CN104164498B - 一种青光眼的筛查试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测ABCA1基因上31个SNP位点的试剂在制备检测青光眼的试剂中的用途，还公开了青光眼检测试剂盒。本发明试剂盒可用于青光眼的辅助性诊断，还可用于个体青光眼疾病的抗性和易感性评估。

Description

一种青光眼的筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及SNP领域，特别涉及与青光眼相关的SNP。

背景技术

青光眼是全世界主要的致盲原因，它是以视网膜神经节细胞死亡为特征。在大多数人群中，原发性开角型青光眼(POAG，MIM137760)是原发性青光眼的主要类型。POAG可以被分为高眼压型青光眼(HTG)和正常眼压型青光眼(NPG)。POAG可以由单个基因突变引起，该种类型符合孟德尔遗传规律；但多数POAG是散发的，由多个基因的遗传变异和环境因素共同引起。目前已鉴定出五个基因—MYOC(编码肌纤蛋白)，OPTN(编码视神经蛋白)，WDR36(编码WD重复结构域)，TBK1(TANK结合激酶1)和ASB10(encoding锚蛋白重合和SOCS盒基因10)能引起单基因遗传的POAG。然而这五个基因的突变只能解释5％-6％的原发性开角型青光眼的发病，而大多数患者的发病仍无法解释。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的青光眼的筛查试剂盒。

本发明提供了检测ABCA1基因rs2487032变异、rs2472519变异、rs2472459变异、rs2164560变异、rs12555462变异、rs2472511变异、rs2422493变异、rs2487042变异、rs2472495变异、rs4397467变异、rs1125873变异、rs715119变异、rs2487052变异、rs2472493变异、rs2487048变异、rs2027400变异、rs2472509变异、rs1800977变异、rs2246293变异、rs2515618变异、rs7023634变异、rs12553329变异、rs2437817变异、rs3887137变异、rs2487046变异、rs2472496变异、rs1800976变异、rs2472516变异、rs2043664变异、rs2487034变异、或/和rs2487031变异的相关试剂在制备青光眼筛查试剂中的用途。

所述试剂包括检测ABCA1基因rs2487032变异A→G、rs2472519变异A→G、rs2472459变异T→C、rs2164560变异C→T、rs12555462变异A→T、rs2472511变异A→G、rs2422493变异C→T、rs2487042变异A→G、rs2472495变异C→T、rs4397467变异G→A、rs1125873变异T→A、rs715119变异A→G、rs2487052变异T→C、rs2472493变异C→T、rs2487048变异C→T、rs2027400变异A→G、rs2472509变异C→A、rs1800977变异T→C、rs2246293变异C→G、rs2515618变异A→G、rs7023634变异G→A、rs12553329变异A→G、rs2437817变异T→G、rs3887137变异A→G、rs2487046变异C→T、rs2472496变异A→G、rs1800976变异C→G、rs2472516变异T→C、rs2043664变异A→G、rs2487034变异G→A、或/和rs2487031变异C→T的试剂。

所述的试剂还包括任选的用于扩增包含ABCA1基因rs2487032、rs2472519、rs2472459、rs2164560、rs12555462、rs2472511、rs2422493、rs2487042、rs2472495、rs4397467、rs1125873、rs715119、rs2487052、rs2472493、rs2487048、rs2027400、rs2472509、rs1800977、rs2246293、rs2515618、rs7023634、rs12553329、rs2437817、rs3887137、rs2487046、rs2472496、rs1800976、rs2472516、rs2043664、rs2487034、或/和rs2487031变异的基因片段的试剂。

其中，所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G、rs2472519变异A→G、rs2472459变异T→C、rs2164560变异C→T、rs12555462变异A→T、rs2472511变异A→G、rs2422493变异C→T、rs2487042变异A→G、rs2472495变异C→T、rs4397467变异G→A、rs1125873变异T→A、rs715119变异A→G、rs2487052变异T→C、rs2472493变异C→T、rs2487048变异C→T、rs2027400变异A→G、rs2472509变异C→A、rs1800977变异T→C、rs2246293变异C→G、rs2515618变异A→G、rs7023634变异G→A、rs12553329变异A→G、rs2437817变异T→G、rs3887137变异A→G、rs2487046变异C→T、rs2472496变异A→G、rs1800976变异C→G、rs2472516变异T→C、rs2043664变异A→G、rs2487034变异G→A、或/和rs2487031变异C→T的试剂为Snapshot用试剂。

所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G、rs2472519变异A→G、rs2472459变异T→C、rs2164560变异C→T、rs12555462变异A→T、rs2472511变异A→G、rs2422493变异C→T、rs2487042变异A→G、rs2472495变异C→T、rs4397467变异G→A、rs1125873变异T→A、rs715119变异A→G、rs2487052变异T→C、rs2472493变异C→T、rs2487048变异C→T、rs2027400变异A→G、rs2472509变异C→A、rs1800977变异T→C、rs2246293变异C→G、rs2515618变异A→G、rs7023634变异G→A、rs12553329变异A→G、rs2437817变异T→G、rs3887137变异A→G、rs2487046变异C→T、rs2472496变异A→G、rs1800976变异C→G、rs2472516变异T→C、rs2043664变异A→G、rs2487034变异G→A、或/和rs2487031变异C→T的试剂为DNA测序用试剂、实时荧光定量PCR法用试剂、变性高效液相色谱分析法用试剂、等位基因特异扩增法用试剂、杂交法用试剂、质谱法用试剂、限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构象多态性分析法用试剂。

本发明青光眼的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测ABCA1基因rs2487032变异、rs2472519变异、rs2472459变异、rs2164560变异、rs12555462变异、rs2472511变异、rs2422493变异、rs2487042变异、rs2472495变异、rs4397467变异、rs1125873变异、rs715119变异、rs2487052变异、rs2472493变异、rs2487048变异、rs2027400变异、rs2472509变异、rs1800977变异、rs2246293变异、rs2515618变异、rs7023634变异、rs12553329变异、rs2437817变异、rs3887137变异、rs2487046变异、rs2472496变异、rs1800976变异、rs2472516变异、rs2043664变异、rs2487034变异、或/和rs2487031变异的相关试剂。

所述的试剂包括检测ABCA1基因rs2487032变异A→G、rs2472519变异A→G、rs2472459变异T→C、rs2164560变异C→T、rs12555462变异A→T、rs2472511变异A→G、rs2422493变异C→T、rs2487042变异A→G、rs2472495变异C→T、rs4397467变异G→A、rs1125873变异T→A、rs715119变异A→G、rs2487052变异T→C、rs2472493变异C→T、rs2487048变异C→T、rs2027400变异A→G、rs2472509变异C→A、rs1800977变异T→C、rs2246293变异C→G、rs2515618变异A→G、rs7023634变异G→A、rs12553329变异A→G、rs2437817变异T→G、rs3887137变异A→G、rs2487046变异C→T、rs2472496变异A→G、rs1800976变异C→G、rs2472516变异T→C、rs2043664变异A→G、rs2487034变异G→A、或/和rs2487031变异C→T的试剂.

所述试剂还包括任选的用于扩增包含ABCA1基因rs2487032、rs2472519、rs2472459、rs2164560、rs12555462、rs2472511、rs2422493、rs2487042、rs2472495、rs4397467、rs1125873、rs715119、rs2487052、rs2472493、rs2487048、rs2027400、rs2472509、rs1800977、rs2246293、rs2515618、rs7023634、rs12553329、rs2437817、rs3887137、rs2487046、rs2472496、rs1800976、rs2472516、rs2043664、rs2487034、或/和rs2487031变异的基因片段的试剂。

其中，所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G、rs2472519变异A→G、rs2472459变异T→C、rs2164560变异C→T、rs12555462变异A→T、rs2472511变异A→G、rs2422493变异C→T、rs2487042变异A→G、rs2472495变异C→T、rs4397467变异G→A、rs1125873变异T→A、rs715119变异A→G、rs2487052变异T→C、rs2472493变异C→T、rs2487048变异C→T、rs2027400变异A→G、rs2472509变异C→A、rs1800977变异T→C、rs2246293变异C→G、rs2515618变异A→G、rs7023634变异G→A、rs12553329变异A→G、rs2437817变异T→G、rs3887137变异A→G、rs2487046变异C→T、rs2472496变异A→G、rs1800976变异C→G、rs2472516变异T→C、rs2043664变异A→G、rs2487034变异G→A、或/和rs2487031变异C→T的试剂为Snapshot试剂。

其中，所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G、rs2472519变异A→G、rs2472459变异T→C、rs2164560变异C→T、rs12555462变异A→T、rs2472511变异A→G、rs2422493变异C→T、rs2487042变异A→G、rs2472495变异C→T、rs4397467变异G→A、rs1125873变异T→A、rs715119变异A→G、rs2487052变异T→C、rs2472493变异C→T、rs2487048变异C→T、rs2027400变异A→G、rs2472509变异C→A、rs1800977变异T→C、rs2246293变异C→G、rs2515618变异A→G、rs7023634变异G→A、rs12553329变异A→G、rs2437817变异T→G、rs3887137变异A→G、rs2487046变异C→T、rs2472496变异A→G、rs1800976变异C→G、rs2472516变异T→C、rs2043664变异A→G、rs2487034变异G→A、或/和rs2487031变异C→T的试剂为DNA测序用试剂、实时荧光定量PCR法用试剂、变性高效液相色谱分析法用试剂、等位基因特异扩增法用试剂、杂交法用试剂、质谱法用试剂、限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构象多态性分析法用试剂。

SNP是SingleNucleotidePolymorphism的缩写，中文翻译为单核苷酸多态性，是指基因组上单个核苷酸的变异。前述5个变异碱基属于单核苷酸变异的结果。

本发明首次阐明了ABCA1基因上31个位点与青光眼存在相关性，使用本发明提供的试剂盒，可以有效筛查待检人群的对青光眼疾病的抗性和易感性，评估待检人群患青光眼的可能性，应用前景良好。

本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。

染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点，SNP在人群中大多只有两种等位型，故亦称为双等位标记，其检测是一种“+/﹣”或“全/无”的检测方式。

附图说明

图1Snapshot检测SNPrs2487032位点的基因分型图谱

图2Snapshot检测SNPrs2472519位点的基因分型图谱

图3Snapshot检测SNPrs2472459位点的基因分型图谱

图4Snapshot检测SNPrs2164560位点的基因分型图谱

图5Snapshot检测SNPrs12555462位点的基因分型图谱

图6Snapshot检测SNPrs2472511位点的基因分型图谱

图7Snapshot检测SNPrs2422493位点的基因分型图谱

图8Snapshot检测SNPrs2487042位点的基因分型图谱

图9Snapshot检测SNPrs2472495位点的基因分型图谱

图10Snapshot检测SNPrs4397467位点的基因分型图谱

图11Snapshot检测SNPrs1125873位点的基因分型图谱

图12Snapshot检测SNPrs715119位点的基因分型图谱

图13Snapshot检测SNPrs2487052位点的基因分型图谱

图14Snapshot检测SNPrs2472493位点的基因分型图谱

图15Snapshot检测SNPrs2487048位点的基因分型图谱

图16Snapshot检测SNPrs2027400位点的基因分型图谱

图17Snapshot检测SNPrs2472509位点的基因分型图谱

图18Snapshot检测SNPrs1800977位点的基因分型图谱

图19Snapshot检测SNPrs2246293位点的基因分型图谱

图20Snapshot检测SNPrs2515618位点的基因分型图谱

图21Snapshot检测SNP7023634位点的基因分型图谱

图22Snapshot检测SNPrs12553329位点的基因分型图谱

图23Snapshot检测SNPrs2437817位点的基因分型图谱

图24Snapshot检测SNPrs3887137位点的基因分型图谱

图25Snapshot检测SNPrs2487046位点的基因分型图谱

图26Snapshot检测SNPrs2472496位点的基因分型图谱

图27Snapshot检测SNPrs1800976位点的基因分型图谱

图28Snapshot检测SNPrs2472516位点的基因分型图谱

图29Snapshot检测SNPrs2043664位点的基因分型图谱

图30Snapshot检测SNPrs2487034位点的基因分型图谱

图31Snapshot检测SNPrs2487031位点的基因分型图谱

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。

需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

SDS：十二烷基硫酸钠

TE：10mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA(pH8.0)

dNTP：脱氧核苷三磷酸

实施例1样本收集和基因组DNA的提取

本发明研究纳入的原发性开角型青光眼包含了高眼压型青光眼(HTG)和正常眼压型青光眼(NPG)。全基因组关联分析(GWAS)的发现阶段，验证一阶段和验证二阶段用的都是高眼压型青光眼(HTG)。发现阶段包含了1007个散发的高眼压型青光眼患者和1009个正常对照。所有样本都来自于上海，香港，和成都地区，分别在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，香港中文大学香港眼科医院，四川省人民医院收集。验证一阶段包含了525位高眼压型青光眼患者和912个正常对照，样本取自新加坡国立眼科中心，新加坡眼科研究所，新加坡国立大学健康署。二阶段验证包含615个散发的高眼压型青光眼患者和1325个正常对照，样本来自上海、北京和四川，分别取自北京同仁医院，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院和四川省人民医院。三阶段患者主要是正常眼压青光眼，共有759个患者和2728个正常对照，样本来自上海、北京、四川和香港地区，分别取自北京同仁医院，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，四川省人民医院和香港眼科医院。所有参与者均由眼科医生按照标准操作流程给予详细的眼科检查。本研究原发性开角型青光眼患者2906例，平均年龄54.9±16.1(18.0-95.0)岁，其中男性占53.8％，对照5974例，平均年龄64.9±16.6(19.0-102.0)岁，其中男性占51.6％。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。

根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4m1)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μl和20μl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加l/10，3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。最后将所得的基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至50ng/μl，置-20℃冰箱保存。

实施例2本发明SNP的基因型分析

本发明采用Snapshot基因分型技术对如下位于三磷酸腺苷结合盒转运子1(ATP-bindingcassette，sub-familyA(ABC1)，member1，ABCA1)基因上的31个SNP位点进行检测。采用基因扩增试剂及Snapshot引物分别按照下述方法进行分型。SNaPshot又称微测序法。该技术由美国应用生物公司(ABI)开发，基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪电泳后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于5-15个SNP位点分析。本发明31个SNP的相关信息如下表1所示：

表1本发明31个SNP的相关信息

实验步骤如下：

1、PCR：95℃变性5分钟；95℃30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟，4℃保温。

2、纯化1：PCR产物各取1-3μl(根据需混合的PCR个数而定，总量为9μl，加入混合液3μl(SAP2μl，1：10Exol酶1μl)。1：10Exol酶的配制：1体积Exol酶，1体积SAP10Xbuffer，8体积ddH₂O。程序：37℃1h，75℃15min。

3、Snapshot反应：SnapshotMULTIPLEX1μl，purifiedPCRmix1μl，Snapshot引物每个为0.2μl，DDH₂O补足5μl。程序：96℃1分钟，96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，cycletostep2for25moretimes，12℃保温。

4、纯化2：每个反应加SAP0.5-1.0μl，程序：37℃1小时，75℃15分钟，4℃保温。

5、1μl上述产物加9μlHD。程序：95℃，5分钟，迅速置冰上，冷却后上机检测。

各个SNP的PCR引物对、得到的扩增序列以及Snapshot引物A分别列举如下：

序列1：kgp11138762(rs2487032)571bp

GCAGGGAAGAGTCAAAGAGGtcagaagcaacactctctgttggtaactaaaaatgagaccaaagattacatccaaacccataagagcctgaagtttgacccaagtccctttgtttattgaatggaaccctgtagataaacaaaggaagcaaaatgaaaaacacttaccaccccttcactgggggtgcacaataagacaaaagcattcccaaatgaatcttcaatgtgtgggagagaaagaA/GttttgagtgacctaagattgaatgagataatagcaccttatgtttctgtgaaatatttgtcaccttatatttctaggaaatgaccagtgtgtcattcaaaaatgtaatacaatgaaaacgaagtttgaagtttcacactcctcattttcttaaaaccatgcaaaggcaaacagagatgtgatactatgagatttcaaggaaactgcagagtcatagtaatttgattctaaaaacagatgcttgacaagaagttatatttaaatcaaccatcaatctatcaggacataatttctgaagtcagtaataaataACCTTTCCATTTCATCCTCC

F：5'GCAGGGAAGAGTCAAAGAGG3'

R：5'GGAGGATGAAATGGAAAGGT3'

SnapshotF：5'AAAACTCACTGGATTCTAACTTACTCTA3'

序列2：(rs2472519)418bp

GATGGGGGACAGAGTGTTTGcagatggaagaaataacactgcttcagagttgaatgttcaattcttctctgacaccaatcaatatgtgatttgattgccatagttagtgctaatgtttattcagtgacaatctaggagaggtttctacctgaagaaaggaaaaaaagtatatatacttttacacttttataaaaatgtaaatacacacacatatacatatatatatgaatatgtacttattcaccttattaA/GataattcagattcctttgttgtcaataatcaattggaaaatctgttctgggtccagttagtacattattttattttacttttatttttcgagatggagtcttgctctgtcacccaggctggagctcagcggtctgatctcggctcaCTACGACCTCTGCTTCCCAG

F：5'GATGGGGGACAGAGTGTTTG3'

R：5'CTGGGAAGCAGAGGTCGTAG3'

SnapshotF：

5'TAAATACACACACATATACATATATATATGAATATGTACTTATTCACCTTATTA3'

序列3：(rs2472459)206bp

AGGCCTGGATTCACTGTGTCcccttcccttctattttagcctaaaataggcttataatgaaagaggtccctatcttcatttgtcaagtgaaccaaaacatccttgctcttgagacagtatagtaggtaagtgtgaacactctgaaaccatgtgatctggttttaaatcccagcctC/TgactcttgagTAGCTGAATGACCGTGGTCA

F：5’AGGCCTGGATTCACTGTGTC3’

R：5’TGACCACGGTCATTCAGCTA3’

SnapshotR：5'AGGCTGGGATTTAAAACCAGATCACATGGTTTCAGA3'

序列4：(rs2164560)305bp

TCGGTGTTTAAAATCCAATGTTTattctttccttatttatctgttaaaagctcttgttaaaccaagtgtttcaactttctgactgttacatgtgttgcaaatatttttaccagattgcaatcttattttaatctgtaaatcttttcctT/CtagggcgtctggctttgctgtttacagattctttctccatttcaagatgatagaaatattcaacttcaaatttcttcaagcacttgcataaattattaagcatttgactttattggtaccagtcccctccacccaaGTCCAATGAGGGGAGACTCA

F：5’TCGGTGTTTAAAATCCAATGTTT3’

R：5’TGAGTCTCCCCTCATTGGAC3’

SnapshotF：5’TCTTATTTTAATCTGTAAATCTTTTCCT3'

序列5：(rs12555462)306bp

CTCCTCTCTCACACACAGCAatccctaagaaatgccctagggttccacaaggcactgtttgaaaactatgtgctgagtaggtatccaaaattccctccagctctgaaggtctgtatggatgatgtttaatcacttcattgataactgagA/TaatcctggattcataacttcacttcttaggctctcagtgggccaacttgcaggcacaatgcccatttgcccctccagactgtgagctccttttctttacagactgggtttattcaaccttgtttccccaattcttaACACAAAGCCTGGCAAGAAG

F：5’CTCCTCTCTCACACACAGCA3’

R：5’ACACAAAGCCTGGCAAGAAG3’

SnapshotF：

5’CTGAAGGTCTGTATGGATGATGTTTAATCACTTCATTGATAACTGAG3’

序列6：(rs2472511)376bp

AAAGGACACCGAGGGAAACAccacataaacacagtgatggatatagtggcatagcaacccagggggtgcaacatatgggttagagcctcatgttttctcaactttcaagttgtgatagaatcagggccctcacaagctataaacatagatttttatctgcaaatgcattatattcgaagtcttgcccaaatctgttatgttttattaataaaaataaaactaaatttagttgtgaatgaaataaatctaacttttaagataggaaaaaaatcA/GtaaaattggtgaatttgatgttcaatcgctggcatcagatggtgaacagatgctttataaacacatagcacaggaaagagcatGGGTTTACTGAGAGCAAGCC

F：5’AAAGGACACCGAGGGAAACA3’

R：5GGGTTTACTGAGAGCAAGCC3’

SnapshotF：5’AATGAAATAAATCTAACTTTTAAGATAGGAAAAAAATC3’

序列7：(rs2422493)635bp

GTGGCCTCCTTCCTCTCAATttatgaagagaagcagtaagatgttcctctcgggtcctctgagggacctggggagctcaggctgggaatctccaaggcagtaggtcgcctatcaaaaatcaaagtccaggtttgtggggggaaaacaaaagcagcccattacccagaggactgtcC/TgccttcccctcaccccagcctaggcctttgaaaggaaacaaaagacaagacaaaatgattggcgtcctgagggagattcagcctagagctctctctcccccaatccctccctccggctgaggaaactaacaaaggaaaaaaaaattgcggaaagcacgatttagaggaagcaaattccactggtgcccttggctgccgggaacgtggactagagagtctgcggcgcagccccgagcccagcgcttcccgcgcgtcttaggccggcgggcccgggcgggggaaggggacgcagaccgcggaccctaagacacctgctgtaccctccacccccaccccacccacctccccccaactccctagatgtgtcgtgggcggctgaacgtcgcccgtttaaggggcgggccccggctccacgtgctttctgctgagtgactgaactACATAAACAGAGGCCGGGAA

F：5’GTGGCCTCCTTCCTCTCAAT3’

R：5’TTCCCGGCCTCTGTTTATGT3’

SnapshotF：5’ACTAACAAAGGAAAAAAAAATTGCGGAAAGCA3’

序列8：(rs2487042)480bp

TCAAAGCAACCTCCAAACAatgccatttaggtaatctccaatttaaaagcctcaatagaatgataagattgagcttttctgtagttccatgacctccagcagagtctgcaaggccacagctgcctgaagA/GttgattctgtaattagaagatgccagggtcatctcagaatagaacctcaagccacccaggctacatttacagaatcagcctctccagaaaaacagcaacaaaggagggccttcctatgtatttggaaggagtcacctagaggagggacttggggttttggtgttggtgtggggggcagggatgggatggggagggggaagcttattgaaatatactaaaagacaaaccaacctaagggctggagggaagaaaattcacacttgtaagcttcttttttaaggggcatctcttaggctctagcttttgagattcagtatatatatatttttgaGTCTTGCTCTGCTGGAGTG

F：5’TCAAAGCAACCTCCAAACA3’

R：5’CACTCCAGCAGAGCAAGAC3’

SnapshotF：5’TGACCTCCAGCAGAGTCTGCAAGGCCACAGCTGCCTGAAG3’

序列9：(rs2472495)566bp

TGACCTCAAGTGATCACCCGcctcaacctcccaaagtgctgggattacaggccagagccacagtgcccagccaaggctaacctcttgatcccaatgacaaacagaacaaacatcttactcaagtccagaagcaataataattttgaatcttgcttgcatgtcaacaggagccacattaatacagaagaggatcacaC/TtggtccaattaaattgaattgattgagagcctctgcaatacacggtctactgcacaaataatgatggttcctggtacatttttatttgaccattgattgctcgatttgtttctgtgtctaactgtgtattggaattaagctgactcaatttgaactgcaggtccttttatccctcttattttttatttatttatttattttattttaaggcatttctcactctccagaaaatctctaagatttcagctattaggcatttgtctttttttttttttttttttttttttttgagactgagtcttgctgggttgcccaggctggaatgcagtgtcacaatctcggctcatcaCAACCTCCACCTCCCTGATT

F：5’TGACCTCAAGTGATCACCCG3’

R：5’CAACCTCCACCTCCCTGATT3’

SnapshotF：5’CTTGCATGTCAACAGGAGCCACATTAATACAGAAGAGGATCACA3’

序列10：(rs4397467)495bp

TGAATTGTCCTCCTGCCCATattctctgcaactctcagctctgcctgtttcctgtaaacagcttttatgctagagcaggcatctccaacagtgaatcaagagaaatccttctatcagacagtcatgcattgttaactatcatgcactgaggtgttctttgttagaaaaatatttcttgtatgcttttacaggttcatgaatgatatatcctcagcatttctatataattagtcccagggtatttttacatatctcattcccaattcgtcttccatttcatcagtgttctctgtctttagacttggtctcctcA/GagtctccgttctgtttcactagcttgtcttgtatgattttttagggctcattgacacagttaagccatttttgcttcttataacttttgactaagtaaactggtacacaatcacttgatgatagcacattgattgatgacagttatcaagtgaaaaatttgcCCAGCAGAACCTTAGTGCAG

F：5’TGAATTGTCCTCCTGCCCAT3’

R：5’TGAATTGTCCTCCTGCCCAT3’

SnapshotF：5’TCCATTTCATCAGTGTTCTCTGTCTTTAGACTTGGTCTCCTC3’

序列11：(rs1125873)344bp

GAATTGCTCCACACCCGAAAaagcacccttgtgctgtctctttgtagtcaacgcttcctctcacctttaaaccctggaaaccactgatctatcctctgactctttagctttgccttttccagaataacatgaaaatggaatcatgtagtaacacagcatcttttacattagggaatttaaaacaaaagcaagtaaacaagcaaaaacaaaA/TactagagccccattccctgaatattctggttaagtaaaatttactatgtcagacacctcacatcgtaatacttctcaaaatatttttcccaatcaaagcaacttttgtttttcTTTCTCTTGGTCCTTGCCCT

F：5’GAATTGCTCCACACCCGAAA3’

R：5’TTTCTCTTGGTCCTTGCCCT3’

SnapshotF：5’TTTAAAACAAAAGCAAGTAAACAAGCAAAAACAAA3’

序列12：(rs715119)409bp

CACTGGTCATCTCAaaagcatttgaaaccgacatgaaaaccttaattcatttcgatgaccacttacccttacacttcagcacttttggacaaaagcacagacagccactgtgaA/GtaaaaaaaataataatgatttgaaaacagaacgactaagatttttactcaaagaaacacagttccttgaatgttttgggctgcatcccactccccagggtttttgtacttgctgtacctctgtccagatgatgctcctgtctggatcgaccaaacccccatttacccttcagatctcaatttgagtgacccttttcctgggaagccatggcctatcctcctccccgcccccagcccccgacatagatgaccttctctgtgttccagagttactctTTGCTAACGTCTGACCCACT

F：5’CACTGGTCATCTCA3’

R：5’TTGCTAACGTCTGACCCACT3’

SnapshotF：5’TTTGGACAAAAGCACAGACAGCCACTGTGA3’

序列13：(rs2487052)450bp

GACCTGCACAGTGGCTTATGcctgtaatcccagcactttgggaggctgatgtgggaggatcacttgagcccaggagttcaagaccagtctgagcaagatagtgagaccttgtctttacaaaaaattgtaaaaatttagccaggagcagtggtgcgtgcctgtggccccagctccttaagaggctgatgtatgaggatcacgtgagcgcaggaggctgaggttgcagtgagccttgtctgtgcagctgcactccaccctgtgcaacagagcaagaccctatctcaaaataaatacaatgaataaacacgtgaaaaacatttcaaacagtacttgccacacagtgctatataagtgtctattcaacaC/TtgcaataactttggccattcatggttgtatccacatgcagatacgaagatggttgcattttttgGAGTAGGCCTTCTCTCAGCA

F：5’GACCTGCACAGTGGCTTATG3’

R：5’GAGTAGGCCTTCTCTCAGCA3’

SnapshotF：5’ACTTGCCACACAGTGCTATATAAGTGTCTATTCAACA3’

序列14：(rs2472493)595bp

GCAGTGGGTGAGGTGTTAataaaagggagggggtagagatgaaatctttccagcagtttggctcttaaggggatagcttgaaggaaagagggttggaagggtggtttttaaaaagaattatcactcactaatcaactagaaatccagtggaatatgcagtaC/TttgtctgtaatccagcaggctaacttttttttttttttttttttgagacggagtctcgctctgtcacccaggctggagtgcagtggcatgatcttggcttaccgcaacctctgcctcccagttcaagcaattctcttgcctcagcctcccaagtagctggaactacaggcatgcaccaccatgcatggctaaattttttttgaatttttagtagagatgagtttcaccatgttggtcaggctggtctcaaattcctgacctcaagtgatcacccgcctcaacctcccaaagtgctgggattacaggccagagccacagtgcccagccaaggctaacctcttgatcccaatgacaaacagaacaaacatcttactcaagtccagaagcaataataattttgaatcttgcttgcatgTCAACAGGAGCCACATTA

F：5’GCAGTGGGTGAGGTGTTA3’

R：5’TAATGTGGCTCCTGTTGA3’

SnapshotF：5’TCAACTAGAAATCCAGTGGAATATGCAGTA3’

序列15：(rs2487048)589bp

TTCTAAGGGCAAACAGTCCatggtgcaaaggggccatgccacccagagttatgagtacctgggactccagaattccttgcctggtggcctccacatgcacttccagggcctgcttgggcctcttctatgggtctgtcctgagtgttgatagaaccactgatgtgagtacctgggcttgagccgtggcctggagatcctgttgactgtagcatggagggggcttgtgcagctgaatgtctgC/TatgcaggtggtgggagttctggaatatgatggagctggaggtgggaagagaagtaggcttggggcagctctctcatgccacctcattctggccaaaactcaggtcaaactgtgaagagtctaaatgtgaatctgcccttcaaggtggctacaaaggtatctttgtcaaggtaggagaccttgtggcctccacgtgcacttccagggcctgcttgggcctcttctacgggtctgtcctgagtcttctatgaatctgcccttcagggcagattcatatttagactcttcacagtttgacctgagttttggccagaataaggtgacatttagTTTGTTGGCTTGATGGATG

F：5’TTCTAAGGGCAAACAGTCC3’

R：5’CATCCATCAAGCCAACAAA3’

SnapshotF：5’CTTGTGCAGCTGAATGTCTG3’

序列16：(rs2027400)434bp

GTAGCTCCTTGTGCACACTtgggaacatttaaaatatactccacctgcagcttatgcttgcatcacaattatacaaggcactttatatacgttattcgactttgaaatctattttttttttttgagacagagtcgtgctctgtcacccaggctcaagtgcagtggcgcgatcttggctcactgcaacctctgcctcctcggttcaagtgattcttctgcctcagcctcccaagtagctgggattacaggcatgtgccaccctgcccaactaattttA/GttttatcgactttgaaattttataacaaccttgagagaggacacaggaaaagccttatgatccttattttccaggacagtaaacagcagctgaaaaacgtgaagcgtatttctcaaatcaacctgcaagaaaatagaAGAAGCAGAACCTGAAGCCA

F：5’GTAGCTCCTTGTGCACACT3’

R：5’AGAAGCAGAACCTGAAGCCA3’

SnapshotF：

5’CCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCATGTGCCACCCTGCCCAACTAATTTT3’

序列17：(rs2472509)347bp

AACAATGGAGGAGCACTGGAtttggttcctaaaacaaaataaagtttgaaatcctgtctttcccatgttgaaaacaaagttggtacaaaaccctttagcttttgcaaacctcctttaagacccgatttaaatgcttccctcctcatgaagctcttctggatccactccttcccatcactaagttgaaagtA/CagatccccttctctttacttccattagacttggattacagcactctttgtatcatgtatttaattctgttttttaattacagttaacatttatttgtcttcctcttgagtgtatgcttctctagaggaaggtctttGATTCATTCTCCCCTGGCCT

F：5’AACAATGGAGGAGCACTGGA3’

R：5’GATTCATTCTCCCCTGGCCT3’

SnapshotF：5’CTTCTGGATCCACTCCTTCCCATCACTAAGTTGAAAGT3’

序列18：(rs1800977)433bp

ACATAAACAGAGGCCGGGAAcggggcggggaggagggagagcacaggctttgaccgatagtaacctctgcgctcggtgcagccgaatctataaaaggaactagtcC/TcggcaaaaaccccgtaattgcgagcgagagtgagtggggccgggacccgcagagccgagccgacccttctctcccgggctgcggcagggcagggcggggagctccgcgcaccaacagagccggttctcagggcgctttgctccttgttttttccccggttctgttttctccccttctccggaaggcttgtcaaggggtaggagaaagagacgcaaacacaaaagtggaaaacaggtaagaggctctccagtgacttacttgggcgttattgttttgtttcgaggccaaggaggcttcgggaagtgctCGGTTTCGGGGACTTTGATC

F：5’ACATAAACAGAGGCCGGGAA3’

R：5’GATCAAAGTCCCCGAAACCG3’

SnapshotF：5’gtgcagccgaatctataaaaggaactagtc3’

序列19：(rs2246293)635bp

GTGGCCTCCTTCCTCTCAATttatgaagagaagcagtaagatgttcctctcgggtcctctgagggacctggggagctcaggctgggaatctccaaggcagtaggtcgcctatcaaaaatcaaagtccaggtttgtggggggaaaacaaaagcagcccattacccagaggactgtccgccttcccctcaccccagcctaggcctttgaaaggaaacaaaagacaagacaaaatgattggcgtcctgagggagattcagcctagagctctctctcccccaatccctccctccggctgaggaaactaacaaaggaaaaaaaaattgcggaaagcaC/GgatttagaggaagcaaattccactggtgcccttggctgccgggaacgtggactagagagtctgcggcgcagccccgagcccagcgcttcccgcgcgtcttaggccggcgggcccgggcgggggaaggggacgcagaccgcggaccctaagacacctgctgtaccctccacccccaccccacccacctccccccaactccctagatgtgtcgtgggcggctgaacgtcgcccgtttaaggggcgggccccggctccacgtgctttctgctgagtgactgaactACATAAACAGAGGCCGGGAA

F：5’GTGGCCTCCTTCCTCTCAAT3’

R：5’TTCCCGGCCTCTGTTTATGT3’

SnapshotF：5’CCCATTACCCAGAGGACTGTC3’

序列20：(rs2515618)248bp

AGTGGTAGAATGGCGTGCTAaatttattctccagctgccattaactgcaaattaaaatcttagtctcttgcctctttaatccaggcttcttcatactataccagaatttaggataactattacagtgccctttataggaA/GagaaagaagaaattgtgtctgtagatgtctgttcctttcagcttaaaatggacactgaaatgttaaatattggactggcctcatttatTTCTCCTGTCTGTTGGTCCA

F：5’AGTGGTAGAATGGCGTGCTA3’

R：5’TTCTCCTGTCTGTTGGTCCA3’

SnapshotF：5’CCAGAATTTAGGATAACTATTACAGTGCCCTTTATAGGA3’

序列21：(rs7023634)321bp

GCCCAAACCATGTGTCAGAGagctgggtgtggccagtgggcccctggtgtgcaactagtcttcagtgatgctactgtatgctagtgacagcacaactgaccactgaaaatatggtgcacgatggtgaacagattggatttcccA/GtatctctagaaccccagggctttgaggcaattctgatagatggagggggagcgagagagagaaagaggagggagaggtatcacatgaaagagatactggactttctgctaataaatgggtgggtatttgggtgagtagataggaaattaaaaagaaaTATGAGAGATGGGCGTGGTG

F：5’GCCCAAACCATGTGTCAGAG3’

R：5’TATGAGAGATGGGCGTGGTG3’

SnapshotF：

5’AACTGACCACTGAAAATATGGTGCACGATGGTGAACAGATTGGATTTCCC3’

序列22：(rs12553329)511bp

GGCCTTTGAAGCCTGATCATatgacctgcttcctcctccatcctcttccatccatccacaccccaccccttactcacccccattctaccaactcacgactctcatcatactttcccattgcttA/GgaaatgcttcctctcatctccactcctgtcgtcctgttatgcttttattctagaagcagtaggaaagaggggcagaaaaaagaaattcacttccctcattaaatggaaagttgtgagatagagggtatatgaagaaagagagagagatttttaagtatccaaattgataggcaaatattacccccaactcagatccattatcaagtgtaacaatagattcacagaagcagtcagtacccttaaatttgccaagaaaataattggactcaggggattaaaagaaatcaagcgcttattataatagaagtagtgcatctgcgtttctttccttattcagagtacttttttgacacttaagaatccatatTCCTGGCTGTGATTTCTGGG

F：5’GGCCTTTGAAGCCTGATCAT3’

R：5’TCCTGGCTGTGATTTCTGGG3’

SnapshotF：5’CTACCAACTCACGACTCTCATCATACTTTCCCATTGCTT3’

序列23：(rs2437817)510bp

GTTTTCTCCCCTTCTCCGGAaggcttgtcaaggggtaggagaaagagacgcaaacacaaaagtggaaaacaggtaagaggctctccagtgacttacttgggcgttattgttttgtttcgaggccaaggaggcttcgggaagtgctcggtttcggggactttgatccggagccccacatccccaccacttgcaactcagatgggaccggaggcggtgttaaatggggagacG/TatgtcctagtacgagctctggtgaccccaggactctgcgctgctgcgcttggggcttgcccgacggtggagaccggggagcatctctgggcgtggagacccgggcgcagtaccccgggctcagaggggtcgggggttcccgggcgtgctgagggcgctgctgccgggtggggagagctgcaggtccggcaccgagcgctgctttgttcggagggccctgagctggctagaaacccttctggttgcaggtcggccagtacCTACGGAGACAAATGCCAGC

F：5’GTTTTCTCCCCTTCTCCGGA3’

R：5’CTACGGAGACAAATGCCAGC3’

SnapshotF：5’TTGCAACTCAGATGGGACCGGAGGCGGTGTTAAATGGGGAGAC3’

序列24：(rs3887137)578bp

ATACTGGGCAAGGATGGGTCaaaacaacacagactattgagggcaacaaaggaaaaaccatgcactcctgaagaaatcgttcccaaaatgctgaaagagaaagaggattgtctctctagaagtctaatagaaaacagtatctggaacatttcctaggattttttttttttctaatgacttactctcttattaatatgtcagagaaaagaaaagctcctggctaagaaataaaacagtccctcatcccagaaatcacagccaggaatatggattcttaagtgtcaaaaaagtactctgaataaggaaagaaacgcagatgcactacttctattataataagcA/GcttgatttcttttaatcccctgagtccaattattttcttggcaaatttaagggtactgactgcttctgtgaatctattgttacacttgataatggatctgagttgggggtaatatttgcctatcaatttggatacttaaaaatctctctctctttcttcatataccctctatctcacaactttccatttaatgagggaagtgaatttcttttttctGCCCCTCTTTCCTACTGCTT

F：5’ATACTGGGCAAGGATGGGTC3’

R：5’GCCCCTCTTTCCTACTGCTT3’

SnapshotF：

5’TCTGAATAAGGAAAGAAACGCAGATGCACTACTTCTATTATAATAAGC3’

序列25：(rs2487046)432bp

ACCCAATTTATTGACCAAGgttattctttgactgaggcaagggggtccgctctcctgggccttgggctttagaaagctcatctctggcctttctgagatccatccctttctttttatttttcttgacacggagtcttgctctgtcactcaggctggagtgcagtggcatgatctcgactcactgtaacctctgcctcccgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcctgagataacaggcgcC/TcgccaccacatctggctaatttttgtatttttagtaaagactgggtttcatcatgttggccaggttggtttcgaactcctgacctgaggtgagctgcccaccttggcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccactgcgcccagctcagatccatccctttcTAAGGGCAAACAGTCCAT

F：5’ACCCAATTTATTGACCAAG3’

R：5’ATGGACTGTTTGCCCTTA3’

SnapshotF：5’CCTCCTGAGATAACAGGCGC3’

序列26：(rs2472496)424bp

GGGCAACCCAGCAAGACTcagtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagacaaatgcctaatagctgaaatcttagagattttctggagagtgagaaatgccttaaaataaaataaataaataaataaaaaataagagggataaaaggacctgcagttcaaattgagtcagcttaattccaatacacagttagacacagaaacaaatcgagcaatcaatggtcaaataaaaatgtaccaggaaccatcattatttgtgcagtagaccA/GtgtattgcagaggctctcaatcaattcaatttaattggaccaatgtgatcctcttctgtattaatgtggctcctgttgacatgcaagcaagattcaaaattattattgcttctggacttgagtaagatgtTTGTTCTGTTTGTCATTGGGAT

F：5’GGGCAACCCAGCAAGACT3’

R：5’ATCCCAATGACAAACAGAACAAN3’

SnapshotF：5’CATTATTTGTGCAGTAGACC3’

序列27：(rs1800976)548bp

ATCTCCAAGGCAGTAGGTCGcctatcaaaaatcaaagtccaggtttgtggggggaaaacaaaagcagcccattacccagaggactgtccgccttcccctcaccccagcctaggcctttgaaaggaaacaaaagacaagacaaaatgattggcgtcctgagggagattcagcctagagctctctctcccccaatccctccctccggctgaggaaactaacaaaggaaaaaaaaattgcggaaagcaggatttagaggaagcaaattccactggtgcccttggctgccgggaacgtggactagagagtctgcggcgcagccccgagcccagcgcttcccgcgcgtcttaggccggcgggcccgggcgggggaagggC/GacgcagaccgcggaccctaagacacctgctgtaccctccacccccaccccacccacctccccccaactccctagatgtgtcgtgggcggctgaacgtcgcccgtttaaggggcgggccccggctccacgtgctttctgctgagtgactgaactACATAAACAGAGGCCGGGAA

F：5’ATCTCCAAGGCAGTAGGTCG3’

R：5’TTCCCGGCCTCTGTTTATGT3’

SnapshotF：5’CCCGCGCGTCTTAGGCCGGCGGGCCCGGGCGGGGGAAGGG3’

序列28：(rs2472516)371bp

ATGCCCGGCCTATCTGTATTatttattcattattgctatgtgaatgaacctgaagaatgcttactgttactgctaagtatttaaccacaccccatgcccatgcaggatgatagtgaatagtggccaaaagatactataattagactcatgtaattaaggaatatttttgtcttgtacctattatgtgcctataaagactatgaaatctatttattcagtgatttattggaataccaaataagcaaagatcctatgtgctaaagattctaatattgtgctaagattttccC/TtcagatgtttggctttctcaaattccctgagggctagaactttgccctactcatttgtgttTCCCAAGTGTCTAACGCAGT

F：5’ATGCCCGGCCTATCTGTATT3’

R：5’TCCCAAGTGTCTAACGCAGT3’

SnapshotF：5’CCTATGTGCTAAAGATTCTAATATTGTGCTAAGATTTTCC3’

序列29：(rs2043664)515bp

AAAATACTGGGCCGGGCGcggtggctcacgcctgtaatcccagcattttgggaggccgaggcgggcggatcatgagatcaggagatcgagaccatcctggctaacagggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaaattagctgggcatggtggcaggcgcctgtagtcccagctgctcgggaggctgaggcagaagaatggtgtgaacctgagaggcagaacttgcagtgagcccagatcacaccactgcactccagcagagcaagactcaaaaatatatatatactgaatctcaaaagctagagcctaagagatgccccttA/GaaaaagaagcttacaagtgtgaattttcttccctccagcccttaggttggtttgtcttttagtatatttcaataagcttccccctccccatcccatccctgccccccacaccaacaccaaaaccccaagtccctcctctaggtgactccttccaaatacataggaagGCCCTCCTTTGTTGCTGTTT

F：5’AAAATACTGGGCCGGGCG3’

R：5’GCCCTCCTTTGTTGCTGTTT3’

SnapshotF：5’TATATACTGAATCTCAAAAGCTAGAGCCTAAGAGATGCCCCTT3’

序列30：(rs2487034)321bp

GCCCAAACCATGTGTCAGAGagctgggtgtggccagtgggcccctggtgtgcaactagtcttcagtgatgctactgtatgctagtgacagcacaactgaccactgaaaatatggtgcacgatggtgaacagattggatttcccA/GtatctctagaaccccagggctttgaggcaattctgatagatggagggggagcgagagagagaaagaggagggagaggtatcacatgaaagagatactggactttctgctaataaatgggtgggtatttgggtgagtagataggaaattaaaaagaaaTATGAGAGATGGGCGTGGTG

F：5’GCCCAAACCATGTGTCAGAG3’

R：5’TATGAGAGATGGGCGTGGTG3’

SnapshotF：5’TGAAAATATGGTGCACGATGGTGAACAGATTGGATTTCCC3’

序列31：(rs2487031)357bp

CCAGGAGGTGAAGGTTGTGTtgagctgagatcccgccattgcactccagcctgggcaacgagcaaaactctgtctcaaaaaaaccgaaaaaattcccccaaaaaaccaaaaaaaaacagcaacaacaaaaaaatcaaataatgtaccttgtttagcataaagcataattatatgcatatggtgattgggaggatgaaatggaaaggttatttattactgacttC/TagaaattatgtcctgatagattgatggttgatttaaatataacttcttgtcaagcatctgtttttagaatcaaattactatgactctgcagtttccttgaaatctcatagtATCACATCTCTGTTTGCCTTTG

F：5’CCAGGAGGTGAAGGTTGTGT3’

R：5’ATCACATCTCTGTTTGCCTTTG3’

SnapshotF：

5’ATGGTGATTGGGAGGATGAAATGGAAAGGTTATTTATTACTGACTT3’

实施例3本发明SNP的基因型分析

除了实施例2列举的Snapshot检测方法，本发明31个SNP还可以采用如下检测方法检测：

检测SNP方法包括：

一、DNA测序技术：

1、双脱氧核苷酸链终止法(传统Sanger测序)是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。基本流程：1)、DNA模板提取和质检；2)、序列比对，引物设计和合成；3)、PCR扩增，包括变性双链模板的制备，延伸和终止反应；4)、PCR产物纯化；5)、测序仪检测；6)、序列读取。

2、焦磷酸测序法(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序方法，依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放，而非双脱氧核苷三磷酸参与的链终止反应。是由4种酶(DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。基本流程：1)、基因组DNA提取；2)、设计和合成PCR引物，其中之一标记生物素，PCR反应；3)、DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火；4)、对含生物素的单链DNA的测序，基于测序的SNP分析及等位基因频率确定。

3、二代高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称“下一代”测序("Next-Generation"Sequencing，NGS)。主要包括Roche454，IlluminaSolexa，ABISOLiD和Life的Iontorrent四大类测序平台。基本流程：1)、将目标DNA剪切为小片段，构建测序文库；2)、将单个小片段DNA分子结合到固相表面，进行锚定桥接；3)单分子独立扩增的预扩增；4)、每次只复制一个碱基(A，C，T，G)的单碱基延伸测序并检测信号；5)、高分辨率的成像系统；6)、数据分析。

4、三代单分子实时测序技术，主要包括并行单分子合成测序(HelicosBiosciences，tSMSTM)平台；单分子实时合成测序(SingleMoleculeRealTime，SMRT)平台；纳米孔单分子技术(OxfordNanoporeTechnologies)平台。以tSMSTM为例，其基本流程：1)将待测序列随机打断成小片段，3’末端加polyA；2)与Cy3荧光标记寡聚PolyT接头进行芯片杂交；3)DNA合成循环反应，洗脱，加帽，渗入，淬灭；4)全内反射显微镜进行单色成像，实现实时测序。

二、实时荧光定量PCR法(Real-TimePCR法)：

1、Taqman探针法是针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。基本流程：1)、DNA提取和质检；2)、序列比对，特异荧光探针设计与合成；3)、荧光定量PCR仪检测；4)、结果数据分析。

2、高分辨率溶解曲线分析法(HighResolutionMeltingAnalysis，HRMA)检测SNP技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形。基本流程：1)DNA提取和质检；2)、序列比对，针对已知SNP位点设计20～35bp的Lunaprobe非标记探针；3)、加入LCGreen饱和荧光染料(EvaGreen或LCgreen)PCR，4)、PCR产物直接进行HRM检测；6)、采用Lunaprobe分析结果。

三、变性高效液相色谱分析(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC)或HPLC波长切换技术(HPLC-WAVEwavelength)是一项在单链构象多态性(SSCP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。将工作温度(柱温)升高使DNA片段开始变性，部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链(错配的)DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。基本流程：1)、DNA提取和质检；2)、PCR扩增；3)变性后缓慢复性；4)、变性高效液相色谱仪检测；5)、Maker核苷酸片段分析系统专用软件分析结果。

四、等位基因特异PCR(Allele-specificPCR,AS-PCR)，又称作探针扩增阻滞突变系统(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)或等位基因特异扩增(Allele-specificenzymaticamplification，ASA)，或PASA(PCRamplificationofspecificallele)。是根据SNP位点设计特异引物，其中一条链(特异链)的3′末端与SNP位点的碱基互补(或相同)，另一条链(普通链)按常规方法进行设计。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。基本流程：1)、DNA提取和质检；2)、多态性位点特异性引物设计：3′末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物；；3)、PCR扩增；4)、通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无。

五、杂交法：

1、等位基因特异寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide，ASO)是一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。基本流程：1)、DNA提取和质检；2)PCR扩增；3)直接与相应的寡核苷酸探针杂交，洗脱；4)、结果分析。2、基因芯片又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray)是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。基本流程：1)、检测样品基因组DNA中通过PCR制备探针；2)、与芯片进行固-液相杂交；3)、经过高严谨度的洗涤后进行结果检测。4)、根据探针标记分子的种类和芯片的规格来选择检测方法；5)、再选用相应的软件进行数据分析。

六、SequenomSNP检测结合多重PCR技术、MassARRAYiPLEX单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)进行分型检测。将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用特异的延伸引物与PCR产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术，检测延伸产物分子量的大小，应用专用的分析软件，通过判断分子量的差异而进行SNP分型检测。基本流程：1)、DNA提取和质检；2)、引物设计与合成；3)、PCR扩增反应和延伸反应；4)、Sequenom质谱仪检测；6)、结果分析。

七、以构象为基础的检测方法：

1、限制性片段长度多态性分析法(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性.基本流程：1)、PCR扩增；2)、PCR扩增产物检测；3)、限制性内切酶酶切消化反应；4)、酶切产物电泳分型；5)、显色，结果判定。

2、单链构象多态性分析法(SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP)是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时移动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现移动变位。基本流程：1)、PCR扩增靶DNA；2)、将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；3)将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)、最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。

实施例3本发明SNP位点与青光眼的相关性

统计方法：利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P<0.05认为统计学的差异显著。结果如下：

1)病例和对照的基本信息

2)SNP位点多态性与青光眼密切相关

No1：rs2487032

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2487032G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.75，95％CI＝0.70-0.81)，青光眼患病风险降低75％。

No2：rs2472519

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472519G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.71-0.83)，青光眼患病风险降低77％。

No3：rs2472459

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472459C等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.71-0.83)，青光眼患病风险降低77％。

No4：rs2164560

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2164560T等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.72-0.84)，青光眼患病风险降低77％。

NO5：rs12555462

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs12555462T等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.78，95％CI＝0.71-0.84)，青光眼患病风险降低78％。

NO6：rs2472511

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472511G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.78，95％CI＝0.72-0.85)，青光眼患病风险降低78％。NO7：rs2422493

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2422493C等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.67，95％CI＝0.58-0.78)，青光眼患病风险降低67％。

NO8：rs2487042

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2487042G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.66，95％CI＝0.55-0.78)，青光眼患病风险降低66％。

NO9：rs2472495

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472495T等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.72，95％CI＝0.63-0.83)，青光眼患病风险降低72％。

NO10：rs4397467

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs4397467A等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.73，95％CI＝0.64-0.84)，青光眼患病风险降低73％。

NO11：kgp5805087(rs1125873)

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs1125873A等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.68-0.88)，青光眼患病风险降低77％。

NO12：rs715119

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs715119G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.76，95％CI＝0.66-0.87)，青光眼患病风险降低76％。

NO13：rs2487052

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2487052C等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.74，95％CI＝0.65-0.85)，青光眼患病风险降低74％。

NO14：rs2472493

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472493T等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.74，95％CI＝0.64-0.86)，青光眼患病风险降低74％。

NO15：rs2487048

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2487048C等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.74，95％CI＝0.64-0.86)，青光眼患病风险降低74％。

NO16：kgp6833498(rs2027400)

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2027400G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.76，95％CI＝0.67-0.88)，青光眼患病风险降低76％。

NO17：rs2472509

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472509A等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.67-0.88)，青光眼患病风险降低77％。

NO18：rs1800977

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs1800977C等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.78，95％CI＝0.68-0.89)，青光眼患病风险降低78％。

NO19：rs2246293

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2246293G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.76，95％CI＝0.65-0.88)，青光眼患病风险降低76％。

NO20：rs2515618

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2515618G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.67-0.89)，青光眼患病风险降低77％。

NO21：rs7023634

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs7023634G等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.34，95％CI＝1.12-1.59)，即青光眼患病风险增加1.34倍，且其95％CI下限为1.12＞1，可以确定rs7023634位点G等位基因是危险因子。

NO22：rs12553329

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs12553329A等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.24，95％CI＝1.09-1.42)，即青光眼患病风险增加1.24倍，且其95％CI下限为1.09＞1，可以确定rs12553329位点A等位基因是危险因子。

NO23：rs2437817

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2437817G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.79，95％CI＝0.69-0.91)，青光眼患病风险降低79％。

NO24：rs3887137

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs3887137A等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.23，95％CI＝1.07-1.41)，即青光眼患病风险增加1.23倍，且其95％CI下限为1.07＞1，可以确定rs3887137位点A等位基因是危险因子。

NO25：rs2487046

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2487046T等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.75，95％CI＝0.61-0.93)，青光眼患病风险降低75％。

No26：rs2472496

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472496G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.77，95％CI＝0.63-0.95)，青光眼患病风险降低77％。

NO27：rs1800976

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs1800976G等位基因可提高青光眼的抗性，使青光眼的危险性显著降低(OR＝0.82，95％CI＝0.70-0.96)，青光眼患病风险降低82％。N028：rs2472516

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2472516T等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.18，95％CI＝1.03-1.36)，即青光眼患病风险增加1.18倍，且其95％CI下限为1.03＞1，可以确定rs2472516位点T等位基因是危险因子。

No29：rs2043664

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2043664A等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.19，95％CI＝1.01-1.40)，即青光眼患病风险增加1.19倍，且其95％CI下限为1.01＞1，可以确定rs2043664位点A等位基因是危险因子。

No30：rs2487034

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，rs2487034G等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.19，95％CI＝1.01-1.39)，即青光眼患病风险增加1.19倍，且其95％CI下限为1.01＞1，可以确定rs2487034位点G等位基因是危险因子。

No31：rs2487031

在未考虑青光眼传统危险因子的情况下，r2487031C等位基因可使青光眼的危险性显著增加(OR＝1.18，95％CI＝1.01-1.38)，即青光眼患病风险增加1.18倍，且其95％CI下限为1.01＞1，可以确定rs2487031位点C等位基因是危险因子。

实施例4检测试剂盒

本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：

PCR扩增试剂(50人份)：

Sanpshot分型检测试剂(50人份)

标准DNA样品：

使用方法：

1)DNA提取

取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。

2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段

PCR扩增(20μl体系)：

反应条件：

PCR产物检测：

用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。

3)Sanpshot分型检测

第一步：PCR产物纯化(12μl体系)：

反应条件：

1、37℃酶切1小时

2、75℃灭活15分钟

3、4℃保存

第二步：单碱基引物延伸反应(5μl)：

反应条件：

第三步：纯化反应物：

反应体系：0.7μl血清碱性磷酸酶/孔

反应条件：37℃1小时，75℃15分钟，4℃保存。

第四步：ABI遗传分析仪读取结果：

反应体系：纯化产物1μl+HD9μl

反应条件：95℃5分钟，迅速冰浴冷却

ABIPRISM3130XLDNASequencer上机读取基因型结果。

本试剂盒用于：1、青光眼抗性人群或者易感人群的早期诊断和分型参考；2、青光眼抗性人群或易感人群的基因检测和可能性评估。

1)本发明的检测方法可用于分析本发明表1所示31个SNP位点的多态性，应用在青光眼的辅助性诊断和个体青光眼疾病抗性和易感性的评估中。

2)利用本发明阐述的青光眼抗性或易感基因/位点的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子，促进新药开发。

3)本发明建立的检测SNP位点多态性的核酸序列和青光眼相关基因/位点，可高灵敏度、特异性地应用于青光眼基因诊断用的试剂盒。

如上所述，得出结论，本发明表1所示31个SNP位点的多态性与青光眼具有显著相关性。因此，根据本发明，测定其多态性可用于进行基因诊断。

综上，本发明通过检测表1所示31个SNP位点的变异，评估待检样本发生青光眼的可能性，灵敏度高，只需要少量DNA样品就足以测定所述位点的变异，达到早期筛查的目的。

Claims (10)

1.检测ABCA1基因rs2487032变异的相关试剂在制备原发性开角型青光眼筛查试剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂包括检测ABCA1基因rs2487032变异A→G的试剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述试剂还包括用于扩增包含ABCA1基因rs2487032基因片段的试剂。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G的试剂为Snapshot用试剂。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G的试剂为DNA测序用试剂、实时荧光定量PCR法用试剂、变性高效液相色谱分析法用试剂、等位基因特异扩增法用试剂、杂交法用试剂、质谱法用试剂、限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构象多态性分析法用试剂。

6.一种青光眼的筛查试剂盒，其特征在于：它包括用于检测ABCA1基因rs2487032变异的相关试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂包括检测ABCA1基因rs2487032变异A→G的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂还包括用于扩增包含ABCA1基因rs2487032的基因片段的试剂。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G的试剂为Snapshot用试剂。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测ABCA1基因rs2487032变异A→G的试剂为DNA测序用试剂、实时荧光定量PCR法用试剂、变性高效液相色谱分析法用试剂、等位基因特异扩增法用试剂、杂交法用试剂、质谱法用试剂、限制性片段长度多态性分析法用试剂或单链构象多态性分析法用试剂。