念図である。
図４では、染色体位置「ｘｘｘｘ」の遺伝子「ＥＧＦＲ」に生じた変異「Ｃ７９７Ｓ」に関する情報が、研究機関Ｐから外部の変異情報データベース３に新たにアップロードされ、変異情報データベース３に記憶された場合を例に挙げている。研究機関Ｐからアップロードされた、遺伝子名「ＥＧＦＲ」の遺伝子の染色体位置「ｘｘｘｘ」に生じた変異「Ｃ７９７Ｓ」に関する情報は、外部の変異情報データベース３において、変異ＩＤ「ｙｙｙｙ」およびアップロード日「ｚｚ年ｚ月ｚ日」などと関連付けられて、公開既知変異情報として登録される。新たにアップロードされた情報としてここに例示した変異は、遺伝子「ＥＧＦＲ」から転写・翻訳された遺伝子産物であるタンパク質「ＥＧＦＲ」の７９７番目のアミノ酸残基がシステインからセリンに置換された変異である。なお、外部の変異情報データベース３には、このような変異に限定されず、多型、変異、およびメチル化などに関する情報が集められ、記憶されていてもよい。
参照配列管理部１１２は、変異情報データベース３に対して変異情報要求を送信し、変異情報データベース３から公開既知変異情報をダウンロードする。参照配列管理部１１２は、前回、公開既知変異情報をダウンロードした日以降に変異情報データベース３にアップロードされた公開既知変異情報のみをダウンロードする構成であってもよい。この構成によれば、例えば、参照配列管理部１１２が変異情報データベース３から公開既知変異情報を「ｚｚ年ｚ月ｚ日」以前にもダウンロードしていた場合、参照配列管理部１１２は、前回ダウンロードした公開既知変異情報のダウンロードは行わない。図４において、参照配列管理部１１２が「ｚｚ年ｚ月ｚ日」の前日に変異情報データベース３から公開既知変異情報をダウンロードし、翌「ｚｚ年ｚ月ｚ日」にも変異情報要求を送信した場合、参照配列管理部１１２は、「ｚｚ年ｚ月ｚ日」にアップロードされて新しく公開既知変異情報として登録された、遺伝子名「ＥＧＦＲ」の変異「Ｃ７９７Ｓ」に関する情報のみをダウンロードしてもよい。
なお、参照配列管理部１１２は、配列解析装置１の解析対象のすべての遺伝子についての公開既知変異情報を定期的（例えば、１か月に１回、１週間に１回、および２日に１回など）に変異情報データベース３からダウンロードする構成であってもよい。または、配列解析装置１を使用するユーザによって入力部１５から入力された遺伝子パネル名に関連付けられた遺伝子パネルの解析対象となる１または複数の遺伝子、および遺伝子名などに対応する遺伝子について、該ユーザの指示に従って公開既知変異情報をダウンロードする構成であってもよい。この場合、参照配列管理部１１２は、遺伝子パネル情報データベース１２１を参照して、公開既知変異情報をダウンロードすべき遺伝子を決定する。なお、ユーザの指示に従って公開既知変異情報をダウンロードする構成の場合、参照配列管理部１１２は、前回、公開既知変異情報をダウンロードした日をユーザに対して提示してもよい。これにより、ダウンロードされている公開既知公開情報が新しく適切なものであるか否かを事前にユーザに知らせることができる。
ここで、入力部１５を介して遺伝子パネルに関する情報が入力された場合に、参照配列管理部１１２が参照する遺伝子パネル情報データベース１２１に記憶されているデータについて、図５を用いて説明する。図５は、遺伝子パネル情報データベース１２１のデータ構造の例を示す図である。
遺伝子パネル情報データベース１２１には、図５に示すデータ１２１Ａのように、遺伝子パネルの解析対象となり得る遺伝子の名称が遺伝子毎に付与された遺伝子ＩＤに関連付けて記憶されている。また、遺伝子パネル情報データベース１２１には、図５に示すデータ１２１Ｂのように、選択可能な遺伝子パネルの名称、各遺伝子パネルに付与された遺伝子パネルＩＤ、および各遺伝子パネルが解析対象としている遺伝子の遺伝子ＩＤが関連付けて記憶されている。
入力部１５から、ユーザによって遺伝子パネル名が入力された場合、参照配列管理部１１２は、遺伝子パネル情報データベース１２１を参照して、入力された遺伝子パネル名に関連付けられた遺伝子名、遺伝子パネルＩＤおよび関連する遺伝子ＩＤを抽出してもよい。
入力部１５から、ユーザによって遺伝子名が入力された場合、参照配列管理部１１２は、遺伝子パネル情報データベース１２１を参照して、入力された遺伝子名に関連付けられた遺伝子ＩＤ、およびこれらの遺伝子ＩＤが関連付けられた遺伝子パネルの遺伝子パネルＩＤを抽出してもよい。
なお、遺伝子パネル情報データベース１２１には、図５に示すデータ１２１Ｃのように、疾病に関する遺伝子パネルの名称および各遺伝子パネルの解析対象となる遺伝子名が関連付けられて記憶されていてもよい。
なお、入力部１５から、ユーザによって疾患名が入力された場合、参照配列管理部１１２は、遺伝子パネル情報データベース１２１を参照して、入力された疾病名に関連付けられた遺伝子パネル名または遺伝子名から、関連する遺伝子ＩＤ、および遺伝子パネルＩＤを抽出してもよい。
参照配列管理部１１２は、ダウンロードした公開既知変異情報に基づいて、再編成配列を生成し、参照配列データベース１２２に追加・保存する。例えば、参照配列管理部１１２は、野生型の部分配列または全配列と、公開既知変異情報が示す変異の染色体番号、位置、および変異配列ａとを用いて、変異配列ａを含む再編成配列を生成する。これにより、再編成配列は、野生型のエクソンなどの部分配列または全配列に生じた公知の多型、変異、およびメチル化などを再現させた配列となる。
ここで、参照配列データベース１２２のデータ構造について、図６を用いて説明する。図６に示すデータ１２２Ａは、参照配列管理部１１２によって生成された再編成配列を記憶する参照配列データベース１２２のデータ構造の一例を示す図である。この例では、参照配列管理部１１２が、遺伝子名が「ＥＧＦＲ」である遺伝子に生じた既知の変異を既知変異情報に基づいて生成した再編成配列を示している。生成された再編成配列は、これに限定されるものではないが、再編成配列の生成に用いた遺伝子名（あるいは、関連遺伝子ＩＤ）、再編成配列に付与された再編成配列ＩＤ、再編成配列の長さ、再編成配列の５´末端から変異配列までの長さなどと関連付けられて記憶されている。さらに、再編成配列は、再編成配列に含まれる変異の変異ＩＤ、変異配列、染色体番号、および染色体番号で示された染色体上の変異の位置が関連付けられて記憶されていてもよい。例えば、図６に示すデータ１２２Ａにおいて再編成配列ＩＤが「ａａ」である再編成配列ａａは、野生型の「ＥＧＦＲ」の配列の全配列または部分配列における、染色体番号「ＣＨａ」の染色体上の位置「ｐａ」に相当する位置に変異配列ａを挿入することによって生成された配列である。また、この再編成配列ａａは、全長が３２５塩基であり、５´末端から変異配列ａが挿入されている位置までの長さがｎａ塩基である。図５に示すデータ１２１Ａの（ａ）に示すように、同じ遺伝子内の異なる位置における変異配列を含む再編成配列、および同じ遺伝子の同じ位置における異なる変異を含む再編成配列などには、個別の再編成配列ＩＤが付与されている。
図４に戻り、参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２から再編成配列ａａ、再編成配列ｂｂ、再編成配列ｃｃ、…、再編成配列ｘｘを読み出して、所定の連結様式によって再編成配列を１つに連結して、単一の参照配列を生成する。なお、参照配列データベース１２２には、変異配列が組込まれた再編成配列および参照配列の他に、野生型参照配列も記憶されている。
参照配列生成部１１５が、再編成配列を一繋がりに連結する方法としては、図７Ａに示すように、再編成配列ａａ（第１の再編成配列）、再編成配列ｂｂ（第２の再編成配列）、再編成配列ｃｃ（第３の再編成配列）、・・・を１塩基も挿入することなく直接連結してもよい。あるいは、図７Ｂに示すように、再編成配列ａａ、再編成配列ｂｂ、再編成配列ｃｃ、・・・の連結部分に所定の長さのスペーサー配列を挿入してもよい。スペーサー配列としては、例えば、グアニンが１０連続する配列などとすることができる。なお、スペーサー配列は、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ以外の文字列で構成されていてもよく、例えば、例えば、「ＡＫＴ１」および「ＥＧＦＲ」などの遺伝子名、例えば、α、βなどのギリシア語のアルファベットに含まれる文字、例えば、Ｉ、ＶＩ、ＩＸなどのローマ数字、および「２０１７０９０１」などの所定数の数字を挿入してもよい。このように、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ以外の文字列も含むスペーサー配列を挿入することにより、リード配列が、参照配列の隣り合う２つの再編成配列にまたがる領域、すなわち、２つの再編成配列を繋ぐ連結部分にマッピングされる可能性を無視できるようにすることができる。なお、英語のアルファベットに含まれる文字「Ｎ」は、参照配列において、リード配列中のＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれにも一致するヌクレオチドを意味する文字として用いられる場合がある。それゆえ、スペーサー配列として「Ｎ」を利用することは、可能な限り避けることが望ましい。
参照配列生成部１１５が生成した参照配列は、参照配列管理部１１２によって、例えば「ｅｇｆｒ－２０１７０８０１」といった参照配列ＩＤが付与され、参照配列データベース１２２に保存される。
図６に示すデータ１２２Ｂは、参照配列生成部１１５によって生成された参照配列を記憶する参照配列データベース１２２のデータ構造の一例を示す図である。参照配列は、参照配列生成部１１５が該参照配列を生成した生成日および参照配列ＩＤと関連付けられて記憶されている。なお、参照配列ＩＤに、各参照配列が生成された生成日を示す情報を含むようにしてもよい。例えば、図６に示すデータ１２２Ａの例では、２０１７年９月１日に、遺伝子名「ＢＲＡＦ」の遺伝子について生成された参照配列には、「ｂｒａｆ－２０１７０９０１」という参照配列ＩＤが付与されている。また、２０１７年８月１日に、遺伝子名「ＥＧＦＲ」の遺伝子について生成された参照配列には、「ｅｇｆｒ－２０１７０８０１」という参照配列ＩＤが付与されている。このように、再編成配列を１つに連結して生成した参照配列ＩＤなどに、該参照配列の生成日を示す情報を含ませることで、ユーザに対して参照配列がいつ生成されたかを容易に知らせることができる。なお、参照配列管理部１１２が変異情報データベース３から公開既知変異情報を取得したとき、あるいは、変異情報データベース３ａの既知変異情報が更新されたときなどに、参照配列生成部１１５が参照配列を生成する構成が望ましいが、これに限定されるものではない。
参照配列データベース１２２に記憶された参照配列は、配列決定部１１３が各核酸断片のリード配列のアライメントを実行する場合に配列決定部１１３によって参照される。
＜単一の参照配列を生成および更新する処理の流れ＞
単一の参照配列を生成および更新する処理の流れの一例を図８のフローチャートに沿って説明する。
まず、図８のステップＳ１において、参照配列管理部１１２は、解析対象となる遺伝子を特定する。例えば、参照配列管理部１１２は、配列解析装置１の解析対象のすべての遺伝子を定期的に特定してもよいし、解析対象とする遺伝子としてユーザによって入力部１５から遺伝子パネル名、および遺伝子名などの入力を受け付けてもよい。
特定した遺伝子が、配列解析装置１を用いて初めて解析される遺伝子である場合（ステップＳ２にてＹＥＳ）、参照配列管理部１１２は、当該遺伝子のすべての公開既知変異情報、各公開既知変異情報に付与された変異ＩＤ、および各変異に関する情報がアップロードされた日付などを、変異情報データベース３からダウンロードする（ステップＳ３）。ただし、これに限定されるものではなく、外部の変異情報データベース３からダウンロードした変異に関する情報に基づいて、ユーザが特定のファイルを作成し、作成したファイルを検査機関１１０が備える変異情報データベース３ａにアップロードする構成であってもよい。なお、ダウンロードする「公知の変異の配列情報」を、変異情報データベース３にアップロードされているすべての公開既知変異情報でなくてもよい。例えば、特定した遺伝子に生じた多型、変異、およびメチル化の中から、疾患に関連することが知られている公開既知変異情報に限定してもよい。
具体的には、参照配列管理部１１２は、通信部１６を介して、特定した遺伝子の遺伝子ＩＤと変異情報要求とを変異情報データベース３へ送信し、この要求によって指定された所望の公開既知変異情報を変異情報データベース３からダウンロードする。なお、変異情報要求は、所定の間隔（例えば、毎日、１週間に１回、１か月に１回など）で定期的に送信されてもよいし、配列解析装置１をユーザが使用するたびに送信されてもよい。あるいは、変異情報データベース３に新たな変異に関する情報がアップロードされた旨の通知を配列解析装置１が取得してもよく、この場合、該通知を取得する毎に変異情報要求を配列解析装置１から送信してもよい。
次に、参照配列管理部１１２は、ステップＳ３においてダウンロードした各公開既知変異情報に対応する再編成配列を生成し、参照配列データベース１２２に保存する（ステップＳ４）。
参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２から、生成された再編成配列を読み出して、所定の連結様式によって再編成配列を１つに連結して、参照配列を生成する（ステップＳ５）。
参照配列生成部１１５が生成した参照配列は、参照配列管理部１１２によって参照配列ＩＤが付与され、参照配列データベース１２２に保存される（ステップＳ６）。
一方、特定した遺伝子が、配列解析装置１を用いて初めて解析される遺伝子ではない場合（ステップＳ２にてＮＯ）、参照配列管理部１１２は、当該遺伝子について、公開既知変異情報を前回ダウンロードした日付より後に変異情報データベース３にアップロードされた変異に関する情報の有無を判定する（ステップＳ７）。
前回に公開既知変異情報をダウンロードした日付よりも後にアップロードされた変異に関する情報が有る場合（ステップＳ７にてＹＥＳ）、参照配列管理部１１２は、新しい公開既知変異情報をダウンロードして、該公開既知変異情報を用いて再編成配列を生成・保存する（ステップＳ８）。
参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２に記憶されている参照配列、および新しく生成された再編成配列を取得して、これらを所定の連結様式によって１つに連結して、新しい参照配列を生成する（ステップＳ９）。すなわち、参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２に記憶されている参照配列を読み出し、参照配列管理部１１２が新たに生成した再編成配列（例えば、図４に示す変異「Ｃ７９７Ｓ」を含む再編成配列）を、既に参照配列に含まれている再編成配列と連結することにより、参照配列を更新する。なお、図４に示す例では、参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２から読み出した参照配列の末尾の再編成配列に、変異「Ｃ７９７Ｓ」を含む再編成配列を連結している。しかし、これに限定されず、参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２から読み出した参照配列に含まれている再編成配列の連結部分に、参照配列管理部１１２が新たに生成した再編成配列を挿入して、参照配列を更新してもよい。
参照配列生成部１１５によって生成された参照配列は、参照配列データベース１２２に記憶される（ステップＳ１０）。図６に示すデータ１２２Ｃのように、参照配列は、参照配列毎に付与された参照配列ＩＤと連結情報とが関連付けられて記憶されている。連結情報とは、参照配列の生成に用いられた再編成配列の再編成配列ＩＤ、各再編成配列の長さの情報、および連結順などを含む情報である。なお、連結情報として、スペーサーの有無、およびスペーサーの長さに関する情報が含まれていてもよい。
一方、前回公開既知変異情報をダウンロードした日付よりも後にアップロードされた変異に関する情報が無い場合（ステップＳ７にてＮＯ）、参照配列管理部１１２は、公開既知変異情報のダウンロードを行わない。また、参照配列生成部１１５は、参照配列を更新しない。なお、参照配列生成部１１５が参照配列を更新しない場合であっても、参照配列管理部１１２は、参照配列データベース１２２に記憶されている参照配列の参照配列ＩＤを更新することが望ましい。これにより、参照配列が最新の公開既知変異情報を反映して生成されたものであることをユーザに知らせることができる。例えば、２０１７年９月１日に参照配列ＩＤ「ｅｇｆｒ－２０１７０８０１」の参照配列に含まれている再編成配列に新しい再編成配列を連結したか否かに関係なく、参照配列ＩＤの「２０１７０８０１」の部分を「２０１７０９０１」に更新した新しい参照配列ＩＤを付与してもよい。
ここでは、参照配列生成部１１５が、遺伝子毎に、再編成配列を連結して１つの参照配列を生成する場合を例に挙げて説明したが、これに限定されない。例えば、遺伝子毎に、野生型参照配列および再編成配列を一繋がりに連結した参照配列を作成してもよいし、ステップ１においてユーザによって入力された遺伝子パネルの解析対象となる遺伝子についての、すべての再編成配列を一繋がりに連結した参照配列としてもよい。
また、ステップ１においてユーザによって入力された遺伝子パネルの解析対象となる遺伝子についての、すべての野生型参照配列および再編成配列を一繋がりに連結した参照配列を作成してもよい。例えば、遺伝子パネル名「Ａ パネル」がユーザによって入力された場合、参照配列生成部１１５は、遺伝子パネル情報データベース１２１を参照して、入力された遺伝子パネル名に関連付けられた遺伝子ＩＤ、または遺伝子名を決定する。決定される遺伝子名および遺伝子ＩＤの数は１または複数である。参照配列生成部１１５は、参照配列データベース１２２から、決定した遺伝子名に対応付けられた野生型配列および再編成配列を読み出して、これらを一繋がりに連結してもよい。このようにして生成された参照配列は、遺伝子パネルを用いた解析におけるリード配列情報のアライメントに使用される再編成配列を含む唯一の参照配列となる。この参照配列には、生成された生成日に加え、遺伝子パネルを示す情報（例えば遺伝子パネル名）を含む参照配列ＩＤ（例えば、「Ａ Ｐｐａｎｅｌ ２０１７０９０１」など）が付与されてもよい。
次に、検査機関１１０では、試料ＤＮＡの塩基配列をシーケンサー２によって解析するための前処理が行われる（図３のステップＳ５２）。前処理の流れを図９Ａのフローチャートに沿って説明する。
（ステップＳ５２：前処理）
まず、図１０の（ａ）に示すように、ＤＮＡを含む試料（ＤＮＡ）を、シーケンサー２で配列を読み取るための長さに断片化する（図９ＡのステップＳ１０１）。試料ＤＮＡの断片化は、例えば、超音波処理や、核酸を断片化する試薬による処理などの公知の方法によって行うことができる。ただし、ステップＳ１０１の断片化処理を必要としない場合もあるため、この断片化処理は必須の前処理ではない。得られるＤＮＡ断片（核酸断片）は、例えば、数十から数百ｂｐの長さであり得る。以下では、解析対象となる遺伝子がＤＮＡである場合を例に挙げて説明するが、解析対象となる遺伝子はＲＮＡであってもよい。
続いて、図１０の（ｂ）に示すように、ステップＳ１０１で得られたＤＮＡ断片の両端（３´末端および５´末端）に、使用するシーケンサー２の種類やシーケンシングプロトコルに対応するアダプター配列を付与する（図９ＡのステップＳ１０２）。ただし、本工程は、シーケンサー２が、イルミナ社のシーケンサー、または、イルミナ社のシーケンサーと同様の方式を採用する装置である場合には必須の工程であるが、他の種類のシーケンサー２を用いる場合には、省略できる場合もある。
アダプター配列は、後の工程においてシーケンシングを実行するために使用する配列であり、一実施形態において、Ｂｒｉｄｇｅ ＰＣＲ法において、フローセルに固定化したオリゴＤＮＡにハイブリダイズするための配列であり得る。
一態様において、図１０の（ｂ）の上段に示すように、ＤＮＡ断片の両端に直接アダプター１配列およびアダプター２配列（アダプター１配列およびアダプター２配列）を付加してもよい。ＤＮＡ断片へのアダプター配列の付加は、当該分野において公知の手法を用いることができる。例えば、ＤＮＡ配列を平滑化し、アダプター配列をライゲーションしてもよい。
また、他の一態様において、図１０の（ｂ）の下段に示すように、ＤＮＡ断片の両端とアダプター配列との間に、インデックス配列を挿入してもよい。
インデックス配列は、各試料のデータを区別するための、試料毎、遺伝子パネル毎、および遺伝子パネルを提供している会社毎に固有の配列である。インデックス配列として用いられる塩基配列は、これに限定されるものではないが、例えば、アデニンが１０～１４連続する配列、アデニンが５～７連続し、グアニンが５～７連続するなどの配列パターン、および所与の長さを有している。インデックス配列は、その配列パターンおよび長さに基づいて、当該インデックス配列が付加されたＤＮＡ断片の配列について、どの試料のシーケンスデータか、用いられた遺伝子パネルは何か、用いられた遺伝子パネルを提供している会社はどの会社か、などに関する情報を識別するために用いることができる。
例えば、遺伝子パネルＡを用いた解析におけるインデックス配列を、アデニンが１４連続する配列パターンとし、遺伝子パネルＢを用いた解析におけるインデックス配列を、アデニンが７連続した後にグアニンが７連続する配列パターンとしてもよい。あるいは、遺伝子パネルＡを用いた解析におけるインデックス配列を、アデニンが１４連続する配列（すなわち、インデックス配列の長さは１４）とし、遺伝子パネルＣを用いた解析におけるインデックス配列を、アデニンが１０連続する配列（すなわち、インデックス配列の長さは１０）としてもよい。
ＤＮＡ断片へのインデックス配列およびアダプター配列の付加は、当該分野において公知の手法を用いることができる。例えば、ＤＮＡ配列を平滑化し、インデックス配列をライゲーションし、さらに、アダプター配列をライゲーションさせてもよい。
次に、図１１に示すように、アダプター配列を付与したＤＮＡ断片に対し、ビオチン化ＲＮＡベイトライブラリをハイブリダイズさせる（図９のステップＳ１０３）。ビオチン化ＲＮＡベイトライブラリは、解析対象となる遺伝子とハイブリダイズするビオチン化ＲＮＡ（以下、ＲＮＡベイトと称する。）によって構成されている。ＲＮＡベイトの長さは任意であるが、例えば、特異性を高めるために１２０ｂｐ程度のロングオリゴＲＮＡベイトを使用してもよい。
なお、本実施形態におけるシーケンサー２を用いたパネル検査では、例えば、１００以上の多数の遺伝子（例えば、１００以上）が解析対象の遺伝子となる。パネル検査で用いられる試薬には、当該多数の遺伝子の各々に対応するＲＮＡベイトのセットが含まれる。パネルが異なれば、解析対象の遺伝子の数および種類が異なるため、パネル検査で用いられる試薬に含まれるＲＮＡベイトのセットも異なる。
そして、図１２に示すように、解析対象となるＤＮＡ断片を回収する（図９のステップＳ１０４）。詳細には、図１２の上段に示すように、ビオチン化ＲＮＡベイトライブラリをハイブリダイズさせたＤＮＡ断片に対し、ストレプトアビジンと磁性ビーズとが結合したストレプトアビジン磁性ビーズを混合する。これにより、図１２の中段に示すように、ストレプトアビジン磁性ビーズのストレプトアビジン部分と、ＲＮＡベイトのビオチン部分とが結合する。そして、図１２の下段に示すように、ストレプトアビジン磁性ビーズを、磁石で集磁するとともに、ＲＮＡベイトとハイブリダイズしていない断片（即ち、解析対象とならないＤＮＡ断片）を洗浄により除去する。これにより、ＲＮＡベイトとハイブリダイズしたＤＮＡ断片、すなわち、解析対象となるＤＮＡ断片を選択・濃縮することができる。シーケンサー２は、このように複数のＲＮＡベイトを用いて選択されたＤＮＡ断片の核酸配列を読み取ることによって複数のリード配列を取得する。
さらに、図１３の左欄から中央欄に示すように、濃縮されたＤＮＡ断片からストレプトアビジン磁性ビーズおよびＲＮＡベイトを外し、ＰＣＲ法によって増幅することにより、前処理を完了させる。
次に、検査機関１１０では、試料ＤＮＡの塩基配列を読み取るためのシーケンシングが行われる（図３のステップＳ５３）。シーケンシングの流れを図９Ｂのフローチャートに沿って説明する。
なお、本実施形態において使用することができるシーケンサー２の種類は特に限定されず、複数の解析対象を一度のランで解析することができるシーケンサーを好適に用いることができる。このようなシーケンサーには、例えば、イルミナ社（サンディエゴ、ＣＡ）のＭｙＳｅｑ９（登録商標）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、サーモ・フィッシャー社（ウォルサム、ＭＡ）のＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）、Ｉｏｎ ＰＧＭ（登録商標）、ロシュ社（バーゼル、スイス）のＧＳ ＦＬＸ +（登録商標）、およびＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）などが挙げられる。以下では、一例として、イルミナ社のシーケンサー、または、イルミナ社のシーケンサーと同様の方式を採用する装置を用いる場合について説明する。イルミナ社のシーケンサーは、Ｂｒｉｄｇｅ ＰＣＲ法とＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓという手法との組合せにより、フローセル上で膨大な数の解析対象となるＤＮＡを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行うことができる。
（ステップＳ５３：シーケンシング）
まず、図１３の右欄に示すように、増幅されたＤＮＡ断片をフローセルに供する（図９ＢのステップＳ１０５）。続いて、図１４に示すように、フローセル上において、Ｂｒｉｄｇｅ ＰＣＲ法により、解析対象となるＤＮＡ断片を増幅する（図９ＢのステップＳ１０６）。
すなわち、解析対象となるＤＮＡ断片（図１４中のＴｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ）は、上述した前処理によって、両末端に２種類の異なるアダプター１配列（アダプター１配列およびアダプター２配列）が付加された状態であり（図１４の「１」）、このＤＮＡ断片を１本鎖にし、５’末端側のアダプター１配列をフローセル上に固定させる（図１４の「２」）。フローセル上には予め５’末端側のアダプター２配列が固定されており、ＤＮＡ断片の３’末端側のアダプター２配列が、フローセル上の５’末端側のアダプター２配列と結合することにより、橋渡しをしたような状態（ブリッジ）が形成される（図１４の「３」）。この状態でＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ伸長反応を行い（図１４の「４」）、変性させると、２本の１本鎖ＤＮＡ断片が得られる（図１４の「５」）。このようなブリッジの形成、ＤＮＡ伸長反応および変性をこの順に繰り返すことにより、多数の１本鎖ＤＮＡ断片を局所的に増幅固定させて、クラスターを形成することができる（図１４の「６」～「９」）。
そして、図１４に示すように、クラスターを形成する１本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓにより、配列を読み取る（図９ＢのステップＳ１０７）。
まず、フローセル上に固定されたオリゴＤＮＡ（例えば、図１５の上段左欄に示す１本鎖ＤＮＡ）に対し、ＤＮＡポリメラーゼ、および、蛍光標識され、３’末端側がブロックされたｄＮＴＰを添加し（図１５の上段中央欄）、さらに、シーケンスプライマーを添加する（図１５の上段右欄）。シーケンスプライマーは、例えば、アダプター配列の一部分にハイブリダイズするように設計されていればよい。換言すれば、シーケンスプライマーは、試料ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅するように設計されていればよく、インデックス配列を付加した場合には、さらにインデックス配列を増幅するように設計されていればよい。
シーケンスプライマーを添加後、ＤＮＡポリメラーゼによって３’末端ブロック蛍光ｄＮＴＰの１塩基伸長反応を行う。３’末端側がブロックされたｄＮＴＰを用いるため、１塩基分伸長したところで、ポリメラーゼ反応は停止する。そして、ＤＮＡポリメラーゼを除去し（図１５の中段右欄）、１塩基伸長した１本鎖ＤＮＡ（図１５の下段右欄）に対し、レーザー光により塩基に結合している蛍光物質を励起させて、そのときに起こる発光を写真として記録する（図１５の下段左欄）。写真は、蛍光顕微鏡を用いて、４種類の塩基を決定させるために、波長フィルタを変更しながら、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔそれぞれに対応する蛍光色毎に撮影する。すべての写真を取り込んだ後、写真データから塩基を決定する。そして、蛍光物質および３’末端側をブロックしている保護基を除去して、次のポリメラーゼ反応に進む。この流れを１サイクルとして、２サイクル目、３サイクル目と繰り返していくことにより、全長をシーケンシングすることができる。
以上の手法によれば、解析できる鎖長は１５０塩基×２までに達し、ピコタイタープレートよりもはるかに小さい単位での解析が可能である。それゆえ、高密度化することにより、１回の解析において４０～２００Ｇｂという膨大な配列情報を入手することができる。
シーケンサー２によるリード配列の読み取りに用いられる遺伝子パネルは、上述したように、複数の解析対象を一度のランで解析するための解析キットを意味し、一実施形態において、特定の疾病に関する複数の遺伝子配列を解析するための解析キットであり得る。
本明細書中にて使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。容器としては、例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなどが挙げられる。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、キットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得る。ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。キットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」には、キット中の各構成についての情報、例えば、治療および／または診断に該キットを適用する場合の手順に関する情報などが示されている。なお、「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピュータ読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。キットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、キットは、治療および／または診断に適用するために必要な器具をあわせて備えていてもよい。
一実施形態において、遺伝子パネルは、上述した、核酸を断片化する試薬、ライゲーション用試薬、洗浄液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ試薬（ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼなど）などの試薬、および磁性ビーズのうち一つ以上を備えていてもよい。また、遺伝子パネルは、断片化したＤＮＡにアダプター配列を付加するためのオリゴヌクレオチド、断片化したＤＮＡにインデックス配列を付加するためのオリゴヌクレオチド、ＲＮＡベイトライブラリ、シーケンシングに用いるシーケンスプライマーなどのうち一つ以上を備えていてもよい。さらに、遺伝子パネルは、所定のオリゴＤＮＡが表面の少なくとも一部に固定化されたフローセル、およびフローセルの表面の少なくとも一部にオリゴＤＮＡを固定化するための試薬などを含んでいてもよい。
特に、各遺伝子パネルが備えるインデックス配列は、当該遺伝子パネル固有の、当該遺伝子パネルを識別するための配列であり得る。また、各遺伝子パネルが備えるＲＮＡベイトライブラリは、当該遺伝子パネルの各検査遺伝子に対応するＲＮＡベイトを含む、当該遺伝子パネル固有のライブラリであり得る。
次に、検査機関１１０では、読み取られたリード配列の解析処理が行われる（図３のステップＳ５４）。
（ステップＳ５４：リード配列の解析）
リード配列の解析処理は、制御部１１のリード配列情報取得部１１１、配列決定部１１３、および変異同定部１１４によって行われる。解析の流れの一例を図１６のフローチャートに沿って説明する。
まず、リード配列情報取得部１１１は、シーケンサー２から提供されたリード配列情報を読み込む（図１６のステップＳ２１）。
リード配列情報は、シーケンサー２で読み取られた塩基配列を示すデータである。シーケンサー２は、多数の核酸断片をシーケンシングして、それらの配列情報を読み取り、リード配列情報として配列解析装置１に提供する。読み取られたリード配列情報は、パネル検査において読み取られた、解析対象となる遺伝子の配列であってもよい。
一態様において、リード配列情報には、読み取られた配列と共に、配列中の各塩基のクオリティスコアが含まれていてもよい。また、被検体の病変部位から採取されたＦＦＰＥ試料をシーケンサー２に供して得られたリード配列情報と、同被検体の血液試料をシーケンサー２に供して得られたリード配列情報との両方が、配列解析装置１に入力される。ここで、「被検体」とは、ヒト被検体並びにヒトではない被検体、例えば、哺乳類、無脊椎動物、脊椎動物、菌類、酵母、細菌、ウイルスおよび植物などを指す。また、「ＦＦＰＥ試料」とは、ホルマリン固定パラフィン包埋された試料を指す。
図１７は、リード配列情報のファイルフォーマットの一例を示す図である。図１７に示す例では、リード配列情報には、配列名、配列、および、クオリティスコアが含まれている。配列名は、シーケンサー２が出力するリード配列情報に付与された配列ＩＤ等を示す。配列は、シーケンサー２で読み取られた塩基配列を示す。クオリティスコアは、シーケンサー２による塩基割当が正しく行われない確率を示す。任意の塩基のシーケンスクオリティスコア（Ｑ）は、次の式により表される。
Ｑ＝－１０ｌｏｇ１０Ｅ
この式において、Ｅは、塩基割当が正しく行われない確率の推定値を表す。Ｑ値が高いほど、エラーの確率が低いことを意味する。Ｑ値が低いほど、そのリードは使用できない部分が大きくなる。また、偽陽性の変異割当も増加し、結果の精度が低下する恐れがある。
ここで、「偽陽性」は、リード配列が判定対象となる真の変異を有していないにもかかわらず、変異を有すると判断されることを意味する。なお、「陽性」は、リード配列が判定対象となる真の変異を有していることを意味し、「陰性」は、リード配列が対象となる変異を有していないことを意味する。
続いて、配列決定部１１３は、リード配列情報取得部１１１が読み込んだリード配列情報に基づいて、リード配列情報に含まれる各核酸断片のリード配列のアライメントを実行する（図１６のステップＳ２２）。なお、ここでは、ＦＦＰＥ試料をシーケンサー２に供して得られたリード配列情報から配列を決定する場合を例に挙げて説明するがこれに限定されない。
図１８は、配列決定部１１３によるアライメントを説明する図である。配列決定部１１３は、参照配列データベース１２２に格納された野生型参照配列および単一の参照配列を参照し、各核酸断片のリード配列を、参照配列に対してマッピングすることにより、アライメントを実行する。
また、配列決定部１１３は、被検体の病変部位から採取されたＦＦＰＥ試料をシーケンサー２に供して得られたリード配列情報と、同被検体の血液試料をシーケンサー２に供して得られたリード配列情報との両方について、アライメントを実行する。
配列決定部１１３のアライメント結果を出力するファイルのフォーマットの一例を示す図である。アライメント結果のフォーマットは、リード配列、参照配列およびマッピング位置をそれぞれ特定し得るものであれば特に限定されないが、参照配列情報、リード配列名、ポジション情報、マップ品質および配列を含むものであってもよい。「参照配列情報」は、参照配列名、参照配列ＩＤ、参照配列の配列長等を示す情報である。「リード配列名」は、アライメント対象となった各リード配列の名称、リード配列ＩＤ等である。「ポジション情報」は、リード配列の最左塩基（５’末端の塩基）がマッピングされた参照配列上の位置を示す情報である。「マップ品質」は、リード配列に対応するマッピング品質に関する情報である。「配列」は各リード配列に対応する塩基配列を示す情報である。
参照配列情報は、例えば、参照配列データベース１２２における参照配列名、参照配列ＩＤ、参照配列の配列長等を示す情報である。リード配列名は、アライメント対象となった各リード配列の名称またはリード配列ＩＤを示す情報である。ポジション情報は、リード配列の最左塩基がマッピングされた参照配列上の位置を示す情報である。マップ品質は、当該リード配列に対応するマッピング品質を示す情報である。配列は、各リード配列に対応する塩基配列（例： …GTAAGGCACGTCATA…）を示す情報である。
図１９は、参照配列データベース１２２の構造例を示す図である。図１９に示すように、参照配列データベース１２２には、野生型の配列を示す野生型参照配列（例えば、染色体＃１～２３のゲノム配列）と、野生型の配列に対して既知の変位配列が組み込まれた再編成配列と、２以上の再編成配列が一繋がりに連結された参照配列が記憶されている。
図１９では、あるエクソンの配列に生じた変異配列ａ、変異配列ｂ、変異配列ｃをそれぞれ含む再編成配列ａａ、再編成配列ｂｂ、および再編成配列ｃｃなどを順に連結して成る単一の参照配列を示しているが、これに限定されない。例えば、連結の順番には限定されない。また、各再編成配列の連結部分に、前述のようなスペーサー配列を挿入する構成であってもよい。例えば、再編成配列ａａの直後に再編成配列ｃｃを連結してもよいし、再編成配列ｂｂの直後に再編成配列ｃｃを連結してもよい。
図２０は、参照配列データベース１２２に含まれる再編成配列および参照配列に組み込まれる既知の変異の例を示す図である。既知の変異は、例えば、例えば、ＣＯＳＭＩＣ、ＣｌｉｎＶａｒ等の外部の変異情報データベース３に登録された変異であり、図２０に示すように、染色体位置、遺伝子名および変異が特定されているものである。図２０の例では、アミノ酸の変異が特定されているが、核酸の変異が特定されていてもよい。変異の種類は、特に限定されず、置換、ＩｎＤｅｌ、メチル化など様々な変異であり得、他の染色体の一部の配列または逆相補配列が結合している変異であってもよい。
図２１は、図１６のステップＳ２２におけるアライメントの詳細な工程の一例を説明するフローチャートである。
図２１のステップＳ１１において、配列決定部１１３は、リード配列情報取得部１１１が取得したリード配列情報に含まれる各核酸断片のリード配列のうち、アライメントを行っていないものを選択して、参照配列データベース１２２から取得した参照配列（野生型参照配列および単一の参照配列）と比較する。図２２Ｂは、リード配列と単一の参照配列とを比較することにより、リード配列のマッピングを行う処理の一例を示すフローチャートである。図２２Ｂに示すように、配列決定部１１３は、リード配列を読み出し（ステップＳ１１１）、参照配列データベース１２２から野生型参照配列を読み出し、該リード配列と野生型参照配列とを比較する（ステップＳ１１２）。次に、配列決定部１１３は、参照配列データベース１２２から単一の参照配列を読み出し（ステップＳ１１３）、該リード配列と参照配列とを比較する（ステップＳ１１４）。なお、リード配列と野生型参照配列との比較、およびリード配列と参照配列との比較の順番は逆であってもよい。そして、ステップＳ１２において、配列決定部１１３は、リード配列との一致率が所定の基準を満たす参照配列上の位置を特定する。ここで、一致率とは、取得したリード配列情報と参照配列とがどの程度一致しているかを示す値であり、例えば、一致する塩基の数や割合等が一例として挙げられる。
一態様において、配列決定部１１３は、リード配列と参照配列の一致率を示すスコアを算出する。一致率を示すスコアは、例えば２つの配列間の同一性のパーセンテージとすることができる。図２２Ａに示すように、配列決定部１１３は、例えば、リード配列の塩基と、野生型参照配列および単一の参照配列の塩基とが同一となる位置の数を特定し、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を参照配列と比較されたリード配列の塩基数で除算することによってパーセンテージを算出する。このように算出されたパーセンテージが一致率を示すスコアである。
図２３Ａは、スコア算出の一例を示す図である。一態様において、図２３Ａに示す位置において、リード配列Ｒ１と参照配列との一致率のスコアは、リード配列１３塩基中１３塩基が一致しているため１００％となり、リード配列Ｒ２と参照配列との一致率のスコアは、リード配列１３塩基中１２塩基が一致しているため９２．３％となる。
また、配列決定部１１３は、リード配列と参照配列の一致率を示すスコアの計算において、リード配列が参照配列に対して所定の変異（例えば、ＩｎＤｅｌ）を含む場合には、通常の計算よりも低いスコアが付くように計算してもよい。
一態様において、配列決定部１１３は、リード配列が参照配列に対して挿入および欠失の少なくとも一方を含む配列について、例えば、上述したような通常計算で算出されたスコアに、ＩｎＤｅｌに対応する塩基数に応じた重み係数を乗算することで、スコアを補正してもよい。重み係数Ｗは、例えば、Ｗ＝｛１－（１／１００）×（ＩｎＤｅｌに対応する塩基数）｝で計算してもよい。
図２３Ｂは、スコア算出の他の例を示す図である。一態様において、図２３Ｂに示す位置において、リード配列Ｒ３と参照配列との一致率のスコアは、通常計算では、リード配列１７塩基（欠失を示す＊も一塩基として計算）中１５塩基が一致しているため８８％となり、補正後のスコアは８８％×０．９８＝８６％となる。また、リード配列Ｒ４と参照配列との一致率のスコアは、通常計算では、リード配列２１塩基中１７塩基が一致しているため８１％となり、補正後のスコアは８１％×０．９６＝７７．８％となる。
参照配列上の図２３Ｃに示す位置において、リード配列Ｒ３と参照配列との一致率のスコアは１００％となり、リード配列Ｒ４と参照配列との一致率のスコアも１００％となる。このように、参照配列を参照すれば、リード配列と参照配列との一致率のスコアは高くなる。それゆえ、リード配列を誤った位置にマッピングする可能性を低減し、アライメントの正確性を向上させることができる。
配列決定部１１３は、各参照配列に対するリード配列のマッピング位置を変えながら一致率のスコアを算出することにより、リード配列との一致率が所定の基準を満たす参照配列上の位置を特定する。その際、動的計画法、ＦＡＳＴＡ法、ＢＬＡＳＴ法等の当該分野において公知のアルゴリズムを使用してもよい。
図２１に戻り、次に、配列決定部１１３は、リード配列との一致率が所定の基準を満たす参照配列上の位置が単一の位置であった場合には（ステップＳ１３にてＮＯ）、当該位置にリード配列をアライメントし、リード配列との一致率が所定の基準を満たす参照配列上の位置が複数の位置であった場合には（ステップＳ１３にてＹＥＳ）、配列決定部１１３は、最も一致率が高い位置に、リード配列をアライメントする（ステップＳ１４）。
配列決定部１１３は、リード配列情報取得部１１１が取得したリード配列情報に含まれる全リード配列をアライメントしていない場合には（ステップＳ１５にてＮＯ）、ステップＳ２１に戻り、リード配列情報に含まれる全リード配列をアライメントした場合には（ステップＳ１５にてＹＥＳ）、図１６のフローチャートの処理にリターンする。
続いて、制御部１１の変異同定部１１４は、被検体の病変部位から採取された試料を供して得られたリード配列がアライメントされたアライメント配列と、同被検体の血液試料を供して得られたリード配列がアライメントされたアライメント配列とを比較する（図１６のステップＳ２３）。そして、変異同定部１１４は、両アライメント配列間の相違を、変異として抽出する（図１６のステップＳ２４）。例えば、同じ解析対象の遺伝子の同じ位置に対する血液検体由来のアライメント配列がＡＴＣＧＡであり、腫瘍組織由来のアライメント配列がＡＴＣＣＡであれば、変異同定部１１４は、ＧとＣとの相違を変異として抽出する。なお、被検体がＦＦＰＥ試料ではなく血液試料である場合には、セルフリー（cell free）ＤＮＡが血液試料に含まれる可能性が有るため、ステップＳ２３の処理は行わずに、ステップＳ２４へ進む。
一態様において、変異同定部１１４は、抽出した変異に基づいて結果ファイルを生成する。図２４は、変異同定部１１４が生成する結果ファイルのフォーマットの一例を示す図である。当該フォーマットは、例えば、Variant Call Format（ＶＣＦ）に基づくものであり得る。図２４に示すように、結果ファイルには、抽出された変異毎に、位置情報、参照塩基および変異塩基が記述されている。位置情報は、参照ゲノム上の位置を示し、例えば、染色体番号と、該染色体上の位置とを含む。参照塩基は、上記位置情報が示す位置における参照塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇなど）を示す。変異塩基は、参照塩基の変異後の塩基を示す。参照塩基は、血液検体由来のアライメント配列上の塩基であり、変異塩基は、腫瘍組織由来のアライメント配列上の塩基である。
なお、図２４において、参照塩基がＣ、変異塩基がＧである変異は、置換変異の例であり、参照塩基がＣ、変異塩基がＣＴＡＧである変異は、挿入（Insertion）変異の例である。また、参照塩基がＴＣＧ、変異塩基がＴである変異は、欠失（Deletion）変異の例である。そして、変異塩基がＧ］１７：１９８９８２］、］１３：１２３４５６］Ｔ、Ｃ［２：３２１６８２［、または、［１７：１９８９８３［Ａである変異は、他の染色体の一部の配列または逆相補配列が結合している変異の例である。
図１６に戻り、続いて、変異同定部１１４は、変異データベース１２３を検索する（ステップＳ２５）。そして、変異同定部１１４は、変異データベース１２３の変異情報を参照して、結果ファイルに含まれる変異にアノテーションを付与することで、変異を同定する（ステップＳ２６）。
図２５は、図２に記載される変異データベース１２３の構造の一例を示す図である。変異データベース１２３は、例えば、ＣＯＳＭＩＣやＣｌｉｎＶａｒなどの外部の変異情報データベース３を基に構築される。また、一態様において、データベース中の各変異情報には、遺伝子パネルに関する情報に関するメタデータが付与されている。図２５に示す例では、データベース中の各変異情報には、解析対象の遺伝子の遺伝子ＩＤがメタデータとして付与されている。
変異データベース１２３に含まれる変異情報には、変異ＩＤ、変異の位置情報（例えば、「ＣＨＲＯＭ」、および「ＰＯＳ」）、「ＲＥＦ」、「ＡＬＴ」、「Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」が含まれていてもよい。変異ＩＤは、変異を識別するための識別子である。変異の位置情報のうち、「ＣＨＲＯＭ」は染色体番号を示し、「ＰＯＳ」は染色体番号上の位置を示す。「ＲＥＦ」は、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）における塩基を示し、「ＡＬＴ」は、変異後の塩基を示す。「Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」は、変異に関する情報を示す。「Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」は、例えば、「ＥＧＦＲ Ｃ２５７３Ｇ」、「ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ」といったアミノ酸の変異を示す情報であってもよい。例えば、「ＥＧＦＲ Ｃ２５７３Ｇ」は、タンパク質「ＥＧＦＲ」の２５７３残基目のシステインがグリシンに置換した変異であることを示す。
上記の例のように、変異情報の「Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」は、塩基情報に基づく変異を、アミノ酸情報に基づく変異に変換するための情報であってもよい。この場合、変異同定部１１４は、参照した「Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」の情報に基づいて、塩基情報に基づく変異を、アミノ酸情報に基づく変異に変換可能である。
変異同定部１１４は、結果ファイルに含まれる変異を特定する情報（例えば、変異の位置情報と変異に対応する塩基情報）をキーとして、変異データベース１２３を検索する。例えば、変異同定部１１４は、「ＣＨＲＯＭ」、「ＰＯＳ」、「ＲＥＦ」および「ＡＬＴ」の情報のいずれかをキーとして変異データベース１２３を検索してもよい。変異同定部１１４は、血液検体由来のアライメント配列と、病変部位由来のアライメント配列とを比較することで抽出した変異が変異データベース１２３に登録されていた場合に、当該変異を試料中に存在する変異として同定し、結果ファイルに含まれる当該変異にアノテーション（例えば、「ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ」、「ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ」など）を付与する。
図１６に戻り、制御部１１は、配列決定部１１３によって決定された核酸配列が、参照配列に含まれる再編成配列、および該再編成配列に対応する野生型参照配列のいずれに一致するかに関する情報を、出力部１４を介して出力する（ステップＳ２７）。具体的には、出力部１４は、配列決定部１１３によってマッピングされたリード配列のアライメント結果、および各変異に付与されたアノテーションなどの変異同定部１１４によって同定された変異に関する情報を出力してもよい。出力部１４は、解析結果をデータとして送信してもよい。解析結果のデータの送信先は、例えば、図１に示すような医療機関２１０であってもよいし、検査機関１１０であってもよい。また、出力部１４は、配列解析装置１と接続されているプリンタであってもよく、この場合、該プリンタによって印刷された後に、紙媒体として、検査機関１１０にて利用されてもよいし、検査機関１１０から医療機関２１０へ提供されてもよい。
あるいは、出力部１４は、制御部１１の各部の処理に関する情報を表示するディスプレイであってもよい。例えば、リード配列情報取得部１１１が読み取ったリード配列情報を表示させて、各リード配列情報の５´末端部分および３´末端部分に含まれるアダプター配列およびインデックス配列（図１０参照）を表示させてもよい。または、配列決定部１１３によるアライメント結果を、参照配列とリード配列情報とを含む画面表示として示してもよい。または、変異同定部１１４が同定した変異に関する情報を表示させてもよい。
以上のように、検査機関１１０において検査が実施され、解析結果に基づいて作成された解析報告書が、解析依頼を行った医療機関２１０に送付される。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
たとえば、図２７Ａに示すように、検査機関１１０には、配列解析装置１は設置せず、シーケンサー２、および情報端末５などを設置し、配列解析装置１は外部の解析機関１２０に設置されていてもよい。その場合、情報端末５は、（１）シーケンサー２によって読み取られた配列情報を取得する機能、（２）外部の機関、例えば、図２７Ａに示す解析機関１２０、に該情報を送信する機能、および（３）解析機関１２０から解析結果を受信する機能、などを有している。なお、医療機関２１０は、ネットワーク４を介して、検査機関１１０に対して解析依頼を送信したり、解析結果のデータおよび解析報告書を受信したりする構成であってもよい。
図２７Ａに示す検査機関１１０では、医療機関２１０からの解析依頼に応じて、試料に含まれる遺伝子の配列がシーケンサー２によって読み取られる。検査機関１１０は、読み取ったリード配列情報を解析機関１２０に送信し、解析を依頼する。そして、検査機関１１０は、解析機関１２０から解析結果を受け取り、該解析結果に基づいて解析報告書を作成する。このように作成された解析報告書は、検査機関１１０から解析依頼元の医療機関２１０に提供される。
図２７Ａに示す変異情報データベース３ａは、解析機関１２０において管理されており、外部の変異情報データベース３からダウンロードした公開既知変異情報、および外部の変異情報データベース３とは異なる情報源から取得した既知変異情報等を記憶していてもよい。
なお、変異情報データベース３ｂが、図２７Ｂに示すように検査機関１１０に備えられ、検査機関１１０によって管理されていてもよい。このように、変異情報データベース３ｂは、配列解析装置１と同じ機関内に設けられている点で、外部の変異情報データベース３とは異なっている。変異情報データベース３と配列解析装置１とは、インターネットなどのネットワーク４を介して接続され得る。一方、変異情報データベース３ｂと配列解析装置１とは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）およびイントラネットなどを介して接続され得る。
図２における参照配列管理部１１２は、公開既知変異情報を外部の変異情報データベース３から参照配列データベース１２２にダウンロードしているがこれに限定されない。例えば、図２７Ａに示す解析機関１２０のように、外部の変異情報データベース３からダウンロードした、多型、変異、およびメチル化などに関する情報を記憶する変異情報データベース３ａを備える構成の場合、変異情報データベース３ａに記憶される既知変異情報の更新は、定期的（例えば、１か月に１回、１週間に１回、および２日に１回など）に自動で行われるように構成されていてもよいし、変異情報データベース３ａを管理する者によって適宜行われてもよい。なお、変異情報データベース３ａには、既知変異情報と、既知変異情報が変異情報データベース３ａに記憶された日時を示す情報とが関連付けて記憶されていてもよい。なお、関連して記憶する日時を示す情報は、変異情報データベースの更新日時であってもよい。
なお、図２７Ａに示す配列解析装置１が変異情報データベース３ａから既知変異情報を取得する場合、参照配列管理部１１２は、変異情報データベース３ａの既知変異情報が更新された場合に再編成配列を生成する構成であってもよい。なお、変異情報データベース３ａには、公開既知変異情報だけではなく、公開されていない既知変異情報も記憶されていてもよい。それゆえ、再編成配列には、公開既知変異情報に基づいて生成されたもののみではなく、公開されていない既知変異情報に基づいて生成されたものが含まれていてもよい。
また、上記では、参照配列管理部１１２が既知変異情報に基づいて再編成配列を生成する場合を例に挙げて説明したがこれに限定されない。例えば、解析機関１２０に属する者などが、変異情報データベース３ａから既知変異情報を取得して、再編成配列を生成してもよい。生成された再編成配列は変異情報データベース３ａに格納されてもよく、この場合には、参照配列管理部１１２は、再編成配列を変異情報データベース３ａから取得すればよい。すなわち、配列解析装置１に対して、配列解析装置１と異なる装置（例えば、変異情報データベース３ａ）が再編成配列を提供する構成であってもよい。
また、上記では、変異情報データベース３からダウンロードした各公開既知変異情報に対応する再編成配列が参照配列管理部１１２によって生成され、参照配列データベース１２２に保存されている場合を例に挙げて説明したがこれに限定されない。例えば、変異情報データベース３ａに、各既知変異情報に対応する再編成配列、再編成配列ＩＤ、および再編成配列が含む変異の変異ＩＤなどが関連付けられて記憶されていてもよい。このような場合、参照配列管理部１１２は、通信部１６を介して、変異情報データベース３ａから各既知変異情報に対応する再編成配列、再編成配列ＩＤ、および再編成配列が含む変異の変異ＩＤなどを取得し、参照配列データベース１２２に格納する。
なお、医療機関２１０、検査機関１１０、解析機関１２０は一つであることに限定されない。すなわち、医療機関２１０は、複数の検査機関１１０に対して解析を依頼してもよく、検査機関１１０は、複数の医療機関２１０からの解析依頼を受け付けてもよい。また、検査機関１１０は、複数の解析機関１２０に対して解析を依頼してもよく、解析機関１２０は、複数の検査機関１１０からの解析依頼を受け付けてもよい。すなわち、医療機関２１０、検査機関１１０、および解析機関１２０のそれぞれが、複数であってもよい。また、例えば、臨床施設と検査施設とを兼備した研究所、および大学病院などの、医療機関２１０と検査機関１１０との双方の機能を有する機関、あるいは、検査機関１１０、解析機関１２０、および医療機関２１０が一体となっている機関においても、配列解析装置１を適用することができる。
例えば、配列解析装置１とは別体の装置が、参照配列管理部１１２、および参照配列生成部１１５の機能を備え、該装置が配列解析装置１に対して、再編成配列および参照配列を出力する参照配列生成装置として機能する構成であってもよい。この参照配列生成装置は、配列解析装置１とネットワーク４を介して接続されている管理サーバ３を含む外部サーバであってもよい。この場合、参照配列は、参照配列生成装置の機能を有する外部サーバから、配列解析装置１に提供されてもよい。例えば、配列解析装置１は、リード配列情報取得部１１１、配列決定部１１３、および変異同定部１１４を備える第１の装置、参照配列管理部１１２および参照配列生成部１１５を備える第２の装置、および記憶部１２と同様の機能を有する第３の装置（またはデータベース）を含むシステムとして構成することも可能である。
１ 配列解析装置
２ シーケンサー
３、３ａ、３ｂ 変異情報データベース
１４ 出力部
１５ 表示部
１１１ リード配列情報取得部
１１３ 配列決定部
１１２ 参照配列管理部
１１５ 参照配列生成部

Claims (36)

  1. 核酸配列を解析する方法であって、
    前記核酸配列から読み取られた複数のリード配列を取得する取得ステップと、
    それぞれのリード配列を、単一の参照配列を参照してアライメントすることにより前記核酸配列を決定する決定ステップと、を含み、
    前記参照配列は、少なくとも、第１の再編成配列、および前記第１の再編成配列とは異なる第２の再編成配列を含み、
    前記第１の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第１部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第２部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列の前記第２部分配列以外の配列は、前記第１の再編成配列の前記第１部分配列以外の配列と同一の配列を含むことを特徴とする配列解析方法。
  2. 前記多型は、反復配列多型、マイクロサテライト、および一塩基多型のうちのいずれかであり、
    前記変異は、置換、欠失、および挿入のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の配列解析方法。
  3. 前記決定ステップにおいて、前記リード配列を前記参照配列と比較し、前記リード配列と前記参照配列との一致率が最も高い、前記参照配列上の領域に前記リード配列をマッピングすることを特徴とする請求項１または２に記載の配列解析方法。
  4. 前記第１の再編成配列と前記第２の再編成配列とを含む前記参照配列を生成する参照配列生成ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  5. 前記第１の再編成配列、および前記第２の再編成配列は、変異情報データベースから取得される既知変異情報に基づいて生成されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  6. 前記変異情報データベースには、前記既知変異情報と、前記既知変異情報が前記変異情報データベースに記憶された日時を示す情報とが関連付けられていることを特徴とする請求項５に記載の配列解析方法。
  7. 前記参照配列生成ステップにおいて、前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が変異情報データベースに新たに記憶された場合、前記新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、前記第１の再編成配列、前記第２の再編成配列、および前記第３の再編成配列を含む前記参照配列を生成することを特徴とする請求項４に記載の配列解析方法。
  8. 前記参照配列生成ステップにおいて、前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が変異情報データベースに新たに記憶された場合、前記新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、前記第１の再編成配列または前記第２の再編成配列に前記第３の再編成配列を連結して、参照配列を生成することを特徴とする請求項４に記載の配列解析方法。
  9. 前記変異情報データベースに記憶された既知変異情報のそれぞれに個別の識別情報が付与されており、
    前記第１の再編成配列、前記第２の再編成配列、および前記第３の再編成配列は、それぞれ異なる識別情報が付与された既知変異情報に基づいて生成されることを特徴とする請求項７または８に記載の配列解析方法。
  10. 前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列は、多型、変異、またはメチル化の少なくとも１つを有するエクソンの部分配列または全配列であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  11. 前記取得ステップにおいて、前記核酸配列のうち、複数のベイトを用いて選択された核酸配列を読み取ることによって前記複数のリード配列を取得することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  12. オリゴＤＮＡが、前記核酸配列を読み取るために用いられる部材表面に固定されていることを特徴とする請求項１１に記載の配列解析方法。
  13. 前記決定ステップにおいて、前記複数のリード配列の各々は、野生型参照配列および参照配列と比較されることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  14. 前記参照配列は、解析対象となる１または２以上の遺伝子について生成された再編成配列を含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  15. 前記リード配列の読み取りは、次世代シーケンサーを用いて実施されることを特徴とする請求項１から１４のいずれか１項に記載の配列解析方法。
  16. 核酸配列を解析する配列解析装置であって、
    前記核酸配列から読み取られた複数のリード配列を取得するリード配列情報取得部と、
    それぞれのリード配列を、単一の参照配列を参照してアライメントすることにより前記核酸配列を決定する配列決定部と、を備え、
    前記参照配列は、少なくとも、第１の再編成配列、および前記第１の再編成配列とは異なる第２の再編成配列を含み、
    前記第１の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第１部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第２部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列の前記第２部分配列以外の配列は、前記第１の再編成配列の前記第１部分配列以外の配列と同一の配列を含むことを特徴とする配列解析装置。
  17. 前記配列決定部は、前記リード配列を前記参照配列と比較し、前記リード配列と前記参照配列との一致率が最も高い、前記参照配列上の領域を決定することを特徴とする請求項１６に記載の配列解析装置。
  18. 前記第１の再編成配列と前記第２の再編成配列とを含む前記参照配列を生成する参照配列生成部をさらに備えることを特徴とする請求項１６または１７に記載の配列解析装置。
  19. 前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いる既知変異情報を、変異情報データベースから取得する参照配列管理部をさらに備えることを特徴とする請求項１８に記載の配列解析装置。
  20. 前記参照配列生成部は、前記第１の再編成配列、前記第２の再編成配列、および前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報に基づいて生成した第３の再編成配列を含む前記参照配列を生成することを特徴とする請求項１９に記載の配列解析装置。
  21. 前記参照配列生成部は、前記第１の再編成配列または前記第２の再編成配列に、前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報に基づいて生成した第３の再編成配列を連結して、参照配列を生成することを特徴とする請求項１９または２０に記載の配列解析装置。
  22. 前記変異情報データベースに記憶された前記第１の再編成配列、前記第２の再編成配列、および前記第３の再編成配列のそれぞれに個別の識別情報が付与されており、
    前記参照配列管理部は、前記第１の再編成配列、前記第２の再編成配列、および前記第３の再編成配列は、それぞれ異なる識別情報が付与された既知変異情報に基づいて生成することを特徴とする請求項２０または２１に記載の配列解析装置。
  23. 前記配列決定部は、前記複数のリード配列の各々を、野生型参照配列および参照配列と比較することを特徴とする請求項１６から２２のいずれか１項に記載の配列解析装置。
  24. 前記配列決定部によって決定された前記核酸配列が前記参照配列、および前記野生型参照配列のいずれに一致するかに関する情報を出力する出力部をさらに備えることを特徴とする請求項２３に記載の配列解析装置。
  25. シーケンサーによって読み取られたリード配列の核酸配列を決定するために用いられる参照配列の生成方法であって、
    第１の再編成配列および第２の再編成配列を取得する再編成配列取得ステップと、
    前記第１の再編成配列と前記第２の再編成配列とを一繋がりに連結した参照配列を生成する参照配列生成ステップとを含み、
    前記第１の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第１部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第２部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列の前記第２部分配列以外の配列は、前記第１の再編成配列の前記第１部分配列以外の配列と同一の配列を含むことを特徴とする参照配列の生成方法。
  26. 前記多型は、反復配列多型、マイクロサテライト、および一塩基多型のうちのいずれかであり、
    前記変異は、置換、欠失、および挿入のうちのいずれかであることを特徴とする請求項２５に記載の参照配列の生成方法。
  27. 前記第１の再編成配列、および前記第２の再編成配列は、変異情報データベースから取得された情報に基づいて生成されることを特徴とする請求項２５または２６に記載の参照配列の生成方法。
  28. 前記変異情報データベースには、既知変異情報と、前記既知変異情報が前記変異情報データベースに記憶された日時を示す情報とが関連付けられていることを特徴とする請求項２７に記載の参照配列の生成方法。
  29. 前記参照配列生成ステップにおいて、前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が前記変異情報データベースに新たに記憶された場合、前記新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、前記第１の再編成配列、前記第２の再編成配列、および前記第３の再編成配列を含む前記参照配列を生成することを特徴とする請求項２７または２８に記載の参照配列の生成方法。
  30. 前記参照配列生成ステップにおいて、前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列の生成に用いられた既知変異情報とは異なる既知変異情報が前記変異情報データベースに新たに記憶された場合、前記新たに記憶された既知変異情報に基づいて生成された第３の再編成配列に基づいて、前記第１の再編成配列または前記第２の再編成配列に前記第３の再編成配列を連結して、参照配列を生成することを特徴とする請求項２７から２９のいずれか１項に記載の参照配列の生成方法。
  31. 前記第１の再編成配列および前記第２の再編成配列は、前記多型、変異、メチル化を有するエクソンの部分配列または全配列であることを特徴とする請求項２５から３０のいずれか１項に記載の参照配列の生成方法。
  32. シーケンサーによって読み取られたリード配列の核酸配列を決定するために用いられる参照配列を生成する参照配列生成装置であって、
    第１の再編成配列および第２の再編成配列を取得する参照配列管理部と、
    前記第１の再編成配列と前記第２の再編成配列とを一繋がりに連結した参照配列を生成する参照配列生成部とを備え、
    前記第１の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第１部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第２部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列の前記第２部分配列以外の配列は、前記第１の再編成配列の前記第１部分配列以外の配列と同一の配列を含むことを特徴とする参照配列生成装置。
  33. コンピュータに、
    核酸配列から読み取られた複数のリード配列を取得する工程と、
    それぞれのリード配列を、第１の再編成配列および第２の再編成配列を少なくとも含む単一の参照配列を参照してアライメントすることにより核酸配列を決定する工程と、
    を実行させるためのプログラムであって、
    前記第１の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第１部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第２部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列の前記第２部分配列以外の配列は、前記第１の再編成配列の前記第１部分配列以外の配列と同一の配列を含むことを特徴とする、遺伝子の配列情報を解析するプログラム。
  34. 請求項３３に記載のプログラムを記録したコンピュータ読取り可能な記録媒体。
  35. コンピュータに、
    第１の再編成配列および第２の再編成配列を取得する工程と、
    前記第１の再編成配列と前記第２の再編成配列とを一繋がりに連結した参照配列を生成する工程と
    を実行させるためのプログラムであって、
    前記第１の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第１部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列は、多型、変異、及びメチル化の少なくとも１つを表す第２部分配列を一部に含む配列であり、
    前記第２の再編成配列の前記第２部分配列以外の配列は、前記第１の再編成配列の前記第１部分配列以外の配列と同一の配列を含むことを特徴とする、シーケンサーによって読み取られたリード配列の核酸配列を決定するために用いられる参照配列を生成するプログラム。
  36. 請求項３５に記載のプログラムを記録したコンピュータ読取り可能な記録媒体。
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