WO2016015194A1 - 青光眼的筛查试剂盒 - Google Patents

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WO2016015194A1
WO2016015194A1 PCT/CN2014/083126 CN2014083126W WO2016015194A1 WO 2016015194 A1 WO2016015194 A1 WO 2016015194A1 CN 2014083126 W CN2014083126 W CN 2014083126W WO 2016015194 A1 WO2016015194 A1 WO 2016015194A1
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mutation
variant
glaucoma
reagent
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杨正林
孙兴怀
林婴
陈宇虹
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电子科技大学附属医院.四川省人民医院
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to the field of S P, and more particularly to S P associated with glaucoma.
  • Glaucoma is the leading cause of blindness worldwide, characterized by retinal ganglion cell death.
  • POAG primary open angle glaucoma
  • HVG high intraocular pressure glaucoma
  • PG normal intraocular pressure glaucoma
  • POAG can be caused by a single gene mutation, which is consistent with Mendelian inheritance; but most POAGs are sporadic, caused by genetic variation of multiple genes and environmental factors.
  • MYOC encode myofibrillin;
  • OPTN encode optic nerve protein
  • WDR36 encoding WD repeat domain
  • TBK1 TANK binding kinase 1
  • ASB 10 encoding ankyrin overlap and SOCS
  • the present invention provides a new glaucoma screening kit.
  • the invention provides detection of AfiC U gene rs2487032 mutation, rs2472519 mutation, rs2472459 mutation, rs2164560 mutation, rsl2555462 variation, rs2472511 variation, rs2422493 variation, rs2487042 variation, rs2472495 variation, rs4397467 variation, rsll25873 variation, rs715119 variation, rs2487052 variation, rs2472493 variation, Rs2487048 variant, rs2027400 variant, rs2472509 variant, rsl800977 variant, rs2246293 variant, rs2515618 variant, rs7023634 variant, rsl2553329 variant, rs2437817 variant, rs3887137 variant, rs2487046 variant, rs2472496 variant, rsl 800976 variant, rs2472516 variant,
  • the reagent includes detection of AfiC gene rs2487032 mutation A ⁇ G, rs2472519 mutation A ⁇ G, rs2472459 mutation T ⁇ C, rs2164560 mutation C ⁇ T, rsl2555462 mutation A ⁇ T, rs2472511 mutation A ⁇ G, rs2422493 mutation C ⁇ T, Rs2487042 mutation A ⁇ G, rs2472495 mutation C ⁇ T, rs4397467 mutation G ⁇ A, rsl 125873 variation T ⁇ A, rs715119 mutation A ⁇ G, rs2487052 variation T ⁇ C, rs2472493 variation C ⁇ T, rs2487048 variation C ⁇ T, rs2027400 Variation A ⁇ G, rs2472509 mutation C ⁇ A, rsl 800977 mutation T ⁇ C, rs2246293 mutation C ⁇ G, rs2515618 mutation A ⁇ G, rs7023634 mutation G
  • the reagent further comprises optionally for amplifying comprising AfiC? gene rs2487032, rs2472519, rs2472459, rs2164560, rs 12555462, rs2472511, rs2422493, rs2487042, rs2472495, rs4397467, rsll25873, rs715119, rs2487052, rs2472493, rs2487048, rs2027400, Rs2472509, rsl800977, Reagents for gene fragments of rs2246293, rs2515618, rs7023634, rsl2553329, rs2437817, rs3887137, rs2487046, rs2472496, rsl800976, rs2472516, rs2043664, rs2487034, or/and rs2
  • the screening kit for glaucoma of the present invention which comprises optionally for detecting gene rs2487032 mutation, rs2472519 mutation, rs2472459 variation, rs2164560 variation, rsl2555462 variation, rs2472511 variation, rs2422493 variation, rs2487042 variation, rs2472495 variation, rs4397467 variation, rsl l25873 Mutation, rs715119 variant, rs2487052 variant, rs2472493 variant, rs2487048 variant, rs2027400 variant, rs2472509 variant, rsl800977 variant, rs2246293 variant, rs2515618 variant, rs7023634 variant, rsl2553329 variant, rs2437817 variant, rs3887137 variant, rs2487046 variant, rs2472496 variant, rsl
  • the reagents include detection of AfiC U gene rs2487032 mutation A ⁇ G, rs2472519 mutation A ⁇ G, rs2472459 mutation T ⁇ C, rs2164560 mutation C ⁇ T, rsl2555462 variation A ⁇ T, rs2472511 variation A ⁇ G, rs2422493 variation C ⁇ T Rs2487042 variation A ⁇ G, rs2472495 variation C ⁇ T, rs4397467 variation G ⁇ A, rsl l25873 variation T ⁇ A, rs715119 variation A ⁇ G, rs2487052 variation T ⁇ C, rs2472493 variation C ⁇ T, rs2487048 variation C ⁇ T, Rs2027400 mutation A ⁇ G, rs2472509 mutation C ⁇ A, rsl800977 mutation T ⁇ C, rs2246293 mutation C ⁇ G, rs2515618 mutation A ⁇ G, rs7023634 mutation G
  • the reagent further comprises optionally for amplifying comprising the AfiCAJ gene rs2487032, rs2472519, rs2472459, rs2164560, rsl 2555462, rs2472511, rs2422493, rs2487042, rs2472495, rs4397467, rsl 125873, rs715119, rs2487052, rs2472493, rs2487048, rs2027400, rs2472509 , rsl800977, rs2246293, rs2515618, rs7023634, rsl2553329, rs2437817, rs3887137, rs2487046, rs2472496, rsl800976, rs2472516, rs2043664, rs2487034, or / and rs248
  • S P is an abbreviation of Single Nucleotide Polymorphism, which is a single nucleotide polymorphism in Chinese, which refers to the variation of a single nucleotide on the genome.
  • the aforementioned five variant bases are the result of single nucleotide variation.
  • the present invention clarifies for the first time that 31 sites on the ASC4J gene are associated with glaucoma.
  • the kit provided by the present invention the resistance and susceptibility of the test population to glaucoma diseases can be effectively screened, and the glaucoma of the test subject is evaluated. The possibility, the application prospects are good.
  • the assay method of the present invention measures genomic DNA derived from humans, and the sample is not limited, such as body fluids (such as blood, ascites, and urine), tissue cells (such as liver tissue), and the like, and genomic DNA can be prepared by extracting and purifying these samples.
  • Each base type at the same position of the chromosomal DNA is called an allelic site.
  • SP has only two alleles in the population, so it is also called a biallelic marker.
  • the detection is a kind of "+/-" or "Full/None" detection method.
  • FIG. 25 Snapshot detection genotyping map of SNP rs2487046 locus
  • dNTP deoxynucleoside triphosphate
  • the primary open angle glaucoma included in the study of the present invention comprises high intraocular pressure glaucoma (HTG) and normal intraocular pressure glaucoma (PG).
  • HOG high intraocular pressure glaucoma
  • PG normal intraocular pressure glaucoma
  • GWAS genome-wide association analysis
  • both the first phase of validation and the second phase of validation were performed with high intraocular pressure glaucoma (HTG).
  • the discovery phase included 1007 patients with high intraocular pressure glaucoma and 1009 normal controls. All samples were from Shanghai, Hong Kong, and Chengdu, respectively, collected at the Eye and ENT Hospital of Fudan University, Hong Kong Chinese Eye Hospital of the Chinese University of Hong Kong, and Sichuan Provincial People's Hospital.
  • the first phase of the validation included 525 patients with high intraocular pressure glaucoma and 912 normal controls.
  • the samples were taken from the National Eye Centre of Singapore, the Singapore Eye Institute, and the National University of Singapore Health Department.
  • the second-stage validation included 615 sporadic high-intensity glaucoma patients and 1,325 normal controls, from Shanghai, Beijing, and Sichuan, from Beijing Tongren Hospital, Fudan University Eye and Otolaryngology Hospital, and Sichuan Provincial People's Hospital.
  • the three-stage patients were mainly normal intraocular pressure glaucoma. There were 759 patients and 2728 normal controls.
  • the samples were from Shanghai, Beijing, Sichuan, and Hong Kong. They were taken from Beijing Tongren Hospital, Fudan University Eye and ENT Hospital, Sichuan province.
  • Genomic DNA was prepared from human peripheral blood according to the following method. The collected 5 ml of human peripheral blood was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes in the presence of an anticoagulant EDTA to remove serum. Then 0.2% NaCl solution was added to make the total volume 50 ml. The solution was gently shaken 5-6 times and placed on ice for 15 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, thereby collecting a precipitate. Washing was carried out in a manner similar to the previous one with a 0.2% NaCl solution. To the precipitate thus obtained, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 10 mM EDTA (4 ml) were added to suspend the precipitate.
  • 10 mM Tris-HCl pH 8.0
  • 10 mM EDTA 4 ml
  • the present invention uses Snapshot genotyping technology to detect 31 SNPs located on the ATP-binding cassette (sub-family A (ABC1), member 1, AfiCAJ) gene.
  • the gene amplification reagent and the Snapshot primer were used for typing according to the following methods.
  • SNaPshot is also known as microsequencing.
  • ABSI Applied Biotechnology
  • the primer is terminated by one base extension, and after electrophoresis by an ABI sequencer, According to the color of the peak, the type of the base to be incorporated is known, thereby determining the genotype of the sample, and the SP site corresponding to the extension product is determined according to the position of the gel moving the peak.
  • the PCR product template can be obtained by a multiplex PCR reaction system. Usually used for 5-15 S P locus analysis. The relevant information of 31 SPs of the present invention is shown in Table 1 below:
  • PCR Denaturation at 95 °C for 5 minutes; 95 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 45 seconds, 35 cycles; 72 °C for 7 minutes, 4 °C for insulation.
  • Snapshot reaction Snapshot MULTIPLEX 1 ⁇ , purified PCR mix 1 ⁇ , Snapshot bow I each 0.2 ⁇ 1, DDH 2 0 complement 5 ⁇ 1.
  • Snapshot F 5 'CCTCCTGAGATAAC AGGCGC 3' ; : j ;oi ⁇ sd3 ⁇ 4us
  • the 31 SPs of the present invention can also adopt the following detection methods.
  • Detection - Detection The S P method includes:
  • the dideoxynucleotide chain termination method (traditional Sanger sequencing) is based on nucleotides starting at a fixed point, randomly terminating at a specific base, and fluorescent labeling after each base. Four sets of nucleotides of different lengths ending with A, T, C, G were generated and then electrophoresed on a urea-denatured PAGE gel to obtain a visible DNA base sequence. Basic procedures: 1), DNA template extraction and quality inspection; 2), sequence alignment, primer design and synthesis; 3), PCR amplification, including preparation of denatured double-stranded template, extension and termination reactions; 4), PCR products Purification; 5), sequencing instrument detection; 6), sequence reading.
  • Pyrosequencing is a DNA sequencing method based on the principle of polymerization, which relies on the release of pyrophosphate in nucleotide incorporation, rather than the chain termination reaction involving dideoxynucleoside triphosphate. Is made up of 4 enzymes
  • DNA polymerase DNA polymerase, ATP sulfurytase, luciferase and adenosine triphosphatase (Apyrasep-catalyzed enzyme cascade reaction in the same reaction system.
  • Basic procedure 1 ), genomic DNA extraction; 2), design and synthesis of PCR primers, one of which labeled biotin, PCR reaction; 3), Isolation of DNA double strands, annealing of biotin-containing single-stranded DNA with sequencing primers; 4) sequencing of biotin-containing single-stranded DNA, sequencing-based SP analysis and allele frequency determination.
  • Second-generation high-throughput sequencing also known as “next generation” sequencing
  • next-Generation Sequencing NGS
  • NGS NGS
  • Roche 454, Illumina Solexa, ABI SOLiD and Life's Ion torrent The basic process: 1), the target DNA is cut into small fragments to construct a sequencing library; 2), a single small fragment DNA molecule is bound to the solid phase surface for anchor bridging; 3) pre-amplification of single molecule independent amplification 4), single base extension of one base (A, C, T, G) at a time to sequence and detect signals; 5), high-resolution imaging system; 6), data analysis.
  • Three-generation single-molecule real-time sequencing technology including parallel single-molecule synthesis sequencing (Helicos Biosciences, tSMSTM) platform; Single Molecule Real Time (SMRT) platform; Nanohole single molecule technology (Oxford Nanopore Technologies) platform .
  • tSMSTM Three-generation single-molecule real-time sequencing technology, including parallel single-molecule synthesis sequencing (Helicos Biosciences, tSMSTM) platform; Single Molecule Real Time (SMRT) platform; Nanohole single molecule technology (Oxford Nanopore Technologies) platform .
  • SMSTM Three-generation single-molecule real-time sequencing technology, including parallel single-molecule synthesis sequencing (Helicos Biosciences, tSMSTM) platform; Single Molecule Real Time (SMRT) platform; Nanohole single molecule technology (Oxford Nanopore Technologies) platform .
  • SMSTM Three-generation single-molecule real-time sequencing technology, including parallel single-molecule synthesis sequencing (Helicos Biosciences, tSMSTM)
  • the Taqman probe method is to design PCR primers and TaqMan probes for different S P sites on the chromosome, and perform real-time fluorescent PCR amplification.
  • the 5'-end and 3'-end of the probe are labeled with a reporter fluorophore and a quenched fluorophore, respectively.
  • the probe anneals to the template to produce a substrate suitable for exonuclease activity, thereby cleaving the fluorescent molecule attached to the 5'-end of the probe from the probe, destroying both PRET between fluorescent molecules fluoresces.
  • the basic process 1), DNA extraction and quality inspection; 2), sequence alignment, specific fluorescent probe design and synthesis; 3), fluorescence quantitative PCR test; 4), analysis of results data.
  • HRMA High Resolution Melting Analysis
  • the detection of SNP technology is based on denaturation of PCR products in a certain temperature range, real-time monitoring of double-stranded DNA fluorescent dyes and PCR in the process of temperature rise.
  • the binding of the amplified products to determine the presence of SP, and whether the different SP sites, whether it is heterozygous or the like will affect the peak shape of the melting curve.
  • the basic process 1) DNA extraction and quality inspection; 2), sequence alignment, designed 20 ⁇ 35bp Luna probe unlabeled probe for known SP sites; 3), add LC Green saturated fluorescent dye (EvaGreen or LC green PCR, 4), PCR products directly HRM detection; 6), using Luna probe analysis results.
  • Denaturing High Performance Liquid Chromatography or HPLC-WAVE wavelength is a single-strand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).
  • SSCP single-strand conformation polymorphism
  • DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
  • AS-PCR Allele-specific PCR
  • Amplification refractory mutation system ARMS
  • Allele-specific enzymatic amplification ASA
  • PAS A PCR amplification of specific allele
  • the 3' end of one strand is complementary (or identical) to the base of the SP locus, and the other strand (ordinary strand;) is designed according to a conventional method. Because specific primers have amplification products in one genotype and no amplification products in another genotype, gel electrophoresis can easily distinguish the presence or absence of amplification products, thereby determining the genotype of SP. .
  • the basic process 1), DNA extraction and quality inspection; 2), polymorphic site-specific primer design: specific PCR primers with 3' terminal and SP site base complement or mismatch; 3), PCR amplification 4), detecting the presence or absence of PCR amplification products by gel electrophoresis or the like. 5.
  • Allele-Specific Oligonucleotide is a detection technique for known mutations based on hybridization.
  • a combination of PCR and AS0 was used to design a 20 bp oligonucleotide fragment containing the site of the mutation, which was used as a probe to hybridize to the PCR-amplified sample DNA immobilized on the membrane.
  • the basic process 1), DNA extraction and quality inspection; 2) PCR amplification; 3) direct hybridization with the corresponding oligonucleotide probe, elution; 4), analysis of results.
  • Gene chips also known as DNA chips or DNA microarrays, are a large number of densely packed arrays of known sequence probes that are complementary to the target nucleic acid sequence being labeled, Hybridization of the probe at a specific site, using the gene chip hybridization image to determine the position of the hybridization probe, the sequence of the target gene can be determined according to the principle of complementary base matching.
  • the basic process 1), detection of sample genomic DNA by PCR preparation of probes; 2), solid-liquid phase hybridization with the chip; 3), after high-rigidity washing, the results are tested. 4) Select the detection method according to the type of the probe label molecule and the specification of the chip; 5), and then select the corresponding software for data analysis.
  • the base difference caused by the SP polymorphism is reflected by the difference in molecular weight, and the matrix-assisted laser solution Adsorption ionization time-of-flight mass spectrometry mass spectrometry was used to detect the molecular weight of the extended product.
  • SP-type detection was performed by determining the difference in molecular weight using a dedicated analysis software. Basic process: 1), DNA Extraction and quality inspection; 2), primer design and synthesis; 3), PCR amplification reaction and extension reaction; 4), Sequenom mass spectrometer detection; 6), analysis of results.
  • the polymorphism of DNA causes changes in the restriction sites and numbers of DNA molecules.
  • the PCR-RFLP method is now used to study the restriction fragment length polymorphism of genes.
  • the basic process 1), PCR amplification; 2 ), PCR amplification product detection; 3), restriction endonuclease digestion reaction; 4), digestion product electrophoresis typing; 5), color development, the results are judged.
  • Single Strand Conformation Polymorphism is a point mutation detection method based on single-strand DNA conformational differences. Single-stranded DNA of the same length forms a different conformation if the order is different, even if the individual bases are different. The speed of movement during electrophoresis is different. When the PCR product is denatured and subjected to single-stranded DNA gel electrophoresis, when a single base substitution or the like changes in the target DNA, a movement displacement occurs.
  • S P locus polymorphism is closely related to glaucoma
  • the rs715119 G allele improves glaucoma resistance without considering the traditional risk factors for glaucoma.
  • the lower limit of %CI is 1.12>1, and it can be determined that the G allele at the rs7023634 locus is a risk factor.
  • N022 rsl2553329 Control 112 461 424 685 1309 1.24 0.344
  • the lower limit of %CI is 1.09>1, and it can be determined that the rsl2553329 locus A allele is a risk factor.
  • the lower limit of %CI is 1.07>1, and it can be determined that the rs3887137 A allele is a risk factor.
  • the lower limit of %CI is 1.03>1, and it can be determined that the T allele at the rs2472516 locus is a risk factor.
  • the lower limit of %CI is 1.01>1, and it can be determined that the rs2043664 locus A allele is a risk factor.
  • the lower limit of %CI is 1.01>1, and it can be determined that the rs2487034 locus G allele is a risk factor.
  • the lower limit of %CI is 1.01>1, and it can be determined that the rs2487031 locus C allele is a risk factor.
  • the PCR product was detected by 2% agarose gel electrophoresis, and the effect of the PCR reaction was observed, and the amount which was added as a template in the subsequent reaction was determined.
  • the first step purification of the PCR product (12 ⁇ 1 system):
  • Step 4 ABI Genetic Analyzer reads the results:
  • genotype results were read on the ABI PRISM 3130XL DNA Sequencer. This kit is used for: 1. Early diagnosis and classification of glaucoma resistant population or susceptible population; 2. Genetic testing and possibility assessment of glaucoma resistant population or susceptible population.
  • the detection method of the present invention can be used to analyze the polymorphisms of the 31 S P sites shown in Table 1 of the present invention, and is used in the auxiliary diagnosis of glaucoma and the evaluation of individual glaucoma disease resistance and susceptibility.
  • the nucleic acid sequence for detecting S P site polymorphism and the glaucoma related gene/site established by the present invention can be applied to a kit for glaucoma gene diagnosis with high sensitivity and specificity.
  • the present invention evaluates the possibility of glaucoma in a sample to be examined by detecting the variation of 31 SP sites shown in Table 1. The sensitivity is high, and only a small amount of DNA sample is sufficient to determine the variation of the site, and the early screening is achieved. Check the purpose.

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Abstract

提供了检测 ABCA1基因上的31个SNP位点的试剂在制备检测青光眼的试剂盒中的用途。还提供了青光眼检测用试剂盒。该试剂盒可用于青光眼的辅助性诊断，还可用于评估个体的青光眼抗性和易感性。

Description

青光眼的筛查试剂盒 技术领域
本发明涉及 S P领域， 特别涉及与青光眼相关的 S P。
背景技术
青光眼是全世界主要的致盲原因， 它是以视网膜神经节细胞死亡为特征。 在大多数人 群中， 原发性开角型青光眼 (POAG， MIM 137760)是原发性青光眼的主要类型。 POAG可以 被分为高眼压型青光眼（HTG)和正常眼压型青光眼（ PG)。 POAG可以由单个基因突变 引起， 该种类型符合孟德尔遗传规律； 但多数 POAG是散发的， 由多个基因的遗传变异和 环境因素共同引起。 目前已鉴定出五个基因一 MYOC(编码肌纤蛋白；)， OPTN (编码视神经 蛋白）， WDR36 (编码 WD重复结构域)， TBK1 (TANK结合激酶 1)和 ASB 10 (encoding锚蛋 白重合和 SOCS盒基因 10) 能引起单基因遗传的 POAG。 然而这五个基因的突变只能解释 5%-6% 的原发性开角型青光眼的发病， 而大多数患者的发病仍无法解释。
发明内容
为了解决上述问题， 本发明提供了一种新的青光眼的筛査试剂盒。
本发明提供了检测 AfiC U基因 rs2487032变异、 rs2472519变异、 rs2472459变异、 rs2164560变异、 rsl2555462变异、 rs2472511变异、 rs2422493变异、 rs2487042变异、 rs2472495变异、 rs4397467变异、 rsll25873变异、 rs715119变异、 rs2487052变异、 rs2472493 变异、 rs2487048变异、 rs2027400变异、 rs2472509变异、 rsl800977变异、 rs2246293变 异、 rs2515618变异、 rs7023634变异、 rsl2553329变异、 rs2437817变异、 rs3887137变异、 rs2487046变异、 rs2472496变异、 rsl 800976变异、 rs2472516变异、 rs2043664变异、 rs2487034 变异、 或 /和 rs2487031变异的相关试剂在制备青光眼筛査试剂中的用途。
所述试剂包括检测 AfiC ?基因 rs2487032变异 A→G、rs2472519变异 A→G、rs2472459 变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462变异 A→T、rs2472511变异 A→G、 rs2422493 变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl 125873 变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048 变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509变异 C→A、 rsl 800977变异 T→C、 rs2246293 变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817 变异 T→G、 rs3887137变异 A→G、 rs2487046变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976 变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂。
所述的试剂还包括任选的用于扩增包含 AfiC ?基因 rs2487032、 rs2472519、 rs2472459、 rs2164560、 rs 12555462、 rs2472511、 rs2422493、 rs2487042、 rs2472495、 rs4397467、 rsll25873、 rs715119、 rs2487052、 rs2472493、 rs2487048、 rs2027400、 rs2472509、 rsl800977、 rs2246293、rs2515618、rs7023634、rsl2553329、rs2437817、rs3887137、rs2487046、rs2472496、 rsl800976、 rs2472516、 rs2043664、 rs2487034、 或 /和 rs2487031变异的基因片段的试剂。
其中，所述检测 ABCA1基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459 变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462变异 A→T、rs2472511变异 A→G、 rs2422493 变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl 125873 变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048 变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509变异 C→A、 rsl 800977变异 T→C、 rs2246293 变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817 变异 T→G、 rs3887137变异 A→G、 rs2487046变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976 变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 Snapshot用试剂。
所述检测 AfiCAJ基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459变异 T→C、 rs2164560变异 C→T、 rsl2555462变异 A→T、 rs2472511变异 A→G、 rs2422493 变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl 125873 变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048 变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509变异 C→A、 rsl 800977变异 T→C、 rs2246293 变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817 变异 T→G、 rs3887137变异 A→G、 rs2487046变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976 变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 DNA测序用试剂、 实时荧光定量 PCR法用试剂、 变性高 效液相色谱分析法用试剂、 等位基因特异扩增法用试剂、 杂交法用试剂、 质谱法用试剂、 限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构象多态性分析法用试剂。
本发明青光眼的筛査试剂盒， 它包括任选的用于检测 基因 rs2487032变异、 rs2472519变异、 rs2472459变异、 rs2164560变异、 rsl2555462变异、 rs2472511变异、 rs2422493变异、 rs2487042变异、 rs2472495变异、 rs4397467变异、 rsl l25873变异、 rs715119 变异、 rs2487052变异、 rs2472493变异、 rs2487048变异、 rs2027400变异、 rs2472509变 异、 rsl800977变异、 rs2246293变异、 rs2515618变异、 rs7023634变异、 rsl2553329变异、 rs2437817变异、 rs3887137变异、 rs2487046变异、 rs2472496变异、 rsl 800976变异、 rs2472516 变异、 rs2043664变异、 rs2487034变异、 或 /和 rs2487031变异的相关试剂。
所述的试剂包括检测 AfiC U基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462变异 A→T、rs2472511变异 A→G、 rs2422493变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl l25873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、rs2027400变异 A→G、rs2472509变异 C→A、rsl800977变异 T→C、 rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、 rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、rs2487046变异 C→T、rs2472496变异 A→G、 rsl 800976变异 C→G、rs2472516变异 T→C、rs2043664变异 A→G、rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂.
所述试剂还包括任选的用于扩增包含 AfiCAJ基因 rs2487032、 rs2472519、 rs2472459、 rs2164560、 rsl 2555462、 rs2472511、 rs2422493、 rs2487042、 rs2472495、 rs4397467、 rsl 125873、 rs715119、 rs2487052、 rs2472493、 rs2487048、 rs2027400、 rs2472509、 rsl800977、 rs2246293、 rs2515618、rs7023634、rsl2553329、rs2437817、rs3887137、rs2487046、rs2472496、rsl800976、 rs2472516、 rs2043664、 rs2487034、 或 /和 rs2487031变异的基因片段的试剂。
其中，所述检测 ABCA1基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459 变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462变异 A→T、rs2472511变异 A→G、 rs2422493 变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl 125873 变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048 变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509变异 C→A、 rsl 800977变异 T→C、 rs2246293 变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817 变异 T→G、 rs3887137变异 A→G、 rs2487046变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976 变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 Snapshot试剂。
其中，所述检测 ABCA1基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459 变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462变异 A→T、rs2472511变异 A→G、 rs2422493 变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl 125873 变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048 变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509变异 C→A、 rsl 800977变异 T→C、 rs2246293 变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817 变异 T→G、 rs3887137变异 A→G、 rs2487046变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976 变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 DNA测序用试剂、 实时荧光定量 PCR法用试剂、 变性高 效液相色谱分析法用试剂、 等位基因特异扩增法用试剂、 杂交法用试剂、 质谱法用试剂、 限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构象多态性分析法用试剂。
S P是 Single Nucleotide Polymorphism的缩写， 中文翻译为单核苷酸多态性， 是指基因组上单个核苷酸的变异。 前述 5个变异碱基属于单核苷酸变异的结果。
本发明首次阐明了 ASC4J基因上 31个位点与青光眼存在相关性，使用本发明提供的 试剂盒，可以有效筛査待检人群的对青光眼疾病的抗性和易感性，评估待检人群患青光眼 的可能性， 应用前景良好。
本发明的测定方法测定来源于人的基因组 DNA， 样品没有限制， 如体液 （如血液、 腹水和尿液）、组织细胞（如肝组织）等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组 DNA。 染色体 DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点， S P在人群中大多只有 两种等位型， 故亦称为双等位标记， 其检测是一种 "+/ - "或"全 /无"的检测方式。
附图说明
图 1 Snapshot检测 SNP rs2487032位点的基因分型图谱
图 2 Snapshot检测 SNP rs2472519位点的基因分型图谱
图 3 Snapshot检测 SNP rs2472459位点的基因分型图谱
图 4 Snapshot检测 SNP rs2164560位点的基因分型图谱
图 5 Snapshot检测 SNP rsl2555462位点的基因分型图谱
图 6 Snapshot检测 SNP rs2472511位点的基因分型图谱
图 7 Snapshot检测 SNP rs2422493位点的基因分型图谱
图 8 Snapshot检测 SNP rs2487042位点的基因分型图谱
图 9 Snapshot检测 SNP rs2472495位点的基因分型图谱
图 10 Snapshot检测 SNP rs4397467位点的基因分型图谱
图 11 Snapshot检测 SNP rsl l25873位点的基因分型图谱
图 12 Snapshot检测 SNP rs715119位点的基因分型图谱
图 13 Snapshot检测 SNP rs2487052位点的基因分型图谱
图 14 Snapshot检测 SNP rs2472493位点的基因分型图谱
图 15 Snapshot检测 SNP rs2487048位点的基因分型图谱
图 16 Snapshot检测 SNP rs2027400位点的基因分型图谱
图 17 Snapshot检测 SNP rs2472509位点的基因分型图谱
图 18 Snapshot检测 SNP rs 1800977位点的基因分型图谱
图 19 Snapshot检测 SNP rs2246293位点的基因分型图谱
图 20 Snapshot检测 SNP rs2515618位点的基因分型图谱
图 21 Snapshot检测 S P 7023634位点的基因分型图谱
图 22 Snapshot检测 SNP rsl2553329位点的基因分型图谱
图 23 Snapshot检测 SNP rs2437817位点的基因分型图谱
图 24 Snapshot检测 SNP rs3887137位点的基因分型图谱
图 25 Snapshot检测 SNP rs2487046位点的基因分型图谱
图 26 Snapshot检测 SNP rs2472496位点的基因分型图谱
图 27 Snapshot检测 SNP rs 1800976位点的基因分型图谱
图 28 Snapshot检测 SNP rs2472516位点的基因分型图谱
图 29 Snapshot检测 SNP rs2043664位点的基因分型图谱
图 30 Snapshot检测 SNP rs2487034位点的基因分型图谱
图 31 Snapshot检测 SNP rs2487031位点的基因分型图谱
具体实施方式 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但 不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实 现的技术均属于本发明的范围。
用于下列实施例中表示试剂均为市售品， 其英文缩写如下。
需要时， 用高压锅 (120°C， 20分钟;)灭菌
EDTA: 乙二胺四乙酸二钠
SDS: 十二垸基硫酸钠
TE: 10mM Tris-HCl(pH7.5)、 ImM EDTA(pH8.0)
dNTP: 脱氧核苷三磷酸
实施例 1 样本收集和基因组 DNA的提取
本发明研究纳入的原发性开角型青光眼包含了高眼压型青光眼 （HTG) 和正常眼压 型青光眼 （ PG)。 全基因组关联分析 （GWAS) 的发现阶段， 验证一阶段和验证二阶段 用的都是高眼压型青光眼 （HTG)。 发现阶段包含了 1007个散发的高眼压型青光眼患者 和 1009个正常对照。 所有样本都来自于上海， 香港， 和成都地区， 分别在复旦大学附属 眼耳鼻喉科医院， 香港中文大学香港眼科医院， 四川省人民医院收集。验证一阶段包含了 525位高眼压型青光眼患者和 912个正常对照， 样本取自新加坡国立眼科中心， 新加坡眼 科研究所，新加坡国立大学健康署。二阶段验证包含 615个散发的高眼压型青光眼患者和 1325个正常对照， 样本来自上海、 北京和四川， 分别取自北京同仁医院， 复旦大学附属 眼耳鼻喉科医院和四川省人民医院。三阶段患者主要是正常眼压青光眼，共有 759个患者 和 2728个正常对照， 样本来自上海、 北京、 四川和香港地区， 分别取自北京同仁医院， 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院， 四川省人民医院和香港眼科医院。所有参与者均由眼科医 生按照标准操作流程给予详细的眼科检査。 本研究原发性开角型青光眼患者 2906例， 平 均年龄 54.9±16.1 (18.0-95.0)岁， 其中男性占 53.8%， 对照 5974例， 平均年龄 64.9±16.6 (19.0-102.0)岁， 其中男性占 51.6%。 所有受检者均为汉族， 且签署知情同意书， 这一研究 也得到了伦理委员会批准。
根据下列方法，用人外周血制备基因组 DNA。在抗凝剂 EDTA存在下，将收集的 5ml 人外周血在 3000rpm离心分离 30分钟除去血清。 接着加入 0.2%NaCl溶液， 使总体积为 50ml。 轻轻振荡溶液 5-6次， 并使其放置于冰上 15分钟。 此后， 在 3000rpm离心分离 30 分钟， 借此收集沉淀物。 用 0.2%的 NaCl溶液， 以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此 获得的沉淀物中， 加入 10mM Tris-HCl (pH8.0)和 10mM EDTA (4ml)， 以悬浮该沉淀物。 将 10%SDS， 25mg/ml的蛋白酶 K和 10mg/ml的 RNaseA加入悬液中， 其加入量分别为 4ml、 16μ1和 20μ1， 接着上下颠倒悬液轻轻混合。 然后， 在 37°C过夜温育悬液。 过夜后， 加入 4ml酚 /Tris溶液， 上下颠倒混合物混合所得的混合物。 以 3000rpm离心分离 10分钟 除去水层。 将水层和 4ml酚 /氯仿溶液混合， 接着逆混合并以 3000rpm离心分离 10分钟， 除去水层。 最后， 用氯仿提取两次， 以获得水相， 往其中加 1/10， 3M NaAC (pH5.2), 两 倍量的冷无水乙醇， 使 DNA沉淀。 用 70%的乙醇洗涤以获得基因组 DNA。 最后将所得 的基因组 DNA溶解于 TE中， 然后定量测定混合物在 260nm的吸收率， DNA工作液浓 度校正至 50ι¾/μ1， 置 -20°C冰箱保存。 实施例 2 本发明 SNP的基因型分析
本发明采用 Snapshot基因分型技术对如下位于三磷酸腺苷结合盒转运子 1 (ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1， AfiCAJ)基因上的 31个 SNP位点进行检测。 采用基因扩增试剂及 Snapshot引物分别按照下述方法进行分型。 SNaPshot又称微测序法。 该技术由美国应用生物公司 (ABI)开发， 基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术， 主要 针对中等通量的 S P分型项目。 在一个含有测序酶， 四种荧光标记的 ddNTP, 紧挨多态 位点 5'端的不同长度延伸引物和 PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止， 经 ABI测序仪电泳后， 根据峰的颜色可知掺入的碱基种类， 从而确定该样本的基因型， 根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的 S P位点。 对于 PCR产物模板可通过多重 PCR反应体系来获得。 通常用于 5-15个 S P位点分析。 本发明 31个 S P的相关信息如 下表 1所示：
表 1 本发明 31个 S P的相关信息
Figure imgf000007_0001
25 9q31.1 rs2487046 107692229 C T
26 9q31.1 rs2472496 107695353 A G
27 9q31.1 rs 1800976 107690709 C G
28 9q31.1 rs2472516 107716396 T C
29 9q31.1 rs2043664 107694245 A G
30 9q31.1 rs2487034 107701890 G A
31 9q31.1 rs2487031 107704228 C T
实验步骤如下：
1、 PCR: 95 °C变性 5分钟; 95 °C30秒、 55 °C退火 30秒、 72°C延伸 45秒， 35个循环; 72 °C延伸 7分钟， 4°C保温。
2、 纯化 1 : PCR产物各取 1-3μ1 (根据需混合的 PCR个数而定， 总量为 9μ1， 加入混 合液 3μ1 ( SAP 2μ1, 1： lO Exol酶 Ιμΐ ) 。 1 : ΙΟ ΕχοΙ酶的配制： 1体积 Exol酶， 1体积 SAP lOXbuffer, 8体积 dd¾0。 程序： 37°C lh， 75 °C 15min。
3、 Snapshot反应： Snapshot MULTIPLEX 1 μΐ， purified PCR mix 1 μΐ， Snapshot弓 I物 每个为 0.2μ1， DDH20补足 5μ1。 程序： 96°C 1分钟， 96°C 10秒， 50°C 5秒， 60°C 30秒， cycle to step 2 for 25 more times, 12°C保温。
4、 纯化 2: 每个反应加 SAP 0.5-1.(^1， 程序： 37°C 1小时， 75 °C 15分钟， 4°C保温。
5、 Ιμΐ上述产物加 9μ1 Ηϋ。 程序： 95 °C， 5分钟， 迅速置冰上， 冷却后上机检测。 各个 S P的 PCR引物对、 得到的扩增序列以及 Snapshot引物 A分别列举如下： 序列 1: kgplll38762 (rs2487032) 571bp
GCAGGGAAGAGTCAAAGAGGtcagaagcaacactctctgttggtaactaaaaatgagaccaaagattacatcc aaacccataagagcctgaagtttgacccaagtccctttgtttattgaatggaaccctgtagataaacaaaggaagcaaaatgaaaaacactta ccaccccttcactgggggtgcacaataagacaaaagcattcccaaatgaatcttcaatgtgtgggagagaaagaA/Gttttgagtgaccta agattgaatgagataatagcaccttatgtttctgtgaaatatttgtcaccttatatttctaggaaatgaccagtgtgtcattcaaaaatgtaatacaa tgaaaacgaagtttgaagtttcacactcctcattttcttaaaaccatgcaaaggcaaacagagatgtgatactatgagatttcaaggaaactgca gagtcatagtaatttgattctaaaaacagatgcttgacaagaagttatatttaaatcaaccatcaatctatcaggacataatttctgaagtcagtaa taaataACCTTTCCATTTCATCCTCC
F ： 5'GCAGGGAAGAGTCAAAGAGG 3'
R ： 5'GGAGGATGAAATGGAAAGGT 3'
Snapshot F ： 5' AAAACTCACTGGATTCTAACTTACTCTA 3' 序列 2: (rs2472519 ) 418bp
GATGGGGGACAGAGTGTTTGcagatggaagaaataacactgcttcagagttgaatgttcaattcttctctgaca ccaatcaatatgtgatttgattgccatagttagtgctaatgtttattcagtgacaatctaggagaggtttctacctgaagaaaggaaaaaaagtat atatacttttacacttttataaaaatgtaaatacacacacatatacatatatatatgaatatgtacttattcaccttattaA/Gataattcagattccttt gttgtcaataatcaattggaaaatctgttctgggtccagttagtacattattttattttacttttatttttcgagatggagtcttgctctgtcacccaggc tggagctcagcggtctgatctcggctcaCTACGACCTCTGCTTCCCAG F ： 5'GATGGGGGACAGAGTGTTTG 3'
R ： 5' CTGGGAAGCAGAGGTCGTAG 3'
Snapshot F ： 序列 3: (rs2472459) 206bp
AGGCCTGGATTCACTGTGTCcccttcccttctattttagcctaaaataggcttataatgaaagaggtccctatcttc atttgtcaagtgaaccaaaacatccttgctcttgagacagtatagtaggtaagtgtgaacactctgaaaccatgtgatctggttttaaatcccag cctC/TgactcttgagTAGCTGAATGACCGTGGTCA
F ： 5'AGGCCTGGATTCACTGTGTC 3'
R ： 5 'TGACC ACGGTC ATTC AGCTA 3'
Snapshot R ： 5' AGGCTGGGATTTAAAACCAGATCACATGGTTTCAGA 3' 序列 4: (rs2164560) 305bp
TCGGTGTTTAAAATCCAATGTTTattctttccttatttatctgttaaaagctcttgttaaaccaagtgtttcaacttt ctgactgttacatgtgttgcaaatatttttaccagattgcaatcttattttaatctgtaaatcttttcctT/Ctagggcgtctggctttgctgtttacag attctttctccatttcaagatgatagaaatattcaacttcaaatttcttcaagcacttgcataaattattaagcatttgactttattggtaccagtcccct ccacccaaGTCCAATGAGGGGAGACTCA
F ： 5'TCGGTGTTTAAAATCCAATGTTT 3'
R ： 5 'TGAGTCTCCCCTC ATTGGAC 3'
Snapshot F ： 5 ' TCTTATTTTAATCTGTAAATCTTTTCCT 3 ' 序列 5: (rsl2555462) 306bp
CTCCTCTCTCACACACAGCAatccctaagaaatgccctagggttccacaaggcactgtttgaaaactatgtgct gagtaggtatccaaaattccctccagctctgaaggtctgtatggatgatgtttaatcacttcattgataactgagA/Taatcctggattcataac ttcacttcttaggctctcagtgggccaacttgcaggcacaatgcccatttgcccctccagactgtgagctccttttctttacagactgggtttattc aaccttgtttccccaattcttaACACAAAGCCTGGCAAGAAG
F ： 5'CTCCTCTCTCACACACAGCA 3'
R ： 5'ACACAAAGCCTGGCAAGAAG 3'
Snapshot F ： 序列 6: (rs2472511) 376bp
AAAGGACACCGAGGGAAACAccacataaacacagtgatggatatagtggcatagcaacccagggggtgcaa catatgggttagagcctcatgttttctcaactttcaagttgtgatagaatcagggccctcacaagctataaacatagatttttatctgcaaatgcatt atattcgaagtcttgcccaaatctgttatgttttattaataaaaataaaactaaatttagttgtgaatgaaataaatctaacttttaagataggaaaaa aatcA/GtaaaattggtgaatttgatgttcaatcgctggcatcagatggtgaacagatgctttataaacacatagcacaggaaagagcatG GGTTTACTGAGAGCAAGCC
F ： 5 'AAAGGAC ACCGAGGGAAAC A 3'
R ： 5 GGGTTTACTGAGAGCAAGCC 3'
Snapshot F ： 5 ' AATGAAAT AAATCTAACTTTT AAGAT AGGAAAAAAATC 3 ' 序列 7: (rs2422493) 635bp
GTGGCCTCCTTCCTCTCAATttatgaagagaagcagtaagatgttcctctcgggtcctctgagggacctgggg agctcaggctgggaatctccaaggcagtaggtcgcctatcaaaaatcaaagtccaggtttgtggggggaaaacaaaagcagcccattacc cagaggactgtcC/Tgccttcccctcaccccagcctaggcctttgaaaggaaacaaaagacaagacaaaatgattggcgtcctgaggga gattcagcctagagctctctctcccccaatccctccctccggctgaggaaactaacaaaggaaaaaaaaattgcggaaagcacgatttaga ggaagcaaattccactggtgcccttggctgccgggaacgtggactagagagtctgcggcgcagccccgagcccagcgcttcccgcgcgt cttaggccggcgggcccgggcgggggaaggggacgcagaccgcggaccctaagacacctgctgtaccctccacccccaccccaccca cctccccccaactccctagatgtgtcgtgggcggctgaacgtcgcccgtttaaggggcgggccccggctccacgtgctttctgctgagtga ctgaactACATAAACAGAGGCCGGGAA
F ： 5'GTGGCCTCCTTCCTCTCAAT 3'
R ： 5'TTCCCGGCCTCTGTTTATGT 3'
Snapshot F ： 5 ' ACT AAC A AAGGAAAAAAA AATTGCGGAAAGC A 3 ' 序列 8: (rs2487042) 480bp
TCAAAGCAACCTCCAAACAatgccatttaggtaatctccaatttaaaagcctcaatagaatgataagattgagcttt tctgtagttccatgacctccagcagagtctgcaaggccacagctgcctgaagA/Gttgattctgtaattagaagatgccagggtcatctcag aatagaacctcaagccacccaggctacatttacagaatcagcctctccagaaaaacagcaacaaaggagggccttcctatgtatttggaag gagtcacctagaggagggacttggggttttggtgttggtgtggggggcagggatgggatggggagggggaagcttattgaaatatactaa aagacaaaccaacctaagggctggagggaagaaaattcacacttgtaagcttcttttttaaggggcatctcttaggctctagcttttgagattca gtatatatatatttttgaGTCTTGCTCTGCTGGAGTG
F ： 5'TCAAAGCAACCTCCAAACA 3'
R ： 5'CACTCCAGCAGAGCAAGAC 3'
Snapshot F ：
序列 9: (rs2472495) 566bp
TGACCTCAAGTGATCACCCGcctcaacctcccaaagtgctgggattacaggccagagccacagtgcccagc caaggctaacctcttgatcccaatgacaaacagaacaaacatcttactcaagtccagaagcaataataattttgaatcttgcttgcatgtcaaca ggagccacattaatacagaagaggatcacaC/Ttggtccaattaaattgaattgattgagagcctctgcaatacacggtctactgcacaaat aatgatggttcctggtacatttttatttgaccattgattgctcgatttgtttctgtgtctaactgtgtattggaatt
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CTCCCTGATT
F ： 5'TGACCTCAAGTGATCACCCG 3'
R ： 5'CAACCTCCACCTCCCTGATT 3'
Snapshot F ： 5 ' CTTGC ATGTC AAC AGG 序列 10: (rs4397467) 495bp
TGAATTGTCCTCCTGCCCATattctctgcaactctcagctctgcctgtttcctgtaaacagcttttatgctagagca ggcatctccaacagtgaatcaagagaaatccttctatcagacagtcatgcattgttaactatcatgcactgaggtgttctttgttagaaaaatattt cttgtatgcttttacaggttcatgaatgatatatcctcagcatttctatataattagtcccagggtatttttacatatctcattcccaattcgtcttccatt tcatcagtgttctctgtctttagacttggtctcctcA/Gagtctccgttctgtttcactagcttgtcttgtatgattttttagggctcattgacacagtt aagccatttttgcttcttataacttttgactaagtaaactggtacacaatcacttgatgatagcacattgattgatgacagttatcaagtgaaaaattt gcCCAGCAGAACCTTAGTGCAG
F ： 5'TGAATTGTCCTCCTGCCCAT 3'
R ： 5'TGAATTGTCCTCCTGCCCAT 3'
Snapshot F ： 5 ' TCC ATTTC ATC AGTGTTCTCTGTCTTTAGACTTGGTCTCCTC 3 ' 序列 11: (rsll25873) 344bp
GAATTGCTCCACACCCGAAAaagcacccttgtgctgtctctttgtagtcaacgcttcctctcacctttaaaccctg gaaaccactgatctatcctctgactctttagctttgccttttccagaataacatgaaaatggaatcatgtagtaacacagcatcttttacattaggg aatttaaaacaaaagcaagtaaacaagcaaaaacaaaA/Tactagagccccattccctgaatattctggttaagtaaaatttactatgtcaga cacctcacatcgtaatacttctcaaaatatttttcccaatcaaagcaacttttgtttttcTTTCTCTTGGTCCTTGCCCT
F ： 5'GAATTGCTCCACACCCGAAA 3'
R ： 5'TTTCTCTTGGTCCTTGCCCT 3'
Snapshot F ： 5 ' TTTAAAAC AAAAGC AAGTAAAC AAGC AAAAAC AAA 3 ' 序列 12: (rs715119) 409bp
CACTGGTCATCTCAaaagcatttgaaaccgacatgaaaaccttaattcatttcgatgaccacttacccttacacttcagc acttttggacaaaagcacagacagccactgtgaA/Gtaaaaaaaataataatgatttgaaaacagaacgactaagatttttactcaaagaaa cacagttccttgaatgttttgggctgcatcccactccccagggtttttgtacttgctgtacctctgtccagatgatgctcctgtctggatcgaccaa acccccatttacccttcagatctcaatttgagtgacccttttcctgggaagccatggcctatcctcctccccgcccccagcccccgacatagat gaccttctctgtgttccagagttactctTTGCTAACGTCTGACCCACT
F ： 5'CACTGGTCATCTCA 3'
R ： 5'TTGCTAACGTCTGACCCACT 3'
Snapshot F ： 5' TTTGGAC AAAAGC AC AGACAGCCACTGTGA 3 ' 序列 13: (rs2487052) 450bp
GACCTGCACAGTGGCTTATGcctgtaatcccagcactttgggaggctgatgtgggaggatcacttgagccca ggagttcaagaccagtctgagcaagatagtgagaccttgtctttacaaaaaattgtaaaaatttagccaggagcagtggtgcgtgcctgtggc cccagctccttaagaggctgatgtatgaggatcacgtgagcgcaggaggctgaggttgcagtgagccttgtctgtgcagctgcactccacc ctgtgcaacagagcaagaccctatctcaaaataaatacaatgaataaacacgtgaaaaacatttcaaacagtacttgccacacagtgctatat aagtgtctattcaacaC/TtgcaataactttggccattcatggttgtatccacatgcagatacgaagatggttgcattttttgGAGTAGG CCTTCTCTCAGCA
F ： 5'GACCTGCACAGTGGCTTATG 3'
R ： 5'GAGTAGGCCTTCTCTCAGCA 3'
Snapshot F ： 5'ACTTGCCACACAGTGCTATATAAGTGTCTATTCAACA 3' 序列 14: (rs2472493) 595bp
GCAGTGGGTGAGGTGTTAataaaagggagggggtagagatgaaatctttccagcagtttggctcttaaggggat agcttgaaggaaagagggttggaagggtggtttttaaaaagaattatcactcactaatcaactagaaatccagtggaatatgcagtaC/Tttg tctgtaatccagcaggctaacttttttttttttttttttttgagacggagtctcgctctgtcacccaggctggagtgcagtggcatgatcttggcttac cgcaacctctgcctcccagttcaagcaattctcttgcctcagcctcccaagtagctggaactacaggcatgcaccaccatgcatggctaaattt tttttgaatttttagtagagatgagtttcaccatgttggtcaggctggtctcaaattcctgacctcaagtgatcacccgcctcaacctcccaaagtg ctgggattacaggccagagccacagtgcccagccaaggctaacctcttgatcccaatgacaaacagaacaaacatcttactcaagtccaga agcaataataattttgaatcttgcttgcatgTCAACAGGAGCCACATTA F ： 5' GCAGTGGGTGAGGTGTTA 3'
R ： 5'TAATGTGGCTCCTGTTGA 3'
Snapshot F ： 5 ' TC AACT AGAAATCC AGTGGAAT ATGC AGT A 3 ' 序列 15: (rs2487048) 589bp
TTCTAAGGGCAAACAGTCCatggtgcaaaggggccatgccacccagagttatgagtacctgggactccagaat tccttgcctggtggcctccacatgcacttccagggcctgcttgggcctcttctatgggtctgtcctgagtgttgatagaaccactgatgtgagta cctgggcttgagccgtggcctggagatcctgttgactgtagcatggagggggcttgtgcagctgaatgtctgC/Tatgcaggtggtggga gttctggaatatgatggagctggaggtgggaagagaagtaggcttggggcagctctctcatgccacctcattctggccaaaactcaggtca aactgtgaagagtctaaatgtgaatctgcccttcaaggtggctacaaaggtatctttgtcaaggtaggagaccttgtggcctccacgtgcactt ccagggcctgcttgggcctcttctacgggtctgtcctgagtcttctatgaatctgcccttcagggcagattcatatttagactcttcacagtttga cctgagttttggccagaataaggtgacatttagTTTGTTGGCTTGATGGATG
F ： 5'TTCTAAGGGCAAACAGTCC 3'
R ： 5'CATCCATCAAGCCAACAAA 3'
Snapshot F ： 5'CTTGTGCAGCTGAATGTCTG 3' 序列 16: (rs2027400) 434bp
GTAGCTCCTTGTGCACACTtgggaacatttaaaatatactccacctgcagcttatgcttgcatcacaattatacaa ggcactttatatacgttattcgactttgaaatctattttttttttttgagacagagtcgtgctctgtcacccaggctcaagtgcagtggcgcgatctt ggctcactgcaacctctgcctcctcggttcaagtgattcttctgcctcagcctcccaagtagctgggattacaggcatgtgccaccctgccca actaattttA/Gttttatcgactttgaaattttataacaaccttgagagaggacacaggaaaagccttatgatccttattttccaggacagtaaac agcagctgaaaaacgtgaagcgtatttctcaaatcaacctgcaagaaaatagaAGAAGCAGAACCTGAAGCCA
F ： 5' GTAGCTCCTTGTGCACACT 3'
R ： 5' AGAAGCAGAACCTGAAGCCA 3'
Snapshot F ： 序列 17: (rs2472509) 347bp
AACAATGGAGGAGCACTGGAtttggttcctaaaacaaaataaagtttgaaatcctgtctttcccatgttgaaaaca aagttggtacaaaaccctttagcttttgcaaacctcctttaagacccgatttaaatgcttccctcctcatgaagctcttctggatccactccttccc atcactaagttgaaagtA/Cagatccccttctctttacttccattagacttggattacagcactctttgtatcatgtatttaattctgttttttaattaca gttaacatttatttgtcttcctcttgagtgtatgcttctctagaggaaggtctttGATTCATTCTCCCCTGGCCT
F ： 5' AACAATGGAGGAGCACTGGA 3'
R ： 5' GATTCATTCTCCCCTGGCCT 3'
Snapshot F ： 5 ' CTTCTGGATCC ACTCCTTCCC ATC ACTAAGTTGAAAGT 3' 序列 18: (rsl800977) 433bp
ACATAAACAGAGGCCGGGAAcggggcggggaggagggagagcacaggctttgaccgatagtaacctctgc gctcggtgcagccgaatctataaaaggaactagtcC/Tcggcaaaaaccccgtaattgcgagcgagagtgagtggggccgggacccgc agagccgagccgacccttctctcccgggctgcggcagggcagggcggggagctccgcgcaccaacagagccggttctcagggcgcttt gctccttgttttttccccggttctgttttctccccttctccggaaggcttgtcaaggggtaggagaaagagacgcaaacacaaaagtggaaaac ： j ;oi{sd¾us
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F ： 5' GGCCTTTGAAGCCTGATCAT 3'
R ： 5 'TCCTGGCTGTGATTTCTGGG 3'
Snapshot F ： 5 ' CTACC AACTC ACGACTCTC ATC ATACTTTCCC ATTGCTT 3 ' 序列 23: (rs2437817) 510bp
GTTTTCTCCCCTTCTCCGGAaggcttgtcaaggggtaggagaaagagacgcaaacacaaaagtggaaaaca ggtaagaggctctccagtgacttacttgggcgttattgttttgtttcgaggccaaggaggcttcgggaagtgctcggtttcggggactttgatc cggagccccacatccccaccacttgcaactcagatgggaccggaggcggtgttaaatggggagacG/Tatgtcctagtacgagctctgg tgaccccaggactctgcgctgctgcgcttggggcttgcccgacggtggagaccggggagcatctctgggcgtggagacccgggcgcag taccccgggctcagaggggtcgggggttcccgggcgtgctgagggcgctgctgccgggtggggagagctgcaggtccggcaccgagc gctgctttgttcggagggccctgagctggctagaaacccttctggttgcaggtcggccagtacCTACGGAGACAAATGCC AGC
F ： 5OTTTTCTCCCCTTCTCCGGA 3'
R ： 5 'CTACGGAGAC AAATGCC AGC 3'
Snapshot F ： 5 ' TTGC AACTC AGATGGGACCGGAGGCGGTGTTAAATGGGGAGAC
序列 24: (rs3887137) 578bp
ATACTGGGCAAGGATGGGTCaaaacaacacagactattgagggcaacaaaggaaaaaccatgcactcctga agaaatcgttcccaaaatgctgaaagagaaagaggattgtctctctagaagtctaatagaaaacagtatctggaacatttcctaggatttttttttt ttctaatgacttactctcttattaatatgtcagagaaaagaaaagctcctggctaagaaataaaacagtccctcatcccagaaatcacagccag gaatatggattcttaagtgtcaaaaaagtactctgaataaggaaagaaacgcagatgcactacttctattataataagcA/Gcttgatttctttta atcccctgagtccaattattttcttggcaaatttaagggtactgactgcttctgtgaatctattgttacacttgataatggatctgagttgggggtaa tatttgcctatcaatttggatacttaaaaatctctctctctttcttcatataccctctatctcacaactttccatttaatgagggaagtgaatttcttttttc tGCCCCTCTTTCCTACTGCTT
F ： 5 'ATACTGGGCAAGGATGGGTC 3'
R ： 5 'GCCCCTCTTTCCT ACTGCTT 3'
Snapshot F ： 序列 25: (rs2487046) 432bp
ACCCAATTTATTGACCAAGgttattctttgactgaggcaagggggtccgctctcctgggccttgggctttagaaa gctcatctctggcctttctgagatccatccctttctttttatttttcttgacacggagtcttgctctgtcactcaggctggagtgcagtggcatgatct cgactcactgtaacctctgcctcccgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcctgagataacaggcgcC/Tcgccaccacatctggct aatttttgtatttttagtaaagactgggtttcatcatgttggccaggttggtttcgaactcctgacctgaggtgagctgcccaccttggcctcccaa agtgctgggattacaggcatgagccactgcgcccagctcagatccatccctttcTAAGGGCAAACAGTCCAT
F ： 5'ACCCAATTTATTGACCAAG 3'
R ： 5'ATGGACTGTTTGCCCTTA 3'
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SI0/9I0Z OAV 序列 30: (rs2487034) 321bp
GCCCAAACCATGTGTCAGAGagctgggtgtggccagtgggcccctggtgtgcaactagtcttcagtgatgcta ctgtatgctagtgacagcacaactgaccactgaaaatatggtgcacgatggtgaacagattggatttcccA/Gtatctctagaaccccaggg ctttgaggcaattctgatagatggagggggagcgagagagagaaagaggagggagaggtatcacatgaaagagatactggactttctgct aataaatgggtgggtatttgggtgagtagataggaaattaaaaagaaaTATGAGAGATGGGCGTGGTG
F ： 5'GCCCAAACCATGTGTCAGAG 3'
R ： 5 ' TATGAGAGATGGGCGTGGTG 3 '
Snapshot F ： 5 ' TGAAAATATGGTGC ACGATGGTGAAC AGATTGGATTTCCC 3 ' 序列 31: (rs2487031) 357bp
CCAGGAGGTGAAGGTTGTGTtgagctgagatcccgccattgcactccagcctgggcaacgagcaaaactct gtctcaaaaaaaccgaaaaaattcccccaaaaaaccaaaaaaaaacagcaacaacaaaaaaatcaaataatgtaccttgtttagcataaagc ataattatatgcatatggtgattgggaggatgaaatggaaaggttatttattactgacttC/Tagaaattatgtcctgatagattgatggttgattt aaatataacttcttgtcaagcatctgtttttagaatcaaattactatgactctgcagtttccttgaaatctcatagtATCACATCTCTGT TTGCCTTTG
F ： 5'CCAGGAGGTGAAGGTTGTGT 3'
R ： 5'ATCACATCTCTGTTTGCCTTTG 3'
Snapshot F ：
实施例 3 本发明 SNP的基因型分析
除了实施例 2列举的 Snapshot检测方法，本发明 31个 S P还可以采用如下检测方法 检测- 检测 S P方法包括：
一、 DNA测序技术：
1、 双脱氧核苷酸链终止法 （传统 Sanger测序） 是根据核苷酸在某一固定的点开始， 随机在某一个特定的碱基处终止， 并且在每个碱基后面进行荧光标记， 产生以 A、 T、 C、 G结束的四组不同长度的一系列核苷酸， 然后在尿素变性的 PAGE胶上电泳进行检测， 从 而获得可见的 DNA碱基序列。 基本流程： 1)、 DNA模板提取和质检； 2)、 序列比对， 引 物设计和合成； 3)、 PCR扩增， 包括变性双链模板的制备， 延伸和终止反应； 4)、 PCR产 物纯化； 5)、 测序仪检测； 6)、 序列读取。
2、 焦磷酸测序法 （Pyrosequencing) 是一种基于聚合原理的 DNA测序方法， 依赖于 核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放， 而非双脱氧核苷三磷酸参与的链终止反应。 是由 4种酶
(DNA聚合酶 (DNA polymerase)、 ATP硫酸化酶 (ATP sulfurytase)、 荧光素酶 (luciferase)禾口 三磷酸腺苷双磷酸酶 (Apyrasep催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。基本流程: 1)、 基因组 DNA提取； 2)、 设计和合成 PCR引物， 其中之一标记生物素， PCR反应； 3)、 DNA双链的分离， 含生物素的单链 DNA与测序引物的退火； 4)、 对含生物素的单链 DNA 的测序， 基于测序的 S P分析及等位基因频率确定。
3、 二代高通量测序技术 （High-throughput sequencing) 又称"下一代 "测序
( "Next-Generation" Sequencing, NGS)。主要包括 Roche 454， Illumina Solexa, ABI SOLiD 和 Life的 Ion torrent四大类测序平台。 基本流程： 1)、 将目标 DNA剪切为小片段， 构建测 序文库； 2)、 将单个小片段 DNA分子结合到固相表面， 进行锚定桥接； 3) 单分子独立扩 增的预扩增； 4)、每次只复制一个碱基（A， C， T， G)的单碱基延伸测序并检测信号； 5 )、 高分辨率的成像系统； 6)、 数据分析。
4、 三代单分子实时测序技术， 主要包括并行单分子合成测序 （Helicos Biosciences, tSMSTM)平台； 单分子实时合成测序（Single Molecule Real Time, SMRT)平台； 纳米孔 单分子技术（Oxford Nanopore Technologies)平台。 以 tSMSTM为例， 其基本流程： 1 )将 待测序列随机打断成小片段， 3'末端加 polyA; 2)与 Cy3荧光标记寡聚 PolyT接头进行芯 片杂交； 3 ) DNA合成循环反应， 洗脱， 加帽， 渗入， 淬灭； 4)全内反射显微镜进行单色 成像， 实现实时测序。
二、 实时荧光定量 PCR法 （Real-Time PCR法）：
1、 Taqman探针法是针对染色体上的不同 S P位点分别设计 PCR引物和 TaqMan探 针， 进行实时荧光 PCR扩增。探针的 5'-端和 3'-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭 荧光基团。 当溶液中存在 PCR产物时， 该探针与模板退火， 即产生了适合于核酸外切酶活 性的底物， 从而将探针 5'-端连接的荧光分子从探针上切割下来， 破坏两荧光分子间的 PRET, 发出荧光。 基本流程： 1 )、 DNA提取和质检； 2)、 序列比对， 特异荧光探针设计 与合成； 3 )、 荧光定量 PCR仪检测； 4)、 结果数据分析。
2、 高分辨率溶解曲线分析法 （High Resolution Melting Analysis, HRMA) 检测 SNP 技术是依据在一定的温度范围内将 PCR扩增的产物进行变性，通过实时监测升温过程中双 链 DNA荧光染料与 PCR扩增产物的结合情况， 来判断是否存在 S P， 而且不同 S P位 点、 是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形。 基本流程： 1 ) DNA提取和质检； 2)、 序 列比对， 针对已知 S P位点设计 20~35bp的 Luna probe非标记探针； 3 )、 加入 LC Green 饱和荧光染料 （EvaGreen 或 LC green) PCR， 4)、 PCR产物直接进行 HRM检测； 6)、 采用 Luna probe分析结果。 三、 变性高效液相色谱分析 (Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) 或 HPLC波长切换技术 （HPLC-WAVE wavelength) 是一项在单链构象多态性 (SSCP)和变性梯度凝胶电泳 （DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术， 可自 动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。将工作温度 （柱温）升高使 DNA片段开 始变性， 部分变性的 DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。 由于异源双链 （错配的 ） DNA 与同源双链 DNA的解链特征不同， 在相同的部分变性条件下， 异源双链因有错配区的存 在而更易变性， 被色谱柱保留时间短于同源双链， 故先被洗脱下来， 从而在色谱图中表现 为双峰或多峰的洗脱曲线。 基本流程： 1)、 DNA提取和质检； 2)、 PCR扩增； 3 )变性后 缓慢复性； 4)、 变性高效液相色谱仪检测； 5 )、 WAVE®Maker核苷酸片段分析系统专用软 件分析结果。 四、 等位基因特异 PCR(Allele-specific PCR ,AS-PCR)， 又称作探针扩增阻滞突变系统 (Amplification refractory mutation system, ARMS)或等位基因特异扩增 (Allele-specific enzymatic amplification, ASA), 或 PAS A ( PCR amplification of specific allele)。 是木艮据 SNP 位点设计特异引物， 其中一条链 (特异链） 的 3'末端与 S P位点的碱基互补 (或相同；)， 另一 条链 (普通链;)按常规方法进行设计。 因为特异引物在一种基因型中有扩增产物， 在另一种 基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因 型的 S P。 基本流程： 1)、 DNA提取和质检； 2)、 多态性位点特异性引物设计： 3'末端 与 S P位点碱基互补或错配的特异 PCR引物；； 3 )、 PCR扩增； 4)、 通过凝胶电泳等方法 检测 PCR扩增产物的有或无。 五、 杂交法：
1、 等位基因特异寡核苷酸片段分析（Allele-Specific Oligonucleotide, ASO)是一种以 杂交为基础对已知突变的检测技术。 以 PCR和 AS0相结合， 设计一段 20bp左右的寡核苷 酸片段， 其中包含了发生突变的部位， 以此为探针， 与固定在膜上的经 PCR扩增的样品 DNA杂交。 基本流程： 1)、 DNA提取和质检； 2) PCR扩增； 3 ) 直接与相应的寡核苷酸 探针杂交， 洗脱； 4)、 结果分析。 2、 基因芯片又称 DNA芯片 （DNA chip) 或 DNA微阵 列 （DNA microarray) 是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针， 通过与被标记的 若干靶核酸序列互补匹配， 与芯片特定位点上的探针杂交， 利用基因芯片杂交图象， 确定 杂交探针的位置， 便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。 基本流程： 1 )、 检测 样品基因组 DNA中通过 PCR制备探针； 2)、 与芯片进行固 -液相杂交； 3 )、 经过高严谨度 的洗涤后进行结果检测。 4)、根据探针标记分子的种类和芯片的规格来选择检测方法； 5 )、 再选用相应的软件进行数据分析。
六、 Sequenom MassARRAY®S P检测结合多重 PCR技术、 MassARRAY iPLEX单碱 基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS ) 进行分型检测。 将包含 SNP位点区域的 DNA模板通过 PCR技术扩增， 再使用特异的延伸引物与 PCR产 物进行单碱基延伸反应。 由于多态性位点碱基不同， 延伸产物不同的末端碱基将导致延伸 后的产物分子量的差异， 因此由 S P多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现， 通 过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术， 检测延伸产物分子量的大小， 应 用专用的分析软件， 通过判断分子量的差异而进行 S P分型检测。 基本流程： 1 )、 DNA 提取和质检； 2)、 引物设计与合成； 3 )、 PCR扩增反应和延伸反应； 4)、 Sequenom质谱 仪检测； 6)、 结果分析。
七、 以构象为基础的检测方法：
1、限制性片段长度多态性分析法 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 由
DNA的多态性， 致使 DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变， 现在多采用 PCR-RFLP 法进行研究基因的限制性片段长度多态性.基本流程： 1 )、 PCR扩增； 2)、 PCR扩增产物 检测； 3 )、 限制性内切酶酶切消化反应； 4)、 酶切产物电泳分型； 5 )、 显色， 结果判定。
2、 单链构象多态性分析法（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)是一种 基于单链 DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链 DNA如果顺序不同， 甚至单 个碱基不同， 就会形成不同的构象。 在电泳时移动的速度不同。 将 PCR产物经变性后， 进 行单链 DNA凝胶电泳时， 靶 DNA中若发生单个碱基替换等改变时， 就会出现移动变位。 基本流程： 1 )、 PCR扩增靶 DNA; 2)、 将特异的 PCR扩增产物变性， 而后快速复性， 使 之成为具有一定空间结构的单链 DNA分子； 3 ) 将适量的单链 DNA进行非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳； 4)、 最后通过放射性自显影、 银染或溴化乙锭显色分析结果。 实施例 3 本发明 SNP位点与青光眼的相关性
统计方法： 利用 SPSS13.0软件进行分析， 检验 Hardy-Weinberg平衡检测， 数量变量 采用 t检验， 质量变量采用卡方检验。 双侧 P<0.05认为统计学的差异显著。 结果如下：
1 ) 病例和对照的基本信息
基本信息 青光眼患者 正常对照
人数 （例） 2906 5974
年龄 （岁） 54.9±16.1 ( 18.0-95.0) 64.9±16.6 (19.0-102.0) 男性比例 （％) 53.8% 51.6%
2) S P位点多态性与青光眼密切相关
rs2487032
Figure imgf000019_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2487032 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.75， 95%CI =0.70-0.81 )， 青光眼患病风险降低 75%。 No2: rs2472519
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472519 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.77， 95%CI =0.71-0.83 )， 青光眼患病风险降低 77%。 No3 : rs2472459
Figure imgf000020_0002
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472459 C等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.77， 95%CI =0.71-0.83 )， 青光眼患病风险降低 77%。
No4: rs2164560
Figure imgf000020_0003
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2164560 T等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.77， 95%CI =0.72-0.84)， 青光眼患病风险降低 77%。 N05: rsl2555462
Figure imgf000020_0004
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rsl2555462 T 等位基因可提高青光眼的抗 性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.78， 95%CI =0.71-0.84)， 青光眼患病风险降低 78%。
N06: rs2472511
Figure imgf000020_0005
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472511 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.78， 95%CI =0.72-0.85 )， 青光眼患病风险降低 78%。 N07: rs2422493
Figure imgf000020_0006
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2422493 C等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.67， 95%CI =0.58-0.78)， 青光眼患病风险降低 67%。 N08: rs2487042
Figure imgf000021_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2487042 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼 的危险性显著降低 （OR =0.66， 95%CI =0.55-0.78)， 青光眼患病风险降低 66%。
N09: rs2472495
Figure imgf000021_0002
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472495 T等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.72， 95%CI =0.63-0.83 )， 青光眼患病风险降低 72%。 NO10: rs4397467
Figure imgf000021_0003
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs4397467 A等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.73， 95%CI =0.64-0.84)， 青光眼患病风险降低 73%。 NOll : kgp5805087(rsl 125873)
Figure imgf000021_0004
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rsl l25873 A等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.77， 95%CI =0.68-0.88)， 青光眼患病风险降低 77%。 N012: rs715119
Figure imgf000021_0005
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs715119 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.76， 95%CI =0.66-0.87)， 青光眼患病风险降低 76%。 N013 : rs2487052
Figure imgf000022_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2487052 C等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.74， 95%CI =0.65-0.85 )， 青光眼患病风险降低 74%。 NO 14: rs2472493
Figure imgf000022_0002
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472493 T等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.74， 95%CI =0.64-0.86)， 青光眼患病风险降低 74%。 N015: rs2487048
Figure imgf000022_0003
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2487048 C等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.74， 95%CI =0.64-0.86)， 青光眼患病风险降低 74%。 N016: kgp6833498 (rs2027400)
Figure imgf000022_0004
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2027400 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.76， 95%CI =0.67-0.88)， 青光眼患病风险降低 76%。 N017: rs2472509
Figure imgf000022_0005
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472509 A等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.77， 95%CI =0.67-0.88)， 青光眼患病风险降低 77%。 N018: rs 1800977
Figure imgf000023_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rsl800977 C等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.78， 95%CI =0.68-0.89)， 青光眼患病风险降低 78%。 N019: rs2246293
Figure imgf000023_0002
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2246293 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.76， 95%CI =0.65-0.88)， 青光眼患病风险降低 76%。 NO20: rs2515618
Figure imgf000023_0003
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2515618 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低 （OR =0.77， 95%CI =0.67-0.89)， 青光眼患病风险降低 77%。 N021 : rs7023634
Figure imgf000023_0004
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs7023634 G等位基因可使青光眼的危险性 显著增加 （OR =1.34， 95%CI =1.12-1.59)， 即青光眼患病风险增加 1.34倍， 且其 95%CI 下限为 1.12〉1， 可以确定 rs7023634 位点 G等位基因是危险因子。
N022: rsl2553329
Figure imgf000023_0005
对照 112 461 424 685 1309 1.24 0.344
6.46xl0-4
POAG 140 423 329 703 1081 (1.09-1.42) 0.394
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rsl2553329 A等位基因可使青光眼的危险性 显著增加 (OR =1.24, 95%CI =1.09-1.42)， 即青光眼患病风险增加 1.24倍， 且其 95%CI 下限为 1.09〉1， 可以确定 rsl2553329 位点 A等位基因是危险因子。
N023 : rs2437817
Figure imgf000024_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2437817 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低（OR =0.79， 95%CI =0.69-0.91 )， 青光眼患病风险降低 79%。 N024: rs3887137
Figure imgf000024_0002
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs3887137 A等位基因可使青光眼的危险性 显著增加 （OR =1.23， 95%CI =1.07-1.41 ) ， 即青光眼患病风险增加 1.23倍， 且其 95%CI 下限为 1.07〉1， 可以确定 rs3887137 位点 A等位基因是危险因子。
N025: rs2487046
Figure imgf000024_0003
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2487046 T等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低（OR =0.75， 95%CI =0.61-0.93 )， 青光眼患病风险降低 75%。
No26: rs2472496
Figure imgf000024_0004
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472496 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低（OR =0.77， 95%CI =0.63-0.95 )， 青光眼患病风险降低 77%。 N027: rs 1800976
Figure imgf000025_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rsl800976 G等位基因可提高青光眼的抗性， 使青光眼的危险性显著降低（OR =0.82， 95%CI =0.70-0.96)， 青光眼患病风险降低 82%。 N028: rs2472516
Figure imgf000025_0002
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2472516 T等位基因可使青光眼的危险性 显著增加 （OR =1.18， 95%CI =1.03-1.36) ， 即青光眼患病风险增加 1.18倍， 且其 95%CI 下限为 1.03〉1， 可以确定 rs2472516 位点 T等位基因是危险因子。
No29: rs2043664
Figure imgf000025_0003
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2043664 A等位基因可使青光眼的危险性 显著增加 (OR =1.19， 95%CI =1.01-1.40) ， 即青光眼患病风险增加 1.19倍， 且其 95%CI 下限为 1.01〉1， 可以确定 rs2043664 位点 A等位基因是危险因子。
No30: rs2487034
Figure imgf000025_0004
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， rs2487034 G等位基因可使青光眼的危险性 显著增加 （OR =1.19， 95%CI =1.01-1.39) ， 即青光眼患病风险增加 1.19倍， 且其 95%CI 下限为 1.01〉1， 可以确定 rs2487034 位点 G等位基因是危险因子。
No31 : rs2487031
Figure imgf000025_0005
Figure imgf000026_0001
在未考虑青光眼传统危险因子的情况下， r2487031 C等位基因可使青光眼的危险性显 著增加 （OR=1.18， 95%CI =1.01-1.38) ， 即青光眼患病风险增加 1.18倍， 且其 95%CI 下限为 1.01〉1， 可以确定 rs2487031 位点 C等位基因是危险因子。 实施例 4 检测试剂盒
本发明试剂盒中的全部组
PCR扩增试剂 （50人份）：
组分 浓度 体积
PCR混合液 2χ 4ml
31个 S P的引物对 5μΜ 各 400μ1 纯水 4ml
Sanpshot分型检测试剂 （50人份）
组分 浓度 体积
SNaPshot Multiplex 60μ1 血清碱性磷酸酶 150μ1 限制性外切酶 50μ1
纯化缓冲液 500μ1
Sanpshot引物混合物 2μΜ 50μ1 纯水 1ml
标准 DNA样品:
组分 浓度 体积
31个 SNP的纯合子基因型 1 SOng/μΙ 各 ΙΟμΙ
31个 S P的纯合子基因型 2 SOng/μΙ 各 ΙΟμΙ 31个 S P的杂合子基因型 50ng/ul 各 ΙΟμΙ 使用方法：
1) DNA提取
取患者全血 （EDTA抗凝） 2ml， 提取其基因组 DNA。
2) 通过 PCR扩增含有所检测的 S P位点的 DNA片段
PCR扩增 （20μ1体系）:
im ¾t #R
样品 DNA SOng/μΙ Ιμΐ PCR试剂混合液 2χ ΙΟμΙ
引物对 5μΜ Ι μΐ
纯水 8μ1
反应条件:
94 °C 5分钟
Γ 94 °C 30秒
35个循环 55 °C 30秒
72 °C 1分钟
72 °C 7分钟
PCR产物检测：
用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物， 观察 PCR反应的效果， 并确定其作为模板 在后续反应中加入的量。
3 ) Sanpshot分型检测
第一步： PCR产物纯化 （12μ1体系）：
Figure imgf000027_0001
体积
PCR产物 1.8μ1
血清碱性磷酸酶 2μ1
限制性外切酶 0.1 μΐ
纯化缓冲液 0.1 μΐ
纯水 0.8μ1
反应条件：
1、 37°C酶切 1小时
2、 75 °C灭活 15 分钟
3、 4°C保存 第二步： 单碱基引物延伸反应 （5μ1 ) :
组分 i 纯化产物 Ι μΐ SNaPshot Multiplex 1 μΐ
SnaPshot引物 0.5μ1
纯水 2.5μ1
反应条件：
96 °C 1分钟
10秒
25个循环 5秒
Figure imgf000027_0002
60 °C
4°C保存 第三步： 纯化反应物：
反应体系： 0.7μ1血清碱性磷酸酶 /孔
反应条件： 37°C 1小时， 75°C 15分钟， 4°C保存。 第四步： ABI遗传分析仪读取结果：
反应体系： 纯化产物 1 μ1+ HD 9μ1
反应条件： 95°C 5分钟， 迅速冰浴冷却
ABI PRISM 3130XL DNA Sequencer上机读取基因型结果。 本试剂盒用于： 1、 青光眼抗性人群或者易感人群的早期诊断和分型参考； 2、 青光眼 抗性人群或易感人群的基因检测和可能性评估。
1 ) 本发明的检测方法可用于分析本发明表 1所示 31个 S P位点的多态性， 应用在青光 眼的辅助性诊断和个体青光眼疾病抗性和易感性的评估中。
2) 利用本发明阐述的青光眼抗性或易感基因 /位点的多态性， 作为生物标志物之一， 可用作药物设计的分子靶标的筛选， 以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子， 促进 新药开发。
3 ) 本发明建立的检测 S P位点多态性的核酸序列和青光眼相关基因 /位点， 可高灵敏 度、 特异性地应用于青光眼基因诊断用的试剂盒。
如上所述，得出结论，本发明表 1所示 31个 S P位点的多态性与青光眼具有显著相关性。 因此， 根据本发明， 测定其多态性可用于进行基因诊断。 综上， 本发明通过检测表 1所示 31个 S P位点的变异， 评估待检样本发生青光眼的可能 性， 灵敏度高， 只需要少量 DNA样品就足以测定所述位点的变异， 达到早期筛査的目的。

Claims

权 利 要 求 书
1、 检测 AfiC ?基因 rs2487032变异、 rs2472519变异、 rs2472459变异、 rs2164560 变异、 rsl2555462变异、 rs2472511变异、 rs2422493变异、 rs2487042变异、 rs2472495变 异、 rs4397467变异、 rsl l25873变异、 rs715119变异、 rs2487052变异、 rs2472493变异、 rs2487048变异、 rs2027400变异、 rs2472509变异、 rs 1800977变异、 rs2246293变异、 rs2515618 变异、 rs7023634变异、 rsl2553329变异、 rs2437817变异、 rs3887137变异、 rs2487046变 异、 rs2472496变异、 rsl 800976变异、 rs2472516变异、 rs2043664变异、 rs2487034变异、 或 /和 rs2487031变异的相关试剂在制备青光眼筛査试剂中的用途。
2、根据权利要求 2所述的用途，其特征在于：所述试剂包括检测 基因 rs2487032 变异 A→G、rs2472519变异 A→G、rs2472459变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462 变异 A→T、 rs2472511变异 A→G、 rs2422493变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495 变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsll25873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052 变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509 变异 C→A、rsl800977变异 T→C、rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634 变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、rs2487046 变异 C→T、rs2472496变异 A→G、 rsl800976变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664 变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂。
3、 根据权利要求 2所述的用途， 其特征在于： 所述试剂还包括任选的用于扩增包含 AfiC U基因 rs2487032、 rs2472519、 rs2472459、 rs2164560、 rsl2555462、 rs2472511、 rs2422493、 rs2487042、 rs2472495、 rs4397467、 rsl 125873、 rs715119、 rs2487052、 rs2472493、 rs2487048、rs2027400、rs2472509、rsl800977、rs2246293、rs2515618、rs7023634、rsl2553329、 rs2437817、 rs3887137、 rs2487046、 rs2472496、 rsl800976、 rs2472516、 rs2043664、 rs2487034、 或 /和 rs2487031基因片段的试剂。
4、 根据权利要求 2所述的用途， 其特征在于： 所述检测 基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459变异 T→C、 rs2164560变异 C→T、 rsl2555462 变异 A→T、 rs2472511变异 A→G、 rs2422493变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495 变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsll25873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052 变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509 变异 C→A、rsl800977变异 T→C、rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634 变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、rs2487046 变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664 变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 Snapshot用试剂。
5、 根据权利要求 2所述的用途， 其特征在于： 所述检测 基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459变异 T→C、 rs2164560变异 C→T、 rsl2555462 变异 A→T、 rs2472511变异 A→G、 rs2422493变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495 变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsll25873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052 变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509 变异 C→A、rsl800977变异 T→C、rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634 变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、rs2487046 变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664 变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 DNA测序用试 剂、 实时荧光定量 PCR法用试剂、 变性高效液相色谱分析法用试剂、 等位基因特异扩增 法用试剂、杂交法用试剂、质谱法用试剂、 限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构 象多态性分析法用试剂。
6、 一种青光眼的筛査试剂盒， 其特征在于： 它包括任选的用于检测 基因 rs2487032变异、 rs2472519变异、 rs2472459变异、 rs2164560变异、 rsl2555462变异、 rs2472511变异、 rs2422493变异、 rs2487042变异、 rs2472495变异、 rs4397467变异、 rsl 125873 变异、 rs715119变异、 rs2487052变异、 rs2472493变异、 rs2487048变异、 rs2027400变异、 rs2472509变异、 rsl 800977变异、 rs2246293变异、 rs2515618变异、 rs7023634变异、 rsl2553329变异、 rs2437817变异、 rs3887137变异、 rs2487046变异、 rs2472496变异、 rsl800976变异、 rs2472516变异、 rs2043664变异、 rs2487034变异、 或 /和 rs2487031变异 的相关试剂。
7、 根据权利要求 6所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂包括检测 基因 rs2487032变异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459变异 T→C、 rs2164560变异 C→T、 rsl2555462变异 A→T、rs2472511变异 A→G、rs2422493变异 C→T、rs2487042变异 A→G、 rs2472495变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsl 125873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509变异 C→A、rsl800977变异 T→C、rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、 rs7023634变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、 rs2487046变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl800976变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂。
8、 根据权利要求 7所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂还包括任选的用于扩增包 含 AfiC4i基因 rs2487032、 rs2472519、 rs2472459、 rs2164560、 rsl2555462、 rs2472511、 rs2422493、 rs2487042、 rs2472495、 rs4397467、 rsl 125873、 rs715119、 rs2487052、 rs2472493、 rs2487048、rs2027400、rs2472509、rsl800977、rs2246293、rs2515618、rs7023634、rsl2553329、 rs2437817、 rs3887137、 rs2487046、 rs2472496、 rsl800976、 rs2472516、 rs2043664、 rs2487034、 或 /和 rs2487031的基因片段的试剂。
9、 根据权利要求 7所述的试剂盒， 其特征在于： 所述检测 基因 rs2487032变 异 A→G、 rs2472519变异 A→G、 rs2472459变异 T→C、 rs2164560变异 C→T、 rsl2555462 变异 A→T、 rs2472511变异 A→G、 rs2422493变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495 变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsll25873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052 变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509 变异 C→A、rsl800977变异 T→C、rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634 变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、rs2487046 变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664 变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 Snapshot用试剂。
10、 根据权利要求 7所述的试剂盒， 其特征在于： 所述检测 ASC4i基因 rs2487032 变异 A→G、rs2472519变异 A→G、rs2472459变异 T→C、rs2164560变异 C→T、rsl2555462 变异 A→T、 rs2472511变异 A→G、 rs2422493变异 C→T、 rs2487042变异 A→G、 rs2472495 变异 C→T、 rs4397467变异 G→A、 rsll25873变异 T→A、 rs715119变异 A→G、 rs2487052 变异 T→C、 rs2472493变异 C→T、 rs2487048变异 C→T、 rs2027400变异 A→G、 rs2472509 变异 C→A、rsl800977变异 T→C、rs2246293变异 C→G、rs2515618变异 A→G、rs7023634 变异 G→A、rsl2553329变异 A→G、rs2437817变异 T→G、rs3887137变异 A→G、rs2487046 变异 C→T、 rs2472496变异 A→G、 rsl 800976变异 C→G、 rs2472516变异 T→C、 rs2043664 变异 A→G、 rs2487034变异 G→A、 或 /和 rs2487031变异 C→T的试剂为 DNA测序用试 剂、 实时荧光定量 PCR法用试剂、 变性高效液相色谱分析法用试剂、 等位基因特异扩增 法用试剂、杂交法用试剂、质谱法用试剂、 限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构 象多态性分析法用试剂。
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